乳腺癌干細胞疫苗及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種腫瘤干細胞疫苗及其制備和應用。本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗包括：按體積比為3:1:1混合的滅活的乳腺癌干細胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法，包括以下步驟：獲得乳腺癌干細胞；將所述乳腺癌干細胞滅活；以及將滅活的乳腺癌干細胞凍融在生理鹽水里，與佐劑甘露聚糖肽、脂肪乳混勻，從而獲得所述的乳腺癌干細胞疫苗。本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法獲得的乳腺癌干細胞疫苗用于制備治療乳腺癌的藥物中的用途。本發(fā)明為乳腺癌的治療及其疫苗的制備提供了一種新的途徑，對乳腺癌患者具有積極地治療效果，可增強患者的免疫功能，對延長患者的生存時間具有積極作用。
【專利說明】乳腺癌干細胞疫苗及其制備方法與應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術，涉及一種腫瘤干細胞疫苗及其制備和應用。

【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是一種全身性的慢性疾病。在中晚期患者體內(nèi)，不僅臟器中有影像學檢 查時明顯的團塊腫瘤,在外周血中更有大量看不見的循環(huán)腫瘤細胞和腫瘤干細胞（Cancer stem cell，CSC)，隨時準備定居在機體易感部位，發(fā)育成新的轉移灶，這也是腫瘤無法根治 的原因。傳統(tǒng)的腫瘤治療包括4種主要療法，即手術、化療、放療和免疫治療。通常前三種療 法治療3-5年后，腫瘤都會發(fā)生周邊臟器或遠端臟器的轉移。隨著對CSC研究的深入，人們 已經(jīng)明確復發(fā)和轉移的原因不是手術做得不徹底，而是由于缺乏有效的控制、甚至消滅CSC 的方法。
[0003] CSC來自人類自體干細胞的惡變，具有低分化度和高擴增性等特點。這些干細胞可 抵抗幾乎全部的傳統(tǒng)化療藥物及放療，可在傳統(tǒng)治療的同時即引起腫瘤乳腺復發(fā)和轉移。 這種現(xiàn)象對于很多免疫治療也不例外，原因是過去一直使用成熟腫瘤細胞作為抗原供免疫 細胞識別，而CSC不表達這些抗原，可逃避免疫攻擊。所以，腫瘤的免疫治療急需更新觀念， 將治療的主攻方向從成熟腫瘤細胞轉變?yōu)镃SC。
[0004] 目前國際公認的成熟的尋找CSC的方法是利用ALDEFLUOR/ALDH在人類腫瘤中尋 找。ALDH是所有干細胞中共有的一種酶，在腫瘤干細胞中高或強表達，而在普通干細胞中弱 或無表達。
[0005] 目前，為了獲得腫瘤干細胞（CSC)，人們常通過大量培養(yǎng)普通的腫瘤細胞系，由單 瓶消化擴增至多瓶，再提取出其內(nèi)的腫瘤干細胞。采用這種方法，其存在很多弊端：獲取的 腫瘤干細胞數(shù)量有限，普通腫瘤細胞培養(yǎng)花費的人力與財力頗大，長期大量培養(yǎng)各種腫瘤 細胞會需要很多培養(yǎng)試劑、配置專人、容易污染致死，甚至出錯；腫瘤干細胞培養(yǎng)存活率低； 培養(yǎng)普通腫瘤細胞因培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)箱空間有限，獲得的細胞數(shù)量也就不多，從中再抽取腫 瘤干細胞，得到的腫瘤干細胞量就更少，遠無法滿足需求。因此，開發(fā)一種操作簡單、快捷的 有助于獲取高產(chǎn)量的腫瘤干細胞（CSC)的制備方法也是非常有必要的。
[0006] 近年來，已經(jīng)有關于腫瘤干細胞疫苗具有抗腫瘤療效的報道，理論上滅活的腫瘤 干細胞可被直接作為疫苗，但是臨床上的療效很不理想，因此有必要研究和開發(fā)適合于臨 床應用的腫瘤干細胞疫苗。
[0007] 乳腺癌是一種發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤。全世界每年約有120萬婦女患 乳腺癌，在西歐、北美等發(fā)達國家，乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤首位。相關資料顯示，西方 婦女乳腺癌的發(fā)病人數(shù)高峰期為50?55歲，而且隨著年齡的增長，發(fā)病率也不斷提高。與 發(fā)達國家相比，中國雖屬乳腺癌的低發(fā)區(qū)，卻是乳腺癌發(fā)病率增長最快的國家。乳腺癌具有 侵襲性和難治愈的特點，治療后仍有可能復發(fā)或轉移。而其起源、復發(fā)與轉移的真正原因 可能是存在于乳腺癌內(nèi)極少數(shù)具有干細胞的自我更新能力和多向分化潛能的細胞群，即乳 腺癌干細胞，這些細胞具有化療、放療及缺氧抵抗性，同時具有高致瘤性、高侵襲轉移性，在 乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展乃至轉移、復發(fā)中起著極其重要作用。然而，放療和化療對存在于腫 瘤中數(shù)量較少的干細胞樣細胞群療效甚微，經(jīng)過治療后殘存的乳腺癌干細胞的增殖足以促 使乳腺癌復發(fā)和轉移之一。目前尚缺乏有效的乳腺癌干細胞疫苗，本領域技術人員在這方 面亟待取得突破。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的第一個方面是提供一種乳腺癌干細胞疫苗，對乳腺癌患者具有積極地治 療效果，可增強患者的免疫功能。
[0009] 本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗包括：按體積比為3:1:1混合的滅活的乳腺癌干 細胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。
[0010] 本發(fā)明的第二個方面提供一種乳腺癌干細胞疫苗的制備方法，可實現(xiàn)簡單、快捷 地獲取高產(chǎn)量、易于質量控制的乳腺癌干細胞，并制備出臨床上有效的乳腺癌干細胞疫苗。 [0011] 本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法，包括以下步驟：獲得乳腺癌干細胞； 將所述乳腺癌干細胞滅活；將滅活的乳腺癌干細胞凍融在生理鹽水里，與佐劑甘露聚糖肽、 脂肪乳混勻，從而獲得所述的乳腺癌干細胞疫苗。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法的進一步特征，所述滅活包括： 將乳腺癌干細胞由-80°c至20°C反復凍融五次致死。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法的進一步特征，所述乳腺癌干細 胞、甘露聚糖肽和脂肪乳的混合比例為3:1:1 (體積比）。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法的進一步特征，所述的乳腺癌干 細胞是⑶133陽性乳腺癌干細胞。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法的進一步特征，所述的CD133陽 性乳腺癌干細胞是通過以下步驟制備的：
[0016] A.將液氮或_80°C保存的乳腺癌細胞于37°C水浴，快速溶化；
[0017] B.用8. Oml的含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基混勻已融化的乳腺癌細胞懸液，于 1500轉/分，離心8分鐘；
[0018] C.棄上清，再吸取8. Oml培養(yǎng)基質混勻細胞沉淀，再1500轉/分，離心8分鐘，棄 上清，細胞沉淀用I. Oml培養(yǎng)基混勻，備用；
[0019] D.另取一個75cm2方瓶，加入14. Oml培養(yǎng)基質，將I. Oml上述制備的含乳腺癌細 胞懸液加入此方瓶中，于37°C，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)；
[0020] E.乳腺癌細胞呈貼壁生長，經(jīng)過3-4天，乳腺癌細胞生長至80%-95%單層時，棄 上清，用0. 5mM的EDTA，處理乳腺癌細胞大約3-5分鐘，用倒置顯微鏡觀察，當90 %的乳腺 癌細胞變圓時，即可用彎管吹打并將消化的細胞轉移到15ml離心管中，于1500轉/分下， 離心8分鐘，棄上清，計數(shù)，若細胞數(shù)不足，擴增至三個培養(yǎng)瓶，繼續(xù)消化離心；
[0021] F.加入緩沖液重懸細胞，采用⑶133免疫磁珠分選系統(tǒng)從細胞液中分選出⑶133 陽性乳腺癌干細胞；
[0022] G.將前一步驟獲得的⑶133陽性乳腺癌干細胞在DMEM/F12培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)；
[0023] H. 37°C、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)5-7天，從而獲得足夠用于制備乳腺癌干細胞疫苗 的⑶133陽性乳腺癌干細胞。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法的進一步特征，所述步驟E中， 在加入EDTA的同時加入0. 25%胰酶I. Oml以消化腫瘤細胞。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法的進一步特征，所述步驟G中， 在DMEM/F12培養(yǎng)液中添加：生長因子rhEGF 15?25ng/ml、rhbFGF 5?15ng/ml、硫酸乳腺 素2?6ug/ml、胎牛血清0· 1?0.2% (質量百分比）和青霉素-鏈霉素雙抗0.5?1.5% (質量百分比）。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法的進一步特征，所述步驟H中， 所述足夠用于制備乳腺癌干細胞疫苗的CD133陽性乳腺癌干細胞是培養(yǎng)至細胞個數(shù)達到 IXlO5?5X105/ml的CD133陽性乳腺癌干細胞。
[0027] 本發(fā)明的第三個方面提供了根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法獲得的乳腺癌干細胞疫 苗用于制備治療乳腺癌的藥物中的用途。
[0028] 本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗劑及其制備方法具有以下特點和優(yōu)點：
[0029] (1)本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗中含有藥學上可接受的佐劑甘露聚糖肽，能 誘導體內(nèi)潛在的DC，進而增強攝取抗原能力，提升機體免疫功能；提升機體外周白細胞，增 強機體防御能力。
[0030] (2)本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗中含有藥學上可接受的佐劑脂肪乳，起到緩 釋作用，讓疫苗緩慢被吸收，延長疫苗作用的時間，增強療效。
[0031] (3)本發(fā)明所述的乳腺癌干細胞疫苗中，乳腺癌干細胞與佐劑甘露聚糖肽和脂肪 乳的比例關系是優(yōu)選的結果，例如，當臨床皮下注射需求量為0.5ml時，取乳腺癌干細胞 0.3ml、甘露聚糖肽和脂肪乳各0. lml，然后混勻。這樣的比例能保證腫瘤干細胞濃度適中， 過濃會影響吸收，過稀則影響藥效；同時〇. 5ml的皮下注射量也在循證醫(yī)學允許的皮下注 射范圍內(nèi)（皮下注射量小于lml)。
[0032] (4)本發(fā)明將未老化的腫瘤細胞經(jīng)過消化復蘇培養(yǎng)、免疫磁珠分選來獲得單個的 CD133陽性腫瘤干細胞CSC，具有操作簡便、易于質控、獲得的乳腺癌干細胞陽性率高的特 點。
[0033] (5)本發(fā)明為乳腺癌的治療及其疫苗的制備提供了一種新的途徑，本發(fā)明所述的 疫苗對乳腺癌患者具有積極地治療效果，可增強患者的免疫功能，對延長患者的生存時間 具有積極作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖IA為本發(fā)明所述方法得到的乳腺癌干細胞陽性率檢測結果。
[0035] 圖IB為采用現(xiàn)有方法制備乳腺癌干細胞的陽性率檢測結果。
[0036] 圖2是采用本發(fā)明所述方法制備得到的乳腺癌干細胞疫苗的治療組和對照組的 生存時間曲線圖。
[0037] 圖3為注射乳腺癌干細胞疫苗后體液免疫應答的結果比較。

【具體實施方式】
[0038] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步說明。
[0039] 本文中，所述的腫瘤細胞是指傳代2-3次的未老化腫瘤細胞。
[0040] 本文中所使用的所有專業(yè)與科學用語若未做特別說明，均與本領域技術人員所熟 悉的意義相同。本文中涉及的甘露聚糖肽及脂肪乳其獲得是通過正規(guī)醫(yī)院購買得到的， CD133免疫磁珠分選系統(tǒng)進行細胞分選的技術也是本【技術領域】的現(xiàn)有技術，具體可以采用 CD 133免疫磁珠分離試劑盒進行分選。
[0041] 實施例1 :乳腺癌干細胞疫苗的制備
[0042] 本實施例是以液氮中儲存的乳腺癌細胞為原料來制備乳腺癌干細胞疫苗。
[0043] 1.將液氮或_80°C保存的乳腺癌導管細胞HCC1937于37°C水浴，快速溶化；
[0044] 2.用8. Oml培養(yǎng)基（RPMI1640+10 % FBS)混勻已融化的腫瘤細胞懸液，于1500轉 /分，離心8分鐘；
[0045] 3.棄上清，再吸取8. Oml培養(yǎng)基質混勻細胞沉淀，再1500轉/分，離心8分鐘，棄 上清，細胞沉淀用I. Oml培養(yǎng)基混勻，備用；
[0046] 4.另取一個75cm2方瓶，加入14.0ml培養(yǎng)基質，將上述制備的含腫瘤細胞懸液 (LOml)加入此方瓶中，于37°C，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)；
[0047] 5.腫瘤細胞呈貼壁生長，經(jīng)過3-4天，腫瘤細胞生長至80%-95%單層時，棄上清， 用0. 5mM的EDTA (難消化的腫瘤細胞用0. 25 %胰酶I. Oml)，處理腫瘤細胞大約3-5分鐘，用 倒置顯微鏡觀察，當90%的腫瘤細胞變圓時，即可用彎管吹打并將消化的細胞轉移到15ml 離心管中，于1500轉/分下，離心8分鐘，棄上清；
[0048] 6.向步驟（5)加入緩沖液重懸細胞，采用⑶133免疫磁珠分選系統(tǒng)從細胞液中分 選出CD133陽性腫瘤干細胞，按照每IO 7個細胞加入60ul緩沖液的量向其中加入緩沖液重 懸形成細胞液。所用緩沖液為PBS緩沖液，其中含有0. 5% BSA，2mM EDTA，pH為7. 2(文中 出現(xiàn)的緩沖液，若為特別說明，均采用該緩沖液）。
[0049] 7.采用CD133免疫磁珠分選系統(tǒng)從細胞液中分選出CD133陽性干細胞，免疫磁珠 分選系統(tǒng)是本【技術領域】的現(xiàn)有技術，采用CD133免疫磁珠分離試劑盒進行分選，可按照試 劑盒的操作說明進行，具體可參照如下步驟進行：
[0050] 7. 1向步驟（6)獲得的細胞液中加入20ul受體阻斷劑FcR/107細胞，再向其中加 入20ul CD133磁珠/IO7細胞；
[0051] 7. 2混勻后，在2-8°C冰箱內(nèi)孵育15分鐘，期間不停輕搖；
[0052] 7. 3 按每 IO7 個細胞加入 l-2ml PBS 緩沖液（含 0· 5% BSA，2mM EDTA，ρΗ7· 2)進 行清洗，以IOOOrpm離心5min，棄上清；
[0053] 7. 4離心后，向其中加入500ul Buffer重懸細胞，備用，以便進入分離階段；
[0054] 7. 5預先將LS分離柱與分選器（分選磁鐵）相匹配連接好；
[0055] 7. 6準備好沖洗的buffer液，其中MS柱：500ul，LS柱3ml ;
[0056] 7. 7加細胞懸液入LS柱，非標記的細胞（⑶133陰性細胞）自動流下；
[0057] 7. 8清洗柱子后，移去柱子，并將柱子固定在適合的收集管上；
[0058] 7. 9向柱子中加入buffer液進行洗柱，以沖去標記的細胞，收集洗液即得⑶133陽 性干細胞。
[0059] 8.⑶133陽性干細胞（CSC)培養(yǎng)：將步驟（7)獲得的⑶133陽性干細胞在DMEM/ F12培養(yǎng)液中進行成團培養(yǎng)，其中，所述DMEM/F12培養(yǎng)液中添加有生長因子rhEGF 20ng/ ml、rhbFGF 10ng/ml、硫酸乳腺素4ug/ml、胎牛血清0. 15% (質量）、青霉素-鏈霉素雙抗 1% (質量）；
[0060] 9.步驟（8)中的干細胞培養(yǎng)至一定數(shù)目（IXlO5?5X105)后反復凍融，按照陽 性干細胞、甘露聚糖肽及脂肪乳按體積比為3:1:1的量混勻，得到腫瘤干細胞疫苗。
[0061] 經(jīng)步驟（1)?（7)后獲得的乳腺癌干細胞，將其培養(yǎng)至一定數(shù)量后，取IO6個細胞 上樣，通過流式細胞儀檢測其干細胞的陽性率，結果如圖IA所示。而采用傳統(tǒng)的腫瘤細胞 培養(yǎng)，其獲得的結果如圖IB所示。
[0062] 圖IB的結果具體是這樣獲得的：乳腺癌導管細胞HCC1937(含CSC)，經(jīng)復蘇后，力口 RPMI1640液與10% FBS培養(yǎng)擴增，至一定數(shù)量后，抽提出CSC，取IO6個細胞上樣，得到流式 圖1B。
[0063] 由圖1A、圖IB可以看出，本實施例的方法獲得的腫瘤干細胞產(chǎn)量更高，而且陽性 率更高，達到90%。
[0064] 實施例2 :注射乳腺癌干細胞疫苗后的療效觀察
[0065] 將實施例1制得乳腺癌干細胞疫苗應用于乳腺癌患者的治療，其詳細實驗過程如 下：隨機抽取30名乳腺癌患者，分為兩組，其中15名接受實施例1制得的疫苗注射治療，作 為治療組；另15人不做疫苗處理，作為對照組。注射患者前抽取每個患者5ml血，檢測外周 血淋巴細胞數(shù)目（T BNK檢測試劑盒）和淋巴細胞功能（6colour T BNK With Trucount檢 測試劑盒），經(jīng)流式細胞儀檢測得出報告單。治療組的患者，通過皮下向乳腺癌患者體內(nèi)輸 入疫苗劑量500ul，間隔一周后，再次注射一次，即每個療程周期是14天，隔周注射一次；治 療組的患者不進行化療、放療及其他免疫治療。對照組的患者進行常規(guī)化療、放療及其他免 疫治療。在15天時，再次抽取每位患者5ml血，再次檢測外周血淋巴細胞數(shù)目，與兩周前對 t匕，結果如下表1、表2所示。表1為治療組在注射疫苗前（0天）與注射疫苗后（14天）， 淋巴細胞檢測結果的統(tǒng)計；表2為未注射疫苗與注射疫苗后6-8天、12-14天CD3+(總體細 胞），CD4+(輔助性T細胞），CD4+CD8+(殺傷性T細胞）分別占總淋巴細胞數(shù)的比率。
[0066] 表1 :為治療組在注射疫苗前（0天）與注射疫苗后（14天）
[0067]

【權利要求】
1. 一種乳腺癌干細胞疫苗，其特征在于，包括：按體積比為3:1:1混合的滅活的乳腺癌 干細胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。
2. -種乳腺癌干細胞疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 獲得乳腺癌干細胞； 將所述乳腺癌干細胞滅活；以及 將滅活的乳腺癌干細胞凍融在生理鹽水里，與佐劑甘露聚糖肽、脂肪乳混勻，從而獲得 所述的乳腺癌干細胞疫苗。
3. 根據(jù)權利要求2所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述滅活包括： 將乳腺癌干細胞由-80°C至20°C反復凍融五次致死。
4. 根據(jù)權利要求2所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法，其特征在于：所述乳腺癌干 細胞、甘露聚糖肽和脂肪乳的混合比例為3:1:1 (體積比）。
5. 根據(jù)權利要求2所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法，其特征在于：所述的乳腺癌 干細胞是⑶133陽性乳腺癌干細胞。
6. 根據(jù)權利要求5所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述的CD133陽 性乳腺癌干細胞是通過以下步驟制備的： A. 將液氮或_80°C保存的乳腺癌細胞于37°C水浴，快速溶化； B. 用8. Oml的含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基混勻已融化的乳腺癌細胞懸液，于1500 轉/分，離心8分鐘； C. 棄上清，再吸取8. 0ml培養(yǎng)基質混勻細胞沉淀，再1500轉/分，離心8分鐘，棄上清， 細胞沉淀用1. 〇ml培養(yǎng)基混勻，備用； D. 另取一個75cm2方瓶，加入14. 0ml培養(yǎng)基質，將1. 0ml上述制備的含乳腺癌細胞懸 液加入此方瓶中，于37°C，5% 0)2孵育箱中培養(yǎng)； E. 乳腺癌細胞呈貼壁生長，經(jīng)過3-4天，乳腺癌細胞生長至80%-95%單層時，棄上清， 用0. 5mM的EDTA，處理乳腺癌細胞大約3-5分鐘，用倒置顯微鏡觀察，當90%的乳腺癌細胞 變圓時，即可用彎管吹打并將消化的細胞轉移到15ml離心管中，于1500轉/分下，離心8 分鐘，棄上清，計數(shù)，若細胞數(shù)不足，擴增至三個培養(yǎng)瓶，繼續(xù)消化離心； F. 加入緩沖液重懸細胞，采用CD133免疫磁珠分選系統(tǒng)從細胞液中分選出CD133陽性 乳腺癌干細胞； G. 將前一步驟獲得的CD133陽性乳腺癌干細胞在DMEM/F12培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)； H. 37°C、5% C02孵育箱中培養(yǎng)5-7天，從而獲得足夠用于制備乳腺癌干細胞疫苗的 ⑶133陽性乳腺癌干細胞。
7. 根據(jù)權利要求6所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟E中， 在加入EDTA的同時加入0. 25%胰酶1. 0ml以消化腫瘤細胞。
8. 根據(jù)權利要求6所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟G中， 在DMEM/F12培養(yǎng)液中添加：生長因子rhEGF 15?25ng/ml、rhbFGF 5?15ng/ml、硫酸乳腺 素2?6ug/ml、胎牛血清0· 1?0.2% (質量百分比）和青霉素-鏈霉素雙抗0.5?1.5% (質量百分比）。
9. 根據(jù)權利要求6所述的乳腺癌干細胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟Η中， 所述足夠用于制備乳腺癌干細胞疫苗的CD133陽性乳腺癌干細胞是培養(yǎng)至細胞個數(shù)達到 1X105?5X105/ml的CD133陽性乳腺癌干細胞。
10.根據(jù)權利要求2至9之一所述的制備方法獲得的乳腺癌干細胞疫苗用于制備治療 乳腺癌的藥物中的用途。
【文檔編號】C12N5/095GK104225592SQ201410502867
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權日:2014年9月26日
【發(fā)明者】陳繼冰, 林茂, 左建生, 劉建國, 徐克成, 牛立志 申請人:廣州復大醫(yī)療股份有限公司復大腫瘤醫(yī)院