一種制備具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性的低分子牡蠣多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物多糖的分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性的低分子牡蠣多糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤逃避機體的免疫系統(tǒng)已成為人類腫瘤免疫治療的一個重大問題。近年來研究發(fā)現(xiàn)，樹突狀細(xì)胞不僅是最強的抗原提呈細(xì)胞，而且具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、誘導(dǎo)免疫耐受的作用。特別是腫瘤浸潤樹突狀細(xì)胞，其表型一旦被腫瘤改變，主要表現(xiàn)為MHC-1I和CD86等的表達(dá)缺失，即可誘導(dǎo)免疫耐受，從而支持腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。設(shè)法扭轉(zhuǎn)腫瘤浸潤樹突狀細(xì)胞的免疫耐受，已成為抗腫瘤免疫治療的一個重要靶點。
[0003]從自然界提取的多種多糖化合物有顯著的抗腫瘤活性，主要與其具有免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)，在抗腫瘤方面，多糖類成分主要通過作用于免疫系統(tǒng)中各種淋巴細(xì)胞(如單核巨噬細(xì)胞、Τ、B淋巴細(xì)胞等)的增殖，促進(jìn)工L-2、TNF、IFN等細(xì)胞因子的分泌以及抗體的生成，發(fā)揮其特異的抑瘤或殺瘤作用；多糖還能通過細(xì)胞毒性作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、清除自由基和抑制血管生成等方式發(fā)揮其抗腫瘤作用。目前己發(fā)現(xiàn)部分多糖有明顯的抗腫瘤活性。范引科等研究表明多糖對小鼠移植性實體瘤具有明顯的抑制作用，多糖具有拮抗環(huán)磷酞胺對小鼠血清溶血素生成的抑制作用，明顯增強免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。李健等研究表明龍葵多糖具有抑制腹水型腫瘤U14生長、延長荷瘤小鼠存活時間的作用，推測該多糖可能是通過激活機體內(nèi)免疫系統(tǒng)的活動，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌而發(fā)揮其抗腫瘤作用。宋高臣等研究表明樺菌芝多糖能夠抑制HepA小鼠腫瘤生長，增加免疫器官重量，促進(jìn)體內(nèi)工L-2的產(chǎn)生，提高小鼠單核吞噬細(xì)胞功能，說明樺菌芝多糖作為生物誘導(dǎo)劑能夠增強荷瘤小鼠的免疫功能，從而起到抗腫瘤作用。付桃利等研究表明，多糖對機體的免疫系統(tǒng)受到嚴(yán)重的肝損傷有明顯療效。
[0004]牡蠣是一種具有藥用價值的海洋經(jīng)濟(jì)貝類動物，其肉中除含有豐富的蛋白質(zhì)外還存在大量的糖原和多糖，也開發(fā)出了牡蠣多糖的多種用途，包括降血壓、抗凝血、提高免疫功能、抗白細(xì)胞下降等。目前，已公開多種牡蠣多糖的制備方法，一般都是利用熱水浸提法進(jìn)行粗提，然后再以酸、堿、乙醇等作為溶劑進(jìn)行后續(xù)處理等。如陳騫等公開了牡蠣糖原的提取方法，包括采用熱水浸提、醇沉及除蛋白等步驟制備了牡蠣糖原，分子量分布范圍為1.0X 104-4.0X 107D;專利CN101012285B公開了制備牡蠣多糖的方法，包括:取大連灣牡蠣或太平洋牡蠣，用0?10°C的水清洗牡蠣;用0.3?0.5MPa壓力，70?80°C溫度煮牡蠣20?45分鐘，過濾、收集上清液;離心去沉淀，將上清液用濃度60?70 %的乙酸調(diào)至pH5-6，酸解1?3h，用膜分離器截留分子量為30000Da以下的物質(zhì)；用NaOH調(diào)解30000Da以上濾液的pH至6-8，離心去沉淀，取上清液在蒸饋水中透析除鹽;通過Sephadex G-100分子篩層析柱，收集0D280nm吸收峰，透析除鹽后冷凍干燥，最終獲得了相對分子量為4000-6500Da的牡蠣多糖。
[0005]從天然生物中分離的多糖多為大分子量的多糖，把較高分子質(zhì)量的多糖降解為低分子質(zhì)量，能顯著提高其活性，制備低分子質(zhì)量的多糖已為新藥篩選的一個重要方向。牡蠣肉提取物具有多種生物活性，至今對牡蠣高分子量多糖體的免疫調(diào)節(jié)作用也有研究，但尚未見對牡蠣低分子多糖的報道?，F(xiàn)有技術(shù)提取牡蠣多糖的方法很多，如何有效的制備獲得具有高效生物活性、具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性的低分子量牡蠣多糖，是本領(lǐng)域內(nèi)面臨的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，發(fā)明人通過研究，提供了一種具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用的低分子量牡蠣多糖的提取方法，通過該方法可以有效提取獲得高純度、分子量為1900-2000D的低分子量牡蠣多糖，進(jìn)一步通過生物實驗研究，該低分子量多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能和抗腫瘤效果。
[0007]具體的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案:
[0008]首先，本發(fā)明公開了一種低分子量牡蠣多糖的提取方法，包括如下步驟:
[0009](1)將新鮮牡蠣去外殼，牡蠣肉用清水沖洗；
[0010](2)將步驟(1)所得的牡蠣肉進(jìn)行高壓熱水浸提，提取溫度110-130°c，提取壓力為2000-2500hPa，時間1_3小時，過濾得提取液上清液；
[0011](3)將步驟(2)所得上清液減壓濃縮，用sevage法去蛋白；
[0012](4)將步驟(3)去蛋白后所得液體減壓濃縮采用乙醇沉淀；
[0013](5)將步驟(4)所得沉淀加蒸餾水溶解；
[0014](6)將步驟(5)所得溶解液經(jīng)-30°C-_80°C反復(fù)凍融和離心2-3次，去除沉淀，取上清液，減壓濃縮；
[0015](7)步驟(6)減壓濃縮后的溶液經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠柱層析純化，采用硫酸-苯酚法檢測，收集在490nm最大吸收峰的洗脫液，所得洗脫液經(jīng)冷凍干燥或烘干，即為低分子牡蠣多糖。
[0016]本發(fā)明所述方法通過各工序順序、各步驟工藝條件的結(jié)合，可以有效的將較高分子質(zhì)量的多糖處理為低分子質(zhì)量多糖，并結(jié)合純化，最終提取到分子量1900-2000D的低分子量牡蠣多糖。發(fā)明人通過多次試驗嘗試，不同的工藝條件的組合和工藝參數(shù)條件下，可獲得多種均一多糖，其分子量相差較大，其活性(免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤性質(zhì))也不同，發(fā)明人通過篩選，最終獲得了本發(fā)明所述具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性的低分子牡蠣多糖。
[0017]優(yōu)選的，步驟(2)中，高壓熱水浸提的蒸餾水與牡蠣肉的液料比為3-6:1，更優(yōu)選的，液料比為5:1。
[0018]優(yōu)選的，步驟(2)中，高壓熱水浸提取溫度121°C，提取壓力為2300hPa，時間1-3小時，提取次數(shù)1-3次。
[0019]優(yōu)選的，步驟(3)中，上清液在40°C條件下減壓濃縮，用sevage法去蛋白3-5次。高壓熱水浸提后降溫進(jìn)行濃縮，可以提高濃縮效率。
[0020]優(yōu)選的，步驟⑷中，用最終濃度30% -70 %乙醇沉淀。
[0021 ]優(yōu)選的，步驟(5)中，沉淀按液料比5:1加蒸餾水溶解
[0022]優(yōu)選的，步驟(6)中，離心條件為10，OOOrpm，lOmin。
[0023]其次，本發(fā)明還公開了上述方法制備得到的低分子量多糖。低分子牡蠣多糖的分子量為 1900-2000D。
[0024]進(jìn)一步的，本發(fā)明還公開了所述低分子量多糖用于制備免疫調(diào)節(jié)的產(chǎn)品的用途。所述免疫調(diào)節(jié)為促進(jìn)⑶4+T細(xì)胞的增值效應(yīng)和IL-2、IFN- γ的產(chǎn)生。
[0025]本發(fā)明還公開了所述低分子量多糖用于制備抗腫瘤產(chǎn)品和/藥物中的用途。
[0026]優(yōu)選的，所述腫瘤包括肉瘤(纖維肉瘤)、黑色素瘤等。
[0027]本發(fā)明通過將所得低分子牡蠣多糖用RPM1-1640配置成一系列濃度溶液，作用于小鼠roil C+樹突狀細(xì)胞，可顯著促進(jìn)⑶11C+樹突狀細(xì)胞細(xì)胞表面MHC-11、⑶86、⑶80、⑶40等分子的表達(dá)，促進(jìn)其對同種⑶4+T細(xì)胞的增值效應(yīng)和IL-2、IFN-y的產(chǎn)生，呈現(xiàn)劑量依賴性?？诜蜃⑸涞头肿佣嗵?lg/kg)，對多種荷瘤小鼠的腫瘤(小鼠肉瘤S-180、小鼠纖維肉瘤Meth-A、小鼠黑色素瘤B16)生長均有顯著抑制作用。
[0028]本發(fā)明取得了以下有益效果:
[0029](1)本發(fā)明通過對現(xiàn)有牡蠣多糖提取工藝進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化，通過改變提取條件和工序，可以有效的把較高分子質(zhì)量的牡蠣多糖降解為低分子質(zhì)量牡蠣多糖，并結(jié)合凝膠柱層析純化進(jìn)行低分子量牡蠣多糖的有效分離，得到了分子量1900-2000D的低分子量牡蠣多糖。
[0030](2)本發(fā)明所制備得到的低分子量牡蠣多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的增值效應(yīng)和IL-2、IFN- γ的產(chǎn)生，提高免疫能力;而且，本發(fā)明所述低分子量牡蠣多糖具有明顯的抗腫瘤效果，對于多種荷瘤腫瘤細(xì)胞(小鼠肉瘤S-180、小鼠纖維肉瘤Meth-A、小鼠黑色素瘤Β16)生長均有顯著抑制作用。
【附圖說明】
[0031]圖1實施例1低分子牡蠣多糖的SepharoseCL-6B制備柱洗脫曲線
[0032]圖2低分子牡蠣多糖的高壓液相色譜分析，其分子量約為1，950D
[0033]圖3低分子牡.多糖的傅里葉紅外光譜分析，化學(xué)組成為a-D_glucopyranose(a-D-吡喃葡萄糖)
[0034]圖4低分子牡蠣多糖對腫瘤浸潤樹突狀細(xì)胞MHC-1I表達(dá)的促進(jìn)作用
[0035]圖5低分子牡蠣多糖處理后腫瘤浸