專利名稱：載蟾蜍靈的環(huán)肽修飾的聚乙二醇-聚乳酸羥基乙醇酸-聚賴氨酸納米粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤靶向遞送與緩釋給藥系統(tǒng)技術(shù)領(lǐng)域。具體是一種載蟾蜍靈的纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇-聚乳酸羥基乙醇酸-聚賴氨酸納米粒，簡稱為bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD，以及它們的制備方法和應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物的用途。
背景技術(shù)：
蟾蜍靈(bufalin)是蟾蜍毒素中的主要成分，對多種惡性腫瘤具有良好的治療效果，但它的毒副作用和低溶解性等缺點(diǎn)，限制了其在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用。近幾十年來，以可生物降解的聚合物為載體的遞送系統(tǒng)由于其獨(dú)特的優(yōu)勢而備受國內(nèi)外關(guān)注。將藥物包裹在靶向遞送載體可以有效地降低藥物的毒副作用，提高藥物的溶解性，增強(qiáng)藥物的靶向性，改善治療效果。許多像聚乳酸、聚乳酸_羥基乙酸等生物降解材料已經(jīng)廣泛的被用做藥物和基因的遞送載體，取得了一定的治療效果。段友容等人發(fā)明了 “聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(簡稱 mPEG-PLGA-PLL)納米遞送系統(tǒng)、制備方法及其應(yīng)用”(CN 200910247576.7)。該專利公開了 mPEG-PLGA-PLL陽離子聚合物納米粒遞送系統(tǒng)的制備和其應(yīng)用，聚合物制備的載體納米?？捎糜谪?fù)載有機(jī)藥物、水溶性藥物、水不溶性抗癌藥物或用于診斷用的顯影劑等。纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽，簡稱cRGD，是一種有效的靶向分子，眾多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)其對腫瘤血管具有很好的靶向效果(James D. Byrne, Tania Betancourt, Lisa Brannon-Peppas, Active targeting schemes for nanoparticle systems in cancer therapeutics. Advanced Drug Delivery Reviews,2008,60 1615-1626.)人們期待能夠具有上述各種優(yōu)點(diǎn)的新的抗腫瘤藥物。在本發(fā)明中，發(fā)明人以mPEG-PLGA-PLL為基礎(chǔ)材料經(jīng)過纈氨酸-精氨酸-甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸環(huán)肽的修飾成為纈氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸聚合物(簡稱mPEG-PLGA-PLL-cRGD)， 然后將蟾蜍靈(bufalin)包裹在mPEG-PLGA-PLL-cRGD聚合物中形成以載bufalin的纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽(VRGDG，cRGD)修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD)納米給藥系統(tǒng)，該系統(tǒng)將能夠有效的降低bufalin的毒性，增強(qiáng)其靶向性。由于聚乙二醇單甲醚(mPEG)附著在 mPEG-PLGA-PLL-cRGD聚合物載體的表面，mPEG的長鏈能使納米載體有效的逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，從而達(dá)到長循環(huán)的目的，有助于取得較好的治療效果。可降解聚合物PLGA， 能將bufalin包裹起來，降低其毒性。同時(shí)可使bufalin隨材料的降解被緩慢釋放出來， 從而達(dá)到較長時(shí)間的治療效果，且PLGA作為植入材料已獲得美國FDA批準(zhǔn)。陽離子多聚物聚左旋賴氨酸PLL，生物相容性好，降解產(chǎn)物為人體所必需的氨基酸。多聚左旋賴氨酸復(fù)合物仍帶正電荷，其結(jié)構(gòu)靈活、穩(wěn)定、易調(diào)整其分子量，可以通過引入側(cè)鏈和特異靶向性基團(tuán)來修飾多聚物骨架，進(jìn)而調(diào)整和改善載體的性能，達(dá)到緩釋藥物的目的。cRGD是一個(gè)有效的靶向分子，眾多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)其對腫瘤血管具有很好的靶向效果。本項(xiàng)目中合成 mPEG-PLGA-PLL-cR⑶聚合物，綜合了它們的優(yōu)點(diǎn)。因此以載蟾蜍靈(bufalin)的纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽(VRGDG，cRGD)修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD)納米給藥系統(tǒng)將能夠有效的降低bufalin 的毒性，增強(qiáng)其靶向性。納米給藥系統(tǒng)的靶向能力是將藥物準(zhǔn)確遞送至靶點(diǎn)并取得良好治療效果的關(guān)鍵。 bufaline-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米給藥系統(tǒng)可以很好的解決這個(gè)問題。研制的納米載體系統(tǒng)直徑可保持在10-500nm。因?yàn)檎＝M織周圍的血管沒有縫隙，而腫瘤組織周圍的血管有100納米左右的縫隙，所以納米粒子就會(huì)從這些縫隙中滲透出來，并利用增強(qiáng)的滲透保留效應(yīng)聚集于腫瘤部位，然后攻擊癌細(xì)胞，但不會(huì)損害正常細(xì)胞，從而達(dá)到被動(dòng)靶向的效果。納米粒上的cRGD靶向基團(tuán)可以與靶點(diǎn)特異性結(jié)合，具有受體介導(dǎo)的靶向給藥系統(tǒng)形成的主動(dòng)靶向效應(yīng)，使蟾蜍靈抗腫瘤藥物比較準(zhǔn)確送到腫瘤細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的靶向治療。采用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的以纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽(VRGDG， cRGD)修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL-cRGD)聚合物為載體，以蟾蜍靈(bufalin)為模型藥制備的bufalin-mPEG-PLGA-PLL的納米給藥系統(tǒng)將具有良好的靶向遞送能力和治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種一種載蟾蜍靈(bufalin)的纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽(VRGDG，cRGD)修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL)納米粒，簡稱 bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD。其中，mPEG 是一種具有長循環(huán)功效，PLGA可生物降解有緩控釋功效、PLL側(cè)鏈帶有側(cè)氨基基團(tuán)，易于用靶向基團(tuán)修飾。cRGD是能夠有效的、主動(dòng)靶向腫瘤血管的靶向分子。此給藥系統(tǒng)還具有運(yùn)送不同抗癌藥物的功能。本發(fā)明的目的還提供一種纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸聚合物，簡稱mPEG-PLGA-PLL-CR⑶。本發(fā)明的目的還提供一種載蟾蜍靈的纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸納米粒的的制備方法。本發(fā)明的一目的是提供一種上述纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL-cRGD)聚合物的制備方法。本發(fā)明的目的還提供一種載蟾蜍靈的纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸_谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸 (buf al in-mPEG-PLGA-PLL-cRGD)的用途，可以用于制備抗腫瘤的納米粒藥物。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于如何有效的將bufalin包裹在制備的聚合物載體中，使之能夠有效地遞送到靶點(diǎn)，從而最大限度的發(fā)揮藥物的療效。本發(fā)明所述的buf al in-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒子是以纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL-cRGD)聚合物為載體，以蟾蜍靈(bufalin)為模型藥，制備出載蟾蜍靈的納米藥物。其粒徑為10-2000nm。所述的納米粒的分子量為1. 5X 103-9. 5X 106,優(yōu)選的分子量范圍為 3X 103-5X 106。其中，乳酸和羥基乙酸摩爾比為1-80 1-80，優(yōu)化的比例為50-80 2-50, 例如乳酸和羥基乙酸摩爾比為5050 50,70 30或80 20等；羥基乙酸和賴氨酸摩爾比為90-50 10-50，優(yōu)化的比例為50-70 10 20，例如羥基乙酸和賴氨酸摩爾比為 70 10,60 10 或 50 20，mPEG-PLGA-PLL 和 cRGD 摩爾比為 1-60 1-60，優(yōu)化的比例為 1 20-50，例如 mPEG-PLGA-PLL 和 cRGD 摩爾比為 1 20、1 30 或 1 50 ； 1-60 1-60, 優(yōu)化的比例為1 20-50，例如Bufalin和mPEG-PLGA-PLL-cRGD的摩爾比為1 20、1 30 或 1 5。本發(fā)明所述的mPEG-PLGA-PLL-cRGD聚合物的合成方法具有如下常壓CN 200910247576. 7 所述的 mPEG-PLGA-PLL 或者下述(1)-(5)的步驟合成獲得的mPEG-PLGA-PLL，在室溫下以及N，N'-羰基二咪唑(⑶I)和二甲亞砜(DMSO) 的混合有機(jī)溶液中，與cRGD攪拌反應(yīng)3-48h，所述的mPEG-PLGA-PLL與cRGD的摩爾比 (為1-60 1-60;所述的N，N'-羰基二咪唑(⑶I)的二甲亞砜(DMSO)摩爾比(為 1-60 1-60。該反應(yīng)推薦在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件進(jìn)行。反應(yīng)后的產(chǎn)物可以進(jìn)一步純化，將上述產(chǎn)物在水中進(jìn)行透析，透析袋截留分子量為1000-10000，然后凍干機(jī)上在0-60°C溫度下凍干l-72h，即得產(chǎn)物純化的 mPEG-PLGA-PLL-cRGD。純化產(chǎn)物低溫干燥保存為好。(l)mPEG-PLGA的制備抽真空加熱干燥耐熱玻璃管，加入一定摩爾質(zhì)量比的丙交酯和乙交酯原料(比例為1-80 1-80)，加入占原料總量質(zhì)量百分比為 15%、分子量范圍為350 5000的mPEG，再加入催化劑，通氮?dú)?，加熱溶解抽真空，冷卻固化抽真空2小時(shí)后封管，120-150°C反應(yīng)8-50h。所述的催化劑包括辛酸亞錫、乳酸鋅、SnCl2 ·2Η20和對甲苯磺酸等。所述的mPEG與催化劑的摩爾比為1-20 1_20。(2)mPEG-PLGA-Boc(Z)的制備在有機(jī)溶劑中和 0 40 °C，mPEG-PLGA、 Boc-Phe (eqv. )、N，N- 二環(huán)己基碳二亞胺(eqv.)和4_ 二甲氨基吡啶反應(yīng)1 3天。該反應(yīng)推薦常壓氮?dú)獗Ｗo(hù)。所述的mPEG-PLGA、Boc-Phe (1 15eqv. )、N，N- 二環(huán)己基碳二亞胺 (1 15eqv.)和4-二甲氨基吡啶的摩爾比為1 1 15 1 15 1 15。反應(yīng)產(chǎn)物可以進(jìn)行純化過濾，堿洗水洗或透析，濃縮，加冰甲醇或冰乙醚沉淀出產(chǎn)物，過濾，真空干燥。所述的Boc-Phe為Boc-苯丙氨酸。(3)mPEG-PLGA-NH2的制備在有機(jī)溶劑中和0°C，上述的mPEG-PLGA_Boc (Z)與三氟乙酸反應(yīng)1 4小時(shí)。反應(yīng)推薦采用氮?dú)獗Ｗo(hù)。所述的mPEG-PLGA-Boc(Z)與三氟乙酸的摩爾比為1-50 1-80。產(chǎn)物純化，旋蒸去除溶劑與未反應(yīng)三氟乙酸，殘?jiān)苡谟袡C(jī)溶劑， 冰甲醇或冰乙醚沉淀，過濾，真空干燥。(4) mPEG-PLGA-PZLL的制備有機(jī)溶劑中和室溫下，PEG_PLGA_NH2和NCA反應(yīng)1 5天。所述的PEG-PLGA-NH2和NCA的摩爾比為1 60。反應(yīng)推薦在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步純化濃縮，冰甲醇或冰乙醚沉淀，過濾，真空干燥。(5)mPEG-PLGA-PLL 的制備在 0°C，mPEG-PLGA-PZLL、三氟乙酸和 33% 的 HBr 醋酸溶液反應(yīng)0. 5-8h，所述的mPEG-PLGA-PZLL和三氟乙酸為等摩爾，33%的HBr醋酸溶液占mPEG-PLGA-PZLL和三氟乙酸的總體積的1_50%。反應(yīng)產(chǎn)物純化可以采用冰甲醇或冰乙醚
沉淀，過濾，真空干燥。mPEG-PLGA-PLL-cRGD聚合物的合成反應(yīng)式縮寫如下其中，r. t-反應(yīng)時(shí)間，h-時(shí)間，d-天，LA-丙交酯，Sn (Oct) 2-辛酸亞錫，mPEG-聚乙二醇單甲醚，PLGA-聚乳酸/羥基乙酸，DCC-二環(huán)己基碳二亞胺，DMAP-4-二甲氨基吡啶，BOC-苯丙氨酸，terminated-末端的，Acetic-醋酸，HBr-氫溴酸，Amino-氨基，poly(NE-(Z)-L-lySine)-帶芐氧羰基有保護(hù)基團(tuán)的聚賴氨酸，PLL-聚賴氨酸， dialysis-透析.
權(quán)利要求
1.本發(fā)明屬于納米給藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種載蟾蜍靈的環(huán)肽修飾的聚乙二醇_聚乳酸羥基乙醇酸_聚賴氨酸納米粒，其特征在于所述的納米粒以纈氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸聚合物為載體，以蟾蜍靈為模型藥，制備載蟾蜍靈的纈氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸納米粒。
2.如權(quán)利要求1所述的納米粒，其特征在于所述的納米粒的粒徑為10-2000nm。
3.如權(quán)利要求1所述的納米粒，其特征在于所述的制備的納米粒的聚合物分子量為 1. 5X 103-9. 5X 106。
4.如權(quán)利要求1所述的納米粒，其特征在于所述的制備納米粒的聚合物中乳酸和羥基乙酸摩爾比為1-80 1-80，羥基乙酸和賴氨酸摩爾比為90-50 10-50，聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸和纈氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸環(huán)肽摩爾比為1-60 1-60，荷蟾蜍靈和纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸的摩爾比為1-60 1-60。
5.一種如權(quán)利要求1所述的載蟾蜍靈的纈氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇_聚乳酸羥基乙醇酸_聚賴氨酸納米粒的制備方法，其特征在于如下步驟獲得(1)在室溫下以及N，N'-羰基二咪唑和二甲亞砜的混合有機(jī)溶液中，聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸和纈氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸環(huán)肽攪拌反應(yīng)3-48h，獲得纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸；所述的聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸和纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽的摩爾比為1-60 1-60 ；(2)纈氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸和蟾蜍靈摩爾比為1-60 1-60時(shí)，通過乳化蒸發(fā)法、界面沉淀法、透析法、薄膜乳化法、冷凍干燥法、超聲分散法或逆向蒸發(fā)法制備獲得載蟾蜍靈的纈氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸納米粒。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟(1)是在氮?dú)庵羞M(jìn)行。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中，所述的采用復(fù)乳法制備是取 4mg纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚_聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸溶于200 μ L 二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶劑中，加入0. 2mg蟾蜍靈溶液，400W，10sX4的條件下進(jìn)行超聲乳化，再加入2. 2mL濃度為的普朗尼克F68水分散介質(zhì)中，再次在400W，IOs X 4的條件下進(jìn)行超聲乳化，然后室溫下攪拌0. 5-5h除去有機(jī)相；所述的薄膜乳化法制備，取4mg纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸和0. 2mg蟾蜍靈溶于400 μ L丙酮溶劑中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，隨后加入4mL的水溶液，室溫下攪拌0. 5-6h ；所述的透析法制備，取4mg纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸溶于200 μ L 二甲亞砜溶劑中，加入0. 4mg蟾蜍靈，將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入2mL水中，之后將溶液裝入透析袋中透析3-72小時(shí)，除去有機(jī)溶劑，所述的透析袋的截留分子量為7000 ；采用乳化蒸發(fā)法制備，取4mg纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸和0. 2mg蟾蜍靈溶于400 μ L丙酮和二氯甲烷的混合溶劑中，加入2. 2mL濃度為2%的含聚乙烯醇的水分散介質(zhì)中，超聲或高壓乳勻乳化，乳液在室溫下攪拌2-4h，揮盡有機(jī)溶劑；采用界面沉淀法制備，取4mg纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸_聚賴氨酸和0. 2mg蟾蜍靈溶于400 μ L丙酮溶劑中， 在不斷的攪拌條件下，將上述溶液注入2. 2mL的濃度為2%的聚乙烯醇水分散介質(zhì)中，加壓揮發(fā)去除丙酮；采用自組裝法制備，取4mg纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸溶于200 μ L水溶液中，加入0. 4mg蟾蜍靈，將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入2mL水中，之后將溶液裝入透析袋中透析3-72小時(shí)， 除去有機(jī)溶劑；三位數(shù)的透析袋的截留分子量為7000。
8.—種如權(quán)利要求1所述的載蟾蜍靈的纈氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸環(huán)肽修飾的聚乙二醇-聚乳酸羥基乙醇酸-聚賴氨酸納米粒的應(yīng)用，其特征在于用于制備具有長循環(huán)、可生物降解、緩控釋、被動(dòng)靶向、主動(dòng)靶向、運(yùn)送活性物質(zhì)、抗腫瘤的藥物。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物是靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、口服或經(jīng)皮給藥等方式的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米給藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種載蟾蜍靈(bufalin)的環(huán)肽(VRGDG，cRGD)修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(bufanlin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD)納米粒，它們的制備方法及其用于制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。該納米粒制備方法簡便，適于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號A61K31/585GK102302783SQ201110177938
公開日2012年1月4日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者侯黎莉, 劉培峰, 劉宣, 周利紅, 孫穎, 李克桑, 李琦, 梁波, 段友容, 殷佩浩, 王炎, 秦建民, 邱艷艷, 陳紅宇, 靳寶輝 申請人:上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院, 上海市腫瘤研究所