專利名稱：胰島細胞片、制造方法及其利用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在醫(yī)學、生物、藥物開發(fā)、藥學等領域有用的胰島細胞片、制造方法及其利用方法。
背景技術：
胰臟是生物體內(nèi)的重要臟器之一，其由將淀粉酶等消化酶分泌到十二指腸內(nèi)的外分泌腺和胰島構成。胰臟的90%以上被外分泌腺所占據(jù)，作為內(nèi)分泌細胞的細胞團的胰島如島般漂浮存在于其中。胰島由4種內(nèi)分泌細胞構成，即在動物的臟器之一的胰臟中分泌胰高血糖素的α細胞(Α細胞)、分泌使血糖量降低的激素胰島素的β細胞(B細胞)、分泌生長抑素的δ細胞和分泌胰多肽的PP細胞。其中，β細胞是指分散存在于許多脊椎動物的胰臟內(nèi)的球形內(nèi)分泌腺組織，主要分泌胰島素并進行血糖的調節(jié)。據(jù)說，胰島的直徑為 100 300 μ m，人的情況下，每Img胰臟有10 20個胰島，整個胰臟中存在100萬個以上的胰島。嚙齒類中，β細胞位于胰島的中心部，α、δ、PP細胞位于周邊部，但是在人中該分布沒有嚙齒類那樣明確。若該胰島的功能發(fā)生障礙，則會引起嚴重的疾病。例如，若β細胞的胰島素分泌斷絕，會導致重癥糖尿病。在該重癥糖尿病病例中，血糖控制多為非常困難，除了糖尿病相關的并發(fā)癥之外，還多產(chǎn)生胰島素給藥后的低血糖發(fā)作，生活質量(QOL)極其不良。迄今為止，對于這樣的重癥糖尿病患者進行了各種各樣的治療。其中，胰島移植是以穩(wěn)定的胰島素供給為目的的療法，與移植胰臟這一臟器本身相比侵襲較低，因而最近開始受到注目。目前，加入了組織工學技術，例如，專利文獻I中開發(fā)了在生物體外的蜂窩狀多孔質體上制造該胰島的方法；專利文獻2中開發(fā)了在三維培養(yǎng)裝置中制造胰島的方法等。眾多開發(fā)者對胰島移植相關技術進行了研究，但現(xiàn)狀是這里所利用的細胞為胰島或者胰島樣細胞團，若對它們進行移植，則為了將營養(yǎng)成分和氧供給至該細胞團內(nèi)部的細胞，不得不在門靜脈等血管中或肝臟組織等血流豐富的部位進行移植。近年來，已經(jīng)確立了與移植方法相關的草案，并且治療成績逐漸提高，但是即便如此，據(jù)說糖尿病患者I年后的胰島素給藥脫離率也不過45%左右(參照非專利文獻I)。作為該方法的問題點，可列舉出血液介導的即刻炎性反應(IBMIR)和伴隨胰島導致的栓塞門靜脈區(qū)域的缺血引起的炎性反應。其結果，喪失了所移植的胰島的半數(shù)以上(參照非專利文獻2、3、4)。為了解決這些問題，希望對胰島進一步實施組織工學加工。在這樣的背景的基礎下，專利文獻3中記載了下述新型的細胞培養(yǎng)法在于基材表面包覆了在水中的上限或下限臨界溶解溫度為O 80°C的聚合物的細胞培養(yǎng)支撐體上，在上限臨界溶解溫度以下或下限臨界溶解溫度以上的溫度培養(yǎng)細胞，然后設為上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，從而無需進行酶處理而將培養(yǎng)細胞剝離。另外，專利文獻4中記載了下述內(nèi)容利用該溫度響應性細胞培養(yǎng)基材，在上限臨界溶解溫度以下或下限臨界溶解溫度以上的溫度培養(yǎng)皮膚細胞，然后設為上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，從而以低損傷將培養(yǎng)皮膚細胞剝離。通過利用溫度響應性細胞培養(yǎng)基材，變得能對于現(xiàn)有的培養(yǎng)技術實現(xiàn)各種各樣的新型的發(fā)展。專利文獻5中，將該技術進一步發(fā)展，發(fā)現(xiàn)通過將肝組織內(nèi)存在的實質細胞制成細胞片，從而可以長期維持肝組織細胞功能，這在現(xiàn)有技術中是很困難的。但是，對于具有特殊形態(tài)的胰島，迄今尚未進行任何研究。現(xiàn)有技術文獻專利文獻專利文獻I :日本特開2008-278769號公報專利文獻2 :日本特開2006-304791號公報專利文獻3 :日本特開平02-211865號公報專利文獻4 :日本特開平05-192138號公報 專利文獻5 日本再表2007-080990號公報非專利文獻非專利文獻I :The New England Journal of Me dicine, 355，1318-1330 (2006)非專利文獻2 !Xenotransplantation, 14 (4), 288-297 (2007)非專利文獻3 Journal of Leukocyte Biology, 77 (5), 587-597 (2005)非專利文獻4 !Pharmacological Reviews, 58，194-243 (2006)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題本發(fā)明是為了解決上述那樣的與胰島移植技術相關的問題而進行的。即，本發(fā)明提供基于與現(xiàn)有技術完全不同的構思的新型的胰島細胞片、制造方法及其利用方法。用于解決問題的方案為了解決上述課題，本發(fā)明人從各種角度加以討論并進行了研究開發(fā)。結果發(fā)現(xiàn)，通過破壞胰島的形態(tài)并將其再構筑成片狀，從而無需移植到血管內(nèi)，在血流缺乏的組織中也可以植活。本發(fā)明是基于該見解而完成的。S卩，本發(fā)明提供一種胰島細胞片，其能夠移植到血管內(nèi)以外的部位并具有胰島素產(chǎn)生功能。另外，本發(fā)明提供在包覆有溫度響應性聚合物的基材表面制作該胰島細胞片的方法。進而，本發(fā)明提供利用所得到的胰島細胞片的方法。本發(fā)明是使用基于細胞片這一世界上無類似物的新想法的細胞結構物首次實現(xiàn)的、極其重要的發(fā)明。發(fā)明的效果若利用本發(fā)明所示的胰島細胞片，則無需將胰島細胞移植到血管內(nèi)之類的血流中，即使移植到例如皮下組織之類的血流缺乏的組織中，也可以充分表現(xiàn)出胰島細胞自身所具有的功能。


圖I是示出實施例I的概要的圖。圖2是示出實施例I的細胞片的剝離的概要的圖。圖3是示出實施例I的在溫度響應性培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的胰島細胞的圖。倍率為100倍。圖4是對實施例I的在溫度響應性培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的胰島細胞內(nèi)存在的胰島素進行染色的圖。倍率為400倍。圖5是示出對實施例I的與培養(yǎng)基中的糖濃度對應的胰島素分泌能力進行討論的結果的圖。圖6是示出將實施例I的在溫度響應性培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的胰島細胞片剝離時的情況的圖。圖7是示出對實施例I中得到的胰島細胞片進行HE染色的結果的圖。倍率為400
倍。 圖8是示出對實施例I中得到的胰島細胞片內(nèi)的胰島素進行染色的結果的圖。倍率為400倍。圖9是示出將實施例I中得到的胰島細胞片移植到大鼠的背部的皮下時的情況的圖。圖10是示出對實施例I中從移植部位摘除的胰島細胞片內(nèi)的胰島素進行染色的結果的圖。圖11是示出實施例4中向糖尿病化SCID小鼠移植胰島細胞片后的血中葡萄糖量(濃度)的變化的結果的圖(標題鏈脲菌素誘發(fā)糖尿病化S CID小鼠中的大鼠胰島細胞片移植后的血中葡萄糖量的變化)。另外，圖11中記載的線圖表示基于以下條件的數(shù)據(jù)。Non fasting blood glucose levels of the streptozotocin-induced diabeticSCID mice after transplantation.At day 0，2islet cell sheets(triangle:n=5)orsingle islet cells(circular:n=3)were transplanted into the subcutaneous spaceon the dorsal site of diabetic SCID mice. Sham-operation (square:n=4). Data areshowed as a mean土SEM. *P〈0. 05(Student’ s t test)g卩，圖11表示出鏈脲菌素誘發(fā)糖尿病化SCID小鼠中的大鼠胰島細胞片移植后的非絕食狀態(tài)下的血中葡萄糖量的變化。O天和2天后，胰島細胞片(三角n = 5)或個別的胰島細胞(黑圓n = 3)被移植到糖尿病化S CID小鼠的背面的皮下。將進行了假手術的小鼠(方形n = 4)作為對照。數(shù)據(jù)以平均值土SEM表示。P < 0.05(學生t檢驗)。圖12是示出實施例5中向糖尿病化SCID小鼠移植胰島細胞片后進行葡萄糖負荷試驗時的血中葡萄糖量(濃度)的變化的結果的圖(標題葡萄糖負荷試驗)。另外，圖12中記載的線圖表示基于以下條件的數(shù)據(jù)。Intraperitoneal glucose tolerant test(IPGTT，2g of glucose/kg bodywt) of the streptozotocin-induced diabetic ornon-diabetic SCID mice thatreceived 2 islet cell sheets. IPGTT was performed 60 days after islet cellsheet transplantation. IPGTT results showing glucose concentrations before (time0) and 15，30，60，90，120，150 min after glucose administration. Diabetic SCIDmice with 2islet cell sheets (n=7，triangle)，diabetic SCID mice with sham-operation(n=5，square)，non-diabetic SCID mice without islet cell sheettransplantation(n=ll, circle). Data were represented as a mean土SEM.g卩，圖12示出接受了 2片胰島細胞片移植的、鏈脲菌素誘發(fā)糖尿病化或非糖尿病化SCID小鼠的腹腔內(nèi)葡萄糖負荷試驗(IPGTT，每Ikg體重為2g葡萄糖)的結果。IPGTT在胰島細胞片移植后第60天實施。IPGTT的結果表示葡萄糖給藥前(O分鐘)和葡萄糖給藥后15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、150分鐘的葡萄糖濃度。該試驗中使用的小鼠為具有2片胰島細胞片的糖尿病化SCID小鼠(η = 7，三角)、進行了假手術的糖尿病化S CID小鼠(η = 5，方形)、和接受了胰島細胞片移植的非糖尿病化SCID小鼠(η = 11，黑圓)。數(shù)據(jù)以平均值土SEM表示。圖13是示出實施例6中向糖尿病化S CID小鼠移植胰島細胞片后的胰島細胞片的情況的圖(標題胰島細胞片移植后的組織學分析(胰島素免疫染色))。
具體實施例方式本發(fā)明的胰島細胞片中使用的胰島細胞是由胰臟回收的細胞。本發(fā)明中，只要其中含有表現(xiàn)胰島素產(chǎn)生功能的β細胞即可，該β細胞的含有比例沒有任何限制，不過考慮到本發(fā)明的胰島細胞片的原本的目的是產(chǎn)生胰島素，則β細胞的含有比率優(yōu)選為 40%以上，進一步優(yōu)選為50%以上，更優(yōu)選為60%以上。關于β細胞以外的細胞的種類、比率，也沒有任何限制，可以含有胰島中所含的α細胞、S細胞、PP細胞。若本發(fā)明的胰島細胞片內(nèi)含有α細胞，則形成還產(chǎn)生胰高血糖素的胰島細胞片，若含有PP細胞，則形成分泌胰多肽的胰島細胞片，在進一步表現(xiàn)胰島樣的功能的意義上是優(yōu)選的。若利用本發(fā)明的胰島細胞片，則能感知胰島細胞片周圍的糖濃度，并根據(jù)該濃度產(chǎn)生胰島素、和/或胰島所產(chǎn)生的其他生理活性物質。本發(fā)明中，還可以含有胰島原本所含細胞以外的細胞，其種類沒有任何限制，例如可列舉出塞托利細胞(Sertoli cell)、胰管細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管內(nèi)皮祖細胞、肝實質細胞、骨髓來源細胞、脂肪來源細胞中的任一種細胞或混合了兩種以上細胞的細胞。另外，這些細胞各自的含有比例也沒有特別限定。本發(fā)明中使用的細胞可列舉出從生物體組織直接采集的細胞；人工多能干細胞(iPS細胞)、胚胎干細胞(胚性干細胞)等從生物體組織直接采集、之后在培養(yǎng)體系等中分化的細胞；或者細胞株，其種類沒有任何限制。這些細胞的來源沒有特別限制，例如，可列舉出人、或者大鼠、小鼠、豚鼠、狨猴、兔、狗、貓、綿羊、豬、黑猩猩或它們的免疫缺陷動物等，在將本發(fā)明的胰島細胞用于人的治療時，希望使用人、豬、黑猩猩來源的細胞。本發(fā)明中的用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基只要使用RPMI 1640等對于培養(yǎng)細胞常用的培養(yǎng)基即可，沒有特別限制。本發(fā)明中，需要對胰島內(nèi)的細胞進行酶處理，從而使其成為單個細胞的狀態(tài)。胰島為穩(wěn)定的細胞團，將其移植到生物體時，由于所移植的是細胞團，因而不得不移植到血流豐富的血管內(nèi)。本發(fā)明中將該穩(wěn)定的胰島進一步分散為單個細胞，雖然通過該分散操作使得β細胞等有用細胞受到若干損傷，但是所得到的胰島細胞片不會像細胞團那么厚，因此不需要像細胞團那樣移植到血流豐富的血管內(nèi)。此時的處理方法依照常規(guī)方法即可，沒有任何限制。另外，培養(yǎng)時接種的細胞數(shù)因使用細胞的動物種類而異，通常適宜為O. 4Χ IO6
2.5 X IO6 個 /cm2，優(yōu)選為 O. 5 X IO6 2. I X IO6 個 /cm2，進一步優(yōu)選為 O. 6 X IO6 I. 7 X IO6個/cm2。接種濃度低于O. 4X IO6個/cm2時，胰島細胞的增殖差，所得到的胰島細胞片的功能表現(xiàn)程度變差，在實施本發(fā)明的方面來看是不優(yōu)選的。另外，在接種濃度高于2. 5 X IO6個/cm2時，胰島細胞的增殖也差，所得到的胰島細胞片的功能表現(xiàn)程度也變差，在實施本發(fā)明的方面來看是不優(yōu)選的。
本發(fā)明中，在于表面包覆了水合力在O 80°C的溫度范圍變化的聚合物的細胞培養(yǎng)支撐體上，在聚合物的水合力弱的溫度區(qū)域培養(yǎng)上述細胞。該溫度通常優(yōu)選為培養(yǎng)細胞的溫度、即37°C。本發(fā)明中使用的溫度響應性高分子可以是均聚物、共聚物中的任意一種。作為這樣的高分子，可列舉出例如日本特開平2-211865號公報中記載的聚合物。具體而言，例如通過以下的單體的均聚或共聚獲得。作為能夠使用的單體，可列舉出例如(甲基)丙烯酰胺化合物、N-(或N，N-二)烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物或乙烯基醚衍生物，在共聚物的情況下，這些之中可以使用任意的2種以上。此外，還可以使用與上述單體以外的單體類的共聚、聚合物彼此之間的接枝或共聚、或者聚合物、共聚物的混合物。另外，在不損害聚合物本來的性質的范圍內(nèi)，還可以進行交聯(lián)。此時，由于所培養(yǎng)、剝離的物質是細胞，因而分離在5°C 50°C的范圍進行，因此作為溫度響應性聚合物，可列舉出聚-N-正丙基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度21°C )、聚-N-正丙基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度27°C )、聚-N-異丙基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度32V )、聚-N-異丙基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度43°C )、聚-N-環(huán)丙基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度45°C )、聚-N-乙氧基乙基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度約350C )、聚-N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度約45°C )、聚-N-四 氫糠基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度約28°C)、聚-N-四氫糠基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度約35°C )、聚-N，N-乙基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度56°C )、聚-N，N- 二乙基丙烯酰胺(均聚物的下限臨界溶解溫度32°C )等。作為本發(fā)明中使用的用于共聚的單體，可列舉出聚丙烯酰胺、聚-N，N- 二乙基丙烯酰胺、聚-N，N- 二甲基丙烯酰胺、聚環(huán)氧乙烷、聚丙烯酸及其鹽、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚丙烯酸羥乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、纖維素、羧甲基纖維素等含水聚合物等，沒有特別限制。本發(fā)明中使用的在基材表面包覆上述各聚合物的方法沒有特別限制，例如，對于基材和上述單體或聚合物，可以通過電子射線照射(EB)、Y射線照射、紫外線照射、等離子體處理、電暈處理、有機聚合反應中的任意一種，或者通過涂布、混煉等物理吸附等來進行包覆。培養(yǎng)基材表面的溫度響應性聚合物的包覆量適宜為I. I 2. 3μ g/cm2的范圍，優(yōu)選為I. 4 I. 9 μ g/cm2,進一步優(yōu)選為I. 5 I. 8 μ g/cm2。包覆量少于I. I μ g/cm2時，即使進行刺激，該聚合物上的細胞也難以剝離，作業(yè)效率顯著變差，故不優(yōu)選。相反若為2. 3 μ g/cm2以上，則細胞難以附著于該區(qū)域，難以使細胞充分地附著。該情況下，若在溫度響應性聚合物包覆層上進一步包覆細胞粘接性蛋白質，則基材表面的溫度響應性聚合物包覆量可以為2. 3 μ g/cm2以上，此時的溫度響應性聚合物的包覆量適宜為9. O μ g/cm2以下，優(yōu)選為8. O μ g/cm2以下,適合為7. O μ g/cm2以下。若溫度響應性聚合物的包覆量為9. O μ g/cm2以上，則即使在溫度響應性聚合物包覆層上進一步包覆細胞粘接性蛋白質，細胞也難以附著，故不優(yōu)選。這樣的細胞粘接性蛋白質的種類沒有任何限定，可列舉出例如膠原、層粘連蛋白、層粘連蛋白5、纖連蛋白、基質膠等中的單獨I種或者2種以上的混合物。另外，這些細胞粘接性蛋白質的包覆方法依照常規(guī)方法即可，通常，采用下述方法在基材表面涂布細胞粘接性蛋白質的水溶液，然后將該水溶液除去并沖洗。本發(fā)明是利用了溫度響應性培養(yǎng)皿的、盡可能利用細胞片自身的技術。因此，溫度響應性聚合物層上的細胞粘接性蛋白質的包覆量極多是不優(yōu)選的。溫度響應性聚合物的包覆量、以及細胞粘接性蛋白質的包覆量的測定依照常規(guī)方法即可，可列舉出例如使用FT-IR-ATR直接測定細胞附著部的方法；利用同樣的方法將預先標簽化的聚合物固定，并根據(jù)固定于細胞附著部的標簽化聚合物量來推測的方法等，可以使用任意一種方法。本發(fā)明的方法中，為了將所培養(yǎng)的細胞片從溫度響應性基材剝離回收，能夠通過將所培養(yǎng)的細胞所附著的培養(yǎng)基材的溫度設為培養(yǎng)基材上的包覆聚合物的上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下而使其剝離。此時，可以在培養(yǎng)液中進行，也可以在其他等滲液中進行，可以根據(jù)目的選擇。為了更快、更高效地將細胞剝離、回收，可以單獨或合用下述方法輕輕敲打或晃動基材的方法、進而使用移液管攪拌培養(yǎng)基的方法等。溫度以外的培養(yǎng)條件依照常規(guī)方法即可，沒有特別限制。例如，關于使用的培養(yǎng)基，可以是添加了公知的胎牛血清(FCS)等血清的培養(yǎng)基，另外，也可以是未添加這樣的血清的無血清培養(yǎng)基。以聚(N-異丙基丙烯酰胺)作為溫度響應性聚合物的例子，對上述內(nèi)容進行說明。已知聚(N-異丙基丙烯酰胺)是在31°C具有下限臨界溶解溫度的聚合物，若為游離狀態(tài)，其在水中于31°C以上的溫度引起脫水合，聚合物鏈凝聚、發(fā)生白濁。相反在31°C以下的溫度
下，聚合物鏈水合，成為溶解于水中的狀態(tài)。本發(fā)明中，該聚合物包覆、固定在培養(yǎng)皿等基材表面。因此,若為31°C以上的溫度,貝U基材表面的聚合物也同樣地脫水合，但由于聚合物鏈包覆、固定在基材表面，因此基材表面顯示出疏水性。相反，若為31°C以下的溫度，則基材表面的聚合物水合，但由于聚合物鏈包覆、固定在基材表面，因此基材表面顯示出親水性。此時的疏水性的表面是細胞能夠附著、增殖的適度的表面，并且，親水性的表面成為細胞無法附著的表面，培養(yǎng)中的細胞、或者細胞片也可以僅通過冷卻而剝離。作為實施包覆的基材，以通常在細胞培養(yǎng)中所用的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等化合物為首，可以使用通常能夠賦予形態(tài)的物質、例如上述以外的聚合物化合物、陶瓷類等全部。本發(fā)明中的培養(yǎng)基材的形狀沒有特別限制，可列舉出例如碟、多孔板、燒瓶、細胞插件那樣的形態(tài)的基材、或者平膜狀的基材等。本發(fā)明中的胰島細胞片是在溫度響應性基材上制作的，其培養(yǎng)時不會受到以分散酶(dispase)、胰蛋白酶等為代表的蛋白質分解酶所帶來的損傷。因此，從基材剝離的胰島細胞片具有粘接性蛋白質，在將胰島細胞以片狀剝離時以某種程度保持了細胞與細胞間的橋粒結構。由此，在移植時能夠與患部組織良好地粘接，能夠實施效率良好的移植。通常關于作為蛋白質分解酶的分散酶，就細胞與細胞間的橋粒結構而言，已知能夠以保持10 40%的狀態(tài)進行剝尚，但由于基本上破壞了細胞與基材間的基底I旲樣蛋白質等，因此所得到的細胞片的強度弱。與之相對，本發(fā)明的胰島細胞片為橋粒結構、基底膜樣蛋白質均殘存60%以上的狀態(tài)，能夠得到上述那樣的各種效果。如此，得到本發(fā)明中的胰島細胞片。本發(fā)明中，該細胞片可以是多片層積而成的。其層積片數(shù)沒有特別限定，層積次數(shù)適宜為10次以下，優(yōu)選為8次以下，進一步優(yōu)選為4次以下。若層積胰島細胞片，則單位面積細胞片的細胞密度提高，作為胰島細胞片的功能也提聞，故優(yōu)選。本發(fā)明中使用的細胞片層積體也可以是以與下述片組合的狀態(tài)層積而成的用于向細胞片內(nèi)導入血管的血管內(nèi)皮細胞或血管內(nèi)皮祖細胞等的細胞片、或者用于胰島細胞片的免疫隔離的軟骨細胞片等由其他細胞所形成的片。此時，若利用2種以上不同的細胞，則在不同的細胞間相互作用，得到具有更高活性的細胞片，故優(yōu)選。此時所利用的細胞沒有特別限定，例如，為塞托利細胞、軟骨細胞、胰管細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管內(nèi)皮祖細胞、肝實質細胞、骨髓來源細胞、脂肪來源細胞中的任一種細胞的細胞片或兩種以上這些細胞混合而成的細胞片。另外，其層積的位置、順序、層積次數(shù)沒有特別限制，根據(jù)包覆或填補的組織，使用粘接性強的滑膜來源細胞片等適宜進行改變。另外，層積次數(shù)適宜為10次以下，優(yōu)選為8次以下，進一步優(yōu)選為4次以下。此時，在選擇了血管內(nèi)皮細胞時，可以利用在細胞片層積體內(nèi)構筑血管網(wǎng)的方法來預防。該構筑血管網(wǎng)的方法沒有特別限定，可列舉出例如在層積體內(nèi)預先混雜血管內(nèi)皮細胞的方法、在制造層積體時層積血管內(nèi)皮細胞片的方法、或者將細胞片層積體埋入在生物體內(nèi)而構筑血管網(wǎng)的方法等。關于制作本發(fā)明中的細胞片層積體的方法，也沒有特別限定，例如可以通過下述方式獲得以片狀剝離培養(yǎng)細胞，根據(jù)需要使用培養(yǎng)細胞移動夾具使培養(yǎng)細胞片彼此層積。此時，關于培養(yǎng)基的溫度，在包覆于培養(yǎng)基材表面的上述聚合物具有上限臨界溶解溫度時，為該溫度以下即可；另外在上述聚合物具有下限臨界溶解溫度時，為該溫度以上即可，沒有特別限制。但是，當然在培養(yǎng)細胞不增殖的低溫區(qū)域、或者培養(yǎng)細胞死亡的高溫區(qū)域下的培養(yǎng)是不合適的。溫度以外的培養(yǎng)條件依照常規(guī)方法即可，沒有特別限制。例如，關于所使用 的培養(yǎng)基，可以是公知的添加了胎牛血清(FCS)等血清的培養(yǎng)基，另外，也可以是未添加這樣的血清的無血清培養(yǎng)基。并且，所使用的培養(yǎng)細胞移動夾具只要能夠捕捉剝離后的細胞片則沒有特別限定，可列舉出例如多孔膜、紙、橡膠等的膜類、板類、海綿類等，為了易于進行層積操作，可以利用在帶柄的夾具上安裝有多孔膜、紙、橡膠等的膜類、板類、海綿類等的工具。本發(fā)明中，在使胰島細胞片的功能穩(wěn)定的意義上，還可以對胰島細胞片包覆合成聚合物或天然聚合物，或者根據(jù)常規(guī)方法進行微膠囊化。此時的聚合物的包覆法、微膠囊化方法、以及所使用的材料沒有任何限定，通常，可以將聚乙烯醇、氨基甲酸酯、纖維素及其衍生物、幾丁質、殼聚糖、膠原、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅等材料制成膜狀、多孔膜狀、無紡布狀、織布狀并使其與胰島細胞片接觸而使用。由此，本發(fā)明中的細胞片層積體是指，從包覆有溫度響應性聚合物的細胞培養(yǎng)基材上剝離，根據(jù)需要使用培養(yǎng)細胞移動夾具，從而得到培養(yǎng)細胞片，該培養(yǎng)細胞片在培養(yǎng)時沒有受到以分散酶、胰蛋白酶等為代表的蛋白質分解酶所帶來的損傷，培養(yǎng)時所形成的細胞與基材間的基底膜樣蛋白質也沒有受到酶的破壞，而且細胞與細胞間的橋粒結構得到保持，結構的缺陷少，強度高。在使胰島細胞片貼緊時使用的載體是用于保持本發(fā)明的細胞的結構物，可以使用例如高分子膜或由高分子膜成型的結構物、金屬性夾具等。例如，在使用高分子作為載體的材質時，作為其具體的材質，可列舉出聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯、聚乙烯、纖維素及其衍生物、紙類、幾丁質、殼聚糖、膠原、氨基甲酸酯、明膠等。載體的形狀沒有特別限定。能夠將本發(fā)明中得到的胰島細胞片移植到生物體內(nèi)的規(guī)定部位。該移植部位可以是生物體內(nèi)的任意場所，沒有特別限定，可列舉出例如皮下組織、大網(wǎng)膜、腹腔內(nèi)組織、腹膜下組織、肝臟、肌肉、筋膜下組織等。其中，特別是從存在豐富的血管且移植行為容易的方面出發(fā)，優(yōu)選大網(wǎng)膜。其移植部位可以預先實施血管誘導，也可以不實施，沒有特別限定。這里，實施血管誘導的方法也沒有特別限定，例如，可列舉出下述方法將作為血管增殖因子的FGF包埋在微球中，一邊改變該微球的組成、大小、注入范圍，一邊作用于生物體8 10天；將聚對苯二甲酸乙二醇酯網(wǎng)切割成任意的大小，制作袋狀物，向該袋的內(nèi)側加入溶解于高濃度瓊脂糖溶液的FGF，8 10天后除去該袋，從而制作進行了血管誘導的空間；等等。無論何種方法，本發(fā)明中得到的胰島細胞片均無需像以往的胰島移植那樣移植到血管內(nèi)那樣的血流下。在以往的胰島的情況下，若將它們進行移植，為了使營養(yǎng)成分和氧供給至該細胞團內(nèi)部的細胞，不得不在門靜脈等血管中或肝臟組織等血流豐富的部位進行移植，與此相對，本發(fā)明的胰島細胞片僅排列了一層所構成的胰島細胞，因此能夠容易地將營養(yǎng)成分和氧供給至構成細胞片的細胞，因而，本發(fā)明的胰島細胞片無需移植到血管內(nèi)這樣的血流豐富的部位，能夠移植到血管內(nèi)以外的通常的組織中。本發(fā)明的胰島細胞片僅通過簡便的移植即可表現(xiàn)出對于生命的維持而言不可欠缺的胰腺功能。本發(fā)明中所移植的胰島細胞片保持了基底膜樣蛋白質，植活性極其良好。移植時根據(jù)目的改變細胞數(shù)即可，所移植的細胞為片狀時，通過改變其大小或形狀，能夠改變胰島功能的總活性度。若將本發(fā)明所示的胰島細胞片用于人，則所移植的胰島細胞片在人的生物體內(nèi)長 期表現(xiàn)胰島功能，以該狀態(tài)成為人工胰臟。可以通過所剝離的胰島細胞片的大小或形狀、或者這兩者來控制功能的表現(xiàn)量。例如以I型糖尿病、2型糖尿病、慢性胰腺炎等各疾病的本質性治療、或胰臟全摘除后的治療、或者胰腺功能輔助為目的而使用這樣的人工胰臟，沒有特別限定。若將本發(fā)明所示的胰島細胞片移植至動物，則成為胰島細胞移植動物?？梢酝ㄟ^所剝離的胰島細胞片的大小或形狀來控制功能的表現(xiàn)量。這里所使用的動物可列舉出大鼠、小鼠、豚鼠、狨猴、兔、狗、豬、黑猩猩或者它們的免疫缺陷動物等，沒有特別限定。例如，以胰腺功能評價系統(tǒng)等為目的而使用這樣的胰島移植動物，沒有特別限定，所述胰腺功能評價系統(tǒng)為對該胰島移植動物給藥待測物質，并判定該待測物質對胰腺功能的影響。實施例以下，基于實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明，但這些實施例并不對本發(fā)明造成任何限定。實施例I在溫度響應性培養(yǎng)皿上培養(yǎng)由各臟器得到的細胞，成為鋪滿(confluent)的狀態(tài)后，實施低溫處理，從而能夠以片狀回收細胞。該技術已經(jīng)應用于心肌、角膜上皮、食道粘膜上皮、肝細胞等，但尚無使用胰島的研究(圖I)。胰島細胞的分離對于出生后8周的大鼠(Lewins rat、雄性、體重約250g),在異氟燒(isofIurane)麻醉下剖腹，進行胰島的摘除。使所摘除的胰島在膠原酶溶液中反應32分鐘，之后通過使用Ficol I液的濃度梯度法將胰島分離。然后，對于所得到的胰島，在O. 125%胰蛋白酶-EDTA中反應5分鐘，從而使胰島成為單個細胞。此時，細胞保管于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich公司制)中。所得到的胰島細胞的活性(viability)為90%以上。胰島細胞的培養(yǎng)作為細胞培養(yǎng)基材，使用對聚苯乙烯制的35mm細胞培養(yǎng)皿(Corning公司制)包覆了作為溫度響應性聚合物的聚-N-異丙基丙烯酰胺而成的基材。溫度響應性聚合物的包覆依照日本特開平02-211865號公報所示的方法進行，最終得到溫度響應性聚合物的包覆量為4. 9 μ g/cm2的溫度響應性細胞培養(yǎng)基材。本實驗中，在該溫度響應性細胞培養(yǎng)基材表面進一步涂覆O. 2 μ g/cm2的層粘連蛋白5(CHEMIC0N公司)，在其表面接種5. 7X105個/cm2的上述胰島細胞，以該狀態(tài)培養(yǎng)2天。此時，作為培養(yǎng)基，利用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich公司制)。包覆了聚-N-異丙基丙烯酰胺的基材表面在32°C以上時為疏水性，在32°C以下時為親水性。由此，在37°C的培養(yǎng)條件下能夠粘接培養(yǎng)，為37°C以下時，無需進行胰蛋白酶處理而以片狀剝離(圖2)。胰島細胞片評價培養(yǎng)第2天，培養(yǎng)皿上胰島細胞的密度幾乎接近100% (圖3)。利用胰島素染色對該培養(yǎng)皿上鋪滿的胰島細胞進行了觀察，結果7 8成的細胞確認為胰島素陽性(圖4)。接著，對于另外準備的溫度響應性培養(yǎng)基材上的胰島細胞，使用以葡萄糖濃度為3mM、20mM、3mM的方式制作的培養(yǎng)基，分別每隔I小時更換一次培養(yǎng)基，測定培養(yǎng)基中的胰島素濃度。其結果，證明了與糖濃度相應的胰島素分泌能力(圖5)。進而，使用PKH26 (SIGMA)對胰島細胞片進行了熒光染色。結果可知，所得到的細胞為胰島細胞。 接著，將所得到的胰島細胞片在20°C的培養(yǎng)室中靜置30分鐘，接著使用支撐膜(CellShifter ,CellSeed公司制)由溫度響應性培養(yǎng)基材表面剝離胰島細胞片。采集后，在培養(yǎng)皿上沒有確認到細胞殘留(圖6)。進而，將胰島細胞片以附著于支撐膜上的狀態(tài)封入到包埋劑中，制成冷凍切片。對切片進行HE染色、胰島素染色，并利用熒光顯微鏡、進而利用電子顯微鏡對細胞內(nèi)的結構進行觀察。其結果，觀察到胰島細胞片為一層的片狀(圖7)。另外，還確認到該胰島細胞片由胰島素陽性細胞和陰性細胞形成(圖8)。進而，由電子顯微鏡觀察可知，所得到的胰島細胞片中橋粒結構、基底膜樣蛋白質均以無損傷的狀態(tài)存在。胰島細胞片的移棺、移棺評價最后，將所得到的胰島細胞片移植到與供體相同種類的大鼠(Lewis rat、出生后8周、雄性、體重約250g)中。在背部以L字狀切開皮膚，剝離皮下，露出該部位的筋膜。在該處靜置使用上述支撐膜采集的胰島細胞片，細胞片和筋膜面附著后，向支撐膜添加生理鹽水，緩慢地除去支撐膜。通過向支撐膜添加水分，從而使支撐膜與胰島細胞片間的吸附力降低，由此胰島細胞片停留在筋膜上，能夠不弄亂片而進行移植(圖9)。移植4天后，使其失血死，然后采集背部的移植組織。將所采集的組織制成冷凍切片，利用胰島素染色進行評價，并在熒光顯微鏡下進行評價。其結果，通過預先對胰島細胞實施熒光染色，從而由移植4天后摘除的組織中確認到以胰島細胞片的狀態(tài)存在。另外，通過胰島素染色，在形成片的細胞中確認到胰島素陽性細胞的存在(圖10)。實施例2除了將實施例I中得到的胰島細胞片移植到與供體相同種類的大鼠(Lewis rat、出生后8周、雄性、體重約250g)的大網(wǎng)膜中以外，均與實施例I同樣地進行實驗。移植14天后，使其失血死，然后采集大網(wǎng)膜的移植組織。將所采集的組織制成冷凍切片，利用胰島素染色進行評價，并在熒光顯微鏡下進行評價。其結果，通過預先對胰島細胞實施熒光染色，從而由移植14天后摘除的組織中確認到以胰島細胞片的狀態(tài)存在。另外，通過胰島素染色，在形成片的細胞中確認到胰島素陽性細胞的存在。實施例3
對于實施例I中得到的胰島細胞片，層積在與實施例I相同的溫度響應性培養(yǎng)基材上另外制作的血管內(nèi)皮細胞片，制作依次層疊了胰島細胞片、血管內(nèi)皮細胞片、胰島細胞片的層積化細胞片。除了將該層積化細胞片移植到與供體相同種類的大鼠(Lewis rat、出生后8周、雄性、體重約240g)的皮下以外，均與實施例I同樣地進行實驗。移植14天后，使其失血死，然后采集皮下的移植組織。將所采集的組織制成冷凍切片，利用胰島素染色進行評價，并在熒光顯微鏡下進行評價。其結果，通過預先對胰島細胞實施熒光染色，從而由移植14天后摘除的組織中確認到以胰島細胞片的狀態(tài)存在。另外，通過胰島素染色，在形成胰島細胞片的細胞中確認到胰島素陽性細胞的存在。進而，可知血管侵入了層積化胰島細胞片中，已經(jīng)植活了具有厚度的胰島細胞片。實施例4根據(jù)常規(guī)方法制作糖尿病化SCID小鼠。具體而言，測定SCID小鼠的體重后，以220mg/kg體重的給藥量腹腔內(nèi)給藥鏈脲菌素(streptozotocin) (Sigma公司制)，從而制作糖尿病化SCID小鼠。另外，鏈脲菌素給藥后，由尾靜脈采集全血，使用小型血糖值測定器Glucocard (Hoechst Marion Roussel Japan 制)測定血糖值,將血糖值為 350mg/dL 以上 的小鼠視為糖尿病發(fā)病。利用與實施例I同樣的操作，向該糖尿病化SCID小鼠的背部皮下移植實施例I的胰島細胞片。移植后的血中葡萄糖量的變化示于圖11。確認到在糖尿病化S CID小鼠中血中葡萄糖量沒有降低，但移植了胰島細胞片的小鼠從移植后開始血中葡萄糖量迅速下降，其效果至少持續(xù)了 60天，進而60天后血中葡萄糖量也沒有再次上升的傾向。另一方面，不將胰島細胞制成片而以單個的狀態(tài)進行了同樣的實驗，但該方法中不能使血中葡萄糖量降低，而且無法使其效果持續(xù)。由此，認為本發(fā)明的胰島細胞片對于糖尿病治療有效。實施例5使用結束了實施例4后的糖尿病化SCID小鼠、胰島細胞片移植糖尿病化SCID小鼠、以及健康的SCID小鼠，對各小鼠分別再進行葡萄糖負荷試驗。此時的葡萄糖負荷量為2g/kg體重。所得到的結果示于圖12。結果確認到在糖尿病化SCID小鼠中血中葡萄糖量沒有降低，但移植了胰島細胞片的小鼠與健康的小鼠同樣地從葡萄糖負荷30分鐘后血中葡萄糖量迅速降低，其效果持續(xù)，進而150分鐘后血中葡萄糖量也沒有再次上升的傾向。由此，認為本發(fā)明的胰島細胞片對于糖尿病治療有效。實施例6實施例4中在胰島細胞片移植18天后以及89天后使其失血死，采集背部的移植胰島細胞片部分。對所采集的組織進行福爾馬林固定、并制成石蠟處理切片，利用胰島素染色進行評價。其結果，在移植了胰島細胞片的皮下組織內(nèi)胰島細胞以片狀組織化，確認到胰島素陽性細胞的存在(圖13)。由移植89天后的組織還可以確認到以下情況胰島素陽性細胞在移植部被再配置，胰島素陽性細胞彼此聚集。這暗示了本發(fā)明中移植的胰島細胞片有可能在移植部位再構成為更優(yōu)選的狀態(tài)。產(chǎn)業(yè)上的可利用件在溫度響應性培養(yǎng)基材上制作的胰島細胞片不需要將胰島細胞移植到血管內(nèi)，SP使移植到例如皮下組織那樣的血流缺乏的組織中，也能夠充分地表現(xiàn)出胰島細胞自身所具有的功能。
權利要求
1.一種胰島細胞片，其能夠移植到血管內(nèi)以外的部位并具有胰島素產(chǎn)生功能。
2.根據(jù)權利要求I所述的胰島細胞片，其中，β細胞含量為40%以上。
3.根據(jù)權利要求1、2中任一項所述的胰島細胞片，其具有胰高血糖素產(chǎn)生功能和葡萄糖濃度感知功能。
4.根據(jù)權利要求I 3中任一項所述的胰島細胞片，其中混合了塞托利細胞、胰管細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管內(nèi)皮祖細胞、肝實質細胞、骨髓來源細胞、脂肪來源細胞中的任ー種或兩種以上的細胞。
5.根據(jù)權利要求I 4中任一項所述的胰島細胞片，其層積了2個以上的胰島細胞片。
6.根據(jù)權利要求I 5中任一項所述的胰島細胞片，其在胰島細胞片上層積了塞托利細胞、軟骨細胞、胰管細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管內(nèi)皮祖細胞、肝實質細胞、骨髓來源細胞、月旨 肪來源細胞中的任一種細胞的細胞片或兩種以上細胞混合而成的細胞片。
7.根據(jù)權利要求I 6中任一項所述的胰島細胞片，其被合成聚合物和/或天然聚合物所包覆。
8.根據(jù)權利要求I 7中任一項所述的胰島細胞片，其被微膠囊化。
9.一種胰島細胞片的制造方法，其特征在于，在于表面包覆有水合力在O 80°C的溫度范圍變化的聚合物的細胞培養(yǎng)支撐體上，在聚合物的水合力弱的溫度區(qū)域培養(yǎng)胰島細胞，之后，使培養(yǎng)液的溫度變化為聚合物的水合力強的狀態(tài)，由此將所培養(yǎng)的胰島細胞以片狀剝離。
10.根據(jù)權利要求9所述的胰島細胞片的制造方法，其中，在細胞培養(yǎng)支撐體表面包覆了層粘連蛋白5。
11.根據(jù)權利要求9、10中任一項所述的胰島細胞片的制造方法，其中，將所剝離的胰島細胞片再層積到另一個胰島細胞片上，或者重復該操作，由此使胰島細胞片層積化。
12.根據(jù)權利要求9 11中任一項所述的胰島細胞片的制造方法，其中，剝離方法為不實施基于蛋白質分解酶的處理而從細胞培養(yǎng)支撐體剝離。
13.根據(jù)權利要求9 12中任一項所述的胰島細胞片的制造方法，其中，剝離方法為在培養(yǎng)結束時使載體貼緊到培養(yǎng)細胞上，與載體一起剝離。
14.根據(jù)權利要求9 13的胰島細胞片的制造方法，其中，胰島由生物體組織采集。
15.根據(jù)權利要求9 14中任一項所述的胰島細胞片的制造方法，其中，培養(yǎng)時接種的細胞數(shù)為 O. 4X IO6 2. 5 X IO6 個 /cm2。
16.根據(jù)權利要求9 15中任一項所述的胰島細胞片的制造方法，其中，水合力在O 80°C的溫度范圍變化的聚合物為聚(N-異丙基丙烯酰胺)。
17.一種胰島細胞片的利用方法，其特征在于，將所得到的胰島片移植到生物體內(nèi)的規(guī)定部位。
18.根據(jù)權利要求17所述的胰島細胞片的利用方法，其中，移植部位為生物體內(nèi)的皮下組織、大網(wǎng)膜、腹腔內(nèi)組織、腹膜下組織、肝臟、肌肉、筋膜下組織。
19.根據(jù)權利要求17、18中任一項所述的胰島細胞片的利用方法，其中，移植部位為預先實施了血管誘導的部位。
20.根據(jù)權利要求19所述的胰島細胞片的利用方法，其中，血管誘導法基于長期的FGF處理。
21.—種人工胰臟，其利用了權利要求I 8中任一項所述的胰島細胞片。
22.根據(jù)權利要求21所述的人工胰臟，其中，所剝離的胰島為片狀，且利用該片的大小和/或形狀能夠控制功能的表現(xiàn)量。
23.根據(jù)權利要求21、22中任一項所述的人工胰臟，其特征在于，其以I型糖尿病、2型糖尿病、慢性胰腺炎、胰臟全摘除后的治療、或胰腺功能輔助為目的。
24.根據(jù)權利要求21 23中任一項所述的人工胰臟，其中，通過基因導入技術而強化了胰島細胞功能。
25.一種胰島細胞移植動物，其移植了權利要求21 24中任一項所述的人工胰臟。
26.根據(jù)權利要求25所述的胰島細胞移植動物，其特征在于，動物為大鼠、小鼠、豚鼠、狨猴、兔、狗、豬、黑猩猩或它們的免疫缺陷動物。
27.一種胰腺功能評價系統(tǒng)，其特征在于，對于通過權利要求25、26中任一項所述的方法得到的胰島細胞移植動物給藥待測物質，判斷該待測物質對肝功能的影響。
全文摘要
在于表面包覆有水合力在0～80℃的溫度范圍變化的聚合物的細胞培養(yǎng)支撐體上，在聚合物的水合力弱的溫度區(qū)域培養(yǎng)胰島細胞，之后，使培養(yǎng)液的溫度變化為聚合物的水合力強的狀態(tài)，由此能夠得到片狀的胰島細胞。如此得到的片狀的胰島細胞即使在非血流條件下也具有胰島素產(chǎn)生功能。
文檔編號A61L27/00GK102858380SQ20108004439
公開日2013年1月2日 申請日期2010年8月2日 優(yōu)先權日2009年8月2日
發(fā)明者清水裕史, 大橋一夫, 鵜頭理惠, 伊勢一哉, 大和雅之, 岡野光夫, 后藤滿一 申請人:學校法人東京女子醫(yī)科大學