專利名稱：糖基化相關(guān)的材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖基化相關(guān)的材料和方法，其更具體地說涉及糖基化結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)，所述結(jié)構(gòu)耐受酶促降解，因而調(diào)節(jié)其一個(gè)或多個(gè)生物特性或整合它們的治療部分的生物特性。更具體地說，本發(fā)明涉及使活化的含氟糖底物(例如，3-氟唾液酸化合物)與糖接受體 (sugar acceptor)反應(yīng)以產(chǎn)生糖接受體與一種或多種所述唾液酸化合物的共價(jià)綴合物。
背景技術(shù)：
多數(shù)天然多肽含有糖部分，所述部分在一級(jí)多肽鏈的一些氨基酸殘基處共價(jià)連接至所述多肽。在本領(lǐng)域中，這些多肽一般稱為糖肽或糖蛋白。還已知，當(dāng)多肽存在于生物系統(tǒng)(例如，細(xì)胞或個(gè)體)時(shí)，任何給定多肽上的糖基化模式的性質(zhì)可影響其特性，所述特性包括蛋白酶抗性、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌、組織靶向、生物半衰期和抗原性。多肽的糖基化是翻譯后修飾的天然形式，其改變多肽的結(jié)構(gòu)和功能。在自然界中， 通過酶促的過程引入糖基化，導(dǎo)致不同類型糖基化多肽的位點(diǎn)特異性修飾。在N-連接的糖基化中，聚糖被連接至天冬酰胺側(cè)鏈的酰胺氮，而在0-連接的糖基化中，聚糖連接至絲氨酸和蘇氨酸側(cè)鏈的羥基氧。其他形式的糖基化包括糖胺聚糖(其連接至絲氨酸的羥基氧)、 糖脂(其中聚糖連接至神經(jīng)酰胺)、透明質(zhì)烷(其不連接至蛋白或脂質(zhì))和GPI錨(其通過聚糖連接將蛋白連接至脂質(zhì))。本領(lǐng)域中的普遍問題是糖基化通常加至真核細(xì)胞中的多肽，但很少加至經(jīng)常用于治療性多肽重組表達(dá)的原核宿主中所表達(dá)的多肽。原核宿主中產(chǎn)生的多肽中糖基化的缺乏可導(dǎo)致所述多肽被識(shí)別為外源物，或者意味著其具有其他不同于其天然形式的特性。還有一個(gè)問題是，在試圖在沒有天然糖基化的位置將糖基化改造進(jìn)入多肽來調(diào)節(jié)肽特征時(shí)，發(fā)現(xiàn)其非常困難。因此，例如在多肽的表達(dá)可引起多肽的天然糖基化形式改變(例如，在細(xì)菌宿主中表達(dá))或需要修飾多肽的糖基化形式以改進(jìn)所述多肽的一個(gè)或多個(gè)特征(尤其是當(dāng)所述多肽是治療性蛋白時(shí))的情況下，本領(lǐng)域中一直在嘗試引入或修飾多肽的糖基化形式。例如，參見US專利No =7226903中描述的干擾素β的修飾。連接至多肽的聚糖分子具有一系列直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)和不同長度的聚糖鏈，并且多肽上存在的特定聚糖分子影響所述多肽的特征。很多類型的聚糖分子包括末端唾液酸。這些在生理ρΗ下帶負(fù)電荷的9個(gè)碳原子的糖被認(rèn)為參與配體-受體相互作用，所述相互作用可極大地影響特定的細(xì)胞-細(xì)胞、病原體-細(xì)胞或藥物-細(xì)胞的通訊。包含末端唾液酸殘基的聚糖鏈的一個(gè)特別的特征是其增加以所述唾液酸糖基化的治療性多肽的半衰期。通過這樣的觀察而得知包含無末端唾液酸殘基的聚糖被肝從循環(huán)中迅速地除去，因而降低治療性多肽的半衰期。氟取代的糖已被用作不可加工的底物用于結(jié)晶酶，例如CstII (Chiu等，Nat. Struct. Mol. Biol. (2004) 11，163-170)。在這種情況下，在含氟糖的糖苷連接處，含氟的糖已知對(duì)酶促加工有抗性。
2，3-二氟唾液酸衍生物已被合成，并且用作來自寄生蟲克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi) (Watts 等，J. Am. Chem. Soc. (2003) 125,7532-7533)和讓氏錐蟲(Trypanosoma rangeli) (Watts 等，Can. J. Chem. (2004)82,1581-1588)之唾液酸酶的滅活劑。該前期工作導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)這些唾液酸酶通過共價(jià)的唾液酸基酶中間體的參與而運(yùn)作，并且確立例如該衍生物的化合物作為錐蟲唾液酸酶的時(shí)間依賴性的共價(jià)滅活劑而發(fā)揮作用。隨后，還已知在C-5具有羥基(而非天然的N-乙酰基基團(tuán))的2，3-二氟神經(jīng)氨酸衍生物也作為讓氏錐蟲(T. rangeli)唾液酸酶的共價(jià)滅活劑而發(fā)揮作用，但顯示出對(duì)原抑制劑(Watts等，J. Biol. Chem. (2006) 281，4149-4155)非常不同的動(dòng)力學(xué)行為(k非活性和
k反應(yīng)性)?？傊嚯奶擒盏男揎?尤其是對(duì)其生物特性的修飾)仍然是本領(lǐng)域中具有挑戰(zhàn)性的問題和尚未被以滿意的方式解決的問題。發(fā)明概述廣義上，本發(fā)明的基礎(chǔ)是這樣的認(rèn)識(shí)氟唾液酸化合物(例如，3-氟唾液酸化合物)可被用于與糖接受體形成綴合物，其調(diào)節(jié)所述綴合物或整合有所述綴合物的治療性部分(therapeutic moiety)的一個(gè)或多個(gè)生物特性。因此，使用這些方法所產(chǎn)生的修飾的糖基化結(jié)構(gòu)可被引入治療性部分(例如，多肽)或者是其一部分。因此，一方面，本發(fā)明涉及用于使活化的3-氟唾液酸化合物與糖接受體基團(tuán)反應(yīng)的方法，其中所述3-氟唾液酸化合物并不像本領(lǐng)域中常規(guī)使用的那樣連接至CMP基團(tuán)。該方法可酶促進(jìn)行(例如使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶(sialyl transferase)、轉(zhuǎn)唾液酸酶(trans_sialidase)或使用來自糖化學(xué)領(lǐng)域的合成技術(shù))。唾液酸轉(zhuǎn)移酶被用于轉(zhuǎn)移唾液酸衍生物至接受體糖，使用天然或修飾的天然底物(S卩，CMP-唾液酸或其衍生物)作為所述酶的供體。反轉(zhuǎn)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(inverting sialyl transferase) PmSTl已被證明將3_氟-CMP唾液酸轉(zhuǎn)移至半乳糖基接受體，然而，該反應(yīng)使用二酶一鍋法(two-enzyme one-pot method)原位產(chǎn)生天然供體糖的3_氟類似物 (Harshal 等，J. Am. Chem. Soc. (2007) 129，10630-10631)。然而，使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶，從未將非天然的活化3-氟唾液酸轉(zhuǎn)移至糖接受體，且在此之前，尚未提出將3-氟唾液酸的特性整合進(jìn)入多肽的糖基化結(jié)構(gòu)。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供包括在糖接受體和3-氟唾液酸化合物之間形成共價(jià)綴合物的方法，所述方法包括將糖接受體與3-氟唾液酸化合物相接觸，該接觸步驟在適于使3-氟唾液酸化合物與糖接受體反應(yīng)并與其共價(jià)鍵合的條件下發(fā)生，其中所述3-氟唾液酸化合物不包含胞嘧啶一磷酸(CMP，cytosine monophosphate)基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括將糖接受體、3-氟唾液酸化合物和能夠?qū)?-氟唾液酸化合物轉(zhuǎn)移至所述糖接受體的酶相接觸，該接觸步驟在適宜使3-氟唾液酸化合物轉(zhuǎn)移至糖接受體并取其共價(jià)鍵合的條件下發(fā)生。該酶可包括唾液酸轉(zhuǎn)移酶或轉(zhuǎn)唾液酸酶。作為替代或補(bǔ)充，3-氟唾液酸化合物與糖接受體的共價(jià)鍵合還通過合成化學(xué)反應(yīng)來進(jìn)行。一般來說，與3-氟唾液酸化合物之共價(jià)綴合物的形成調(diào)節(jié)糖接受體或包含所述糖接受體的治療性部分的生物特性，例如酶水解(例如，通過外-唾液酸酶 (exo-sialidase)或神經(jīng)氨酸苷酶)抗性、生物穩(wěn)定性或藥代動(dòng)力學(xué)特性。優(yōu)選地，該方法作為體外無細(xì)胞方法而進(jìn)行。在轉(zhuǎn)移反應(yīng)為酶促反應(yīng)的情況下，其可發(fā)生時(shí)伴有在3-氟唾液酸化合物和接受體糖基團(tuán)之間異頭連接處的倒轉(zhuǎn)(inversion)。 與現(xiàn)有技術(shù)中基于CMP的方法不同，本發(fā)明的方法可使用一種酶進(jìn)行。本發(fā)明還幫助克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，即已知的CMP 3-氟唾液酸化合物的少量已知例子被證明對(duì)唾液酸轉(zhuǎn)移酶非常穩(wěn)定，因而在合成氟唾液酸綴合物中并不實(shí)用。在一些實(shí)施方案中，該方法可包括修飾已存在于多肽上的糖基化結(jié)構(gòu)(例如，表達(dá)產(chǎn)生的或之前合成產(chǎn)生的糖基化結(jié)構(gòu))的步驟。在一個(gè)典型的情況下，其可包括從初始存在于多肽上的糖基化結(jié)構(gòu)中除去一個(gè)或多個(gè)末端糖基基團(tuán)以形成接受體基團(tuán)和/或用一個(gè)或多個(gè)3-氟唾液酸基團(tuán)替代糖基化結(jié)構(gòu)的末端糖基基團(tuán)的額外步驟。為了方便起見， 酶促地進(jìn)行除去所述末端糖基基團(tuán)的步驟，例如通過使用唾液酸酶來進(jìn)行?；蛘?，現(xiàn)有的糖基化結(jié)構(gòu)可被進(jìn)一步切割或改變(例如不僅除去末端糖基基團(tuán))以提供根據(jù)本發(fā)明可使用的糖接受體。此外，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可包含將多個(gè)3-氟唾液酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至多肽的接受體基團(tuán)。這樣做是為了提供額外保護(hù)，以使核心糖基化結(jié)構(gòu)免受降解。舉例來說， 通過重復(fù)連接連續(xù)的3-氟唾液酸基團(tuán)或?qū)?-氟唾液酸基團(tuán)寡聚物共價(jià)連接至接受體的方法，兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)3-氟唾液酸基團(tuán)可共價(jià)連接至接受體基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中， 3-氟唾液酸基團(tuán)可綴合至多肽上存在的糖基化結(jié)構(gòu)的末端糖基殘基。優(yōu)選地，本申請(qǐng)中公開的方法使用通式(I)所示的3-氟唾液酸化合物
權(quán)利要求
1.一種方法，其包括在糖接受體和3-氟唾液酸化合物之間形成共價(jià)綴合物，所述方法包括將所述糖接受體和3-氟唾液酸化合物相接觸，所述接觸步驟在適于使所述3-氟唾液酸化合物與所述糖接受體反應(yīng)并共價(jià)鍵合的條件下進(jìn)行，其中所述3-氟唾液酸化合物不包含胞嘧啶一磷酸(CMP)基團(tuán)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包括將所述糖接受體、所述3-氟唾液酸化合物和能夠?qū)⑺?-氟唾液酸化合物轉(zhuǎn)移至所述糖接受體的酶相接觸，所述接觸步驟在適合轉(zhuǎn)移所述3-氟唾液酸化合物并使其共價(jià)鍵合至所述糖接受體的條件下進(jìn)行。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述3-氟唾液酸化合物與所述糖接受體的共價(jià)鍵合是通過合成化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中與3-氟唾液酸化合物的共價(jià)綴合物的形成調(diào)節(jié)糖接受體或包含所述糖接受體的治療性部分的生物特性。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述生物特性是對(duì)酶水解的抵抗、生物穩(wěn)定性或藥代動(dòng)力學(xué)特性。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是體外無細(xì)胞方法。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述3-氟唾液酸化合物表示為以下通式(I)
8.權(quán)利要求7的方法，其中R1是甲磺酸酯/鹽、4-甲苯磺酸酯/鹽、三氟甲基磺酸酯/ 鹽、三氟甲基甲苯磺酸酯/鹽、咪唑磺酸酯/鹽或鹵素(F、Cl.Br, I)。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)移反應(yīng)是酶促的，伴有在3-氟唾液酸化合物和糖接受體之間異頭連接處的倒轉(zhuǎn)。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述糖接受體是糖基化結(jié)構(gòu)的一部分。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含單觸角結(jié)構(gòu)、雙觸角結(jié)構(gòu)、三觸角結(jié)構(gòu)或復(fù)合糖基化結(jié)構(gòu)。
12.權(quán)利要求10或權(quán)利要求11的方法，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含天然的或合成的單糖、寡糖或多糖。
13.權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含N連接的或0連接的糖基團(tuán)。
14.權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包括從糖基化結(jié)構(gòu)中除去末端糖基基團(tuán)以形成糖接受體基團(tuán)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述末端糖基基團(tuán)的除去是通過使用唾液酸酶酶促進(jìn)行的。
16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括將多個(gè)3-氟唾液酸化合物轉(zhuǎn)移至糖接受體。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述多個(gè)3-氟唾液酸化合物是作為寡聚體或通過重復(fù)所述綴合反應(yīng)而轉(zhuǎn)移的。
18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述糖接受體存在于或用于連接至治療性部分，例如多肽。
19.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其還包括將所述綴合物連接至治療性部分。
20.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括將多個(gè)3-氟唾液酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至多肽上存在的糖基化結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)末端糖基殘基。
21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中用于轉(zhuǎn)移所述3-氟唾液酸基團(tuán)的酶是唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
22.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中用于轉(zhuǎn)移所述3-氟唾液酸基團(tuán)的酶是轉(zhuǎn)唾液酸酶。
23.權(quán)利要求21或權(quán)利要求22的方法，其中所述酶是經(jīng)基因改造而提高轉(zhuǎn)移反應(yīng)速率和/或提高供體3-氟唾液酸分子之結(jié)合的唾液酸轉(zhuǎn)移酶或轉(zhuǎn)唾液酸酶。
24.權(quán)利要求10至23中任一項(xiàng)的方法，其包括將糖基化結(jié)構(gòu)引入多肽中位點(diǎn)的初始步馬聚ο
25.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含聚(亞烷基二醇)分子。
26.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽表示為下式 多肽-AA-L1-Gly其中AA是所述多肽的末端或內(nèi)部氨基酸殘基；L1是共價(jià)連接至所述氨基酸AA的任選的接頭基團(tuán)；Gly表示糖接受體基團(tuán)，其任選地是糖基化結(jié)構(gòu)的一部分。
27.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述綴合反應(yīng)改變所述多肽的穩(wěn)定性、生物半衰期、清除特性、水溶性和/或免疫學(xué)特征。
28.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是為了提高多肽的糖基化對(duì)唾液酸酶水解的抗性。
29.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽是紅細(xì)胞生成素、干擾素、白細(xì)胞介素、趨化因子、淋巴因子、細(xì)胞因子、胰島素、單克隆抗體或其片段、重組抗體或其片段、凝血因子、集落刺激因子、生長激素、纖溶酶原激活物、病毒來源的肽、生殖激素或治療性酶。
30.一種可通過前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法獲得的綴合物。
31.一種包含糖基化結(jié)構(gòu)之治療性部分的綴合物，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)共價(jià)鍵合至一個(gè)或多個(gè)3-氟唾液酸基團(tuán)，其中所述3-氟唾液酸基團(tuán)形成所述糖基化結(jié)構(gòu)的末端糖基基團(tuán)。
32.權(quán)利要求31的綴合物，其中所述治療性部分是多肽并且所述糖基化結(jié)構(gòu)在糖基化位點(diǎn)處和/或通過所述多肽的氨基酸殘基連接至所述多肽，任選地通過接頭基團(tuán)連接至所述多肽。
33.一種糖基化結(jié)構(gòu)，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含一個(gè)或多個(gè)3-氟唾液酸基團(tuán)并且其中所述3-氟唾液酸基團(tuán)共價(jià)鍵合至所述糖基化結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)末端糖基基團(tuán)。
34.權(quán)利要求33的糖基化結(jié)構(gòu)，其包含至少一個(gè)3-氟唾液酸基團(tuán)和另外兩個(gè)糖單元。
35.一種包含一個(gè)或多個(gè)末端3-氟唾液酸基團(tuán)的糖基化結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)表示為下式
36.權(quán)利要求35的糖基化結(jié)構(gòu)，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含單觸角結(jié)構(gòu)、雙觸角結(jié)構(gòu)、三觸角結(jié)構(gòu)或復(fù)合糖基化結(jié)構(gòu)。
37.權(quán)利要求35或權(quán)利要求36的糖基化結(jié)構(gòu)，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含天然的或合成的單糖、寡糖或多糖。
38.權(quán)利要求35至37中任一項(xiàng)的糖基化結(jié)構(gòu)，其中所述糖基化結(jié)構(gòu)包含N連接的或0 連接的糖基團(tuán)。
39.權(quán)利要求33至38中任一項(xiàng)的糖基化結(jié)構(gòu)和治療性部分的綴合物，其中的所述糖基化結(jié)構(gòu)共價(jià)鍵合至一個(gè)或多個(gè)3-氟唾液酸基團(tuán)，其中所述3-氟唾液酸基團(tuán)形成所述糖基化結(jié)構(gòu)的末端糖基基團(tuán)。
40.根據(jù)權(quán)利要求31、32或39中任一項(xiàng)的綴合物，其用于醫(yī)學(xué)處理方法中。
41.綴合物，其用于根據(jù)權(quán)利要求40的處理方法，其中所述處理是治療或診斷。
42.根據(jù)權(quán)利要求31、32或39中任一項(xiàng)的綴合物在制備用于治療病癥的藥物中的用途，所述病癥對(duì)施用所述治療性部分有響應(yīng)。
43.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求31、32或39中任一項(xiàng)的綴合物和藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
描述了糖基化技術(shù)，且更具體地說，生產(chǎn)糖基化結(jié)構(gòu)的技術(shù)，所述結(jié)構(gòu)耐受酶促降解，因而調(diào)節(jié)其一個(gè)或多個(gè)生物特性或整合了它們的治療性部分的生物特性，且特別是使活化的含氟糖底物(例如，3-氟唾液酸化合物)與糖接受體反應(yīng)以產(chǎn)生糖接受體與一種或多種唾液酸化合物的共價(jià)綴合物的技術(shù)。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102481377SQ201080031987
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月16日
發(fā)明者安德魯·格雷厄姆·沃茨, 特倫斯·坎特納, 阿曼達(dá)·芭芭拉·麥肯齊 申請(qǐng)人:巴斯大學(xué)