專利名稱：蓮子心或其提取物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蓮子心在制備預(yù)防或/和治療糖尿病腎病藥物或保健食品中的用途，屬于醫(yī)藥食品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病腎病是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一，又是終末期腎病主要原因。隨著經(jīng)濟 的發(fā)展和生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率逐漸升高，目前尚無較好的治療方法。糖尿病性 腎病其他病理改變特點包括腎小球基膜增厚，腎小球上皮細胞足突融合以及由于細胞外系 膜基質(zhì)增多所致腎小球增大。疾病晚期可出現(xiàn)腎小管萎縮腎內(nèi)纖維化。糖尿病病程10年 以上者約50%并發(fā)糖尿病腎病。目前，糖尿病的治療主要在兩方面誘發(fā)因素的控制和DN 發(fā)展中關(guān)鍵環(huán)節(jié)的阻斷。目前，糖尿病腎病的發(fā)病機理雖尚未完全清楚，但腎小球基膜增厚，腎小球上皮細 胞足突融合及腎小球機械屏障和電荷屏障受損，導(dǎo)致尿蛋白的漏出是其主要原因。腎小球 濾過屏障是腎小球的重要結(jié)構(gòu)，從內(nèi)向外依次為內(nèi)皮窗孔層，腎小球基底膜(GBM)、足細胞 及其裂孔隔膜(GPSD)，其中GBM和GPSD是阻止蛋白漏出最主要的兩層。GBM主要起電荷屏 障作用，GPSD主要發(fā)揮機械屏障作用，它們的結(jié)構(gòu)和功能的任何改變均可破壞腎小球濾過 屏障的完整性，導(dǎo)致蛋白漏出。腎組織足細胞相關(guān)分子nephrin、podocin和GBM上相關(guān)分 子乙酰肝素酶(heparanase，HPA)的變化可以反映機械屏障和電荷屏障的變化。因此，如能 減輕腎小球基膜增厚，減少腎小球上皮細胞足突融合，恢復(fù)腎小球機械屏障和電荷屏障是 最終減少尿蛋白漏出的關(guān)鍵，也是治療糖尿病腎病的重要靶點。蓮子心(PLUMULANELUMBINIS)，又名蓮心，為睡蓮科Nelumbo nuciferaGaertn.多 年生水生草本植物蓮的成熟種子中的青嫩胚芽?！吨袊幍洹?005版一部收載，具有清心安 神，交通心腎，澀精止血。據(jù)報道，蓮子心中主要含有蓮子心堿(liensinine)、甲基蓮子心 堿(neferine)、異蓮子心堿(isoliensinine)等生物堿及木犀草素、蘆丁等黃酮類化合物。 蓮子心的藥效主要為降壓和抗心律失常等作用。文獻潘揚，等，蓮子心及Nef對實驗性糖 尿病及肥胖大鼠模型的影響，《南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報》，2003年19卷4期，公開了蓮子心及甲 基蓮心堿(neferine，Nef)對鏈脲佐菌素(str印tozotocin，SIZ)和高糖高脂制作的大鼠糖 尿病及肥胖模型的影響，并與二甲雙胍(metformin，Met)作對照。結(jié)果表明，蓮子心及Nef 對實驗性糖尿病及肥胖大鼠有一定的降低血糖及調(diào)節(jié)血脂作用。目前尚有關(guān)于蓮子心及提 取物用于預(yù)防或/和治療糖尿病腎病的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了蓮子心或其提取物的新用途。本發(fā)明提供了蓮子心或其提取物在制備預(yù)防或/和治療糖尿病腎病的藥物或保 健食品中的用途。其中，所述的蓮子心提取物為蓮子心的水或有機溶液提取物或酸堿提取物。其中，所述的蓮子心提取物是蓮子心水或有機溶劑提取物。所述的蓮子心提取物，可以是用蓮子 心的水提物，如水煎，水煎液的濃縮液，或蓮子心水提醇沉后經(jīng)噴霧干燥得到的粉劑；可以 是以乙醇或其他有機溶劑對蓮子心進行提?。豢梢允且运嵋簼B漉對蓮子心進行提?。豢梢?是以離子交換樹脂對蓮子心進行提?。豢梢允且阅し蛛x技術(shù)對蓮子心進行提取等。其中，所述的蓮子心提取物為蓮子心總生物堿。其中，所述的藥物是減輕腎小球基膜增厚，減少腎小球上皮細胞足突融合，恢復(fù)腎 小球機械屏障和電荷屏障的藥物。其中，所述的蓮子心總生物堿中總生物堿的百分含量為5% 95%，含有蓮子心 堿的重量百分含量為 80%。進一步優(yōu)選地，所述的蓮子心總生物堿提取物中總生物 堿的重量百分含量為30% 70%，含有蓮子心堿的重量百分含量為10% 30%。本發(fā)明的活性成分蓮子心總生物堿的含量以蓮子心堿為標(biāo)準(zhǔn)計算。含量測定采 用紫外分光光度法測定蓮子心堿含量，蓮子心堿在處有最大吸收，根據(jù)蓮子心堿的 含量計算總生物堿的含量，也可采用HPLC法測定。(參考文獻郭毛娣，李蘭貴.中國大 陸產(chǎn)蓮子心中生物堿成分的研究[J].中草藥，1984，15 (7) 3.袁小紅.蓮子心微囊中總 生物堿的含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(7) :1141-1142 ；柳偉，王宏潔，司南等.蓮 子心總生物堿滴丸的制備工藝及含量測定[J].中國中藥雜志，2007,32(7) :581-584;陳錦 容.HPLC法測定不同炮制工藝蓮子心中生物堿的含量[J].海峽藥學(xué)，2009，21 (9) :33-36)本發(fā)明還提供了一種治療糖尿病腎病的藥物組合物，它是由有效量的蓮子心或其 提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。其中，所述的制劑是口服制劑、注射制劑。本發(fā)明蓮子心及其活性成分制成的藥劑、保健食品和食品添加劑中，可以是臨床 上能夠使用的各種不同劑型。如片劑、口服液、丸劑、膠囊劑、注射劑(包括靜脈輸液劑)、膏 劑、酊劑、散劑、沖劑、栓劑、霜劑、透皮制劑等。也可添加到食品、飲料等保健食品中。當(dāng)然 也可以將蓮子心原藥直接制備成單方或復(fù)方的制劑、保健食品和食品添加劑。本發(fā)明蓮子心用于預(yù)防或/和治療糖尿病腎病，藥效明確，且用藥安全，為臨床提 供了一種新的用藥選擇。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明蓮子心總堿的制備取蓮子心，粉碎，加水2 6倍，煎煮3次，每次0. 5 池，合并濾液，回流濃縮，過 濾，加入2 8倍乙醇，使水提溶液中乙醇濃度達50 60%。靜置12 Mh，過濾，濾液減 壓回收乙醇至盡，并濃縮之相對密度為1. 20 1. 40，減壓干燥，得蓮子心提取物，即得蓮子 心總堿。含量測定采用紫外分光光度法，結(jié)果總生物堿的重量百分含量為70%，以蓮子心 堿計，重量百分含量為30%。
實施例2本發(fā)明蓮子心總堿的制備取蓮子心，粉碎，用2 5倍量70 85 %乙醇回流提取2 4次，每次回流提取 0. 5 1. 5h，濾過合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮之相對密度為1. 01 1. 10的濃縮液。濃 縮液用硫酸調(diào)pH至2. 0 4. 0，靜置，離心，離心液用10 20%氨堿化調(diào)pH至8 10，靜 置，過濾取沉淀，加乙醇加熱溶解，靜置，過濾，濾液減壓回收乙醇至盡，并濃縮之相對密度 為1. 20 1. 40，減壓干燥，得蓮子心提取物，即得蓮子心總堿?？偵飰A含量50%，以蓮子 心堿計占10%。含量測定采用紫外分光光度法。實施例3本發(fā)明蓮子心總堿的制備取蓮子心，粉碎，放入滲漉器中，加入2 6%。HCl浸漬膨脹M 48h，然后不斷添 加新的2 6%。HC1，自上而下使其滲透過藥材，從滲漉器下部流出并收集浸出液，合并所有 濾液，用10 20%氨堿化至pH值為8 10，過濾得到沉淀，減壓干燥，即得蓮子心總堿，總 生物堿含量30%，以蓮子心堿計占15%。含量測定采用紫外分光光度法。實施例4蓮子心堿、異蓮子心堿、甲基蓮子心堿可從蓮子心總堿通過如下方式提取路線制備。蓮子心總堿一用制備高效液相分離蓮子心總堿一膠束電動色譜分離其中，蓮子心堿、異蓮子心堿、甲基蓮子心堿三個化合物分離純化方法可參考如下 文獻朱金花，李德亮.膠束電動色譜中大體積進樣法分離測定蓮子心中的蓮子心堿、異 蓮子心堿和甲基蓮子心堿.分析化學(xué)，2009，37 (10) :126;陳昌國.大孔吸附樹脂分離純 化蓮子心中蓮子心總堿的研究.時珍國醫(yī)國藥2009,20(4) :981-983 ；張先洲，胡學(xué)民，羅 順德等.高效液相色譜法測定蓮子心中3種生物堿的含量.藥物分折雜志，1997，17 O) 110-112，或直接通過市售購買化合物標(biāo)準(zhǔn)品。這里所說的活性成分主要為雙芐基異喹 啉-(7-0-1Γ )-單醚鍵生物堿衍生物及類似物，主要為蓮子心堿、異蓮子心堿、甲基蓮子 心堿，可從睡蓮科植物的不同部位，如蓮子心、蓮須、荷葉等或通過全合成或半合成方法制 備。以下通過具體藥效學(xué)試驗或臨床試驗進一步證明本發(fā)明的有益效果。試驗例1本發(fā)明提取物的藥效學(xué)實驗1材料與方法1. 1實驗材料1. 1. 1動物清潔級健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠100只，體重180 200g，購 自四川大學(xué)華西實驗動物中心。在室溫(22士 1)°C、相對濕度(55士5)%、光照周期12h 12h環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)Iwk后試驗。1. 1. 2藥物蓮子心提取物，由實施例1方法制備，使用時用生理鹽水配制灌胃；開 博通(卡托普利)片，上海中美施貴寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號1003052。1. 1. 3主要試劑鏈脲佐菌素(Str印tozotocin，STZ)，Sigma公司，臨用前溶解在 0. 01mol/L枸櫞酸緩沖液中，pH 4. 5 ；兔抗大鼠η印hrin、podocin與HPA多克隆抗體，武漢 博士德；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG及山羊血清封閉 液，北京博奧森生物科技有限公司；動物組織總RNA提取試劑盒(離心柱型)及RT-PCR試劑盒，天根生化科技有限公司；PCR引物，上海生工生物工程技服務(wù)有限公司。1. 2 方法1. 2. 1動物模型的建立及分組大鼠單次腹腔注射1 % STZ 65mg/kg, 72h后尾靜 脈采血，血糖儀測定全血血糖，以空腹1 后血糖> 11. lmmol/L者入選糖尿病大鼠模型。正 常對照組(n = 10，)單次腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。選取造模成功后的大鼠隨機分為蓮 子心提取物高劑量組(n = 10)，含蓮子心提取物^ig .kg—1，蓮子心提取物中劑量(n = 10)， 含蓮子心提取物2mg · kg、蓮子心提取物低劑量(n = 10)，含蓮子心提取物Img · kg—1，開 博通組(n = 10)，含開博通3. 6mg/kg(按照人與鼠體表面積換算，相當(dāng)于成人37. 5mg/d)灌 胃，糖尿病腎病模型組(n = 10)，正常對照組(n = 10)，正常對照組和模型組口服等量生理 鹽水。每天給藥一次，持續(xù)8wk。所有大鼠在整個實驗期間均喂標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水，不應(yīng)用 胰島素，保持墊料干燥，定期斷尾取血監(jiān)測血糖，觀察8wk。1. 2. 2標(biāo)本收集處死前準(zhǔn)確收集24h尿液，離心分裝后保存于_20°C冰箱中待測尿 蛋白和尿白蛋白含量。尾靜脈采血，血糖儀測定空腹1 后的全血血糖水平。稱量體重。末 次給藥μ小時后頸椎脫白處死大鼠，迅速取出雙側(cè)腎臟，用4°c預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)清洗， 去包膜濾紙吸干血跡后稱重左腎，左腎重(KW)和體質(zhì)量的比值作為腎臟指數(shù)(KI)的指標(biāo)。 右腎縱剖為二，一半用10%中性福爾馬林固定，留做病理學(xué)，免疫組織化學(xué)研究。另一半用 2. 5%戊二醛固定，留做透射電鏡研究。左腎置于DEPC水處理過的凍存管中，液氮凍透后轉(zhuǎn) 入-70°C冰箱待測RT-PCR。1. 2. 3測定方法M小時尿蛋白定量(Upro)，采用考馬斯亮蘭法；尿白蛋白測定，采用放射免疫法， 由北京北方生物技術(shù)研究所提供大鼠專用尿蛋白試劑盒，用SN-682型自動γ免疫計數(shù)器 檢測。1.2. 4病理學(xué)檢查光鏡標(biāo)本制作腎組織經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、切片厚4 μ m，進行HE染色。電鏡標(biāo)本制作樣品經(jīng)3%戊二醛預(yù)固定，四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水， Epon812包埋，半薄切片光學(xué)定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，日立H-600IV型 透射電鏡觀察。1.2.5免疫組化研究采用SP法，石蠟切片厚4 μ m，常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2阻斷內(nèi) 源性過氧化物酶后，在檸檬酸鈉溶液中微波抗原修復(fù)，10%正常山羊血清封閉。滴加一抗 nephrin(l 100)、podocin(1 120)和 HPA(1 100)，4°C冰箱過夜。PBS 洗片后滴加山 羊抗兔IgG工作液，37 °C孵育20min ；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37°C孵育20min ；DAB 顯色，復(fù)染、脫水、透明、封片。每例切片隨機選取10個不重復(fù)的腎小球視野(X400)，應(yīng)用 Image Proplus 6. 0軟件，檢測腎小球內(nèi)陽性信號的平均光密度和面積，用陽性指數(shù)(PI) 表示陽性物質(zhì)的相對含量，計算公式為PI =陽性信號平均光密度X陽性信號面積/腎小 球面積。1. 2. 6RT-PCR研究由基因庫分別查得大鼠η印hrin、podocin、HPA及β -actin的 mRNA核苷酸序列，PCR引物用ft~imer引物設(shè)計軟件設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有 限公司合成，見表1。表 1 大鼠 η印hrin、podocin、HPA 及 β—actin 引物序列
權(quán)利要求
1.蓮子心或其提取物在制備預(yù)防或/和治療糖尿病腎病的藥物或保健食品中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物是減輕腎小球基膜增厚，減少 腎小球上皮細胞足突融合，恢復(fù)腎小球機械屏障和電荷屏障的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的蓮子心提取物為蓮子心的水、 有機溶液提取物或酸堿提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的蓮子心有機溶液提取物為乙醇提 取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的蓮子心提取物為蓮子心總生 物堿提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的蓮子心總生物堿提取物中總生物 堿的重量百分含量為5% 95%，含有蓮子心堿的重量百分含量為 80%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述的蓮子心總生物堿提取物中總生物 堿的重量百分含量為30% 70%，含有蓮子心堿的重量百分含量為10% 30%。
8.一種治療糖尿病腎病的藥物組合物，它是由有效量的蓮子心或其提取物為活性成 分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述的制劑是口報制劑、注射制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述的制劑為片劑、口服液、丸 劑、膠囊劑、注射劑、膏劑、酊劑、散劑、沖劑、栓劑、霜劑、透皮制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了蓮子心或其提取物在制備治療糖尿病腎病藥物中的用途。蓮子心及提取物用于防治糖尿病腎病主要通過減輕腎小球基膜增厚，減少腎小球上皮細胞足突融合，恢復(fù)腎小球機械屏障和電荷屏障，從而減少蛋白的漏出。劑型可以是口服、舌下、鼻粘膜、經(jīng)皮、直腸等不同給藥的固體制劑和液體制劑等。
文檔編號A61P3/10GK102091131SQ201110056788
公開日2011年6月15日 申請日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月10日
發(fā)明者劉冬戀, 尤思路, 李宏, 鄧晶晶, 馬松濤 申請人:成都醫(yī)學(xué)院