專利名稱：一種抗腫瘤的鬼臼類中藥提取物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種抗腫瘤的鬼白類中藥提取物及其制 備方法與應(yīng)用。該抗腫瘤的鬼白類中藥提取物含有鬼白毒素類化合物與黃酮類化合物。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其死亡率僅次于心血管疾病。近年來(lái)，隨著 環(huán)境污染的加劇和飲食結(jié)構(gòu)的變化，癌癥發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告， 全球60多億人口中，每年新增的癌癥患者約為900萬(wàn)人，因癌癥而死亡的病例約700萬(wàn)人， 約占總死亡率的五分之一。雖然目前癌癥的治療采用了外科手術(shù)、化療、放療、基因治療等 綜合手段，但其臨床療效仍然難以令人滿意。在抗癌藥物中，常用的西藥占據(jù)了主導(dǎo)地位， 但這些西藥毒性很大，在治療腫瘤的同時(shí)，給患者帶來(lái)嚴(yán)重的副作用。因此需要繼續(xù)尋找新 的高效低毒的抗癌藥物。中藥及天然藥物是抗腫瘤藥物的重要源泉，據(jù)統(tǒng)計(jì)目前臨床上使 用抗腫瘤藥物，60%以上是直接或間接來(lái)源于天然產(chǎn)物。我國(guó)有豐富的藥用植物資源，并且 有幾千年的用藥經(jīng)驗(yàn)。因此，從抗癌中草藥尋找有效地抗腫瘤藥物是一條有效途徑。鬼白類中藥，應(yīng)用歷史悠久，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，其具有祛風(fēng)濕、活血 止痛、鎮(zhèn)咳平喘、祛痰等功能，可用于毒蛇咬傷、癰癤腫毒、跌打損傷、風(fēng)濕筋骨痛、胃痛、氣 管炎等。我國(guó)目前所用鬼臼類中藥，屬于小檗科，包括八角蓮屬(Dysosma versipellis)的 八角蓮及六角蓮(Dysosma pleiantha)、桃兒七屬的桃兒七(Sinopodophyllum emodi)三種 植物的根和根莖，分布較廣，產(chǎn)我國(guó)浙江、安徽、江西、湖北等省。雖然，鬼白類中藥有三個(gè)來(lái)源，但主要成分相同，均為鬼白毒素類化合物和黃酮類 化合物。其中，鬼白毒素類化合物屬環(huán)木脂內(nèi)酯型木脂素，具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用，其作用 靶標(biāo)為α -tubulin，作用位點(diǎn)與秋水仙堿相同，通過(guò)抑制微管蛋白聚合，影響了紡錘體的形 成，從而使細(xì)胞的有絲分裂停止。然而，鬼白毒素對(duì)正常細(xì)胞的微管蛋白亦具有毒性，因而 這類化合物具有強(qiáng)烈的副作用，如惡心、嘔吐、腹瀉、肝臟及神經(jīng)系統(tǒng)損傷等。黃酮類化合物 對(duì)人體的毒性低，而且具有保健功效。有學(xué)者進(jìn)行過(guò)流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)黃酮的攝取量越 高，患心臟病及癌癥的幾率降低。近年的研究發(fā)現(xiàn)，黃酮不但對(duì)多種癌細(xì)胞均具有殺傷作 用，而且能減輕抗癌藥的毒性。長(zhǎng)期以來(lái)，人們只是關(guān)注鬼臼毒素的抗腫瘤作用而忽視其中黃酮的作用。目前，尚 未有關(guān)于用鬼白類中藥中提取的鬼白毒素類化合物與黃酮類化合物搭配使用應(yīng)用于抗癌 的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種抗腫瘤的鬼臼類中 藥提取物。本發(fā)明的另一目的在于提供所述的抗腫瘤的鬼臼類中藥提取物的制備方法。本發(fā)明的再一目的在于提供所述的抗腫瘤的鬼白類中藥提取物在抗腫瘤藥物制備中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種抗腫瘤的鬼白類中藥提取物，其含有 鬼臼毒素類化合物與黃酮類化合物；所述的鬼白毒素類化合物優(yōu)選為鬼白毒素葡萄糖苷或鬼白毒素中的一種或兩 種；所述的黃酮類化合物優(yōu)選為山奈黃素-3-β-D-葡萄糖苷或山萘酚中的一種或兩 種；所述的抗腫瘤的鬼臼類中藥提取物的制備方法，優(yōu)選包含如下步驟將鬼臼類植 物的根或/和根莖干燥，粉碎，過(guò)篩，用醇溶液進(jìn)行提取，過(guò)濾，得到醇總提取液，濃縮，得到 鬼臼類中藥提取物；所述的鬼臼類植物包括八角蓮、六角蓮、桃兒七三種；所述的醇溶液優(yōu)選為乙醇溶液或甲醇溶液；所述的乙醇溶液優(yōu)選的濃度為體積百分比為50 100% ；所述的甲醇溶液優(yōu)選的濃度為體積百分比為50 100% ；所述的提取的方式為滲漉、超聲或加熱回流中的一種；所述加熱回流的條件優(yōu)選為在70 80°C進(jìn)行；所述的提取優(yōu)選至少提取3次，每次提取0. 5 Ih ；所述的抗腫瘤的鬼白類中藥提取物的制備方法，還包含如下步驟將醇總提取液 依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯提取液和正丁醇提取液分別濃縮，得到鬼臼 類中藥提取物；所述的濃縮的方式優(yōu)選為減壓濃縮至恒重；所述的抗腫瘤的鬼白類中藥提取物在抗腫瘤藥物制備中的應(yīng)用；所述的抗腫瘤的鬼白類中藥提取物優(yōu)選通過(guò)包含如下步驟的方法制備得到將鬼 臼類植物的根或/和根莖干燥，粉碎，過(guò)篩，用醇溶液進(jìn)行提取，過(guò)濾，得到醇總提取液，濃 縮，得到鬼白類中藥提取物；所述的鬼白類植物包括八角蓮、六角蓮和桃兒七三種；所述的醇溶液優(yōu)選為乙醇溶液或甲醇溶液；所述的乙醇溶液優(yōu)選的濃度為體積百分比為50 100% ；所述的甲醇溶液優(yōu)選的濃度為體積百分比為50 100% ；所述的提取的方式為滲漉、超聲或加熱回流中的一種；所述加熱回流的條件優(yōu)選為在70 80°C進(jìn)行；所述的提取優(yōu)選至少提取3次，每次提取0. 5 Ih ；所述的抗腫瘤的鬼白類中藥提取物的制備方法，還包含如下步驟將醇總提取液 依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯提取液和正丁醇提取液分別濃縮，均得到鬼 臼類中藥提取物；所述的抗腫瘤的鬼白類中藥提取物特別優(yōu)選為乙酸乙酯萃取部位的鬼白類中藥 提取物；所述的腫瘤包括前列腺癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果
(1)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)含有鬼白毒素類和黃酮類化合物的鬼白類中藥提取物具有較好的 抗腫瘤作用，特別是乙酸乙酯萃取部位具有強(qiáng)大的抗肝癌、前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌等多 種癌癥活性。而且含有鬼白毒素類和黃酮類化合物的鬼白類中藥提取物對(duì)正常細(xì)胞毒性 低。本發(fā)明所述的鬼白類中藥提取物制備方法簡(jiǎn)單。(2)將含有鬼白毒素類和黃酮類化合物的鬼白類中藥提取物應(yīng)用于制備抗腫瘤藥 物，高效低毒，符合藥物發(fā)展的要求。


圖1是實(shí)施例1得到的八角蓮提取物的HPLC色譜圖，其中A D依次分別為實(shí)施例1制備的醇總提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及 水提物的HPLC色譜圖；1為山奈黃素-3- β -D-吡喃葡萄糖苷、2為鬼臼毒素葡萄糖苷、3為鬼臼毒素、4為 山萘酚。圖2是提取物抑制前列腺癌細(xì)胞PC3增殖的活性圖，其中A為醇總提取物抑制前列腺癌細(xì)胞PC3增殖的活性圖；B為乙酸乙酯提取物抑制前列腺癌細(xì)胞PC3增殖的活性圖；C為正丁醇提取物抑制前列腺癌細(xì)胞PC3增殖的活性圖；D為水提物抑制前列腺癌細(xì)胞PC3增殖的活性圖。圖3是提取物抑制前列腺癌細(xì)胞DU145增殖的活性圖，其中A為醇總提取物抑制前列腺癌細(xì)胞DU145增殖的活性圖；B為乙酸乙酯提取物抑制前列腺癌細(xì)胞DU145增殖的活性圖；C為正丁醇提取物抑制前列腺癌細(xì)胞DU145增殖的活性圖；D為水提物抑制前列腺癌細(xì)胞DU145增殖的活性圖。圖4是提取物抑制肝癌細(xì)胞H印G2增殖的活性圖，其中A為醇總提取物抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖的活性圖；B為乙酸乙酯提取物抑制肝癌細(xì)胞H印G2增殖的活性圖；C為正丁醇提取物抑制肝癌細(xì)胞!fepG2增殖的活性圖；D為水提物抑制肝癌細(xì)胞!fepG2增殖的活性圖。圖5是提取物抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7增殖的活性圖，其中A為醇總提取物抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7增殖的活性圖；B為乙酸乙酯提取物抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7增殖的活性圖；C為正丁醇提取物抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7增殖的活性圖；D為水提物抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7增殖的活性圖。圖6是提取物抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖的活性圖，其中A為醇總提取物抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖的活性圖；B為乙酸乙酯提取物抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖的活性圖；C為正丁醇提取物抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖的活性圖；D為水提物抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖的活性圖。圖7是提取物抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞BV2增殖的活性圖，其中
A為醇總提取物抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞BV2增殖的活性圖；B為乙酸乙酯提取物抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞BV2增殖的活性圖；C為正丁醇提取物抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞BV2增殖的活性圖；D為水提物抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞BV2增殖的活性圖。圖8是三種鬼臼類中藥八角蓮、桃兒七及六角蓮化學(xué)成分的比較，其中A為八角蓮甲醇提取物的HPLC色譜圖；B為桃兒七甲醇提取物的HPLC色譜圖；C為六角蓮甲醇提取物的HPLC色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。實(shí)施例1(1)預(yù)防和治療癌癥的含鬼白毒素及黃酮提取物的制備將八角蓮原藥材(根莖部分，5. 8kg)干燥，粉碎，過(guò)100目篩，用95% (ν/ν)乙醇 溶液在常溫下進(jìn)行滲漉提取3次，每次1小時(shí)，過(guò)濾，得到總提取液；將總提取液減壓濃縮至 干燥得總提物(680g)，將此總提物混懸于水中，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到乙 酸乙酯提取液，正丁醇提取液，剩下部分即為水溶液；然后將這些萃取液減壓濃縮至恒重， 得到漿狀物，即為乙酸乙酯提取物(508g)、正丁醇提取物(68g)及水提取物(104g)。(2)對(duì)步驟(1)得到的提取物進(jìn)行分析將步驟(1)得到的各提取物溶于甲醇，配成10mg/ml的溶液，用HPLC進(jìn)行色譜 分析，色譜條件是C18反相半制備柱(5 μ m，9. 4 X 250mm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為2Mnm，流速為 lml/min，梯度系統(tǒng)為=A 水，B 乙腈；O 10min，10% (ν/ν)的乙腈溶液；10 50min，10% —100%的乙腈溶液；50 55min :100%的乙腈溶液；55 60min 100%^ 10%的乙腈溶 液；分別得到總提取物(見圖1A)、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物的指紋圖譜(見圖1)。指 紋圖譜中的四個(gè)特征峰，用波譜分析法分別鑒定為山奈黃素-3- β -D-吡喃葡萄糖苷(圖中 標(biāo)注為“1”)、鬼臼毒素葡萄糖苷(圖中標(biāo)注為“2”)、鬼臼毒素(圖中標(biāo)注為“3”)、山萘酚 (圖中標(biāo)注為“4”)，其中化合物1及4為黃酮類化合物，化合物2及3為鬼白毒素類化合物 波譜學(xué)數(shù)據(jù)如下化合物1 黃色針晶，mp 171-188 °C ；ESI-MS m/z :447[Μ-ΗΓ ；1H_WlU400MHz， CD3OD) δ η 6. 21 (1Η, d, J = 1. OHz, Η_6)，6· 43 (1Η, d, J = 1. OHz, Η_8)，8· 03 (2Η, d, J = 8. OHz, Η-2 ' ,6 ' ) ,6. 88 (2Η, d, J = 8. OHz, Η-3 ' ,5 ' ) ；Glu 5. 45 (1Η, d, J =8. OHz, H-I “ )，3. 54(1Η，dd，J = 10. 1，2. 5Ηζ，Η-6 “ )，3. 20 (1Η，dd，J = 10. 1， 2. 5Ηζ, Η-6 “ ) ,3. 29 (4Η, m, Η-2 “ 5 〃 ) ； 13C-NMR (1 OOMHz, CD3OD) δ c 143. 1 (C_2)， 133. 2 (C-3)，177. 4 (C-4)，159. 9 (C-5)，98. 7 (C-6)，164. 4 (C-7)，93. 7 (C-8)，156. 2 (C-9)， 103. 9 (C-IO), 121. O (C-I' ), 130. 9(C-2' ,6' ),115. l(C-3' ,5' ), 156. 4 (C-4 ‘ ) ；Glu 100. 9(C-1" ), 74. 2 (C-2 “ ), 76. 3 (C-3 “ ) ,77. 5 (C-5 “ ) ,69. 8 (C-4 “ )，60.8(C_6")。鑒 定化合物1為山奈黃素-3-β -D-葡萄糖苷(kaempferol-3-Ο-β -D-glucoside)。化合物2 白色晶體，mp 221 223°C ；ESI-MS m/z :599[M+Na]+ ；1H_WlU400MHz，(1Η, d, J = 4. OHz, H-1)，3. 00 (1H，dd, J = 13. 5,4. OHz, H-2)，2. 95 (1H， m, H-3)，5. 05 (1H, d, J = 9. OHz, H-4)，7. 37 (1H, s, H-5)，6. 43 (1H, s, H-8)，4. 69 (1H, dd, J =8. 5,6. 5Hz, H-Il α )，4· 21 (1Η, dd, J = 8. 5,6. 5Hz, H-Il β )，6· 42 (2Η, s, H-2' ,6')， 5. 92 (2Η, s, OCH2O), 3. 71 (9Η, s, 3‘，4'，5' -OCH3) ；Glu 4. 39 (1Η, d, J = 7. 2Hz, H-I “)， 3. 89(lH，dd，J = 10. 8，1. 8Hz，H_6 〃)，3. 75 (1H，dd，J = 10. 8，1. 8Hz，H_6 〃 ), 3. 36(4H,m, H-2“ 5〃 ) ；1V-WR(1 OOMHz，CD3OD) δ c 43. 8 (C_l)，44. 9 (C_2)，39. 2 (C_3)，78. 9 (C_4)， 108. 3，108. 7(C-5，8)，147. 7 (C_6)，147. 3 (C_7)，131. 7，131. 3(C_9，10) ,70. 1 (C-Il)， 175. 5(C-12)，136. 8(C-1 ' )，108.3(C_2'，6' )，152.4(C_3'，5' )，136.4(C-4')， 101. 3 (OCH2O) ,59. 7(3'，5' -OCH3), 61. 4 (4' -OCH3) ;Glu 102. 3 (C_l 〃)，73.8(C_2〃)， 76.8(C-3〃，5〃 ),70. l(C-4" )，61.4(C_6〃)。鑒定化合物2為鬼臼毒素葡萄糖苷(podo phyllotoxin-4-O-β -D-glucoside)?；衔? 白色晶體，mp 158 160 °C ； ESI-MS m/z :413[Μ_ΗΓ ；1H_WlU400MHz， CD3OD) δΗ 4. 73 (1Η, d, J = 1. 5Hz, H-1) ,2. 99 (1H, dd, J=L 5,4. 5Hz, H-2), 2. 73 (1H, m, H-3), 4. 71 (1H, d, J = 8. 5Hz, H-4), 7. 11 (1H, s, H-5), 6. 42 (1H, s, H-8), 4. 50 4. 56 (1H, m, H-Il α )，4. 10 (1H, dd, J = 9. 5,9. OHz, H-Il β )，6· 43 (2H, s, H-2' ,6' )，5. 92 (2H, s, OCH2O)，3· 72 (6H，s，3 ‘，5 ‘ -OCH3), 3. 71 (3H, s，4 ‘ -OCH3) ； 13C-NMR (100MHz, CD3OD) δ c 45. 5 (C-I)，46. 2 (C-2)，42. 0 (C-3)，73. 0 (C-4)，107. 4 (C-5)，148. 9 (C-6,7)，110. 5 (C-8)， 135. 5 (C-9), 132. 5 (C-10), 72. 8 (C-Il), 177. 2 (C-12), 138. 2 (C-1 ‘ )，109.8(C_2'，6')， 153. 8(C-3' ,5' ), 138. 0 (C-4‘ ), 102. 7 (OCH2O), 61. 1(4' -OCH3), 56. 6 (3‘ ,5' -OCH3)。 鑒定化合物3為鬼臼毒素(podophyllotoxin)?；衔? 黃色粉末，mp 300 302 °C ； ESI-MS m/z :303[M+H]+ ；1H_WlU400MHz， DMS0-d6) δΗ 6. 31 (1Η, d, J = 1. OHz, Η_6)，6. 55 (1Η，d, J = 1. OHz, H-8), 8. 17 (2Η, d, J =10. OHz, Η-2 ‘，6' ) ,7. 05 (2Η, d, J = 10. OHz, Η-3 ‘，5' ) ,9. 52 (1Η, br. s,3-0H), 12·8(1Η，br.s，5-0H)，ll. 1(1Η，br.s，7-0H)，10.5(lH，br.s，4 ' -OH) ； 13C-WR(100MHz， DMS0-d6) δ c 146. 6 (C-2)，136. 0 (C-3)，175. 2 (C-4)，160. 3 (C-5)，98. 4 (C_6)，163. 9 (C_7)， 94. 2 (C-8) ,157. 3 (C-9)，103. 7 (C-10) ,121. 1 (C-1 ‘ ), 129. 6 (C-2 ‘，6' ), 115. 6 (C-3 ‘， 5' ),159. 7 (C-4')。鑒定化合物 4 為山萘酚(kaempferol)?；衔?-4的結(jié)構(gòu)式如下(3)對(duì)步驟(1)得到的含鬼白毒素及黃酮提取物的抗腫瘤活性進(jìn)行檢測(cè)①采用MTT法檢測(cè)步驟(1)得到的八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取 物、水提取物分別對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC3(購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取單層培養(yǎng)的PC3細(xì)胞(RPMI 1640，含有10 % ν/ν胎牛血清)，用質(zhì)量體積比0. 25 %的 胰蛋白酶溶液消化，并接種于96孔板上(每孔加入細(xì)胞懸浮液100 μ 1，細(xì)胞數(shù)為3000個(gè))。 接種M小時(shí)后，加入不同濃度待測(cè)樣品，并以相同體積比DMSO作為對(duì)照。培養(yǎng)72小時(shí)后， 每孔加入20 μ 1 MTT溶液(5mg/ml)，4小時(shí)后離心棄上清液，加入DMSO(100 μ 1/孔)，振 蕩15min左右，置酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，波長(zhǎng)為570nm，并計(jì)算細(xì)胞存活率，同時(shí)作圖并用SPSS 18. 0軟件求得半數(shù)抑制濃度(IC5tl)。結(jié)果如圖2所示，隨著八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物濃度的升 高，癌細(xì)胞PC-3的抑制率明顯升高，其IC5tl值分別為0. 039,0.019,9. 882 μ g/mL，而水提 取物無(wú)活性。八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物的IC5tl值低，其抗前列腺癌活性非常顯著。 與對(duì)照相比，八角蓮總提取物在濃度彡0. 005μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組有顯著性差異(P <0.01)；乙酸乙酯提取物在濃度彡0.00125 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組亦有顯著性差異(P < 0. 01)。②采用MTT法檢測(cè)步驟(1)得到的八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取 物、水提取物對(duì)前列腺癌細(xì)胞DU145(購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。 取單層培養(yǎng)的DU145細(xì)胞(RPMI 1640，含有10% ν/ν胎牛血清)，用質(zhì)量體積比0. 25%的胰 蛋白酶溶液消化，并接種于96孔板上(每孔加入細(xì)胞懸浮液100 μ 1，細(xì)胞數(shù)為3000個(gè))。 接種M小時(shí)后，加入不同濃度待測(cè)樣品，并以相同體積比DMSO作為對(duì)照。培養(yǎng)72小時(shí)后， 每孔加入20 μ 1 MTT溶液(5mg/ml)，4小時(shí)后離心棄上清液，加入DMSOdOOy 1/孔)，振 蕩15min左右，置酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，波長(zhǎng)為570nm，并計(jì)算細(xì)胞存活率，同時(shí)作圖并用SPSS 18. 0軟件求得半數(shù)抑制濃度(IC5tl)。結(jié)果如圖3所示，隨著八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物濃度的 升高，癌細(xì)胞DU145的抑制率明顯升高，其IC5tl值分別為0. 020,0. 026、6. 7 μ g/mL而水 提取物無(wú)活性。八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物的IC5tl值低，其抗前列腺癌活性非常顯 著。與對(duì)照相比，八角蓮總提取物在濃度彡0. 0025 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組有顯著性差 異(P < 0. 01)；乙酸乙酯提取物在濃度彡0. 0013 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組有顯著性差異 (P < 0. 01)；正丁醇提取物在濃度彡0. 625 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組亦有顯著性差異(P < 0. 01)。③采用MTT法檢測(cè)步驟(1)得到的八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取 物、水提取物對(duì)肝癌細(xì)胞IfepG2(購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取單 層培養(yǎng)的H印G2細(xì)胞(RPMI 1640，含有10% ν/ν胎牛血清)，用質(zhì)量體積比0.25%的胰蛋白 酶溶液消化，并接種于96孔板上(每孔加入細(xì)胞懸浮液100 μ 1，細(xì)胞數(shù)為3000個(gè))。接種 24小時(shí)后，加入不同濃度待測(cè)樣品，并以相同體積比DMSO作為對(duì)照。培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔 加入20 μ 1 MTT溶液(511^/1111)，4小時(shí)后離心棄上清液，加入01^0(10(^1/孔)，振蕩15111士11 左右，置酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，波長(zhǎng)為570nm，并計(jì)算細(xì)胞存活率，同時(shí)作圖并用SPSS 18. 0軟件 求得半數(shù)抑制濃度(IC5tl)。結(jié)果如圖4所示，隨著八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物濃度的升 高，癌細(xì)胞H印G2的抑制率明顯升高，其IC5tl值分別為0. 009,0. 009,3. 222 μ g/mL而水提 取物無(wú)活性。八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物的IC5tl值低，其抗肝癌活性非常顯著。與 對(duì)照相比，八角蓮總提取物在濃度彡0. 0025 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組有顯著性差異(P
8<0.01)；乙酸乙酯提取物在濃度彡0.0013 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組有顯著性差異(P
<0.01)；正丁醇提取物在濃度彡0.625 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組亦有顯著性差異(P
<0. 01)。④采用MTT法檢測(cè)步驟(1)得到的八角蓮總提取物、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物 對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7(購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取單層培養(yǎng)的 MCF7細(xì)胞(RPMI 1640，含有10% ν/ν胎牛血清)，用質(zhì)量體積比0. 25%的胰蛋白酶溶液消 化，并接種于96孔板上(每孔加入細(xì)胞懸浮液100 μ 1，細(xì)胞數(shù)為3000個(gè))。接種M小時(shí)后， 加入不同濃度待測(cè)樣品，并以相同體積比DMSO作為對(duì)照。培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加入20 μ 1 MTT溶液(5!^/!111)，4小時(shí)后離心棄上清液，加入01^0(10(^1/孔)，振蕩15min左右，置酶 標(biāo)儀測(cè)定OD值，波長(zhǎng)為570nm，并計(jì)算細(xì)胞存活率，同時(shí)作圖并用SPSS 18. 0軟件求得半數(shù) 抑制濃度(IC50)。結(jié)果如圖5所示，隨著八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物濃度的升 高，癌細(xì)胞MCF7的抑制率明顯升高，其IC5tl值分別為:0.011,0. 009、12. 294 μ g/mL而水提 取物無(wú)活性。八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物的IC50值低，其抗乳腺腺癌活性非常顯 著。與對(duì)照相比，八角蓮總提取物在濃度彡0. 0025 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組有顯著性差 異(P < 0. 01)；乙酸乙酯提取物在濃度彡0. 0025 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組有顯著性差異 (P < 0. 01)；正丁醇提取物在濃度彡1. 25 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組亦有顯著性差異(P < 0. 01)。⑤采用MTT法檢測(cè)步驟(1)得到的八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取 物、水提取物對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa(購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取 單層培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞(RPMI 1640，含有10%胎牛血清)，用質(zhì)量體積比0. 25%的胰蛋白酶 溶液消化，并接種于96孔板上(每孔加入細(xì)胞懸浮液100 μ 1，細(xì)胞數(shù)為3000個(gè))。接種M 小時(shí)后，加入不同濃度待測(cè)樣品，并以相同體積比DMSO作為對(duì)照。培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加 入20 μ 1 MTT溶液(511^/1111)，4小時(shí)后離心棄上清液，加入01^0(10(^1/孔)，振蕩15min 左右，置酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，波長(zhǎng)為570nm，并計(jì)算細(xì)胞存活率，同時(shí)作圖并用SPSS 18. 0軟件 求得半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果如圖6所示，隨著八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物濃度的 升高，癌細(xì)胞HeLa的抑制率明顯升高，其IC50值分別為0. 07,0. 001、19. 152 μ g/mL而水 提取物無(wú)活性。八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物的IC50值低，其抗宮頸癌活性非常顯 著。與對(duì)照相比，八角蓮總提取物在濃度彡0. 02 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組有顯著性差 異(P < 0. 01)；乙酸乙酯提取物在濃度彡0. 0025 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組有顯著性差 異(P < 0. 01)；正丁醇提取物在濃度彡5.0 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組亦有顯著性差異(P < 0. 01)。⑥采用MTT法檢測(cè)步驟(1)得到的八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取 物、水提取物對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞BV2 (購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。 取單層培養(yǎng)的BV2細(xì)胞(RPMI 1640，含有10% ν/ν胎牛血清)，用質(zhì)量體積比0. 25%的胰 蛋白酶溶液消化，并接種于96孔板上(每孔加入細(xì)胞懸浮液100 μ 1，細(xì)胞數(shù)為3000個(gè))。 接種M小時(shí)后，加入不同濃度待測(cè)樣品，并以相同體積比DMSO作為對(duì)照。培養(yǎng)72小時(shí)后， 每孔加入20 μ 1 MTT溶液(5mg/ml)，4小時(shí)后離心棄上清液，加入DMSO(100 μ 1/孔)，振蕩15min左右，置酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，波長(zhǎng)為570nm，并計(jì)算細(xì)胞存活率，同時(shí)作圖并用SPSS 18. 0軟件求得半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果如圖7所示，隨著八角蓮總提取物、乙酸乙酯、正丁醇提取物濃度的升高，癌 細(xì)胞BV2的抑制率明顯升高，其IC50值分別為0. 002,0. 001,32. 22 μ g/mL而水提取物無(wú) 活性。八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物的IC50值低，其抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤活性非常顯著。與 對(duì)照相比，八角蓮總提取物在濃度彡0. 0025 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組有顯著性差異(P
<0. 01)；乙酸乙酯提取物在濃度彡0. 00125 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組有顯著性差異(P
<0. 01)；正丁醇提取物在濃度彡28. 889 μ g/ml時(shí)，處理組與對(duì)照組亦有顯著性差異(P
<0. 01)。對(duì)比實(shí)施例1(1)預(yù)防和治療癌癥的含鬼臼毒素及黃酮提取物的制備同實(shí)施例1步驟(1)。(2)對(duì)步驟(1)得到的提取物進(jìn)行分析同實(shí)施例1步驟O)。(3)對(duì)步驟(1)得到的提取物對(duì)正常細(xì)胞毒性的檢測(cè)采用MTT法檢測(cè)步驟(1)得到的八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取 物、水提取物對(duì)綠猴腎細(xì)胞VER0(購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取 單層培養(yǎng)的VERO細(xì)胞(DMEM，含有10% ν/ν胎牛血清)，用質(zhì)量體積比0. 25%的胰蛋白酶 溶液消化，并接種于96孔板上(每孔加入細(xì)胞懸浮液100 μ 1，細(xì)胞數(shù)為3000個(gè))。接種M 小時(shí)后，加入10 μ g/ml待測(cè)樣品，并以相同體積比DMSO作為對(duì)照。培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加 入20 μ 1 MTT溶液(511^/1111)，4小時(shí)后離心棄上清液，加入01^0(10(^1/孔)，振蕩15min 左右，置酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，波長(zhǎng)為570nm，并計(jì)算細(xì)胞存活率?？偺崛∥铩⒁宜嵋阴ヌ崛∥?、正丁醇提取物、水提取物在10yg/ml的濃度下對(duì) VERO細(xì)胞的抑制率分別為34. 51%、48. 44%、18%、15. 65%。因此，在超過(guò)對(duì)上述癌細(xì) 胞IC5tl值100倍的濃度下。八角蓮總提取物、乙酸乙酯提取物對(duì)于正常細(xì)胞的毒性未達(dá)到 50 %，相對(duì)于其抗癌活性而言，其對(duì)正常細(xì)胞的毒性不大。對(duì)比實(shí)施例2三種鬼臼類中藥八角蓮、桃兒七及六角蓮化學(xué)成分的比較(1)樣品制備分別取八角蓮、六角蓮及桃兒七藥材(均為根莖部分)各0. 5g，用IOml甲醇超聲 提取1小時(shí)，提取液用0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾，濾液取20 μ 1注入HPLC進(jìn)行分析。(2)分析條件采用HP 1100儀器系統(tǒng)，反相色譜柱(150X4. 6讓，3 μ m;Al Itech，USA)，流動(dòng)相 water (A) and CH3CN(B).梯度洗脫系統(tǒng)0_15min 15% — 30% B ； 15_30min :30 60% B ；30-35min,60% B ；35_40min，60%— 15% B，流速0. 8ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)236nm。(3)分析條件結(jié)果如圖8所示，三種鬼臼類中藥八角蓮、桃兒七及六角蓮的主要色譜峰的保留 時(shí)間一致，說(shuō)明它們的化學(xué)成分非常接近。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤的鬼白類中藥提取物，其特征在于其含有鬼白毒素類化合物與黃酮類化 合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的鬼白類中藥提取物，其特征在于所述的鬼白毒素 類化合物為鬼白毒素葡萄糖苷或鬼白毒素中的一種或兩種；所述的黃酮類化合物為山奈黃素_3-β -D-葡萄糖苷或山萘酚中的一種或兩種。
3.權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤的鬼白類中藥提取物的制備方法，其特征在于包含如 下步驟將鬼白類植物的根或/和根莖干燥，粉碎，過(guò)篩，用醇溶液進(jìn)行提取，過(guò)濾，得到醇 總提取液，濃縮，得到鬼白類中藥提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤的鬼白類中藥提取物的制備方法，其特征在于所述 的鬼白類植物為八角蓮、六角蓮或桃兒七中的至少一種；所述的醇溶液為乙醇溶液或甲醇溶液；所述的提取的方式為滲漉、超聲或加熱回流中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗腫瘤的鬼白類中藥提取物的制備方法，其特征在于所述 的乙醇溶液的濃度為體積百分比為50 100% ；所述的甲醇溶液的濃度為體積百分比為50 100% ；所述加熱回流的條件為在70 80°C進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤的鬼白類中藥提取物的制備方法，其特征在于還包含 如下步驟將醇總提取液依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，將得到的乙酸乙酯萃取液和正丁醇 萃取液分別濃縮，得到鬼白類中藥提取物。
7.權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤的鬼白類中藥提取物在抗腫瘤藥物制備中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的抗腫瘤的鬼白類中藥提取物通過(guò) 包含如下步驟的方法制備得到(1)將鬼白類植物的根或/和根莖干燥，粉碎，過(guò)篩，用醇溶液進(jìn)行提取，過(guò)濾，得到醇 總提取液；(2)將步驟(1)得到的醇總提取液依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到的乙酸乙酯 提取液和正丁醇提取液；步驟(1)得到的醇總提取液以及步驟( 得到的乙酸乙酯提取液和正丁醇提取液分別 濃縮，得到的濃縮物均為抗腫瘤的鬼白類中藥提取物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的濃縮的方式為減壓濃縮。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為前列腺癌、肝癌、乳腺癌、 宮頸癌或神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗腫瘤的鬼臼類中藥提取物及其制備方法與應(yīng)用。該抗腫瘤的鬼臼類中藥提取物含有鬼臼毒素類化合物與黃酮類化合物。本發(fā)明通過(guò)將鬼臼類植物干燥，粉碎，過(guò)篩，用醇溶液進(jìn)行提取，過(guò)濾，得到醇總提取液；再將醇總提取液依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到的乙酸乙酯提取液和正丁醇提取液；醇總提取液、乙酸乙酯提取液和正丁醇提取液的濃縮物均為抗腫瘤的鬼臼類中藥提取物。本發(fā)明證實(shí)含有鬼臼毒素類和黃酮類化合物的鬼臼類中藥提取物具有較好的抗腫瘤作用，特別是乙酸乙酯萃取部位。而且本發(fā)明所述的鬼臼類中藥提取物對(duì)正常細(xì)胞毒性低。將該鬼臼類中藥提取物應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物，高效低毒，符合藥物發(fā)展的要求。
文檔編號(hào)A61K36/29GK102133255SQ20111005414
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者姜飛, 李娟 , 江仁望, 田海妍 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)