專利名稱：miR-34c在制備治療或預(yù)防肝癌的藥物或保健品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非編碼小RNA基因miR-3k及其靶基因TGIF2的應(yīng)用，特別涉及其在 早期診斷、預(yù)防和治療原發(fā)性肝癌尤其是在HBV感染引起的原發(fā)性肝癌方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是世界常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率較高，嚴(yán) 重危害著人們的健康，目前，早期診斷除B超、CT等影像學(xué)檢查外，甲胎蛋白(AFP)是最常 用的檢測(cè)手段，但有時(shí)出現(xiàn)漏診和誤診，并且尚無滿意的治療。乙型肝炎病毒(HBV)感染被認(rèn)為是HCC發(fā)生的最主要原因。全球HCC病例的60%， 流行地區(qū)病例的70%被認(rèn)為是由HBV引起的。HBV引起原發(fā)性肝癌的發(fā)生機(jī)制極其復(fù)雜。研究表明，在某些病毒感染過程中，病毒可以通過自身合成的或利用宿主的特定 miRNAs，調(diào)節(jié)病毒或宿主的基因表達(dá)，利于病毒的生存、傳播，或使病毒逃逸宿主的免疫反 應(yīng)，從而導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生[1]，因此miRNAs在病毒感染的診斷和相關(guān)腫瘤的治療中可 能具有廣泛的應(yīng)用前景。miRNA是一類長(zhǎng)約21_Mnt的非編碼單鏈成熟RNA，在生物進(jìn)化上高度保守，其與 靶基因的特異序列結(jié)合，使靶基因降解或干擾靶蛋白的翻譯來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，大量證據(jù) 表明，miRNA參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡的調(diào)節(jié)，與腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2_3]。人類miR-34 包括 miR-34a、miR_34b 和 miR_34c 等，可通過被 p53 激活，抑制 E2F3、 Bcl-2、c-myc、CDK4、CDK6、Cyclin Dl以及Cyclin E2的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞停滯在Gl期，抑 制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并通過E2F3、SIRT1與p53形成正反饋環(huán)路，不斷增 強(qiáng)其自身和P53的作用。miR-34家族的非正常表達(dá)已被證實(shí)出現(xiàn)在多種的腫瘤中。Welch 等[4]對(duì)兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma)的研究發(fā)現(xiàn)，定位于1ρ36. 23的mir-34a基 因經(jīng)常缺失，位于該部位的另一腫瘤抑制因子CHD5 chromodomain protein能夠通過ARF CDKN2A激活p53，因此1ρ36的缺失可影響p53通路的完整性。miR_34b與miR-Mc的最小 程度缺失被Calin等[5]證明同樣存在于乳腺癌和肺癌中。Chang等[6]發(fā)現(xiàn)miR-34a的表 達(dá)在胰腺癌腫瘤細(xì)胞中缺失；1^2^3等[7]證實(shí)mil^Ma的下調(diào)存在于人類結(jié)腸癌的發(fā)展過 程中；Bommer等 對(duì)非小細(xì)胞型肺癌進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-34家族在非小細(xì)胞型肺癌的表達(dá) 很大程度上降低了該腫瘤的發(fā)生，同時(shí)恢復(fù)miR-34基因表達(dá)能夠抑制非小細(xì)胞型肺癌細(xì) 胞的生長(zhǎng)。近年來多項(xiàng)研究表明miR-34與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Igor P. Pogribny等[9] 在長(zhǎng)期給予他莫昔芬藥物的大鼠肝癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-34顯著下調(diào)。Volodymyr P. Tryndyak 等_通過amethyl-deficient diet方法誘導(dǎo)建立大鼠的肝癌模型，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn) miR-34a低表達(dá)。Na Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)在肝癌組織和H印G2肝癌細(xì)胞系中，miR-34a表達(dá) 顯著下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)mil^Ma可通過下調(diào)c-met的表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。然而 Pascal Pineaua 等[12]通過 Microarray analysis 顯示 miR_34a 在 HCC 中顯著高表達(dá)。從 以上研究可見因不同誘發(fā)因素產(chǎn)生的肝癌細(xì)胞中miR-34s的表達(dá)亦不同，miR-34在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能充當(dāng)著癌基因和(或)抑癌基因的角色。目前對(duì)miR-34家族的研究主要針對(duì)miR_34a進(jìn)行的，由miR_34a推導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)論 是否同樣適用于miR-34b/c目前還難以確定。很少有報(bào)道m(xù)iR-34在肝癌中的研究，并且尚 無miR-34對(duì)HBV感染及其相關(guān)肝癌的基因調(diào)控機(jī)制的研究。因此闡明miR-3k在HBV感 染及其相關(guān)肝癌的基因調(diào)控機(jī)制中的作用是非常有必要的。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明公開了一種非編碼小RNA基因miR-3k在診斷和治 療原發(fā)性肝癌中的應(yīng)用，該miR-3k能夠有效抑制HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)， miR-34c在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌組織和HBV感染的肝癌細(xì)胞株顯著低表達(dá)，且在給予肝癌 細(xì)胞H印G2. 2. 15轉(zhuǎn)染miIKMc的表達(dá)載體后，mil^Mc可以顯著抑制HBV DNA的復(fù)制和表 達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，這表明miR-3k可以有助于早期診斷、預(yù) 后和治療HBV相關(guān)性肝癌，因此，miR-3k可以用于制備治療或預(yù)防肝癌的藥物或保健品， 尤其是由HBV感染引起的原發(fā)性肝癌。所述miR-34c基因成熟體序列的核苷酸序列為 5’ -AGGCAGTGTAGTTAGCTGATTGC-3’。本發(fā)明利用基因芯片技術(shù)對(duì)不同月齡HBV轉(zhuǎn)基因Balb/c小鼠肝組織和正常Balb/ c小鼠肝組織的miRNAs及mRNA表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果表明HBV感染抑制了肝癌組織中 miR-3k的表達(dá)，下調(diào)達(dá)2倍以上，TGIF2基因的表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)定量PCR技 術(shù)(real-time PCR)對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2. 2. 15和H印G2中mil^Mc和TGIF2的表達(dá)進(jìn) 行分析，結(jié)果顯示與基因芯片結(jié)果相吻合。HBV感染能夠引起miR-34c的表達(dá)下調(diào)和TGIF2 表達(dá)上調(diào)。同時(shí)發(fā)明人通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光報(bào)告分析證實(shí)TGIF2是時(shí)1 -34(3的直 接靶基因，并且在H印G2. 2. 15肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-3k的表達(dá)載體后，結(jié)果顯示miR_34c 可以從mRNA水平和蛋白水平抑制TGIF2的表達(dá)，可以抑制HBVDNA的復(fù)制，下調(diào)HBsAg和 HBeAg的表達(dá)水平，并且miR-3k可能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，抑制肝癌細(xì)胞的增殖。這說 明miR-3k能夠有效抑制HBV感染引起的原發(fā)性肝癌的發(fā)生，因此miR-3k在原發(fā)性肝癌 尤其是HBV感染引起的肝癌的早期診斷、預(yù)后和治療的具有廣泛的前景。


圖1 (A、B) :real-time PCR技術(shù)檢測(cè)HBV感染引起肝癌細(xì)胞H印G2. 2. 15中 miR-34c低表達(dá)(圖1A)，miR_34c能夠抑制TGIF2的表達(dá)(圖1B)。圖2 雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)鑒定miR_34c的直接靶基因TGIF2。圖3 RT-PCR檢測(cè)靶基因TGIF2的mRNA表達(dá)變化。圖4 =Western Blot檢測(cè)TGIF2的蛋白表達(dá)變化。圖 5(A、B、C) :miR-34c 抑制 HBVDNA 的復(fù)制(圖 5A)，下調(diào) HBsAg (圖 5B)和 HBeAg (圖5C)的表達(dá)水平。圖6 :miR-34c抑制HBV感染的肝癌細(xì)胞的增殖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 基因芯片檢測(cè)HBV轉(zhuǎn)基因Balb/c小鼠肝癌組織和正常小鼠肝組織中 miRNAs和mRNAs的表達(dá)情況按Trizol試劑說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取分別取6、12、20月齡的HBV轉(zhuǎn)基 因Balb/c小鼠肝組織和正常Balb/c小鼠肝組織豆粒大小，加入Iml Trizol提取液，研磨， 吹打混勻，將懸液收集到DEPC處理過的Ep管中，15°C 30°C孵育樣品5min，使核酸蛋白 充分分離。再加0. 2ml氯仿，劇烈震蕩1 后，15°C 30°C孵育2-;3min，4°C 12000rpm，離 心15min，取RNA上清層，轉(zhuǎn)入新的Ep管內(nèi)，加入0. 5ml異丙醇，顛倒混勻，15°C 30°C孵育 IOmin, 40C 12000rpm 離心 lOmin，棄上清，加入 Iml 75% DEPC-乙醇，漂洗沉淀，7500rpm， 2°C 8°C離心5min。棄上清，5 IOmin內(nèi)使RNA快速晾干。50 μ L的DEPC水重溶RNA沉 淀，55°C 60°C孵育lOmin，使沉淀充分溶解。用紫外分光光度儀對(duì)其進(jìn)行定性定量分析?；蛐酒瑱z測(cè)miRNA和mRNA基因芯片檢測(cè)和軟件分析由LCkiences公司完成。 結(jié)果顯示在20月齡HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中miRNAs異常表達(dá)，其中miR-3k表達(dá)下調(diào)； mRNA表達(dá)參差不齊。實(shí)施例2 :miR-34c靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)合實(shí)施例1的結(jié)果和生物信息學(xué)方法，利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)(TargetScan :http:// www.tarRetscan.org/ ;Pictar :http://pictar.bio.nyu.edu/ :miRanda :http:// microrna. sanger. ac. uk/)預(yù)測(cè)mil^Mc相關(guān)的靶基因，暫確定mil^Mc的靶基因?yàn)門GIF2。實(shí)施例3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞系中mil^Mc和TGIF2表達(dá)水平Trizol法分別提取肝癌細(xì)胞系H印G2和H印G2. 2. 15細(xì)胞的總RNA。用PBS將細(xì) 胞洗滌2遍，每瓶加入Iml Trizol，吹打混勻，室溫孵育5min ；將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移入DEPC處理過 的1. 5ml離心管中，每管加入0. 2ml氯仿，劇烈振蕩1 混勻，冰上靜置3 5min使分層； 4°C，12000rpm，離心15min ；小心吸取上層液體，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)DEPC處理過的1. 5ml離心管 中，加入等體積(0. 5ml)已在4°C預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒輕輕混勻15 30s，冰上(室溫) 靜置5 IOmin ；4°C，12000rpm，離心15min ；棄上清，加入Iml 75 %乙醇，輕輕洗滌沉淀2 次；4°C，7500rpm離心lOmin，棄上清，EP管倒置晾干，加入DEPC水30ul溶解RNA。紫外吸 收測(cè)定法和甲醛變性電泳檢測(cè)總RNA的濃度和純度。利用hvitrogen的miRNA cDNA合成試劑盒將上述所提總RNA進(jìn)行cDNA的合成。 反應(yīng)體系(20ul)如下總RNA 100pg-lug，5X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液如1，lOXSuperScript 逆轉(zhuǎn)錄酶2ul，EDPC水補(bǔ)足到20ul。將上述體系混勻，PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件 370C 60min,95°C 5min，4°C保存。再以cDNA為模板，利用試劑盒自帶的miRNA通用引物和根據(jù)試劑盒提供的方法 自己設(shè)計(jì)的miR-34c的特異引物，在ABI7000儀上進(jìn)行Real-time PCR0反應(yīng)體系QOul) 如下2X反應(yīng)緩沖液10ul，10uM特異引物0. ^l，10uM通用引物0. ^l，25uM ROX 0. 4ul, cDNA2ul，EDPC 水 6. 8ul。反應(yīng)條件:50°C 2min ；95°C 2min ；95°C 15s，60°C lmin，40 個(gè)循環(huán)。 以U6小RNA為內(nèi)參對(duì)照，采用相對(duì)定量法處理數(shù)據(jù)。利用TOYOBO的mRNAcDNA合成試劑盒將上述所提總RNA進(jìn)行cDNA的合成。反應(yīng) 體系(IOul)如下總 RNA 0.5pg-lug，5x RT Buffer 2ul, RT Enzyme Mix 0. 5ul, Primer MixO. 5ul, Nuc lease-free Water加至10ul。將上述體系混勻，PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件37 °C 15min，98 °C 5min，4 °C 保存。再以 cDNA 為模板，利用 TAKAER 的 mRNAqPCR 試劑盒，進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系(20ul) =SYBR Premix ExTaq(2x) 10ul, PCR Forward Primer(IOuM)O. 4ul, PCR Reverse Primer(IOuM)O. 4ul, ROX Reference Dye(50x)0.4ul, DNA 模板 2ul，dH20 6. 8ul.反應(yīng)條件95°C 30s 預(yù)變性，95°C 5s 60°C 30s 40 個(gè)循環(huán)。以 β -actin為內(nèi)參對(duì)照，采用相對(duì)定量法處理數(shù)據(jù)。Real-time PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果相吻合，與肝癌細(xì)胞系H印G2相比，miR-Mc 在HBV感染的肝癌細(xì)胞系H印G2. 2. 15中表達(dá)下調(diào)(圖1A)；基因TGIF2在HepG2. 2. 15中表 達(dá)上調(diào)，miR-34c能夠抑制TGIF2的表達(dá)(圖1B)。實(shí)施例4 :miR-34c表達(dá)載體的構(gòu)建首先依據(jù)Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的miRNA數(shù)據(jù)，根據(jù)pri-miR-34c序列設(shè)計(jì) 引物(miR-34c-F和miR-34c_R)，并在miR-34c_F的5'端懸垂內(nèi)切酶BamHI的酶切位點(diǎn)和 保護(hù)堿基；在miR-34c-R 5'端懸垂另一內(nèi)切酶HindIII的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。然后進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(50ul)如下:2X反應(yīng)緩沖液25ul，10uM上游引物lul, 10uM下 游引物 1ul，DNA 2ul (小于 lug), ddH20 21ul。反應(yīng)條件-MV 3min ； 94 °C 30s, 55 °C 40s, 72°C 40s，32個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min ；4°C保存。擴(kuò)增后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系為 (50ul) :10XK Buffer 5ul, BamHI 2. 5ul, HindIII 2. 5ul，PCR 產(chǎn)物 15ul，ddH20 25ul。酶 切反應(yīng)在37°C水浴中進(jìn)行，池后則酶切反應(yīng)液經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑 盒回收酶切產(chǎn)物，產(chǎn)物最終溶于10 μ L Buffer EB中。再對(duì)載體pSilencer3. I-Hlneo進(jìn)行雙酶切，酶切體系為(50ul) =10XK Buffer 5ul, BamHI 2. 5ul, HindIII 2. 5ul, pSilencer3. 1iHl neo 10ul, ddH20 30ul。酶切反應(yīng)在 37°C水浴中進(jìn)行，池后利用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，產(chǎn)物最終溶于10 μ L Buffer EB 中。將上述酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系為QOul) =10X連接Buffe 2 μ L，載體片 6 μ L，目的基因片段10 μ L，T4DNA連接酶2 μ L。連接反應(yīng)在4°C下進(jìn)行，16 20h后，70°C 水浴IOmin滅活連接酶，終止連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，涂菌平皿于37°C孵箱內(nèi)培養(yǎng)12 16h。然后挑 選陽(yáng)性克隆，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，酶切和測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確的miR-3k表達(dá)載體，命名為 pS_miR-34c。實(shí)施例5 靶基因表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)GenBank中TGIF2基因的序列，選取包含與has-mil^Mc匹配的一段序列設(shè) 計(jì)引物，(TGIF2-F和TGIF2-R),并在TGIF2-F的5'端懸垂內(nèi)切酶KpnI的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿 基；在TGIF2-R5'端懸垂另一內(nèi)切酶BglIII的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實(shí)施例3。擴(kuò)增后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系為(60ul) IOXT Buffer5ul, KpnI 2. 5ul, BglIII 2. 5ul, PCR 產(chǎn)物 15ul, ddH20 25ul。酶切反應(yīng)在 37°C水浴中進(jìn)行，池后利用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，產(chǎn)物最終溶于10 μ L Buffer EB 中。再對(duì)載體pGL3control進(jìn)行雙酶切，酶切體系為(50ul) =10XT Buffer 5ul，KpnI 2. 5ul, BglIII 2. 5ul，pGL3 control 10ul, ddH20 30ul。酶切反應(yīng)在 37°C水浴中進(jìn)行，3h 后利用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，產(chǎn)物最終溶于10μL Buffer EB中。
將上述酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系和連接反應(yīng)同實(shí)施例3。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后 挑選陽(yáng)性克隆，也分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，酶切和測(cè)序驗(yàn)證，最后獲得正確的表達(dá)載體，命名為 pGL3-TGIF2。以同樣的方法構(gòu)建了 TGIF2的反義寡核苷酸的表達(dá)載體pGL3-anti TGIF2。實(shí)施例6 :miR-34c過表達(dá)將pS-miR-34c 轉(zhuǎn)染至 H印 G2. 2. 15 細(xì)胞是用 hvitrogen 公司的 FuGENE. HD 轉(zhuǎn) 染試劑，轉(zhuǎn)染前一天，以每孔4X 105個(gè)細(xì)胞的濃度接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)20h后，細(xì) 胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)增殖期，稀釋適當(dāng)體積的pS-mil^Mc或pSilencer3. 1-control于IOOul OPTI-MEM培養(yǎng)基中，輕柔混合，使其終濃度為20ug/ml，F(xiàn)u. GENE. HD :pS-miR-34c或 pSilencer3. 1-control按4 : 2的比例在96孔板中配制轉(zhuǎn)染混合物，劇烈震蕩5_10s，靜 置15min后，將轉(zhuǎn)染混合物緩慢加到含H印G2. 2. 15細(xì)胞和OPTI-MEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，輕 搖30s，在37°C 5%的(X)2孵育6h后，更換成含10%新生小牛血清和380 μ g/ml G418的MEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-7 后檢測(cè)轉(zhuǎn)染水平以及后續(xù)試驗(yàn)。實(shí)施例7 雙熒光報(bào)告的檢測(cè)HepG2細(xì)胞接種M小時(shí)后，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔面積的90%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染 方法同實(shí)例6，然后進(jìn)行雙熒光報(bào)告的檢測(cè)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的檢測(cè)，采用Promega 的Dual-luciferase熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，按試劑盒說明操作，簡(jiǎn)要過程如下轉(zhuǎn)染 H印G2細(xì)胞4 后用PBS洗一遍細(xì)胞，然后每孔用被動(dòng)裂解液IOOul裂解細(xì)胞，取15ul裂解 產(chǎn)物加入50ul Luciferase反應(yīng)底物，然后用熒光測(cè)量?jī)x測(cè)定Firefly熒光，再加入Mop Glo試劑50ul，馬上測(cè)量Renilla熒光。分析檢查得到Firefly熒光素酶和Renilla熒光 素酶的熒光值，用Renilla熒光素酶熒光值對(duì)Firefly熒光素酶熒光值進(jìn)行歸一化。每組 實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值。雙熒光報(bào)告檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)miR-3k表達(dá)載體pS-miR-3k與靶基因的表達(dá)載體 pGL3-TGIF2/pGL3-antiTGIF2共轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞后，pGL3_TGIF2組熒光素酶的熒光值顯著降 低，而pGL3-antiTGIF2組熒光素酶的熒光值無明顯變化，這表明TGIF2的確是miR-3k的靶 基因(圖2)。實(shí)施例8 =RT-PCR檢測(cè)靶基因的表達(dá)情況miR-34c表達(dá)載體轉(zhuǎn)染H印G2. 2. 15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例6，轉(zhuǎn)染后48h，利用 Trizol法提取細(xì)胞的總RNA。提取方法同實(shí)施例3，紫外吸收測(cè)定法和甲醛變性電泳檢測(cè)總 RNA的濃度和純度后，利用試劑盒將所提總RNA進(jìn)行cDNA的合成。反應(yīng)體系QOul)如下總RNA 100pg-lug，5 X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液如1，逆轉(zhuǎn)錄酶 lul, Oligo (dT) lul, DEPC水補(bǔ)足到20ul。將上述體系混勻，PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條 件:37°C 15min，98°C 5min，4°C 保存。再以cDNA為模板，對(duì)靶基因進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系QOu 1)如下2X反應(yīng)緩沖液 IOul, IOUms 上游引物 0. 4ul, IOuM 下游引物 0. 4ul, cDNA lul, EDPC 水 8. 2ul。反應(yīng)條件 940C 2min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min, 4°C保存。以 β -actin 為靶 基因的內(nèi)參對(duì)照。RT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染了 pS-miR-3k的靶基因在mRNA水平表達(dá)降低 (圖 3)。
實(shí)施例9 =Western Blot檢測(cè)靶基因的表達(dá)情況收集實(shí)施例6中經(jīng)處理的各組細(xì)胞至Ep管中，PBS洗滌兩次。各管中加入IOOyL 細(xì)胞蛋白裂解液，冰上孵育30min(每隔5min輕彈混勻)。12000rpm，4°C離心5min，取上清 至新Ep管中(20yL/管)，-80°C保存?zhèn)溆?。用洗潔精清洗玻璃板，流水沖凈，再用酒精棉球擦洗，晾干。按照說明書安裝好 灌膠的裝置，在IOOmL小燒杯內(nèi)配制分離膠(12% )，沿高玻璃板倒膠至矮玻璃板的大約 3/4(注意不要有氣泡)，接著加滿雙蒸水。待30min后分離膠凝聚，用吸水紙吸凈上層水， 再灌積層膠(5% )，插入梳子。待積層膠凝聚后，將凝膠放入電泳槽中安裝好，矮玻璃板在 內(nèi)，高玻璃板在外，加入IXSDS電泳緩沖液，液面超出矮玻璃。小心拔出梳子，注意不要有 氣泡。取各組細(xì)胞的裂解液100 μ L，各加入20 μ L 6X SDS上樣緩沖液，混勻。低分子 量蛋白質(zhì)Marker IOyL中加入2μ L 6 X SDS上樣緩沖液，混勻。沸水中煮沸3 5min， 12000rpm離心lmin，冰上放置，上樣。用緩沖液沖洗梳孔后，按順序上樣(!fepG2對(duì)照組、H印G2. 2. 15未處理組、 pS-control組、pS-miR-34c組)每組樣品設(shè)3個(gè)孔，7 μ L/孔。在膠的兩側(cè)分別加入3 μ L 蛋白質(zhì)分子量Marker (彩色)。穩(wěn)壓電泳，積層膠中電流為60V，進(jìn)入分離膠，電壓增加至 100V。電泳結(jié)束后，取出電泳裝置，小心剝下凝膠，切下包含所有樣品的三分之一膠，經(jīng)考馬 斯亮蘭染色，檢測(cè)是否有目的蛋白條帶。切下剩余三分之二膠中各目的條帶所在范圍的凝膠。根據(jù)凝膠的大小剪4塊 Whatman濾紙和1塊PVDF膜(兩者的大小不可超過凝膠)，將剪好的濾紙、PVDF膜(提前 在甲醇中浸泡5-6min)、凝膠及轉(zhuǎn)膜裝置中的海綿置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡3 5min。在海 綿上依次放置兩層濾紙、凝膠、PVDF膜、兩層濾紙。加緊海綿，放入轉(zhuǎn)移槽內(nèi)。(注意凝 膠一側(cè)靠近負(fù)極，PVDF膜一側(cè)靠近正極)。電流400mA，穩(wěn)流，4°C轉(zhuǎn)移lh。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取 出塑料支架，依次去掉各層，用鉛筆在膜的上緣做好標(biāo)記，切下Marker上樣孔的所對(duì)應(yīng)的 膜的1/2，用麗春紅染色3s，而后用水清洗，檢查轉(zhuǎn)膜是否完全。將其余的PVDF膜放在大小合適的雜交袋中，根據(jù)膜和袋的大小加入適量的封閉 液，封口，室溫封閉lh。在雜交袋上剪一小口，小心取出回收封閉液，不洗膜。在不同雜交袋 內(nèi)分別加入以封閉液按1 1000稀釋的小鼠抗人TGIF2抗體和按1 2000稀釋的小鼠抗 人β-actin抗體，37°C雜交lh，4°C雜交過夜。從雜交袋中小心取出PVDF膜，用洗膜液振蕩 洗滌3次，IOmin/次。再以TBS洗滌1次，lOmin。將PVDF膜分別與用TBST按1 10000 稀釋的羊抗鼠二抗室溫孵育池。從雜交袋中小心取出PVDF膜，用洗膜液振蕩洗滌3次， IOmin/ 次。在EP管中中加入適量ECL顯色液A、B(1 1)配制好的溶液，均勻加到PVDF膜 上，立即在暗室內(nèi)顯影。觀察目的條帶的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示與H印G2組相比，H印G2. 2. 15未處理組和pS-control組TGIF2表達(dá)上 調(diào)，在pS-miR-34c轉(zhuǎn)染組TGIF2表達(dá)下調(diào)(圖4)。實(shí)施例10 :miR-34c抑制HBVDNA的復(fù)制和表達(dá)(1)對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA含量的影響H印G2. 2. 15細(xì)胞以每孔2X IO4個(gè)細(xì)胞的濃度接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)20h后，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)增殖期。將預(yù)先配制好的100ymol/L pS-miR-3k或pS-control加入各 孔，作用終濃度為10μmol/L，各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)孵育24h或4 后，收集培養(yǎng)液上清 100 μ L，以熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)HBV DNA的含量，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，結(jié)果 為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。結(jié)果顯示pS-miR-34c可顯著降低H印G2. 2. 15細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA的含量， 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 001)(圖5A)。(2)對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg表達(dá)的影響如同(1)所述的方法，終濃度為10 μ mol/L的pS-miR-34c或pS-control作用于 H印G2. 2. 15細(xì)胞24h或48h后，收集培養(yǎng)液上清200 μ L，分別加入包被有HBsAb和HBeAb 的ELISA檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的吸光值，結(jié)果 為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。結(jié)果顯示pS-miR-3k可顯著抑制H印G2. 2. 15細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg的表 達(dá)(圖5B、C)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 001)。實(shí)施例11 :CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖H印G2. 2. 15細(xì)胞以每孔2 X 104個(gè)細(xì)胞的濃度接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)20h后，細(xì) 胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)增殖期。每孔加入lOulCCK-8溶液，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的吸光度值，棄去各孔原 培養(yǎng)液，分別加入pS-miR-3k或pS-control至各組細(xì)胞(同時(shí)設(shè)立未經(jīng)處理的對(duì)照組細(xì) 胞)，每孔終體積為100 μ L。各實(shí)驗(yàn)組均設(shè)三孔重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，各孔加入10ulCCK_8 溶液孵育lh。酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)下各孔吸光值(A)，結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在H印G2. 2. 15中過表達(dá)miR-34c實(shí)驗(yàn)組48h后細(xì)胞的生長(zhǎng)被顯著 抑制，而在7 后腫瘤細(xì)胞不再被抑制。說明miR-3k可以短期內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖 6)。附參考文獻(xiàn)[l]Yeung ML,Bennasser Y, Jeang KT. MiRNAs in the biology of cancers and viral infections. Curr Med Chem 2007 ；14 :191-197[2]LEE R C,AMBROS V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans[J], Science, 2001, 294 :862-864[3]Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin_4encodes smaIlRNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 1993 ；75 843-854[4]. Welch C, Chen Y, Stallings RL. MicroRNA-34a functions as a potential tumor suppressor byinducing apoptosis in neuroblastoma cells. Oncogene,2007, 26(34) :5017-22[5]. Calin GA, Sevignani C, Dumitru CD, et al. Human microRNA genes are frequently located atfragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(9) :2999-3004[6]. Chang TC,Wentzel EA,Kent OA,et al.Transactivation of miR_34a by p53 broadly influencesgene expression and promotes apoptosis. Mol Cell,2007,26 (5) 745-52
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權(quán)利要求
1.miR-34c在制備治療或預(yù)防肝癌的藥物或保健品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述肝癌為原發(fā)性肝癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述原發(fā)性肝癌是由HBV感染引起的原 發(fā)性肝癌。
4.miR-34c在制備抑制腫瘤細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非編碼小RNA基因miR-34c在診斷和治療原發(fā)性肝癌中的應(yīng)用，該miR-34c能夠有效抑制HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-34c在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌組織和HBV感染的肝癌細(xì)胞株顯著低表達(dá)，且在給予肝癌細(xì)胞HepG2.2.15轉(zhuǎn)染miR-34c的表達(dá)載體后，miR-34c可以顯著抑制HBV DNA的復(fù)制和表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，這表明miR-34c可以有助于早期診斷、預(yù)后和治療HBV相關(guān)性肝癌，因此，miR-34c可以用于制備治療或預(yù)防肝癌的藥物或保健品，尤其是由HBV感染引起的原發(fā)性肝癌。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102145180SQ20111005918
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月11日
發(fā)明者劉玉剛, 孫汶生, 王春梅, 王燕, 范春光 申請(qǐng)人:山東大學(xué)