專利名稱：治療或預(yù)防腫瘤的藥物、腫瘤全細(xì)胞疫苗及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防腫瘤的藥物、腫瘤全細(xì)胞疫苗(Whole-cell vaccine ； Whole cell vaccine)及其制備方法和用途，屬于生物工程領(lǐng)域和生物免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤具有多種免疫逃逸機(jī)制，包括腫瘤細(xì)胞抗原特異性低和/或腫瘤抗原破壞、或缺乏一些免疫輔助因子的表達(dá)等，使得現(xiàn)有腫瘤疫苗的臨床治療效果不佳。此外在腫瘤的進(jìn)展期，腫瘤細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，極易發(fā)生突變而逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)督，突變導(dǎo)致腫瘤抗原表型消失，繼而也使針對(duì)該抗原的免疫治療效果降低。為了使腫瘤疫苗療效實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化，常采用細(xì)胞因子(如IL-12，GM-CSF)等作為佐劑以增強(qiáng)免疫效應(yīng)。白細(xì)胞介素 15(IL-15)是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子，參與對(duì)多種組織細(xì)胞的調(diào)節(jié)，是目前機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)的研究新熱點(diǎn)。但是未見(jiàn)有以IL-15作為疫苗佐劑使用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物。本發(fā)明預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物包括如下組分腫瘤全細(xì)胞疫苗 (Whole-cell vaccine ；Whole cell vaccine)、陽(yáng)離子脂質(zhì)體(Liposome)和編碼白細(xì)胞介素-15 (Interleukin 15，IL-15)的重組質(zhì)粒。其中，所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗優(yōu)選為滅活的具有特異性和主動(dòng)性激發(fā)生物體主動(dòng)免疫機(jī)能的腫瘤細(xì)胞疫苗。進(jìn)一步的，所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗包含至少一種能激活生物體特異性抗腫瘤T淋巴細(xì)胞的活性成分；其中，所述的活性成分為蛋白質(zhì)、多肽、脂類、蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物、DNA 分子、RNA分子、腫瘤相關(guān)抗原、特異性腫瘤抗原中至少一種。其中，本發(fā)明預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物中所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗優(yōu)選由下述方法制備而成腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞滅活至細(xì)胞增殖活性被抑制；其中，所述的腫瘤細(xì)胞為能特異性的誘導(dǎo)、激活機(jī)體主動(dòng)免疫，增強(qiáng)生物體預(yù)防腫瘤和抗腫瘤免疫的自體細(xì)胞、 同源細(xì)胞系細(xì)胞或具有交叉抗原的異體腫瘤細(xì)胞。包括良性、惡性腫瘤，可為原發(fā)性或者繼發(fā)性甚至轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。其組織來(lái)源可為上皮組織、間葉組織、血液組織等。所述的腫瘤細(xì)胞可以為肺癌細(xì)胞、腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、 皮膚癌細(xì)胞、食道癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞中至少一種。進(jìn)一步的，上述的細(xì)胞滅活可以采用如下方法微波細(xì)胞滅活法，電磁波細(xì)胞滅活法，激光細(xì)胞滅活法，高溫細(xì)胞滅活法，超聲破碎細(xì)胞滅活法，反復(fù)細(xì)胞凍融、勻漿、離心、沉淀細(xì)胞滅活法，酶學(xué)消化細(xì)胞滅活法中至少一種。
其中，本發(fā)明藥物中的陽(yáng)離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15的重組質(zhì)粒可以作為疫苗佐劑使用。其中，本發(fā)明預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)體為雙鏈季銨鹽型表面活性劑，如D0TAP (N-[1- (2，3-dioleoyloxy) propyl]-N, N, N-trimethylammonium methylsulfate ；1,2- 二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化銨)、D0TMA (N-[1- (2，3- 二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨)、D0SPA(3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N， N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸銨)或DOGS(雙十八烷基酰胺甘氨酰精胺)中至少一種；陽(yáng)離子脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒DNA的重量配比優(yōu)選為1 15 1，所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)體和 IL-15重組質(zhì)粒DNA的重量配比更優(yōu)選為3 1。其中，本發(fā)明治療或預(yù)防腫瘤的藥物，所述的LI-15重組質(zhì)粒DNA包括1)、根據(jù)編碼IL-15的基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA ；或2)、根據(jù)編碼LI-15的基因序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸且具有IL-15基因功能的基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA ；或3)、在生物體內(nèi)被吸收轉(zhuǎn)染后能分泌具有IL-15生物活性的質(zhì)粒。其中，上述的治療或預(yù)防腫瘤的藥物的制劑優(yōu)選為試劑盒，其包括包裝在空間獨(dú)立的制劑單元中的順序給藥的腫瘤全細(xì)胞疫苗、陽(yáng)離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15的重組質(zhì)粒。進(jìn)一步的，為了使本發(fā)明藥物治療或預(yù)防腫瘤的效果最好，本發(fā)明藥物使用時(shí)將脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒按照比例混合，以無(wú)沉淀為標(biāo)準(zhǔn)。皮下注射、腫瘤內(nèi)部或瘤周注射、淋巴結(jié)內(nèi)或周圍注射等使用時(shí)，腫瘤全細(xì)胞疫苗先單獨(dú)注射使用，后將脂質(zhì)體與質(zhì)粒的混合物注射，不混合在一起注射使用。還可視具體情況與已誘導(dǎo)的致敏T淋巴細(xì)胞、B-7、 GM-CSF, Y-干擾素(INFY)等聯(lián)合使用。其中，IL-15重組質(zhì)粒DNA可以采用下述方法制備重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序測(cè)定正確后，用質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行大量制備，具體如下1)細(xì)菌培養(yǎng)質(zhì)粒接種于含100 μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；2)收獲細(xì)菌4°C離心30min，4000rpm，棄上清，敞開瓶口并倒置使上清全部流盡，
稱重；3)重懸在細(xì)菌沉淀中加入125ml Buffer P1，反復(fù)振蕩，吹打直至菌體完全重懸；4)裂解加入125ml Buffer P2，輕柔而徹底地顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，室溫放置5min ；5)中和加入125ml冰預(yù)冷的Buffer P3，立即徹底而溫和地顛倒離心瓶數(shù)次，充分混勻內(nèi)容物，直至白色絮狀物形成，而裂解物不再粘稠。然后在冰上放置30min，冰浴期間應(yīng)間或混勻樣品數(shù)次；6)沉淀雜蛋白4°C，20000rpm/min離心樣品30min，小心收集上清液到另一干凈
離心管中；7)收集質(zhì)粒溶液將收集的上清液再離心15min，4°C，25000rpm/min,小心將上清液全部收集于500ml的玻璃容器中，同時(shí)取樣電泳檢查。8)去內(nèi)毒素加入30ml Buffer ER，混勻后冰浴30min ；
9)平衡柱子在Qiagen-tip 10000中加入75ml Buffer QBT，讓其自然流空；10)樣品上柱將樣品倒入柱子里，讓其自然地進(jìn)入柱子中；11)反復(fù)洗柱用 600ml Buffer QC 洗柱；12)樣品洗脫用75ml Buffer QN將柱子里的質(zhì)粒DNA樣品洗脫下來(lái)，收集在沒(méi)有內(nèi)毒素污染的離心管里；13)沉淀質(zhì)粒在洗脫下來(lái)的DNA樣品中加入0. 70體積(約52. 5ml)處于室溫的異丙醇，混勻后即在4°C，15000rpm離心30min，小心棄上清；14)洗滌沉淀用IOml無(wú)內(nèi)毒素的處于室溫的70%乙醇洗滌DNA沉淀，15000rpm/ min離心樣品lOmin，小心頃棄上清；15)涼干溶解敞開離心管口，放置10 20min，直到乙醇蒸發(fā)殆盡，用適量的滅菌的無(wú)內(nèi)毒素的生理鹽水溶解質(zhì)粒DNA，并檢測(cè)質(zhì)粒的純度；16)為進(jìn)一步去除內(nèi)毒素，將溶解的質(zhì)粒從第(8)步開始重復(fù)，再次過(guò)柱純化；17)用無(wú)內(nèi)毒素的生理鹽水溶解質(zhì)粒DNA，采用紫外分光光度儀測(cè)定OD 260/280 讀數(shù)，測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度和純度的測(cè)定。分裝后-20°C凍存。其中，陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以采用常規(guī)方法制備，比如采用下述方法制備DOTAP陽(yáng)離子脂質(zhì)體1)將 D0TAP(D6182)按 1 1 的摩爾比加入 DOPE (Dioleylphosphatidyl-ethanol amine)中，然后溶解于氯仿和甲醇的混合物(氯仿和甲醇的體積比為3 1)；2)再將上述混合物放入充滿氮?dú)獾膱A底燒瓶?jī)?nèi)的薄片上進(jìn)行干燥，采用高度真空法去除掉殘余的氯仿和甲醇；3)經(jīng)上述過(guò)程制備的脂質(zhì)體放入5%的葡萄糖溶液中進(jìn)行水合；4)在近距離超聲破碎儀中進(jìn)行處理直至完全增溶；5)將制備的脂質(zhì)體通過(guò)聚碳酸酯膜進(jìn)行濾過(guò)，形成單層小囊泡形態(tài)；6)制備好的陽(yáng)離子脂質(zhì)體(濃度:3mg/ml)保存在4°C的條件下備用。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述的藥物在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物中的用途。所述的腫瘤可以為人體腦膠質(zhì)瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、 頭頸部癌、胰腺癌或腎細(xì)胞癌等。其中，所述藥物中的腫瘤全細(xì)胞疫苗皮下注射腫瘤疫苗數(shù)目為1 X IO5 1 X IO8個(gè)/次。其中，本發(fā)明藥物引入生物體內(nèi)的途徑包括皮下單點(diǎn)注射、皮下多點(diǎn)注射、靜脈注射、瘤周注射、瘤內(nèi)注射、胸腔注射、腹腔注射、蛛網(wǎng)膜下腔注射、淋巴結(jié)內(nèi)或周圍注射、肌肉注射等。上述途徑可視具體情況單獨(dú)運(yùn)用，必要時(shí)聯(lián)合運(yùn)用。本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備腫瘤全細(xì)胞疫苗的方法，該方法包括如下步驟a、取腫瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶或EDTA消化、分離，得到細(xì)胞沉淀；b、a步驟所得細(xì)胞沉淀滅活至細(xì)胞增殖活性被抑制。進(jìn)一步的，a步驟中所述的腫瘤細(xì)胞的來(lái)源可以為腫瘤細(xì)胞株或細(xì)胞系，或來(lái)源于生物體的腫瘤組織；其中，當(dāng)腫瘤細(xì)胞的來(lái)源為腫瘤細(xì)胞株或細(xì)胞系時(shí)，按如下方法準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞取狀態(tài)CN 102343086 A
說(shuō)明書
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良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代，達(dá)到所需細(xì)胞數(shù)后進(jìn)入腫瘤全細(xì)胞疫苗制備程序；當(dāng)腫瘤細(xì)胞的來(lái)源為生物體的腫瘤組織時(shí)，按如下方法準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞在無(wú)菌條件下取腫瘤新鮮、血供好的未壞死部分，放入盛有含小牛或胎牛血清的DMEM/F12中在4°C 下保存，用含青霉素、鏈霉素的PBS溶液清洗，通過(guò)酶消化法、差速貼壁法或差速消化法分離得到純化的腫瘤細(xì)胞，將純化的腫瘤細(xì)胞移入含小牛或胎牛血清的DMEM等培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，然后放入37°C，5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 3d后，細(xì)胞鋪滿瓶底80 90 %時(shí)傳代，達(dá)到所需細(xì)胞數(shù)后進(jìn)入腫瘤全細(xì)胞疫苗制備程序。進(jìn)一步的，上述a步驟優(yōu)選采用下述方法進(jìn)行分離取腫瘤細(xì)胞，加質(zhì)量濃度為 0. 25%的胰酶或質(zhì)量濃度為0. 02%的EDTA消化至細(xì)胞收縮變圓后加入含10%血清的常規(guī)培養(yǎng)基終止消化，并吹打使細(xì)胞分散脫落，收集液體，離心，棄上清液，得到細(xì)胞沉淀。其中，上述b步驟中可以采用下述方法進(jìn)行細(xì)胞滅活微波細(xì)胞滅活法，電磁波細(xì)胞滅活法，激光細(xì)胞滅活法，高溫細(xì)胞滅活法，超聲破碎細(xì)胞滅活法，反復(fù)細(xì)胞凍融、勻漿、 離心、沉淀細(xì)胞滅活法，酶學(xué)消化細(xì)胞滅活法中至少一種。進(jìn)一步的，上述b步驟中優(yōu)選采用下述方法進(jìn)行細(xì)胞滅活a步驟所得細(xì)胞沉淀用重懸溶液重懸，離心后棄上清液，加入質(zhì)量濃度為的戊二醛固定7- ，然后用相應(yīng)的重懸溶液洗滌，離心，所得細(xì)胞沉淀再次重懸后于5% C02，37°C的培養(yǎng)箱中放置1. 5 2. 5h，然后再用相應(yīng)的重懸溶液洗滌，離心，重復(fù)3次，重懸后即得細(xì)胞疫苗，保存?zhèn)溆?；其中，所述的重懸溶液為生理鹽水NS或磷酸鹽 PBS緩沖液。更進(jìn)一步的，為了使離心效果更好，上述步驟中離心時(shí)的離心速度優(yōu)選為1300 1700rpm/min (離心速度更優(yōu)選為1500rpm/min)，離心時(shí)間優(yōu)選為2 ^iin (離心時(shí)間更優(yōu)選為3min)。本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供由上述的方法制備的腫瘤全細(xì)胞疫苗。IL-15結(jié)構(gòu)和功能與IL-2相似，而IL-15對(duì)NK細(xì)胞的分化發(fā)育和功能調(diào)節(jié)尤其密切，也是記憶性免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)因子。此外，對(duì)T、B細(xì)胞的刺激作用IL-15也較IL-2 強(qiáng)。因此，以IL-15作為免疫佐劑，能更好地增強(qiáng)主動(dòng)性免疫反應(yīng)，減少免疫負(fù)調(diào)節(jié)，并增強(qiáng)免疫記憶。目前已上市的自體源性細(xì)胞免疫療法藥物，是利用患者自身腫瘤細(xì)胞成分致敏自身樹突狀細(xì)胞制成的個(gè)體化免疫。本發(fā)明是將培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞株滅活處理使瘤細(xì)胞喪失致瘤性，并保留其免疫原性，以此作為全細(xì)胞腫瘤疫苗，同時(shí)聯(lián)合IL-15作為免疫佐劑，目的在于建立一種長(zhǎng)效的，“按需給藥”的治療方法，這種細(xì)胞疫苗聯(lián)合細(xì)胞因子的特異性主動(dòng)性免疫是機(jī)體自身建立的一種針對(duì)腫瘤抗原的長(zhǎng)效的主動(dòng)性防御機(jī)制，符合“按需給藥”的治療模式，能夠達(dá)到較佳的治療效果。本發(fā)明藥物能促進(jìn)生物體內(nèi)提高免疫能力，特別是針對(duì)腫瘤細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞和 NK細(xì)胞等。相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明藥物治療的小鼠腫瘤中，CD4+的T細(xì)胞、CDS+的T細(xì)胞、 B細(xì)胞(⑶24)、NK(⑶57)細(xì)胞的標(biāo)記物均明顯表達(dá)增多，表明其誘導(dǎo)、放大并增強(qiáng)了生物體內(nèi)的特異性免疫應(yīng)答。因此，通過(guò)全細(xì)胞疫苗聯(lián)合IL-15質(zhì)粒進(jìn)行預(yù)防或治療，后者能激發(fā) CD4+的T細(xì)胞、CDS+的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞的表達(dá)，從而加強(qiáng)放大腫瘤細(xì)胞疫苗在腫瘤預(yù)防免疫和抗腫瘤免疫治療中的作用，進(jìn)一步加強(qiáng)了生物體的特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。本發(fā)明中所述制備預(yù)防或治療腫瘤藥物的方法，類似的方法可制備人類腫瘤細(xì)胞疫苗并治療人體腫瘤。本發(fā)明適用于醫(yī)療領(lǐng)域，特別是預(yù)防或治療腫瘤，亦適用于術(shù)后腫瘤殘留或不能外科切除的腫瘤。本發(fā)明中作為疫苗的細(xì)胞可來(lái)自同一人類或非人類生物個(gè)體，也可來(lái)自不同的人類或者非人類生物個(gè)體。本發(fā)明藥物治療或預(yù)防腫瘤的效果顯著，為本領(lǐng)域提供了一種新的選擇，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為皮下膠質(zhì)瘤治療性實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤體積曲線。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為腫瘤體積。圖2為建模成功后，C6/ffistar腫瘤治療后MRI特征及體積變化情況圖。圖3為顱內(nèi)Ce/Wistar膠質(zhì)瘤治療后體積生長(zhǎng)曲線圖。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)， 縱坐標(biāo)為腫瘤體積。圖4為顱內(nèi)Ce/Wistar膠質(zhì)瘤治療后生存曲線圖。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為存活率(％)。圖5為建模成功后，9L/F344腫瘤治療后MRI特征及體積變化情況圖。圖6為顱內(nèi)F344/9L膠質(zhì)瘤大鼠體積生長(zhǎng)曲線圖。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為腫瘤體積。圖7為顱內(nèi)9L/F344膠質(zhì)瘤治療后生存曲線圖。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為存活率(％)。圖8LL2小鼠肺癌模型治療后體積生長(zhǎng)曲線圖。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為腫瘤體積。圖9LL2小鼠肺癌模型治療后生存曲線圖。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為存活率(％ )。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做進(jìn)一步的描述，并不因?qū)Ρ景l(fā)明限制。本發(fā)明預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物包括如下組分腫瘤全細(xì)胞疫苗 (Whole-cell vaccine ；Whole cell vaccine)、陽(yáng)離子脂質(zhì)體(Liposome)和編碼白細(xì)胞介素-15 (Interleukin 15，IL-15)的重組質(zhì)粒。其中，所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗優(yōu)選為滅活的具有特異性和主動(dòng)性激發(fā)生物體主動(dòng)免疫機(jī)能的腫瘤細(xì)胞疫苗。進(jìn)一步的，所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗包含至少一種能激活生物體特異性抗腫瘤T淋巴細(xì)胞的活性成分；其中，所述的活性成分為蛋白質(zhì)、多肽、脂類、蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物、DNA 分子、RNA分子、腫瘤相關(guān)抗原、特異性腫瘤抗原中至少一種。其中，本發(fā)明預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物中所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗優(yōu)選由下述方法制備而成腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞滅活至細(xì)胞增殖活性被抑制；其中，所述的腫瘤細(xì)胞為能特異性的誘導(dǎo)、激活機(jī)體主動(dòng)免疫，增強(qiáng)生物體預(yù)防腫瘤和抗腫瘤免疫的自體細(xì)胞、 同源細(xì)胞系細(xì)胞或具有交叉抗原的異體腫瘤細(xì)胞。包括良性、惡性腫瘤，可為原發(fā)性或者繼發(fā)性甚至轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。其組織來(lái)源可為上皮組織、間葉組織、血液組織等。所述的腫瘤細(xì)胞可以為肺癌細(xì)胞、腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、食道癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞中至少一種。進(jìn)一步的，上述的細(xì)胞滅活可以采用如下方法微波細(xì)胞滅活法，電磁波細(xì)胞滅活法，激光細(xì)胞滅活法，高溫細(xì)胞滅活法，超聲破碎細(xì)胞滅活法，反復(fù)細(xì)胞凍融、勻漿、離心、沉淀細(xì)胞滅活法，酶學(xué)消化細(xì)胞滅活法中至少一種。其中，本發(fā)明藥物中的陽(yáng)離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15的重組質(zhì)?？梢宰鳛橐呙缱魟┦褂?。其中，本發(fā)明預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)體為雙鏈季銨鹽型表面活性劑，如D0TAP (N-[1- (2，3-dioleoyloxy) propyl]-N, N, N-trimethylammonium methylsulfate ；1,2- 二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化銨)、D0TMA (N-[1- (2，3- 二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨)、D0SPA(3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N， N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸銨)或DOGS (雙十八烷基酰胺甘氨酰精胺)中至少一種，當(dāng)然，制備脂質(zhì)體時(shí)還可以加入脂質(zhì)伴侶(如D0PE)等輔料；陽(yáng)離子脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒DNA的重量配比優(yōu)選為1 15 1，所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒DNA的重量配比更優(yōu)選為3 1。其中，本發(fā)明治療或預(yù)防腫瘤的藥物，所述的IL-15重組質(zhì)粒DNA包括1)、根據(jù)編碼IL-15的基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA ；或2)、根據(jù)編碼IL-15的基因序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸且具有IL-15基因功能的基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA ；或3)、在生物體內(nèi)被吸收轉(zhuǎn)染后能分泌具有IL-15生物活性的質(zhì)粒。其中，上述的治療或預(yù)防腫瘤的藥物的制劑優(yōu)選為試劑盒，其包括包裝在空間獨(dú)立的制劑單元中的順序給藥的腫瘤全細(xì)胞疫苗、陽(yáng)離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15的重組質(zhì)粒。進(jìn)一步的，為了使本發(fā)明藥物治療或預(yù)防腫瘤的效果最好，本發(fā)明藥物使用時(shí)將脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒按照比例混合，以無(wú)沉淀為標(biāo)準(zhǔn)。皮下注射、腫瘤內(nèi)部或瘤周注射、淋巴結(jié)內(nèi)或周圍注射等使用時(shí)，腫瘤全細(xì)胞疫苗先單獨(dú)注射使用，后將脂質(zhì)體與質(zhì)粒的混合物注射，不混合在一起注射使用。還可視具體情況與已誘導(dǎo)的致敏T淋巴細(xì)胞、B-7、 GM-CSF, Y-干擾素(INFY)等聯(lián)合使用。其中，IL-15重組質(zhì)粒DNA可以采用下述方法制備重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序測(cè)定正確后，用質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行大量制備，具體如下1)細(xì)菌培養(yǎng)質(zhì)粒接種于含100 μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；2)收獲細(xì)菌4°C離心30min，4000rpm，棄上清，敞開瓶口并倒置使上清全部流盡，
稱重；3)重懸在細(xì)菌沉淀中加入125ml Buffer P1，反復(fù)振蕩，吹打直至菌體完全重懸；4)裂解加入125ml Buffer P2，輕柔而徹底地顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，室溫放置5min ；5)中和加入125ml冰預(yù)冷的Buffer P3，立即徹底而溫和地顛倒離心瓶數(shù)次，充分混勻內(nèi)容物，直至白色絮狀物形成，而裂解物不再粘稠。然后在冰上放置30min，冰浴期間應(yīng)間或混勻樣品數(shù)次；
6)沉淀雜蛋白4°C，20000rpm/min離心樣品30min，小心收集上清液到另一干凈
離心管中；7)收集質(zhì)粒溶液將收集的上清液再離心15min，4°C，25000rpm/min,小心將上清液全部收集于500ml的玻璃容器中，同時(shí)取樣電泳檢查。8)去內(nèi)毒素加入30ml Buffer ER，混勻后冰浴30min ；9)平衡柱子在Qiagen-tip 10000中加入75ml Buffer QBT，讓其自然流空；10)樣品上柱將樣品倒入柱子里，讓其自然地進(jìn)入柱子中；11)反復(fù)洗柱用 600ml Buffer QC 洗柱；12)樣品洗脫用75ml Buffer QN將柱子里的質(zhì)粒DNA樣品洗脫下來(lái)，收集在沒(méi)有內(nèi)毒素污染的離心管里；13)沉淀質(zhì)粒在洗脫下來(lái)的DNA樣品中加入0. 70體積(約52. 5ml)處于室溫的異丙醇，混勻后即在4°C，15000rpm離心30min，小心棄上清；14)洗滌沉淀用IOml無(wú)內(nèi)毒素的處于室溫的70%乙醇洗滌DNA沉淀，15000rpm/ min離心樣品lOmin，小心頃棄上清；15)涼干溶解敞開離心管口，放置10 20min，直到乙醇蒸發(fā)殆盡，用適量的滅菌的無(wú)內(nèi)毒素的生理鹽水溶解質(zhì)粒DNA，并檢測(cè)質(zhì)粒的純度；16)為進(jìn)一步去除內(nèi)毒素，將溶解的質(zhì)粒從第(8)步開始重復(fù)，再次過(guò)柱純化；17)用無(wú)內(nèi)毒素的生理鹽水溶解質(zhì)粒DNA，采用紫外分光光度儀測(cè)定OD 260/280 讀數(shù)，測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度和純度的測(cè)定。分裝后-20°C凍存。其中，陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以采用常規(guī)方法制備，比如采用下述方法制備DOTAP陽(yáng)離子脂質(zhì)體1)將 D0TAP(D6182)按 1 1 的摩爾比加入 DOPE (Dioleylphosphatidyl-ethanol amine)中，然后溶解于氯仿和甲醇的混合物(氯仿和甲醇的體積比為3 1)；2)再將上述混合物放入充滿氮?dú)獾膱A底燒瓶?jī)?nèi)的薄片上進(jìn)行干燥，采用高度真空法去除掉殘余的氯仿和甲醇；3)經(jīng)上述過(guò)程制備的脂質(zhì)體放入5%的葡萄糖溶液中進(jìn)行水合；4)在近距離超聲破碎儀中進(jìn)行處理直至完全增溶；5)將制備的脂質(zhì)體通過(guò)聚碳酸酯膜進(jìn)行濾過(guò)，形成單層小囊泡形態(tài)；6)制備好的陽(yáng)離子脂質(zhì)體(濃度3mg/ml)保存在4°C的條件下備用。本發(fā)明還提供了上述的藥物在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物中的用途。所述的腫瘤可以為人體腦膠質(zhì)瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸部癌、胰腺癌或腎細(xì)胞寺。其中，所述藥物中的腫瘤全細(xì)胞疫苗皮下注射腫瘤疫苗數(shù)目為1 X IO5 1 X IO8個(gè)/次。其中，本發(fā)明藥物引入生物體內(nèi)的途徑包括皮下單點(diǎn)注射、皮下多點(diǎn)注射、靜脈注射、瘤周注射、瘤內(nèi)注射、胸腔注射、腹腔注射、蛛網(wǎng)膜下腔注射、淋巴結(jié)內(nèi)或周圍注射、肌肉注射等。上述途徑可視具體情況單獨(dú)運(yùn)用，必要時(shí)聯(lián)合運(yùn)用。本發(fā)明還提供了一種制備腫瘤全細(xì)胞疫苗的方法，該方法包括如下步驟a、取腫瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶或EDTA消化、分離，得到細(xì)胞沉淀；
b、a步驟所得細(xì)胞沉淀滅活至細(xì)胞增殖活性被抑制。進(jìn)一步的，a步驟中所述的腫瘤細(xì)胞的來(lái)源可以為腫瘤細(xì)胞株或細(xì)胞系，或來(lái)源于生物體的腫瘤組織；其中，當(dāng)腫瘤細(xì)胞的來(lái)源為腫瘤細(xì)胞株或細(xì)胞系時(shí)，按如下方法準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞取狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代，達(dá)到所需細(xì)胞數(shù)后進(jìn)入腫瘤全細(xì)胞疫苗制備程序；當(dāng)腫瘤細(xì)胞的來(lái)源為生物體的腫瘤組織時(shí)，按如下方法準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞在無(wú)菌條件下取腫瘤新鮮、血供好的未壞死部分，放入盛有含小?；蛱ヅＱ宓腄MEM/F12中在4°C 下保存，用含青霉素、鏈霉素的PBS溶液清洗，通過(guò)酶消化法、差速貼壁法或差速消化法分離得到純化的腫瘤細(xì)胞，將純化的腫瘤細(xì)胞移入含小牛或胎牛血清的DMEM等培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，然后放入37°C，5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 3d后，細(xì)胞鋪滿瓶底80 90 %時(shí)傳代，達(dá)到所需細(xì)胞數(shù)后進(jìn)入腫瘤全細(xì)胞疫苗制備程序。進(jìn)一步的，上述a步驟優(yōu)選采用下述方法進(jìn)行分離取腫瘤細(xì)胞，加質(zhì)量濃度為 0. 25%的胰酶或質(zhì)量濃度為0. 02%的EDTA消化至細(xì)胞收縮變圓后加入含10%血清的常規(guī)培養(yǎng)基終止消化，并吹打使細(xì)胞分散脫落，收集液體，離心，棄上清液，得到細(xì)胞沉淀。其中，上述b步驟中可以采用下述方法進(jìn)行細(xì)胞滅活微波細(xì)胞滅活法，電磁波細(xì)胞滅活法，激光細(xì)胞滅活法，高溫細(xì)胞滅活法，超聲破碎細(xì)胞滅活法，反復(fù)細(xì)胞凍融、勻漿、 離心、沉淀細(xì)胞滅活法，酶學(xué)消化細(xì)胞滅活法中至少一種。進(jìn)一步的，上述b步驟中優(yōu)選采用下述方法進(jìn)行細(xì)胞滅活a步驟所得細(xì)胞沉淀用重懸溶液重懸，離心后棄上清液，加入質(zhì)量濃度為的戊二醛固定7- ，然后用相應(yīng)的重懸溶液洗滌，離心，所得細(xì)胞沉淀再次重懸后于5% C02，37°C的培養(yǎng)箱中放置1. 5 2. 5h，然后再用相應(yīng)的重懸溶液洗滌，離心，重復(fù)3次，重懸后即得細(xì)胞疫苗，保存?zhèn)溆茫黄渲?，所述的重懸溶液為生理鹽水NS或磷酸鹽 PBS緩沖液。更進(jìn)一步的，為了使離心效果更好，上述步驟中離心時(shí)的離心速度優(yōu)選為1300 1700rpm/min (離心速度更優(yōu)選為1500rpm/min)，離心時(shí)間優(yōu)選為2 ^iin (離心時(shí)間更優(yōu)選為3min)。本發(fā)明還提供了由上述的方法制備的腫瘤全細(xì)胞疫苗。實(shí)施例本發(fā)明治療或預(yù)防腫瘤的藥物的制備1、IL-15的制備及方法(hIL-15質(zhì)粒的擴(kuò)增與純化)重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序測(cè)定正確后，用Qiagen公司的EndofreeTM plasmid Giga 試劑盒進(jìn)行大量制備。方法參考操作手冊(cè)進(jìn)行。步驟如下(下述各種Buffer的用量，適合于2. 5L細(xì)菌培養(yǎng)物)1)細(xì)菌培養(yǎng)質(zhì)粒接種于含100 μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；2)收獲細(xì)菌4°C條件下4000rpm/min離心30分鐘，棄上清，敞開瓶口并倒置使上
清全部流盡，稱重；3)重懸在細(xì)菌沉淀中加入125ml Buffer P1，反復(fù)振蕩，吹打直至菌體完全重懸；4)裂解加入125ml Buffer P2，輕柔而徹底地顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，室溫放置5分鐘；
5)中和加入125ml冰預(yù)冷的Buffer P3，立即徹底而溫和地顛倒離心瓶數(shù)次，充分混勻內(nèi)容物，直至白色絮狀物形成，而裂解物不再粘稠。然后在冰上放置30分鐘，冰浴期間應(yīng)間或混勻樣品數(shù)次；6)沉淀雜蛋白4°C下彡20000rpm/min離心樣品30min，小心收集上清液到另一干
凈離心管中；7)收集質(zhì)粒溶液將收集的上清液再離心15分鐘，4°C，20000rpm/min，收集上清， 同時(shí)取樣電泳檢查。8)去內(nèi)毒素加入30ml Buffer ER，混勻后冰浴30min ；9)平衡柱子在Qiagen-tip 10000中加入75ml Buffer QBT,以自然流速過(guò)柱；10)樣品上柱將樣品倒入柱子，以自然流速過(guò)柱；11)反復(fù)洗柱用 600ml Buffer QC 洗柱；12)樣品洗脫用75ml Buffer QN將吸附于膜上的質(zhì)粒DNA樣品洗脫下來(lái)，收集于無(wú)內(nèi)毒素的離心管里；13)沉淀質(zhì)粒在洗脫下來(lái)的DNA樣品中加入0. 70體積置于室溫的異丙醇，混勻后即在4D 15000rpm離心30分鐘，小心棄上清；14)洗滌沉淀用IOml 70%乙醇洗滌DNA沉淀，彡15000rpm/min離心樣品10分鐘，小心頃棄上清；15)涼干溶解敞開離心管口，放置10 20分鐘，直到乙醇蒸發(fā)殆盡，用適量無(wú)內(nèi)毒素的滅菌雙蒸水溶解質(zhì)粒DNA，并檢測(cè)質(zhì)粒的純度；16)紫外分光光度儀測(cè)定其純度及濃度，并將其濃度調(diào)整為lmg/ml，_20°C凍存?zhèn)溆谩?、陽(yáng)離子脂質(zhì)體制備1)將陽(yáng)離子脂質(zhì)體 D0TAP(D6182)按 1 1 的摩爾比加入 DOPE (Dioleylphosphat idyl-ethanolamine, Sigma P1223)中，然后溶解于氯仿和甲醇的混合物(氯仿和甲醇的體積比為3 1)。2)再將上述脂質(zhì)體混合物放入充滿氮?dú)獾膱A底燒瓶?jī)?nèi)的薄片上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后進(jìn)行真空干燥。3)經(jīng)上述過(guò)程制備的脂質(zhì)體放入5%的葡萄糖溶液中進(jìn)行水合，再次旋蒸。4)將旋蒸后液體進(jìn)行水浴超聲破碎直至完全增溶。5)再將制備的脂質(zhì)體通過(guò)聚碳酸酯膜進(jìn)行濾過(guò)，形成單層小囊泡形態(tài)。6)制備好的陽(yáng)離子脂質(zhì)體(濃度3mg/ml)保存在4°C的條件下備用。3、腫瘤全細(xì)胞疫苗的制備3.1細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)1)從液氮中取出裝有C6細(xì)胞的凍存管、迅速置于37°C恒溫水浴箱，使凍存管中的凍存物迅速融化；2)打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中；3) 1000rpm/min 離心 lOmin，棄去上清液；4)沉淀加10ml DMEM培養(yǎng)液，吹打均勻，離心1000rpm/min，IOmin,棄上清液；5)加入DMEM培養(yǎng)基，吹打均勻，接種與細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37°C培養(yǎng)，次日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。3. 2細(xì)胞傳代從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，吸去培養(yǎng)基后，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌2次，加入0. 25%的胰酶或0. 02 % EDTA消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓后，加入完全培養(yǎng)基終止消化，并吹打使細(xì)胞脫落分散，收集液體，1500rpm/min,離心3min，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基重懸，吹打均勻后分瓶培養(yǎng)。一般3-4天傳代1次。3. 3細(xì)胞保種1)胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集至離心管中。2) 1000rpm/min 離心 lOmin，棄上清液。3)沉淀加細(xì)胞保種液，計(jì)數(shù)，調(diào)整至5 X 106/ml左右。4)將懸液分至凍存管中，每管1ml。5)將凍存管口封嚴(yán)。6)貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。7)按下列順序緩慢降溫①室溫，②4°C (20min)，③冰箱冷凍室(30min)④低溫冰箱(Ih)，⑤氣態(tài)氮(30min)，⑥液氮。3. 4腫瘤細(xì)胞疫苗制備及方法1)取出對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基上清；2)用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌2次，加入0. 25%的胰酶或0. 02% EDTA消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓后，加入完全培養(yǎng)基終止消化，并吹打使細(xì)胞分散脫落收集液體，1500rpm, 離心3min，細(xì)胞沉淀用PBS重懸，細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)；3)再次離心后棄上清；4)細(xì)胞加入戊二醛IOml固定過(guò)夜；5)用PBS洗滌后離心，重復(fù)3次；6)用 IOmlPBS 重懸后置 37°C，5% CO2 孵箱 2h ；7)用PBS洗滌后離心，重復(fù)3次；8)重懸后細(xì)胞4°C保存。試驗(yàn)例1本發(fā)明藥物用于治療Wistar/Ce皮下腦膠質(zhì)瘤腫瘤模型1、模型建立及評(píng)
①Wistar雄性大鼠，每組12只，體重250g 士 20g ；②大鼠右后肢去毛，局部予以碘酒和75%酒精消毒；③用微量進(jìn)樣器將20 μ 1細(xì)胞懸液(含2Χ106個(gè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞)接種于大鼠右后肢皮下，制成C6膠質(zhì)瘤皮下模型；④術(shù)后前3天，每只大鼠每天給予青霉素10-20萬(wàn)U/只腹腔注射預(yù)防感染。⑤觀察大鼠生長(zhǎng)情況，體重變化、飲食、毛色、活動(dòng)情況及注射局部有無(wú)紅腫及包塊等。2、皮下膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型分組及治療腫瘤成瘤后(直徑大于5mm)，隨后將其隨機(jī)分成5組，即溶劑對(duì)照組(Control)、 脂質(zhì)體組(Liposome)，白介素15重組質(zhì)粒+脂質(zhì)體組(pORF-hIL-15+lipo)，全細(xì)胞瘤苗+ 脂質(zhì)體+空載質(zhì)粒組(TV+pORF+lipo)(簡(jiǎn)稱TV-ORF組)，聯(lián)合治療組即全細(xì)胞瘤苗+脂質(zhì)
13體+白介素15重組質(zhì)粒組(TV+pORF-hIL-15+lipo)(簡(jiǎn)稱TV+IL-15組)，每組12只。3、治療各組動(dòng)物成瘤后，分別予上述分組進(jìn)行干預(yù)，每3天治療1次，連續(xù)8次。4、皮下膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型觀察指標(biāo)①常規(guī)觀察每周測(cè)大鼠體重3次，每日定時(shí)觀察其意識(shí)、接觸反應(yīng)、運(yùn)動(dòng)缺陷、顱神經(jīng)損害及視覺(jué)反應(yīng)，有無(wú)偏癱和癲癇發(fā)作等。②皮下膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型體積檢測(cè)用游標(biāo)卡尺每3天檢測(cè)皮下腫瘤大小，測(cè)量出腫瘤的短徑(a)和最大徑(b)，根據(jù)公式計(jì)算各組的腫瘤體積皮下腫瘤體積=1/2X腫瘤短徑2X腫瘤長(zhǎng)徑(a2b/^)。將腫瘤體積均值與生長(zhǎng)時(shí)間的變化繪出生長(zhǎng)曲線。按公式[1_(治療組平均體積變化/對(duì)照組平均體積變化)]X 100 %，計(jì)算抑瘤率。③生存期觀察及標(biāo)本采集記錄各組大鼠的生存天數(shù)，用公式(治療組平均存活天數(shù)-對(duì)照組平均存活天數(shù))/對(duì)照組平均存活天數(shù)X 100%，計(jì)算延長(zhǎng)生存期。5、治療效果皮下接種大鼠55只，接種5-7天后，右后肢接種腫瘤處包塊隆起，為實(shí)體性包塊， 當(dāng)直徑大于0. 5cm時(shí)認(rèn)為建模成功，3只未見(jiàn)確切腫瘤，成瘤率為94. 5%，將其中50只建模成功者隨機(jī)分為5組予以相應(yīng)措施干預(yù)。腫瘤逐漸長(zhǎng)大，以后期為甚，大鼠右后肢皮下可見(jiàn)團(tuán)塊性腫瘤形成，大多瘤體隨瘤齡延長(zhǎng)其體積明顯增大。自15天開始，個(gè)別腫瘤開始變小， 大部分體積逐步增加，每次治療同時(shí)測(cè)一次腫瘤體積，治療結(jié)束后仍每3d檢測(cè)1次，直到腫瘤完全消失或者大鼠死亡。根據(jù)體積的檢查變化，可見(jiàn)各組體積均表現(xiàn)出增大的趨勢(shì)，以對(duì)照組和脂質(zhì)體組最為明顯。pORF-hIL-15組、TV+pORF組及聯(lián)合治療組體積增加趨勢(shì)變緩，以聯(lián)合組最為明顯，大部分腫瘤生長(zhǎng)受到抑制，部分腫瘤完全消失，至40d時(shí)，聯(lián)合組腫瘤均消失。其他各組腫瘤體積在同期逐漸變大，而部分腫瘤在干預(yù)結(jié)束后體積逐漸變小，而對(duì)照組也出現(xiàn)體積變小的趨勢(shì)。至60天時(shí)，各組腫瘤均完全消失(如圖1所示)。計(jì)算各組腫瘤平均體積大小并稱重，根據(jù)前述公式計(jì)算與Control組對(duì)比，聯(lián)合治療組(TV+IL-15)腫瘤的抑瘤率約為86%，明顯高于其余各組。試驗(yàn)例2本發(fā)明藥物用于治療Wistar/C6顱內(nèi)腫瘤1、模型建立及評(píng)估①接種前3d灌胃給予地塞米松10 μ g/g，降低免疫力，減少排斥反應(yīng)。②參照Paxinos和Watson的《大鼠腦立體定位圖譜》確定右尾狀核區(qū)靶點(diǎn)接種。 在大鼠腦立體定位儀上選取大鼠腦右側(cè)尾狀核區(qū)為靶點(diǎn)，其坐標(biāo)為前因中點(diǎn)前1. 0mm，矢狀縫右旁開3 3. 5mm,硬膜下4 5. 0mm。③大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3yl/g)后，固定于腦立體定向手術(shù)臺(tái) (DW-2000，中國(guó))，俯臥位，將上齒固定，保持氣道通暢，雙側(cè)耳桿固定。④以雙側(cè)內(nèi)珧連線與頭正中矢狀線交點(diǎn)向后Icm為切口，剪去頭頂部毛，碘酒、 75%酒精消毒，于選定切口向后縱向切開皮膚，暴露顱骨標(biāo)志，按上述坐標(biāo)點(diǎn)定位，用牙科鉆在露骨上鉆孔，孔徑1. 2mm，用25ul的微量注射器(Hamilton syringe)針頭銳性刺破硬膜在立體定向引導(dǎo)下接種針垂直緩慢延伸至硬膜下6. 0mm，上提(后延)1. Omm硬膜下5mm靶點(diǎn)處，將細(xì)胞懸液IX IO6個(gè)細(xì)胞以luL/min緩慢注入靶區(qū)(注射量為10 μ 1/只，速度不超過(guò)1 μ 1/min)，留針5-lOmin，使細(xì)胞充分沉積，避免返流(如為9L細(xì)胞，同樣為1 X IO6個(gè)腫瘤細(xì)胞重懸于10 μ IPBS中，1 μ 1/min)，注射完后留針3min，退出;3min。在注射過(guò)程中，密切觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的呼吸狀況，如果出現(xiàn)呼吸急促，嘆氣樣呼吸， 呼吸微弱等情況，需暫停注射。⑤緩慢拔針后，顱骨鉆孔處以骨蠟封閉，縫合頭皮，側(cè)臥，保溫，置于干燥環(huán)境。常規(guī)分籠飼養(yǎng)。⑥術(shù)后前3天，每只大白鼠每天給予青霉素10 20萬(wàn)U/只腹腔注射預(yù)防感染。 觀察大鼠生長(zhǎng)情況，體重變化、飲食及活動(dòng)情況等。手術(shù)后動(dòng)物保溫，觀察有無(wú)手術(shù)后死亡等。待麻醉清醒后，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。 手術(shù)后第10日進(jìn)行磁共振檢查，觀察顱內(nèi)腫瘤的成瘤情況、形態(tài)特征等。2、分組及治療經(jīng)過(guò)MRI檢測(cè)觀察成瘤后，去除成瘤不確切、體積過(guò)大及顱外有腫瘤生長(zhǎng)者， 選擇60只隨機(jī)分為5組，分組及干預(yù)方案同皮下膠質(zhì)瘤。即對(duì)照組，Liposome組， pORF-IL-15+lipo 組，TV+pORF+lipo 組，TV+pORF-IL-15+lipo。每組各 12 只。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果從手術(shù)后第8日開始，各組按照預(yù)定實(shí)驗(yàn)方案在皮下予以治療，以多點(diǎn)局部注射方式進(jìn)行，在進(jìn)行聯(lián)合治療時(shí)，先予以皮下注射全細(xì)胞膠質(zhì)瘤疫苗，后在疫苗周圍注射由脂質(zhì)體包裹的pORF-hIL-15，每3d注射一次，共注射8次。經(jīng)過(guò)治療干預(yù)后，第二次(治療后2w)MRI檢測(cè)時(shí)腫瘤體積仍呈總體增大的趨勢(shì)， 以對(duì)照組、脂質(zhì)體和IL-15組為甚，腫瘤體積明顯變大，平均體積為；而TV組和聯(lián)合組腫瘤體積增大較緩慢，部分腫瘤幾乎沒(méi)有變大，少部分腫瘤開始變小(圖幻。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)后兩組平均體積為較前三組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后兩者間間尚沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)過(guò)干預(yù)后，第二次(治療后2w)MRI檢測(cè)時(shí)腫瘤體積仍呈總體增大的趨勢(shì)，以對(duì)照組、脂質(zhì)體和IL-15組為甚，腫瘤體積明顯變大；而TV組和聯(lián)合組腫瘤體積增大較緩慢，特別是聯(lián)合組，部分腫瘤幾乎沒(méi)有變大，少部分腫瘤開始變小(圖幻。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)后兩組平均體積為較前三組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后兩者間聯(lián)合組TV+IL-15組效果明顯較 TV+pORF效果更佳。自接種后5w(治療后#，8次免疫已經(jīng)完成)，對(duì)照組僅存活2只，1只腫瘤已經(jīng)消失，1只腫瘤體積巨大。pORF-hIL-15+lipo、脂質(zhì)體組也大部分大鼠死亡，至35d時(shí)分別存活4只和2只；聯(lián)合組腫瘤體積明顯變小，大部分已消失，而TV組大鼠雖然體積增加緩慢， 但是大鼠死亡率較聯(lián)合組高，至60d時(shí)，聯(lián)合組有7只存活，腫瘤消失，而TV+pORF+lipo組僅剩3只，其余各組均剩下1只為死亡。計(jì)算各組生存率后得到生存曲線如下(圖4)。計(jì)算腫瘤的長(zhǎng)、寬、高，根據(jù)前述公式計(jì)算腫瘤抑瘤率，相對(duì)于溶劑對(duì)照組， TV+IL-15組的抑瘤率在第3w和第5w分別為72%和83%，最終TV+IL-15組治療的有效率為 58. 3%。試驗(yàn)例3本發(fā)明藥物用于治療F344/9L顱內(nèi)腫瘤1、建模及分組、干預(yù)同試驗(yàn)例22、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1)MRI影像學(xué)檢查結(jié)果因?yàn)槟[瘤破壞正常的血腦屏障，經(jīng)尾靜脈注射的Gd-BOPTA大量通過(guò)破壞的血腦屏障進(jìn)入組織間隙，形成影像上的造影劑濃聚區(qū)域，因此高信號(hào)區(qū)域可以認(rèn)為是腫瘤生長(zhǎng)的范圍。磁共振影像上腫瘤呈不規(guī)則圓形或類圓形，與周圍腦組織之間分界不清。在21及 35d的磁共振影像上，腫瘤體積繼續(xù)增大，以對(duì)照組和脂質(zhì)體組明顯。TV-ORF組和TV+IL-15 組腫瘤早期(術(shù)后21d前)生長(zhǎng)較緩慢，隨治療時(shí)間延長(zhǎng)，聯(lián)合治療組腫瘤部分開始出現(xiàn)變小，或者消失；而TV-ORF組組等對(duì)照組腫瘤體積均呈增大的趨勢(shì)(圖5)。與C6膠質(zhì)瘤不同，9L所致腫瘤出現(xiàn)瘤內(nèi)壞死的幾率低，常常為實(shí)體瘤，即便體積巨大時(shí)，瘤內(nèi)可見(jiàn)部分小是囊性壞死區(qū)，仍以實(shí)體性為主。2)顱內(nèi)F344/9L膠質(zhì)瘤干預(yù)后體積變化手術(shù)后第7d，通過(guò)磁共振證實(shí)大鼠顱內(nèi)腫瘤種植成功后，精確測(cè)量腫瘤的前后徑、左右徑及上下徑的最大值，數(shù)據(jù)精確到立方毫米，計(jì)算腫瘤體積(腫瘤容積= LXffXDX π /6，即長(zhǎng)X寬X深X π /6)。發(fā)現(xiàn)第一次檢測(cè)時(shí)平均體積在0. 5cm3左右，各組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)過(guò)干預(yù)后，腫瘤的體積變化類似Wistar/C6，第二次(治療后2周)MRI檢測(cè)時(shí)腫瘤體積仍呈總體增大的趨勢(shì)，以對(duì)照組、脂質(zhì)體和IL-15組為甚，腫瘤體積明顯變大；而 TV-ORF組和TV+IL-15組腫瘤體積增大較緩慢，部分腫瘤幾乎沒(méi)有變大，少部分腫瘤開始變小。較前三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后兩者間尚沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖6)。經(jīng)過(guò)不同干預(yù)后，對(duì)照組腫瘤體積逐步快速增大，而聯(lián)合組腫瘤體積增加緩慢，至后期腫瘤完全消失。3)顱內(nèi)F344/9L膠質(zhì)瘤干預(yù)后生存時(shí)間荷瘤大鼠大多數(shù)在接種后4 5w死亡(治療后#，8次免疫已經(jīng)完成)，對(duì)照組僅存活2只，MRI顯示腫瘤巨大，中線移位明顯，而聯(lián)合治療組腫瘤體積增加不明顯，大部分腫瘤體積開始變小，甚至完全消失，腫瘤的體積變化曲線見(jiàn)圖7。至40d時(shí)，對(duì)照組和脂質(zhì)體組大鼠全部死亡，而TV-ORF組和IL-15組也大部分死亡，TV+IL-15組腫瘤體積明顯變小，大部分已消失，至60d時(shí)，聯(lián)合組有7只存活，腫瘤消失，其余各組均死亡，由此描繪的大鼠生存曲線如下(圖7)。從圖9可知，各組荷瘤大鼠經(jīng)過(guò)治療后生存情況可見(jiàn)荷瘤大鼠大多在 3-5周內(nèi)死亡，聯(lián)合組經(jīng)治療后存活率可達(dá)近60%。根據(jù)前述公式計(jì)算腫瘤的抑瘤率，相對(duì)于對(duì)照組，TV+IL-15聯(lián)合組的抑瘤率在第 3w和第5w分別為66. 3%和63%，聯(lián)合組長(zhǎng)期存活為58. 3%0試驗(yàn)例4本發(fā)明藥物用于LL2小鼠肺癌1. LL2小鼠肺癌皮下荷瘤模型建立75%酒精消毒，用Iml皮試針將制備好的LL2腫瘤細(xì)胞懸液均勻接種于小鼠右后肢皮下，建立LL2肺癌皮下模型。2.動(dòng)物分組及免疫將健康C57小鼠隨機(jī)分成6組，每組5只A生理鹽水組皮下注射生理鹽水，100 μ 1/只；B脂質(zhì)體組皮下注射脂質(zhì)體，25 μ g/只，注射體積100 μ 1/只；C空載體組皮下注射按前述方法制備的未連接IL-15基因片段的pORF-lipo (空載)質(zhì)粒，10 μ g/只(單純pORF質(zhì)粒質(zhì)量)，注射體積100 μ 1/只；
D IL-15組皮下注射前述方法制備的IL-15-pORF-lipo質(zhì)粒，10 μ g/只(單純 IL-15-pORF質(zhì)粒質(zhì)量)，注射體積100 μ 1/只；E全細(xì)胞瘤苗組皮下注射前述方法制備的LL2全細(xì)胞瘤苗，106/只，注射體積 100 μ 1/ 只；F聯(lián)合免疫組皮下注射全細(xì)胞瘤苗，劑量方法同TV組，圍繞TV組皮下注射點(diǎn)周圍多點(diǎn)皮下注射IL-15-pORF-lipo質(zhì)粒，總劑量同IL-15組。免疫方案分別于第1周、第3周、第4周、第5周按上述方法及劑量免疫C57小鼠，并與設(shè)定時(shí)間采集小鼠血清。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果1)荷瘤小鼠一般情況免疫結(jié)束后第7天(DO)建立LL2肺癌皮下模型，接種后12天(D12)開始，聯(lián)合免疫組小鼠進(jìn)食飲水明顯多于其它組小鼠，全細(xì)胞瘤苗組次之，IL-15組再次，精神狀況及活動(dòng)情況各組均無(wú)明顯異常。接種后第15天(DK)開始，除聯(lián)合免疫組小鼠外各組小鼠均開始出現(xiàn)進(jìn)行性的進(jìn)食及活動(dòng)減少，伴體重減輕、精神不振、皮毛粗糙。2)LL2皮下腫瘤生長(zhǎng)接種后8天(D8)開始觸及右后肢皮下米粒大小團(tuán)塊形成，大多數(shù)瘤體隨瘤齡延長(zhǎng)而體積明顯增大，質(zhì)韌、可推動(dòng)。根據(jù)前述公式計(jì)算腫瘤抑瘤率，聯(lián)合免疫組相對(duì)生理鹽水對(duì)照組的抑瘤率在接種后15天最大，達(dá)93. 02% (圖8)。3)荷瘤小鼠生存情況聯(lián)合免疫組小鼠生存情況明顯優(yōu)于其它5組。接種后21天開始出現(xiàn)對(duì)照組小鼠死亡，到接種后45天，聯(lián)合免疫組和全細(xì)胞瘤苗組各存活2只，其余組小鼠全部死亡，其中聯(lián)合免疫組存活的兩只小鼠腫瘤體積不超過(guò)2500mm3，至接種后60天觀察結(jié)束時(shí)仍帶瘤存活(圖9)。4)聯(lián)合免疫對(duì)小鼠細(xì)胞免疫的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生理鹽水組、脂質(zhì)體組和空載體組殺傷效應(yīng)均小于15%，IL-15 組、全細(xì)胞瘤苗組及聯(lián)合免疫組抑制率升高，其中聯(lián)合免疫組升高最為明顯，且在效靶比為 1 100時(shí)達(dá)到最大的58. 17%。5)聯(lián)合免疫對(duì)小鼠體液免疫的影響以LL2細(xì)胞為包被抗原，檢測(cè)小鼠血清中LL2全細(xì)胞瘤苗抗體的含量，通過(guò)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可了解聯(lián)合免疫對(duì)小鼠體液免疫的影響。圖示不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清LL2全細(xì)胞瘤苗抗體表達(dá)量的差異，免疫后聯(lián)合免疫組和全細(xì)胞瘤苗組血清中的LL2瘤苗抗體表達(dá)量明顯增高，且聯(lián)合免疫組抗體表達(dá)量增高更為顯著。而IL-15基因疫苗組和其余對(duì)照組免疫前后抗體表達(dá)量改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。6)免疫組化結(jié)果選擇了⑶4、⑶8、⑶24、⑶57抗體分別作為CD4+的T細(xì)胞、CD8+的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞的標(biāo)志物，對(duì)各組小鼠腫瘤組織進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)。結(jié)果顯示，IL-15組腫瘤中⑶57、⑶8有較多表達(dá)，⑶4和⑶對(duì)相對(duì)表達(dá)較少，而全細(xì)胞瘤苗組的⑶4、⑶8和⑶對(duì)都有較多表達(dá)，CD57相對(duì)表達(dá)較少。全細(xì)胞瘤苗聯(lián)合IL-15組的小鼠腫瘤中各標(biāo)記物均明顯表達(dá)增多，且均多于單獨(dú)全細(xì)胞瘤苗組或IL-15組。余組偶見(jiàn)少量非特異性染色，上述各
17標(biāo)記物均未見(jiàn)明顯陽(yáng)性征。 綜上，經(jīng)過(guò)相應(yīng)干預(yù)后，TV-ORF組、p0RF-hIL_15和TV+IL-15聯(lián)合組通過(guò)激活淋巴細(xì)胞CTL作用和NK細(xì)胞及體液免疫參與抗瘤治療，而聯(lián)合組顯示了更強(qiáng)的抗瘤效應(yīng)。35d 時(shí)皮下腫瘤抑制率達(dá)到86%，顱內(nèi)為81% (C6/ffistar)和79% (9L/F344)；聯(lián)合治療組生存期延長(zhǎng)，部分治療后腫瘤消失；血清學(xué)分析顯示腫瘤TNF- α、IFN- y、IL-12、IL_6、IL-15 等明顯升高，抗膠質(zhì)瘤抗原的抗體滴度增加。CTL顯示聯(lián)合組明顯高于其他組，4h時(shí)細(xì)胞死亡約40%;淋巴細(xì)胞流式表型分析發(fā)現(xiàn)⑶4+、⑶8+細(xì)胞在聯(lián)合組相應(yīng)增多，⑶47⑶8+比值約為3，明顯超過(guò)正常值；免疫組化顯示⑶4+、⑶8+和⑶56抗體在瘤周及瘤內(nèi)明顯增多，說(shuō)明細(xì)胞免疫在腦膠質(zhì)瘤免疫治療中占有主導(dǎo)性地位，VEGF等表達(dá)和MVD在聯(lián)合組明顯降低， 可能同時(shí)抑制了腫瘤血管生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞增殖。總之，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)采用滅活腫瘤全細(xì)胞瘤苗、脂質(zhì)體包裹IL-15質(zhì)粒局部多點(diǎn)注射后，機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫均被激活，CD4+、 CDS+T細(xì)胞和NK細(xì)胞被激活，荷瘤大鼠針對(duì)膠質(zhì)瘤抗原的抗體IgG滴度增高，可直接通過(guò)細(xì)胞毒效應(yīng)和/體液免疫方式參與免疫過(guò)程，能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，甚至部分被治愈，有效提高了抗瘤效果，延長(zhǎng)了生存期。
權(quán)利要求
1.預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于包括如下組分腫瘤全細(xì)胞疫苗、陽(yáng)離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15的重組質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗為滅活的具有特異性和主動(dòng)性激發(fā)生物體主動(dòng)免疫機(jī)能的腫瘤細(xì)胞疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗包含至少一種能激活生物體特異性抗腫瘤T淋巴細(xì)胞的活性成分；其中，所述的活性成分為蛋白質(zhì)、多肽、脂類、蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物、DNA分子、RNA分子、腫瘤相關(guān)抗原、特異性腫瘤抗原中至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗由下述方法制備而成腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞滅活至細(xì)胞增殖活性被抑制；其中，所述的腫瘤細(xì)胞為能特異性的誘導(dǎo)、激活機(jī)體主動(dòng)免疫，增強(qiáng)生物體預(yù)防腫瘤和抗腫瘤免疫的自體細(xì)胞、同源細(xì)胞系細(xì)胞或具有交叉抗原的異體腫瘤細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于所述的腫瘤細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、食道癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞中至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于細(xì)胞滅活的方法為微波細(xì)胞滅活法，電磁波細(xì)胞滅活法，激光細(xì)胞滅活法，高溫細(xì)胞滅活法，超聲破碎細(xì)胞滅活法，反復(fù)細(xì)胞凍融、勻漿、離心、沉淀細(xì)胞滅活法，酶學(xué)消化細(xì)胞滅活法中至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于 所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)體為DOTAP、DOTMA、DOSPA、DOGS中至少一種；陽(yáng)離子脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒DNA的重量配比為1 15 1，所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒DNA的重量配比優(yōu)選為3 1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7任一項(xiàng)所述的治療或預(yù)防腫瘤的藥物，其特征在于所述的 IL-15重組質(zhì)粒DNA包括1)、根據(jù)編碼IL-15的基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA；或2)、根據(jù)編碼IL-15的基因序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸且具有 IL-15基因功能的基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA ；或3)、在生物體內(nèi)被吸收轉(zhuǎn)染后能分泌具有IL-15生物活性的質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8任一項(xiàng)所述的治療或預(yù)防腫瘤的藥物，其特征在于所述的治療或預(yù)防腫瘤的藥物的制劑為試劑盒，其包括包裝在空間獨(dú)立的制劑單元中的順序給藥的腫瘤全細(xì)胞疫苗、陽(yáng)離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15的重組質(zhì)粒。
10.權(quán)利要求1 9任一項(xiàng)所述的藥物在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物中的用途。
11.更具權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于所述藥物中的腫瘤全細(xì)胞疫苗皮下注射腫瘤疫苗數(shù)目為IXlO5 IXlO8個(gè)/次。
12.制備腫瘤全細(xì)胞疫苗的方法，其特征在于包括如下步驟a、取腫瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶或EDTA消化、分離，得到細(xì)胞沉淀；b、a步驟所得細(xì)胞沉淀滅活至細(xì)胞增殖活性被抑制。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備腫瘤全細(xì)胞疫苗的方法，其特征在于a步驟中所述的腫瘤細(xì)胞的來(lái)源為腫瘤細(xì)胞株或細(xì)胞系，或來(lái)源于生物體的腫瘤組織；其中，當(dāng)腫瘤細(xì)胞的來(lái)源為腫瘤細(xì)胞株或細(xì)胞系時(shí)，按如下方法準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞取狀態(tài)良好、 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代，達(dá)到所需細(xì)胞數(shù)后進(jìn)入腫瘤全細(xì)胞疫苗制備程序；當(dāng)腫瘤細(xì)胞的來(lái)源為生物體的腫瘤組織時(shí)，按如下方法準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞在無(wú)菌條件下取腫瘤新鮮、血供好的未壞死部分，放入盛有含小?；蛱ヅＱ宓腄MEM/F12中在4°C下保存，用含青霉素、鏈霉素的PBS溶液清洗，通過(guò)酶消化法、差速貼壁法或差速消化法分離得到純化的腫瘤細(xì)胞，將純化的腫瘤細(xì)胞移入含小?；蛱ヅＱ宓腄MEM等培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，然后放入37°C，5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 3d后，細(xì)胞鋪滿瓶底80 90 %時(shí)傳代，達(dá)到所需細(xì)胞數(shù)后進(jìn)入腫瘤全細(xì)胞疫苗制備程序。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的制備腫瘤全細(xì)胞疫苗的方法，其特征在于所述a步驟采用下述方法進(jìn)行分離取腫瘤細(xì)胞，加質(zhì)量濃度為0. 25%的胰酶或質(zhì)量濃度為0. 02%的EDTA消化至細(xì)胞收縮變圓后加入含10%血清的常規(guī)培養(yǎng)基終止消化，并吹打使細(xì)胞分散脫落，收集液體，離心，棄上清液，得到細(xì)胞沉淀；所述b步驟中采用下述方法進(jìn)行細(xì)胞滅活微波細(xì)胞滅活法，電磁波細(xì)胞滅活法，激光細(xì)胞滅活法，高溫細(xì)胞滅活法，超聲破碎細(xì)胞滅活法，反復(fù)細(xì)胞凍融、勻漿、離心、沉淀細(xì)胞滅活法，酶學(xué)消化細(xì)胞滅活法中至少一種。
15.根據(jù)權(quán)利要求12 14任一項(xiàng)所述的制備腫瘤全細(xì)胞疫苗的方法，其特征在于b 步驟中采用下述方法進(jìn)行細(xì)胞滅活a步驟所得細(xì)胞沉淀用重懸溶液重懸，離心后棄上清液，加入質(zhì)量濃度為1 %的戊二醛固定7-8h，然后用相應(yīng)的重懸溶液洗滌，離心，所得細(xì)胞沉淀再次重懸后于5% C02，37°C的培養(yǎng)箱中放置1. 5 2. 5h，然后再用相應(yīng)的重懸溶液洗滌，離心，重復(fù)3次，重懸后即得細(xì)胞疫苗，保存?zhèn)溆?；其中，所述的重懸溶液為生理鹽水NS 或磷酸鹽PBS緩沖液。
16.由權(quán)利要求12 15任一項(xiàng)所述的方法制備的腫瘤全細(xì)胞疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防腫瘤的藥物、腫瘤全細(xì)胞疫苗及其制備方法和用途，屬于生物工程領(lǐng)域和生物免疫學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種治療或預(yù)防腫瘤的效果較好的藥物和腫瘤全細(xì)胞疫苗。本發(fā)明藥物包含腫瘤全細(xì)胞疫苗、陽(yáng)離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15基因的重組質(zhì)粒。本發(fā)明藥物具有腫瘤預(yù)防免疫和抗腫瘤免疫治療的雙重作用，其作用持久，治療或預(yù)防腫瘤的效果顯著。
文檔編號(hào)A61K39/39GK102343086SQ20111014237
公開日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者仝愛(ài)平, 吳揚(yáng), 周良學(xué), 郭剛, 陳曦, 魏于全 申請(qǐng)人:四川大學(xué)