專利名稱：：分子的糖基化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及獲得糖基化的分子，特別是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子的方法。背景高效表達系統(tǒng)是生產(chǎn)大多數(shù)目前正在開發(fā)中的生物藥物(例如，重組蛋白)所需要的。許多這些生物藥物的生物學(xué)活性依賴于它們的修飾(例如，磷酸化或糖基化)。一種基于酵母的表達系統(tǒng)將遺傳操作和微生物發(fā)酵的簡易性與分泌和修飾蛋白的能力相結(jié)合。然而，酵母細胞中產(chǎn)生的重組糖蛋白主要展現(xiàn)為異質(zhì)性的高甘露糖和超甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)(high-mannoseandhyper-mannoseglycanstructures),其可能7十蛋白質(zhì)功能、下游力口工和后續(xù)治療用途有害，特別是在糖基化扮演重要的生物學(xué)角色的情況下。概述本發(fā)明至少部分基于(a)發(fā)現(xiàn)解脂西洋蓍霉(]^rovWa/少;o/仏'ca)細胞中的單個基因缺失(外部鏈延長(OuterCHainelongation)(OCHl)缺失)導(dǎo)致基本上均質(zhì)產(chǎn)生在MansGlcNAc2(結(jié)構(gòu)式IV;圖l)骨架上具有a-l,2-連接的甘露糖殘基的糖基化蛋白質(zhì)；(b)發(fā)現(xiàn)靶向解脂西洋蓍霉細胞(具有和不具有OCH1缺失的兩種細胞)ER的經(jīng)工程化的a-l，2-甘露糖苷酶的過表達導(dǎo)致基本上均質(zhì)產(chǎn)生具有MansGlcNAc2N-聚糖結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)式IV;圖l)的糖基化蛋白；(c)發(fā)現(xiàn)使解脂西洋蓍霉細胞中天冬酰胺連接的糖基化3(ALG3)酶活性失活導(dǎo)致糖基化聚糖水平的高度增加；和(d)發(fā)現(xiàn)解脂西洋蓍霉細胞中解脂西洋蓍霉基因(MNN4)的過表達導(dǎo)致a-1,2-連接的甘露糖殘基的超磷酸化(hyperphosphorylation)。如此，遺傳工程化的細胞(例如，解脂西洋蓍霉(Kwrow/a/j[po/"/ca)、^rxw/aat/em'w/vora"s,或其它相關(guān)種類的雙態(tài)性酵母細胞)可以在產(chǎn)生如下目標分子的方法中使用，所述目標分子如與在未經(jīng)遺傳工程化的相同種類的細胞中產(chǎn)生的目標分子的N-糖基化形式相比具有改變的N-糖基化形式。向患有代謝紊亂(例如，溶酶體貯積病(lysosomalstoragedisorder))的患者施用N-糖基化的目標分子(例如，N-糖基化蛋白)已被證明可改善所述病癥的癥狀，所描述的方法和細胞可用于制備N-糖基化的目標分子用于治療，包括但不限于，代謝紊亂，例如溶酶體貯積病。本發(fā)明還至少部分基于解脂西洋蓍霉和巴斯德畢赤酵母(尸&/^IIAC1基因的剪接形式的發(fā)現(xiàn)。由HAC1基因編碼的蛋白質(zhì)Haclp是轉(zhuǎn)錄激活因子，其通過與稱為未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(UnfoldedProteinResponse)(UPR)元件的DNA序列基序結(jié)合而激活數(shù)個靶基因的轉(zhuǎn)錄。在Haclp耙基因之中包括編碼侶伴蛋白、折疊酶(foldase)和負責脂質(zhì)和肌醇代謝的蛋白質(zhì)的那些。由于經(jīng)剪接形式Haclp是比由未經(jīng)剪接的HAC1mRNA所編碼的形式更強力的轉(zhuǎn)錄激活因子，所以Haclp轉(zhuǎn)錄因子的經(jīng)剪接形式的過表達能夠?qū)е绿烊缓彤愒吹鞍妆磉_水平的增加，以及在ER膜中的增加。由此，Haclp的經(jīng)剪接形式能夠用于在多種真核細胞(例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍霉或任何其它本文描述的酵母細胞)、植物細胞或動物細胞(例如，哺乳動物細胞的產(chǎn)生。，5、，"本發(fā)明還基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即在解脂西洋蓍霉中表達時，MNS1甘露糖香酶的突變形式能夠?qū)an8GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I;圖4)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式IV;圖4)、Man6GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式V;圖4)和Man7GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式VI;圖4)。由此，表達甘露糖苷酶如MNS1的突變形式的遺傳工程化的真核細胞(例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍霉或任何其它本文描述的酵母細胞)、植物細胞或動物細胞(例如，哺乳動物細胞如人的細胞))能夠在產(chǎn)生如下目標分子的方法中使用，所述目標如與在未經(jīng)遺傳工程化的相同種類的細胞中產(chǎn)生的目標分子的N-糖基化形式相比具有改變的N-糖基化形式。因此，所描述的方法和細胞可用于制備N-糖基化的目標分子用于治療，包括但不限于，代謝紊亂，例如溶酶體貯積病(見下文)。在一個方面，本公開描述了產(chǎn)生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法。所述方法包括向細胞引入編碼目標蛋白的核酸的步驟，其中所述細胞產(chǎn)生N-糖基化形式改變的目標蛋白，并且其中所述細胞是經(jīng)遺傳工程化而含有至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或^n:w/atwfew'm'wrara細胞(或相關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細胞)。所述方法也可包括提供經(jīng)遺傳工程化而含有至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或^rxw/a12c^em'"/vora/w細胞(或相關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細胞)的步驟。所述方法也可包括分離目標蛋白的改變的N-糖基化形式的步驟。在一些實施方案中，目標蛋白可以是內(nèi)源蛋白或外源蛋白。目標蛋白可以是哺乳動物蛋白如人的蛋白。目標蛋白可以是例如，病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細胞因子、趨化因子、抗體或其抗原結(jié)合片段，或融合蛋白。融合蛋白可以是例如，病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細胞因子或趨化因子與抗體或其抗原結(jié)合片段的融合物。目標蛋白可以是例如，與溶酶體貯積病(LSD)相關(guān)的蛋白質(zhì)。目標蛋白可以是例如，葡糖腦香酯酶、半乳糖腦苷酯酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、(3-D-半乳糖苷酶、P-葡糖苷酶、P-己糖胺酶、P-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖芬酶、芳基碌^酸酯酶B、芳基^L酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acteylgalactosaminidase)、天冬氨酰葡糖胺酶(aspartylglucosaminidase)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、(3-D-葡糖醛酸酶(p-D-glucoronidase)、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苷酶、a-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶(sphinogmyelinase)、石危酯酶、組織蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。在一些實施方案中，改變的N-糖基化形式可以含有一種或多種N-聚糖結(jié)構(gòu)如，例如，Man5GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2、Man3GlcNAc2、GlClMan5GlcNAc2、Glc2Man5GlcNAc2。在一些實施方案中，改變的糖基化可以是，例如，Man5GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2、Man3GlcNAc2、GlCiMan5GlcNAc2、Glc2Man5GlcNAc2。在一些實施方案中，目標蛋白的改變的N-糖基化形式可以是均質(zhì)的或基本上均質(zhì)的。例如，含有改變的糖基化的改變的目標分子的分數(shù)可以是至少約20%,至少約30%,至少約40%,至少約45%,至少約50%,至少約55%,至少約60%，至少約65%，至少約70%，至少約75%，至少約80%，至少約85%,至少約90%,或至少約95%或更多。在一些實施方案中，細胞可以經(jīng)遺傳工程化而缺乏至少一種N-糖基化活性。所述N-糖基化活性可以是，例如，ALG3活性、OCH1活性、MNS1活性或MNN9活性。在一些實施方案中，至少一種修飾可以是(a)缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因；(b)表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的突變形式；(c)引入或表達干擾具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的功能性表達的RNA分子；(d)13表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)(例如ALG6或a-甘露糖香酶(例如，耙向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的a-甘露糖苷酶)。表達的蛋白質(zhì)可以是由細胞中的內(nèi)源核酸編碼的蛋白質(zhì)。表達的蛋白質(zhì)可以是最適pH在7.5以下的(例如，最適pH在5.1以下)的a-甘露糖苷酶。具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是外源蛋白。具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是哺乳動物蛋白(如人的蛋白)或低等真核生物的(例如，真菌、原生動物或錐蟲)蛋白。低等真核生物可以選自下組布氏錐蟲(7Vpa/70^oma6rwcez')、口合茨木審(7h.c/oc/ermaAarz/awt/m)、#^(/41yperg///w1s)，和任何其它本文描述的低等真核生物。在一些實施方案中，N-糖基化活性可以是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性。在一些實施方案中，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是ALG6或a-甘露糖苷酶。a-甘露糖香酶可以靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。例如，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是融合蛋白，其包含a-甘露糖苷酶多肽和HDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留肽(HDELend叩lasmicreticulumretentionpeptide)。在一些實施方案中，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是能夠從Maii5GlcNAc2去除葡萄糖殘基的蛋白質(zhì)。例如，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是具有a-l,3-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)，例如，但不限于，葡糖苷酶II(例如，葡糖苷酶II的a和卩亞基之一或二者)或變聚糖酶(mutanase)。在一些實施方案中，細胞可以經(jīng)遺傳工程化而包含至少兩種經(jīng)修飾的N糖基化活性，例如任何本文描述的經(jīng)修飾的N-糖基化活性。所述至少兩種經(jīng)修飾的N-糖基化活性可以包含，例如，ALG3活性的缺乏和升高的ALG6活性水平。在一些實施方案中，細胞可以經(jīng)遺傳工程化而包含至少三種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，例如任何本文描述的經(jīng)修飾的N-糖基化活性。所述至少三種經(jīng)修飾的N-糖基化活性可以包含，例如，ALG3活性的缺乏；升高的ALG6活性水平；和升高的葡糖苷酶II活性水平。在一些實施方案中，細胞未經(jīng)遺傳工程化而缺乏OCHl活性。在一些實施方案中，修飾可以包含表達能夠影響目標蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物活性的變體。所述能夠影響目標蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物活性的變體可以是MNN4、PN01或MNN6。在一些實施方案中，糖蛋白的至少約30%的甘露糖基殘基可以是磷酸化的。在一些實施方案中，所述方法可進一步包括對糖蛋白的額外加工。額外14加工可以發(fā)生在體外或體內(nèi)。額外加工可以包括將異源模塊(moiety)添加到修飾的糖蛋白。異源模塊可以是聚合物或載體。額外加工可以包括對目標蛋白的改變的N-糖基化形式酶處理或化學(xué)處理。例如，額外加工可以包括用甘露糖苷酶、甘露聚糖酶、磷酸二酯酶、葡糖苷酶或糖基轉(zhuǎn)移酶處理目標蛋白的改變的N-糖基化形式。額外加工可以包括用氫氟酸處理目標蛋白的改變的N-糖基化形式。額外加工可以包括目標蛋白的改變的N-糖基化形式的磷酸化。在另一方面，本公開提供產(chǎn)生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法。本方法包括如下步驟提供經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的真核細胞(例如，真菌細胞、植物細胞或動物細胞)；和向細胞引入編碼目標蛋白的核酸，其中所述細胞產(chǎn)生N-糖基化形式改變的目標蛋白。在另一方面，本公開描述了產(chǎn)生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法。所述方法包括將目標蛋白與,人角年月旨西洋蓍霉或爿n:w/aacfem'm'vorara細月包制備的細胞裂解物接觸的步驟，所述解脂西洋蓍霉或Axw/g^fe"/m'wraw細胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，其中將目標蛋白與所述細胞裂解物接觸導(dǎo)致目標蛋白的改變的N-糖基化形式。在又一方面，本公開描述產(chǎn)生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括將目標蛋白與一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸的步驟，其中所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)獲得自經(jīng)遺傳修飾而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或Jr:a^a&m'm'vora似細胞，并且其中將目標分子與一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸導(dǎo)致目標蛋白的改變的N-糖基化形式。在另一方面，本公開提供N-糖基化改變的分離的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)由任一上述方法產(chǎn)生。在又一方面，本公開提供分離的經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或^n:w/aa&w'w'vora附細胞(或其它相關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細胞)。所述N-糖基化活性可以是，例如，ALG3活性、OCH1活性、MNS1活性或MNN9活性。所述修飾可以是任何本文所述的那些修飾。例如，所述修飾可以包括(a)缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因；(b)表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的突變形式；(c)引入或表達干擾具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的功能性表達的RNA分子；或(d)表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)。具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是例如，ALG6。具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)可以是哺乳動物蛋白，例如人的蛋白。所述修飾也可以包括表達能夠促進經(jīng)修飾糖蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)(例如，MNN4或PNOl)或其生物學(xué)活性的變體。在另一方面，本公開提供治療病癥的方法，所述病癥可以通過施用N-糖基化改變的蛋白質(zhì)來治療。所述方法包括向受試者施用如下蛋白質(zhì)的步驟，所述蛋白質(zhì)可以通過上述任何方法獲得，其中所述受試者是患有或疑似患有可通過施用N-糖基化改變的蛋白質(zhì)來治療的疾病的患者。所述方法也可以包括如下步驟(a)提供受試者和/或(b)測定該受試者是否患有可以通過施用N-糖基化改變的蛋白質(zhì)來治療的疾病。所述受試者可以是哺乳動物如人。所述病癥可以是例如，癌癥，免疫病癥(例如，炎性狀態(tài))或代謝紊亂。代謝紊亂可以是任何本文描述的那些代謝紊亂，例如，溶酶體貯積病(LSD)如高歇爾氏病(Gaucherdisease),泰-沙二氏病(Tay-Sachsdisease)、旁姆普氏病(Pompedisease)、尼-皮二氏病(Niemann-Pickdisease)或法布里氏病(Fabrydisease)。所述蛋白質(zhì)可以是與LSD相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如，所述蛋白質(zhì)可以是，例如，葡糖腦香酯酶、a-半乳糖苷酶。所述蛋白質(zhì)可以是，例如，oc-L-艾杜糖苷酸酶、P-D-半乳糖苷酶、p-葡糖苷酶、(3-己糖胺酶(hexosaminidase)、卩-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖苦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、(3-D-葡糖醛酸酶、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苷酶、a-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶(sphinogmyelinase)、石克酯酶、組織蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。在另一方面，本公開提供解脂西洋蓍霉或y^;w/a"Am'"/vorara細胞(或其它相關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細胞)的基本上純的培養(yǎng)物，其中大量細胞是經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾(例如任何本文所述的修飾)的N-糖基化活性的。所述細胞培養(yǎng)物可以包含一種或多種細^9包亞群，各亞群包含不同的經(jīng)修飾的糖基化活性。在又一方面，本公開提供(a)包含SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的分離的核苷酸序列；(b)包含與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2至少80%相同的序列的分離的核苷酸序列；或(c)由(a)或(b)的分離的核苷酸序列編碼的多肽。在一些實施方案中，分離的核酸序列是SEQIDNO:l或SEQIDNO:2。在另一方面，本公開描述分離的核酸，其含有(a)在高嚴緊條件下與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的補體雜交的核苷酸序列；或(b)核苷酸序列的補體。在又一方面，本公開提供(a)包含本文所示核酸序列中任一(或由其組成)的分離的核苷S吏序列；(b)包含與本為所示的核酸序列中的任一至少80%相同的序列的分離的核苷酸序列；或(c)由(a)或(b)的分離的核苷酸序列編碼的多肽。在一些實施方案中，所迷分離的核酸序列是本文所示的核酸序列中的任一。在另一方面，本公開描述分離的核酸，其含有(a)在高嚴緊條件下與本文所示核酸序列中任一的補體雜交的核苷酸序列；或(b)所述核芬酸序列的補體。在又一方面，本公開提供(a)包含上述核酸序列中任一的載體或(b)含有(a)的載體的經(jīng)培養(yǎng)的細胞。所述載體可以是表達載體。載體中的核酸序列可以與表達調(diào)控序列可操作地連接。在另一方面，本公開提供產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法。所述方法包括在允許多肽表達的條件下培養(yǎng)上述細胞中的任一種的步驟。所述方法也可包括如下步驟在培養(yǎng)細胞之后，從細胞或培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中分離多肽。所述細胞可以是例如，含有包含上述核酸序列中任一的載體的經(jīng)培養(yǎng)細胞。本文所述的目標分子(例如，目標蛋白)、具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)和N-糖基化改變的分子(統(tǒng)稱為"本發(fā)明的分子")可以是，但不需要是分離的。術(shù)語"分離的"如應(yīng)用于任何本文所述的本發(fā)明的分子是指這樣的分子或其片段，其已經(jīng)從天然與其伴隨的成分(例如，蛋白質(zhì)或其它天然存在的生物分子或有機分子)分開或純化。應(yīng)理解的是重組分子(例如，重組蛋白)將總是"分離的"。通常，當本發(fā)明的分子按重量占制備物中全部相同類型的分子的至少60%時，例如占樣品中全部相同類型的分子的60%時，則它是分離的。例如，當糖基化改變的蛋白質(zhì)按重量占制備物或樣品中全部蛋白質(zhì)的至少60%時，它是分離的。在一些實施方案中，制備物中的本發(fā)明的分子按重量組成至少75%，至少90%，或至少99%的制備物中全部相同類型的分子。如用于本文，目標分子的"改變的N-糖基化形式"是由經(jīng)遺傳工程化的宿主細胞(例如，解脂西洋蓍霉細胞、Jnrw/fl"<ie"/m'vonms細胞或另一相關(guān)的雙態(tài)性酵母細胞種類的細胞)產(chǎn)生的目標分子的N-糖基化形式，其不同于未經(jīng)遺傳工程化的與經(jīng)遺傳工程化的細胞相同種類的細胞中產(chǎn)生的目標分子的N-糖基化形式。由此，目標分子的改變的糖基化形式可以是例如，非N-糖基化的目標分子。此外，目標分子的改變的糖基化形式可以是例如，一種或多種N-聯(lián)聚糖的磷酸化改變的目標分子的形式。如用于本文，術(shù)語"其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母細胞種類"是指與解脂西洋著審和Jncw/aac/em.m'v。raw相關(guān)的屬于雙足囊菌科(familyZ^wc^wcacg"g)的酵母，例如爿rjaJa、雙足嚢菌屬(Z)0o^^cws)(例如白色雙足嚢菌(D.a/6^/w"、大雙足嚢菌CD./wgem')、或i"/eci/^)、半乳糖霉(Ga/fl"cwy/ce力(例如里氏半乳凈唐霉(Gre&s7./)或大；也半乳沖唐霉(Ggeo/n'c/zw/w》、iS^orap"c/^afer附fl、射盾子嚢霉屬CSy甲/w"oascw力(例如，西非射盾子嚢霉(S.cz/en7))、擬威克酵母屬(奶'c/:er/zamz'e〃a)和才妄嚢菌屬(ZygoascM力。具體而言,進4b4支M^c/w汰ovWa(例如，Af./3w/c/zew'/wa或Magaves)和射盾子嚢霉屬(通過分析菌種如(例如Aac/em'mVoram或」.&/7^的》的26S-rDNA序歹'j的Dl/D2結(jié)構(gòu)域?qū)⒔庵餮筝槊贡环峙溆谄渲?中的酵母以及一些念珠菌屬菌種(Ca"WAspecies)(例如，C.ap/co/a，而非白念珠菌(C,a/6z'cara)、麥芽糖念珠菌(C.ma/tose)或熱帶念珠菌(C.frap/cafc))。"多肽，，和"蛋白質(zhì)，，可以互換使用并且意指任何肽連接的氨基酸鏈，無論其長度和翻譯后修飾。本公開還提供本文所述的野生型、全長、成熟"目標蛋白"或"具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)，，的(i)生物學(xué)活性變體和(ii)生物學(xué)活性片段或其生物學(xué)活性變體。全長、成熟、野生型蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的片段的生物學(xué)活性變體可以含有添加、缺失或取代。具有取代的蛋白質(zhì)將通常具有不多于50個(例如，不多于l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或50個)保守氨基酸取代。保守取代是用一種氨基酸取代另一種具有相似特征的氨基酸。保守取代包括在以下組內(nèi)的取代纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非極性疏水氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和曱硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。將上述極性、堿性或酸性組中的一個成員用相同組中的另一成員取代可認為是保守取代。相反，非保守取代是用一種氨基酸取代另一種具有不相似的特征的氨基酸的取代。在夾失變體可以擊夾乏l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(兩個或更多個氨基酸的)氨基酸區(qū)段或不連續(xù)的單獨氨基酸。添力口(添加變體)包括融合蛋白，所述融合蛋白含有(a)全長、野生型、成熟多肽或其含有至少五個氨基酸的片段；和(b)內(nèi)部或末端(C或N)的無關(guān)的或異源的氨基酸序列。在這些融合蛋白的背景下，術(shù)語"異源氨基酸序列"是指除(a)之外的氨基酸序列。因此含有本文描述的肽和異源氨基酸序列的融合蛋白在序列上不對應(yīng)于天然存在的蛋白質(zhì)的全部或部分。例如，異源序列可以是用于重組蛋白的純化的序歹U(例如，F(xiàn)LAG、多組氨酸(例如，六組氨酸)、血凝素(hemagluttanin)(HA)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP))。異源序列也可以是用作診斷或檢測標志物的蛋白質(zhì)，例如，螢光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。在一些實施方案中，融合蛋白含有來自另一蛋白質(zhì)的信號序列。在某些宿主細胞(例如，酵母宿主細胞)中，目標蛋白的表達和/或分泌可以通過使用異源信號序列增加。在一些實施方案中，融合蛋白可以含有可用于例如引發(fā)免疫應(yīng)答(例如，用于抗體生成；見下文)的載體(例如，KLH)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體保留信號。異源序列可以具有不同的長度，并且在一些情況下可以是比異源序列所附接的全長目標蛋白更長的序列。"片段，，如用于本文是指比全長、不成熟的蛋白質(zhì)短的多肽的區(qū)段。蛋白質(zhì)的片段可以具有末端(羧基或氨基末端)缺失和/或內(nèi)部缺失。通常，蛋白質(zhì)的片段的長度將是至少4個(例如，至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少12個、至少15個、至少18個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少50個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個或至少IOO個或更多個)氨基酸。目標蛋白或具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性片段或生物學(xué)活性變體具有野生型、全長、成熟蛋白質(zhì)的活性的至少25%(例如，至少30%;40%;50%;60%;70%;75%;80%;85%;卯％;95%;97%;98%;99%;1999.5%,或100%或甚至更高)。在目標蛋白的情況下，相關(guān)活性是目標蛋白在經(jīng)遺傳工程化的細胞中經(jīng)歷改變的N-糖基化的能力。在具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的情況下，相關(guān)活性是N-糖基化活性。依賴于它們的預(yù)期用途，蛋白質(zhì)、其生物學(xué)活性片段或生物學(xué)活性變體可以是任何物種的，如，例如，真菌(包括酵母)、線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠(gerbil)、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人)。在一些實施方案中，生物學(xué)活性片段或生物學(xué)活性變體包括所述蛋白質(zhì)的免疫原性和抗原性片段。免疫原性片段是具有相關(guān)全長、未成熟蛋白質(zhì)在感興趣的動物中刺激免疫應(yīng)答(例如，抗體應(yīng)答或細胞免疫應(yīng)答)的能力的至少25%(例如，至少30%;40%;50%;60%;70%;75%;80%;85%;90%;95%;97%;98%;99%;99.5%或100%或甚至更多)的片段。蛋白質(zhì)的抗原性片段是具有相關(guān)全長、未成熟的蛋白質(zhì)被對于所述蛋白質(zhì)特異性的抗體或?qū)τ谒龅鞍踪|(zhì)特異性的T細胞識別的能力的至少25%(例如，至少30%;40%;50%;60%;70%;75%;80%;85%;90%;95%;97%;98%;99%;99.5%或100%或甚至更多)的片段。"N-糖基化活性"如用于本文是指任何如下活性，即(i)能夠向目標分子添加N-聯(lián)聚糖(即，寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性)；(ii)從目標分子去除N-聯(lián)聚糖，(iii)修飾目標分子上的一個或多個N-聯(lián)聚糖，(iv)修飾多萜醇連接的寡糖；或(v)能夠輔助(i-iv)之內(nèi)的活性的活性。同樣，N-糖基化活性包括，例如，N-糖苷酶活性、糖芬酶活性、糖基轉(zhuǎn)移酶活性、糖核苷酸合成、修飾或轉(zhuǎn)運蛋白活性。對目標分子上一種或多種N-聯(lián)聚糖的修飾包括甘露糖基磷?；D(zhuǎn)移酶(mannosylphosphoryltransferase)活性、5敫酶活性或石舞酸酶活性，例如，改變目標分子上N-聯(lián)聚糖的磷酸化狀態(tài)的甘露糖基磷?；D(zhuǎn)移酶、激酶或磷酸酶活性。如用于本文，"遺傳工程化"細胞或"經(jīng)遺傳工程化的細胞"和類似術(shù)語是指任何人工創(chuàng)造的細胞的遺傳改變，其導(dǎo)致與未經(jīng)遺傳工程化的細胞(例如，真菌細胞例如解脂西洋蓍霉細胞、^nrw/aacfem'm'vora"s細胞或其它相關(guān)種類的雙態(tài)性的酵母細胞，植物細胞或動物細胞(例如，哺乳動物細胞例如人的細胞))相比細胞中的至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。由此，應(yīng)該理解的是人工創(chuàng)造的遺傳改變不包括，例如，自發(fā)突變。人工遺傳改變的實例在下文描述(參見"遺傳工程化的細胞，，)。如用于本文，術(shù)語"野生型"如應(yīng)用于核酸或多肽是指當生物學(xué)生物體產(chǎn)生的核酸或多肽。術(shù)語"異源，，如在本文中應(yīng)用于宿主細胞中的核酸或由宿主細胞產(chǎn)生的多肽是指并非源自與宿主細胞相同種類的細胞的核酸或多肽(例如，具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì))。因此，如用于本文，"同源，，核酸或蛋白質(zhì)是在與宿些。術(shù)語"外源，，如用于本文與核酸和特定宿主細胞有關(guān)時是指不存在于(并且不能獲得自)在自然界中存在的所述特定細胞的任何核酸。因此，非天然存在的核酸一旦引入宿主細胞則被認為對于所述宿主細胞是外源的。重要的是應(yīng)注意非天然存在的核酸可以含有在自然界中存在的核酸序列的核酸亞序列或片段，條件是所述核酸作為整體不存在于自然界中。例如，在表達載體內(nèi)含有基因組DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，并且因此一旦引入宿主細胞則對所述宿主細胞是外源的，因為該核酸分子作為整體(基因組DNA加上載體DNA)不存在于自然界中。因此，作為一個整體在自然界中不存在的任何載體、自復(fù)制質(zhì)?；虿《?例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或皰滲病毒)被認為是非天然存在的核酸。由此推斷通過PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理的基因組DNA片段以及cDNA被認為是非天然存在的核酸，因為它們作為在自然界中不存在的單獨的分子而存在。還由此推斷以自然界中不存在的排列含有啟動子序列和多肽編碼序列的任何核酸是非天然存在的核酸。天然存在的核酸對于特定細胞可以是外源的。例如，從酵母x的細胞分離的完整染色體一旦引入酵母y的細胞則該染色體對于酵母y的細胞是外源核酸。從上文將顯而易見的是，"外源"核酸可以是"同源"或"異源，，核酸。相反，術(shù)語"內(nèi)源"如用于本文與核酸或基因(或由所述核酸或基因編碼的蛋白質(zhì))以及特定細胞有關(guān)時是指確實存在于(并且可以獲得自)在自然界中存在的所述特定細胞中。作為對上述概念的示例，轉(zhuǎn)化入解脂西洋蓍霉細胞中的編碼解脂西洋蓍霉ALG6蛋白的表達質(zhì)粒相對于該細胞而言是外源核酸。然而，編碼ALG6蛋白的序列和由其產(chǎn)生的ALG6蛋白與所述細胞是同源的。類似地，轉(zhuǎn)化入21解脂西洋蓍霉細胞中的編碼a血w'mVoraraALG6蛋白的表達質(zhì)粒相對于該細胞而言是外源核酸。然而與前一例子相反，編碼所述ALG6蛋白的序列和由其產(chǎn)生的ALG6蛋白與所述細胞是異源的。如用于本文，"啟動子"是指使基因能夠被轉(zhuǎn)錄的DNA序列。啟動子由RNA聚合酶識別，然后起始轉(zhuǎn)錄。因此，啟動子含有或者直接通過RNA聚合酶的募集結(jié)合的或在RNA聚合酶的募集中涉及的DNA序列。啟動子序列也可以包括"增強子區(qū)，，，其是能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合以增強基因簇中基因的轉(zhuǎn)錄水平(因此得名)的一個或多個DNA區(qū)(即，反式作用因子，更像一組轉(zhuǎn)錄因子)。所述增強子盡管通常在編碼區(qū)的5，端，但是也可以與啟動子序列分開，并且可以例如在基因內(nèi)含子區(qū)內(nèi)或在基因編碼區(qū)的3，。如用于本文，"可操作地連接，，是指并入遺傳構(gòu)建體從而表達調(diào)控序列有效地調(diào)控感興趣的編碼序列的表達。本文描述的任何核酸序列的變體(例如，SEQIDNO:l或SEQIDNO:2中所示的HAC1序列)可以具有與野生型核酸序列同源的序列，例如，與野生型核酸序列為至少約70%(例如，至少約75%，至少約80%,至少約85%，至少約卯％，至少約95%或至少約99%)同源(相同)的序列。這4f的野生型序列可以分離自自然界或者可以通過重組或合成方法產(chǎn)生。由此野生型序列核酸可以具有天然存在的人的核酸序列、猴核酸序列、鼠類核酸序列或任何其它含有所述感興趣野生型核酸的同源物的物種的核酸序列。如用于本文，"同源"或"同源核酸序列"或類似術(shù)語是指如下序列，其特征在于在核苷酸水平的至少指定百分比的同源性，并且可與序列同一性互換使用。百分比同源性或同一性可以如下測定，例如通過Gap程序(WisconsinSequenceAnalysisPackage,用于UNIX的第八版，GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,Madison,WI)，使用缺省設(shè)定，其j吏用Smith和Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2:482-489)的算法。在一些實施方案中，探針和靶(見下文)之間的同源性在約50%至約60%之間。在一些實施方案中，探針和耙核酸之間的同源性是大約55%-65%，65%-75%,約70%-80%，約75%-85%,約80%-90%,約85%-95%或約90%-100%。術(shù)語"探針，，如用于本文是指長度可變的核酸序列。在一些實施方案中，探針包含至少io個并且多如6,00o個核苷酸序列。在一些實施方案中，^:針包含至少12個，至少14個，至少16個，至少18個，至少20個，至少25個，至少50個或至少75個或100個連續(xù)核苷酸。較長長度的探針通常獲得自天然或重組的來源(與直接的化學(xué)合成相反)，對于靶序列是高特異性的，并且與較長的寡聚物相比與靶雜交慢得多。探針可以是單鏈或雙鏈核酸分子。在一些實施方案中，本文描述的變體核酸可以具有如下序列，所述序列包含與感興趣的野生型核酸(例如，如SEQIDN0:1或SEQIDNO:2中所示的HAC1核酸序列)中的區(qū)域、部分、結(jié)構(gòu)域或區(qū)段具有部分互補性(例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少卯％、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%互補性)的單鏈或雙鏈。在一些實施方案中，感興趣的變體核酸序列可以具有如下序列，所述序列包含與野生型核酸序列中的區(qū)域、部分、結(jié)構(gòu)域或區(qū)段具有完全互補性(即，100%互補性)的單鏈或雙鏈。序列"互補性"是指特定含氮堿基之間由于它們的氫鍵鍵合特性(即，具有使反向平行雙鏈體能夠形成的^5威基序列的兩條核酸鏈的性質(zhì)，其中腺噤呤和尿嘧啶(或胸腺嘧啶，在DNA或經(jīng)修飾的RNA的情況下)4皮此相反，而鳥嘌呤和胞嘧咬彼此相反)產(chǎn)生的化學(xué)親和力。如此，完全互補序列將是在核苷酸序列形成反向平行雙鏈體時具有完全的一對一44基序列對應(yīng)性(即，腺噪呤對尿嘧啶/胸腺嘧啶且鳥噪呤對胞嘧啶)的兩個序列。雜交也可用作對兩個核酸序列之間同源性的測量。本文描述的核酸序列，或其片段或變體，可以用作依據(jù)標準雜交技術(shù)的雜交探針。感興趣的特定探針(例如，HAC1核苷酸序列的探針，例如，如SEQIDNOS:l或2中所示的HAC1核苷S臾序列)與來自試驗來源(例如，真核細胞)的DNA或RNA的雜交表明對在試驗來源中對應(yīng)于所述探針的DNA或RNA的存在(例如，HAC1核香酸序列)。雜交條件是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的，并且可以在CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.,6.3.1-6.3.6,1991中找到。將中等雜交條件定義為等同于在2X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在30。C雜交，之后在IXSSC、0.1%SDS中在50。C清洗。將高嚴緊性條件定義為等同于在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在45°C雜交，之后在0.2XSSC、0.1%SDS中在65。C清洗。除非另有限定，本文使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一個普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。盡管在本發(fā)明的實踐或測試中可以使用與本文描述的那些相似的或等同的方法和材料，在下文將描述示例性的方法和材料。將本文提及的全部^^開文獻、專利申請、專利、Genbank登錄號和其它參考文獻通過所述整體并入。發(fā)生沖突的情況下，以包括定義在內(nèi)的本申請為準。材料、方法和實例僅作為示例說明，而非意欲進行限制。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢，例如，產(chǎn)生N-糖基化改變的分子的方法，將從以下詳述并從權(quán)利要求書中清楚可見。附圖簡述圖1是描述在酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的N-聚糖前體合成的示意圖。其所編碼的蛋白質(zhì)具有介導(dǎo)指明的酶促轉(zhuǎn)化的活性的基因在帶陰影的框中(例如，ALG7;左上)。"UDP"和"UMP"分別指二磷酸尿普和一磷酸尿苷。"GDP"和"GMP"分別指二磷酸鳥苷和一磷酸鳥苷。"Gn"是指N-乙酰葡糖胺。"M"是指單體甘露糖，G是指葡萄糖，Pi是指磷酸。圖2是描述酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中N-聚糖加工的示意圖。圖3是描述釀酒酵母0S.cerevWae)高爾基體中N-聚糖加工的示意圖。其編碼的蛋白質(zhì)具有介導(dǎo)指明的酶促轉(zhuǎn)化的活性的基因在帶陰影的框中(例如，0CH1;中上)。圖4是描述多種本文所述的N-聚糖結(jié)構(gòu)的示意圖。圖5是描述用于破壞解脂西洋蓍霉中0CH1基因的克隆策略的示意圖。"PCR"是指聚合酶鏈式反應(yīng)。圖6是描述用于MNN9基因破壞片段的克隆策略的示意圖。"PCR"是指聚合酶鏈式反應(yīng)。圖7是一系列描述獲得自野生型解脂西洋蓍霉細胞或糖基化突變體(例如，Aochlc19、Amnn91和AochlAmnn9)細胞和MTLY60菌林細胞的甘露糖蛋白的N-聚糖分析的電泳圖譜(dectroferogram)。在一些情況下，將所述N-聚糖進一步用a-l,2甘露糖苷酶處理。使用DNA測序儀輔助型、熒光團輔助型糖電泳(DSA-FACE)來進行分析。"M5","M6","M7"，"M8"，和"M9"是指與基本N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)結(jié)合(conjugate)的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖(oligomaltose)的分析。圖8是描述用于釀酒酵母MNS1表達載體的克隆策略的示意圖。"PCR"是指聚合酶鏈式反應(yīng)。圖9是一系列描述對獲得自MTLY60細胞的分泌型糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜，所述細胞表達野生型(WT)Mnslp或所指明的Mnslp的多種突變形式(即，R273G、R273L或R269S/S272G/R273L)。分析使用I)SA-FACE進行。"M5","M6","M7"，"M8","M9，，是指與基本N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖10是描述用于MNN4表達載體的克隆策略的示意圖。圖11是一系列描述對獲得自指明的野生型MTLY60細胞或糖基化突變細胞的分泌型糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。"M5"，"M6"，"M7","M8"，"M9"是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。"P，，是指含有一個磷酸殘基的甘露糖蛋白，而"PP"是指含有兩個磷酸殘基的甘露糖蛋白。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖12是描述用于a-半乳糖苷酶表達載體的克隆策略的示意圖。圖13是一系列描述對獲得自指明的野生型MTLY60細胞或糖基化突變細胞的多種克隆的甘露糖蛋白和磷酸甘露糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。"alg3，，表明所述細胞是ALG3敲除型。"ALG6過表達"表明所述ALG6的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在細胞中過表達。分析使用DSA-FACE進行。"M5，，，"M6，，，"M7"，"M8，，和"M9，，是指與基本N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過聚丙烯酰胺凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖14是一系列描述對獲得自指明的野生型MTLY60細il包或糖基化突變細胞的多種克隆的甘露糖蛋白和磷酸甘露糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。"alg3，，表明所述細胞是ALG3敲除型。"ALG6過表達"表明所述ALG6的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在細胞中過表達。一個峰與RNA酶B標志物的Man5GlcNAc2運行在相同位置，并且在a-l，2-甘露糖苷酶處理之后遷移了兩個葡萄糖單位，并在(x-甘露糖苷酶(JB)消化之后遷移4個葡萄糖單位。這與預(yù)期的25Man5GlcNAc2結(jié)構(gòu)相符。額外的兩個峰在約一個和兩個糖單位的距離運行，并且不受a-l,2-甘露糖苷酶消化的影響。在a-甘露糖苷酶(JB)消化時兩個峰都遷移一個葡萄糖單位。小遷移是因為加入的酶(例如JB甘露糖苷酶)的較高的鹽濃度。分析使用DSA-FACE進行。"M5"，"M6"，"M7"，"M8"和"M9"是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對焚光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖15是對獲得自未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(UPR)誘導(dǎo)的菌抹解脂西洋蓍霉的分離的DNA片段(SEQIDNO:l)序列與基因組HAClDNA序列(SEQIDNO:5)的序列比對。帶框的序列對應(yīng)于非常規(guī)剪接的內(nèi)含子。圖16是一系列對巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母的預(yù)測的5'(頂部)和3，(底部)剪接位點的序列比對。粗體加下劃線的核苷酸存在于環(huán)結(jié)構(gòu)中。圖17A和17B是對獲得自DTT-誘導(dǎo)型(I)(SEQIDNO:2)和非誘導(dǎo)型(NI)(SEQIDNO:6)巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物的HAC1cDNA的序列比對的兩個部分視圖。圖18是對巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母18個氨基酸的C-末端區(qū)域的序列比對。保守的氨基酸為粗體并加下劃線。圖19是描述對KAR2mRNA的相對表達水平進行比較的柱狀圖。將克隆3、4和5(巴斯德畢赤酵母GSM5細胞)在作為碳源的曱醇上培養(yǎng)。"3+"、"4+"和"5+，，是指在作為碳源的曱醇上培養(yǎng)的各個克隆，而"3-"、"4-"和"5_"是指在作為碳源的葡萄糖上培養(yǎng)的各個克隆。Y軸代表使用實時PCR的KAR2基因的相對表達。圖20是描述兩種巴斯德畢赤酵母克隆(克隆6和8)中Kar2和HAC1的相對表達水平的柱狀圖。"6+，，和"8+，，是指在作為碳源的曱醇上培養(yǎng)的各個克隆，而"6-，，和"8-"是指在作為碳源的葡萄糖上培養(yǎng)的各個克隆。Y軸代表使用實時PCR的KAR2基因的相對表達。圖21是描述用于Y1MNN6表達載體的克隆策略的示意圖。圖22是一系列描述對獲得自指明的單獨的Aochl解脂西洋蓍霉細胞，或表達Y1MNN6的Aochl解脂西洋蓍霉的多種克隆(Z3、Z4、Z5、U5、U6和U8)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖23是描述用于MFManHDEL表達載體的克隆策略的示意圖。圖24是一系列描述對獲得自指明的單獨的Aochl解脂西洋蓍霉細胞，或表達MFManHDEL的Aochl解脂西洋蓍霉的多種克隆(9、11、10、3、5和6)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖25是描述用于LIP2preManHDEL表達載體的克隆策略的示意圖。圖26是一系列描述對獲得自指明的單獨的Aochl解脂西洋蓍霉細胞，或表達LIP2ManHDEL的Aochl解脂西洋蓍霉的多種克隆(l、5、10和11)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。"M5"，"M6","M7"，"M8"和"M9"是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖27A和27B是解脂西洋蓍霉(圖27A;SEQIDNO:3)和巴斯德畢赤酵母(圖27B;SEQIDNO:4)的HAC1蛋白的氨基酸序列。圖28是考馬斯藍染色的聚丙烯酰胺凝膠的照片，其描述在多種解脂西洋蓍霉細胞(MTLY60、MTLY60Aa/g3和MTLY60Aa/gWZG6)培養(yǎng)物中Lip2p過表達的結(jié)果。在凝膠中解析了以下樣品泳道l("梯子"或"梯")，已知分子量的蛋白質(zhì)的組合；泳道2("WT")，獲得自過表達Lip2p的WT解脂西洋蓍霉細胞(MTLY60)的Lip2p蛋白；泳道3("WT+PGaseF，)，獲得自過表達Lip2p的WT解脂西洋蓍霉細胞并用PNGaseF酶處理的Lip2p蛋白；泳道4("alg3-ALG6"),獲得自缺乏alg3并且過表達Lip2p和ALG6二者的西洋蓍霉細胞(MTLY60Aa/g^4丄G6)的Lip2p蛋白；泳道5("alg3-ALG6+PNGaseF,)，獲得自缺乏alg3并且過表達Lip2p和ALG6二者的西洋蓍霉細胞(MTLY60A"/g3/^G"6)并且用PNGaseF酶處理的Lip2p蛋白；泳道6("alg3，，)，獲得自缺乏alg3并且過表達Lip2p的解脂西洋蓍霉細胞(MTLY60Aa/g3)的Lip2p蛋白；泳道7("alg3+PNGaseF"),獲得自缺乏alg3并且過表達Lip2p的解脂西洋蓍霉細胞(MTLY60Aalg3)并用PNGaseF酶處理的Lip2p蛋白；泳道8("無Lip2p過表達的WT"),獲得自MTLY60細胞的蛋白質(zhì)；和泳道9("無Lip2p過表達的WT+PNGaseF")，獲得自MTLY60細胞并用PNGaseF酶處理的蛋白質(zhì)。圖29是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(WT(MTLY60);Aalg3;Aalg3ALG6過表達的；和過表達ALG6連同來自解脂西洋蓍霉(Yl)或布氏錐蟲(Tb)的葡糖苷酶II的a亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。"M5"，"M6","M7"，"M8"和"M9"是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝月交的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。圖30是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(Aalg3;Aalg3ALG6過表達的；和過表達ALG6連同含有HDEL序列的來自解脂西洋蓍霉(Y1)的葡糖苷酶II的a亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖語。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。圖31是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(Aalg3;Aalg3ALG6過表達的；和過表達ALG6連同含有HDEL序列的來自布氏錐蟲(ro;p朋仍oma^mc&)(Tb)的葡糖苷酶II的a亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。圖32是一系列描述對獲得自指明的用不同濃度變聚糖酶體外處理的alg3ALG6解脂西洋蓍霉細胞的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。圖33是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(Aalg3;Aalg3ALG6過表達的；和過表達ALG6連同在Hp4d或TEF啟動子調(diào)控下表達的來自解脂西洋蓍霉(Y丄)的葡糖苷酶II的a亞基和來自Y.l的葡糖苷酶II的(3亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。圖34是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(Aalg3ALG6過表達的；和過表達ALG6連同在Hp4d或TEF啟動子調(diào)控下表達的含HDEL的來自解脂西洋蓍霉(Y.1.)的葡糖香酶II的a亞基和來自Y.l的葡糖苷酶II的(3亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對焚光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。圖35是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(Aalg3和過表達在TEF啟動子調(diào)控下表達的來自解脂西洋蓍霉(Y.1.)的葡糖苷酶II的a亞基和來自Y.l的葡糖苷酶II的卩亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。圖36A和36B描述的是編碼黑曲霉C^p^^〃wm'gw)葡糖苷酶IIq成熟形式(缺少信號肽)的cDNA的核苷酸序列，其是為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA(SEQIDN0:7)。圖37是描述編碼黑曲霉(v^;wgz7/^m'gw)葡糖苷酶II卩成熟形式(缺少信號肽)的cDNA的核苷酸序列，其是為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA(SEQIDNO:8)。圖38是一系列對獲得自指明的多種解脂西洋蓍霉細胞(Aalg3和ALG6過表達的，連同在TEF或hp4d啟動子調(diào)控下表達的來自黑曲霉(An)的葡糖香酶II的a亞基)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖鐠是對RNA酶B的分析。圖39A和39B是一對柱狀圖，其描述在WT(MTLY60)解脂西洋蓍霉細胞中或在含有在hp4d啟動子表達調(diào)控下的HAClcDNA的經(jīng)剪接形式的解脂西洋蓍霉細胞的兩個克隆(克隆7和克隆2)中，HAC1(39A)或KAR(39B)基因的相對表達水平(Y軸)。圖40是線型圖，其描述用空載體轉(zhuǎn)化的野生型巴斯德畢赤酵母GS115細胞與表達Haclp蛋白的巴斯德畢赤酵母GS115細胞的生長相比的生長。圖41是考馬斯藍染色的聚丙烯酰胺凝膠的照片，其比較了來自表達鼠類IL-10(mlL-10)蛋白的巴斯德畢赤酵母GS115細月包細胞培養(yǎng)物的mIL-lO蛋白的表達水平與獲得自在誘導(dǎo)型啟動子AOX1調(diào)控下表達mIL-lO和來自巴斯德畢赤酵母的經(jīng)剪接HAC1蛋白的GS115細胞的培養(yǎng)物的mlL-10蛋白的表達。在凝膠中解析了以下樣品泳道l("梯子")，已知分子量的蛋白質(zhì)的組合；泳道2("參照，，)，獲得自表達參照mIL-lO的巴斯德畢赤酵母菌抹(GS115)的蛋白質(zhì)；泳道3("參照")，獲得自表達參照mIL-lO的巴斯德畢赤酵母菌抹的、在用PNGaseF酶處理蛋白質(zhì)之后的蛋白質(zhì)；泳道4("克隆l")，獲得自誘導(dǎo)型表達HAC1蛋白的表達mIL-10的巴斯德畢赤酵母細胞的蛋白質(zhì)；泳道5("克隆1")，荻得自誘導(dǎo)型表達HAC1蛋白的表達mIL-lO的巴斯德畢赤酵母細胞的、在用PNGaseF酶處理蛋白質(zhì)之后的蛋白質(zhì)；泳道6("克隆2")，獲得自誘導(dǎo)型表達HAC1蛋白1的表達mIL-10的巴斯德畢赤酵母細胞的蛋白質(zhì)；泳道7("克隆2")，獲得自誘導(dǎo)型表達HAC1蛋白的表達mIL-10的巴斯德畢赤酵母細胞的、在用PNGaseF酶處理蛋白質(zhì)之后的蛋白質(zhì)。圖42描述的是編碼里氏木霉(7Hc/706few7aa-l，2甘露糖苷酶、為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化、含有LIP2前信號序列的示例性cDNA序列的核苷酸序列(SEQIDNO:9)。圖43描述的是用于解脂西洋蓍霉的GAP啟動子的示例性核苷酸序列的核苷酸序列(SEQIDNO:10)。圖44A-44C描述的是用于表達載體pYLHUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDNO:ll)，其含有編碼里氏木霉a-1,2甘露糖苷酶的、為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化并且含有LIP2前信號序列的cDNA序列。圖45A-45C描述的是用于表達載體pYLGUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDNO:12)，其含有編碼里氏木霉a-l，2甘露糖苷酶的、為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化并且含有LIP2前信號序列的30200880018736.4cDNA序列。圖46A-46C描述的是用于表達載體pYLPUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDNO:13)，其含有編碼里氏木霉a-l,2甘露糖苷酶的、為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化并且含有LIP2前信號序列的cDNA序列。圖47A-47C描述的是用于表達載體pYLTUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDNO:14),其含有編碼里氏木霉a-l,2甘露糖苷酶的、為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化并且含有LIP2前信號序列的cDNA序列。圖48是一系列對獲得自用指明的不同表達載體轉(zhuǎn)化的解脂西洋蓍霉細胞的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜"hp4dL2ManHDEL"(pYLHUXdL2preManHDEL，圖44A-44C);"GAPL2ManHDEL，，(pYLGUXdL2preManHDEL，圖45A-45C);"TEFlL2ManHDEL"(pYLTUXdL2preManHDEL，圖47A-47C)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的葡聚糖(dextran)的分析。系列中第二個電泳圖鐠是對RNA酶B的分析。圖49是一系列對獲得自含有穩(wěn)定整合的表達載體pYLTUXdL2preManHDEL(圖47A-47C)的解脂西洋蓍霉MTLY60Aoc/z/細胞的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。糖蛋白樣品獲得自24、48、72和96小時的細胞培養(yǎng)物。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的葡聚糖(dextran)的分析。系列中第二個電泳圖譜是對RNA酶B的分析。圖50是用于人葡糖腦苷酯酶的示例性核酸序歹'](GLCM，SwissProt條目號P04062;SEQIDNO:15),其是按照為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA以化學(xué)方法合成的。圖51是免疫印跡的照片，其描述了在解脂西洋蓍霉菌林MTLY60(WT;泳道4和6)和MTLY60AocW(Aochl;前三個泳道)中表達的人葡糖腦苷酯酶的遷移圖。蛋白質(zhì)的分子量(kDa)通過在所述免疫印跡最右側(cè)的分子量標志物來說明。圖52是人促紅細胞生成素的示例性核酸序歹'J(Epo,SwissProt條目號P01588;SEQIDNO:16)，其是按照為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子31優(yōu)化的CDNA以化學(xué)方法合成的。圖53是人a-半乳糖香酶A的示例性核酸序列(AGAL,SwissProt條目號P06280;SEQIDNO:17)，其是按照為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA以化學(xué)方法合成的。圖54是一系列過表達Haclp蛋白的經(jīng)剪接形式的巴斯德畢赤酵母細胞或野生型巴斯德畢赤酵母細胞的電子顯微照片。將細胞中堆疊的脂質(zhì)膜的離散區(qū)加框。圖55是一系列電泳圖譜，其描述對獲得自指明的WT解脂西洋蓍霉細胞(polld)和表達a-l，2-甘露糖芬酶和HDEL序列的融合蛋白的解脂西洋蓍霉細胞的糖蛋白進行的N-聚糖分析。分析使用DSA-FACE進行。"M5"，"M6"，"M7"，"M8"和"M9"是指與殼二糖核心結(jié)構(gòu)結(jié)合的甘露糖殘基數(shù)。Y軸代表相對熒光單位，表明各個甘露糖結(jié)構(gòu)的量。X軸代表各個復(fù)合甘露糖結(jié)構(gòu)通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。詳述本文描述的方法和遺傳工程化的細胞可以用于產(chǎn)生如下目標分子(例如，目標蛋白或目標多萜醇)，其與在未經(jīng)遺傳工程化的細胞中產(chǎn)生的所述目標分子的N-糖基化形式相比具有改變的N-糖基化形式。已經(jīng)證明糖基化目標分子(例如，糖基化蛋白)向患有代謝紊亂(例如，溶酶體貯積病)患者的施用使所述病癥的癥狀改善。因此，所述的方法和細胞可用于制備N-糖基化改變的目標分子，其用于包括但不限于治療代謝紊亂如溶酶體貯積病。這樣的N-糖基化改變的分子也可用于廣泛多樣的其它領(lǐng)域，例如，食品和飲料工業(yè)；藥物工業(yè)(例如，作為疫苗)；農(nóng)業(yè)工業(yè)；和化學(xué)工業(yè)，等等。N-糖基化改變的分子如用于本文，目標分子是指通過來自遺傳工程化的細胞(例如，真菌細胞；植物細胞；或動物細胞)的一種或多種N-糖基化活性而經(jīng)受改變的N-糖基化的任何分子。在一些實施方案中，目標分子能夠^皮運輸經(jīng)過解脂西洋蓍或多步，導(dǎo)致它們的N-糖基化因宿主細胞機構(gòu)(machinery)而改變。所述目標分子可以是內(nèi)源或外源的。述含有添加、缺失或取代的蛋白質(zhì)。合適的目標蛋白包括病原體蛋白(例如，破傷風(fēng)類毒素；白喉(diphtheria)類毒素；病毒表面蛋白(例如，巨細胞病毒(CMV)糖蛋白B、H和gCIII;人免疫缺陷病毒1(HIV-1)包膜糖蛋白；勞斯肉瘤病毒(RSV)包膜糖蛋白；單純皰瘆病毒(HSV)包膜糖蛋白；EB病毒(EBV)包膜糖蛋白；水痘帶狀皰滲病毒(VZV)包膜糖蛋白；人乳頭狀瘤病毒(HPV)包膜糖蛋白；流感病毒糖蛋白；和肝炎家族表面抗原)，溶酶體蛋白(例如，葡糖腦苦酯酶、腦苷酶或半乳糖腦香酯酶)，胰島素，胰高血糖素，生長因子，細胞因子，趨化因子，抗體及其片段，或所述蛋白質(zhì)中任一與抗體或抗體片段的融合物(例如，蛋白質(zhì)-Fc)。生長因子包括，例如，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、神經(jīng)生長因子(NGF);神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、血小板衍生生長因子(PDGF)、促紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、Myostatin(GDF-8)、生長分化因子-9(GDF9)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF或FGF2)、表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)。細胞因子包括，例如，白介素(例如，IL-1至IL-33(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-12、IL-13或IL-15))。趨化因子包括，例如，1-309、TCA-3、MCP-1、MIP-louMIP-1卩、RANTES、CIO、MRP-2、MARC、MCP-3、MCP-2、MRP-2、CCF18、MIP-ly、Eotaxin、MCP-5、MCP-4、NCC-1、CkpiO、HCC-1、白細胞誘素-1(Leukotactin-l)、LEC、NCC-4、TARC、PARC或Eotaxin-2。還包括腫瘤糖蛋白(例如，腫瘤相關(guān)抗原)，例如，癌胚抗原(CEA)、人粘蛋白、HER-2/neu和前列腺特異性抗原(PSA)[R.A.Henderson和0.J.Finn,AdvancesinImmunology,62，第217-56頁(1996)]。在一些實施方案中，目標蛋白可以是與溶酶體貯積病相關(guān)的目標蛋白，所述目標蛋白包括，例如，a-L-艾杜糖苷酸酶、P-D-半乳糖苷酶、|3-葡糖苷酶、(3-己糖胺酶、(3-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、(3-D-葡糖醛酸酶、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苦酶、a-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。目標蛋白也可以是融合蛋白。融合蛋白包括，例如，(i)本文描述的任何蛋白或其片段與(ii)抗體或其片段的融合物。如用于本文，術(shù)語"抗體片段"是指抗原結(jié)合片段，例如，F(xiàn)ab、F(ab')2、Fv和單鏈Fv(scFv)片段。scFv片段是單一多肽鏈，其包括所述scFv所源自的抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)二者。此外，雙抗體[Poljak(1994)Structure2(12):1121-1123;Hudson等(1999)J.Immunol.Methods23(1-2):177-189，將這兩篇的內(nèi)容通過所述整體并入本文]和細胞內(nèi)抗體[Huston等(2001)Hum.Antibodies10(3-4):127-142;Wheeler等(2003)Mol.Ther.8(3):355-366;Stocks(2004)DrugDiscov.Today9(22):960-966,將全部這些的內(nèi)容通過所述整體并入本文]也可以在本發(fā)明的方法中使用。目標蛋白也可以與聚合物、載體、佐劑、免疫毒素或可檢測的(例如，焚光、發(fā)光或放射性)模塊中的一種或多種結(jié)合。例如，可以將目標蛋白與聚乙二醇結(jié)合，所述聚合物模塊可以用于例如增加小蛋白質(zhì)的分子量和/或增加循環(huán)滯留期。在一些實施方案中，目標分子可以是或可以含有多萜醇。遺傳工程化的細胞本文描述的遺傳工程化的細胞具有至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，所述細胞可用于一種或多種具有改變的N-糖基化形式的目標分子的產(chǎn)生。適合于遺傳工程化的細胞包括，例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍霉或本文所述的任何其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母細胞)，植物細胞或動物細胞(例如，(線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人))。所述細胞可以是原代細胞、無限增殖化細胞或經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞。所述細胞可以是動物中，例如非人哺乳動物中的那些細胞。這些細胞，在進行本文指定的遺傳工程化之前，可以獲得自多種商業(yè)來源和研究資源機構(gòu)，如，例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(Rockville,MD)。目標分子包括蛋白質(zhì)，例如任何本文所述的目標蛋白(見上文)。目標分子也包括多碎醇。對細胞進行的遺傳工程化包括遺傳修飾如(i)缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因；(ii)引入編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)(例如，內(nèi)源或外源蛋白)的突變形式的重組核酸(即，表達具有N-糖基化活性的突變蛋白)；(iii)引入或表達RNA分子，所述RNA分子干擾具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的功能性表達；(iv)引入編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的野生型(例如，內(nèi)源的或外源的)的重組核酸(即，表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì))；或(v)改變編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的一種或多種內(nèi)源基因的啟動子或增強子元件，由此改變它們編碼的蛋白質(zhì)的表達。RNA分子包括，例如，小干擾RNA、短發(fā)夾RNA(shRNA)、反義RNA或微小RNA(miRNA)。應(yīng)該理解的是，第(ii)項包括，例如，用相對于如下被替代的內(nèi)源基因編碼具有更大N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因替代內(nèi)源基因(例如，通過同源重組)。遺傳工程化還包括改變編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因以產(chǎn)生具有添加(例如，異源序列)、缺失或取代(例如，突變?nèi)琰c突變；保守或非保守突變)的蛋白質(zhì)。突變可以特異性地引入(例如，定點誘變或同源重組；參加隨附實施例)或者可以隨機引入(例如，可以對細胞進行化學(xué)誘變，如在例如Newman和Ferro-Novick(1987)J.CellBiol.105(4):1587中所述，將其公開內(nèi)容通過所述整體并入本文)。本文描述的遺傳修飾可以導(dǎo)致如下的一種或多種(i)在經(jīng)遺傳修飾的細胞中一種或多種N-糖基化活性的增加，(ii)在經(jīng)遺傳修飾的細胞中一種或多種N-糖基化活性的減少，(iii)在經(jīng)遺傳修飾的細胞中一種或多種N-糖基化活性的定位或胞內(nèi)分布的變化，或(iv)在經(jīng)遺傳^f務(wù)飾的細胞中一種或多種N-糖基化活性的比例的變化。應(yīng)該理解的是，N-糖基化活性的量的增加可以歸因于一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的過表達；內(nèi)源基因的拷貝數(shù)的增加(例如，基因重復(fù))；或內(nèi)源基因的啟動子或增強子的改變，其刺激由所述基因編碼的蛋白質(zhì)的表達增加。一種或多種N-糖基化活性的減少可以歸因于一種或多種蛋白質(zhì)的突變形式(例如，顯性陰性形式)的過表達，所述突變形式具有改變N-糖基化的活性；一種或多種干擾RNA分子的引入或表達，所述干擾RNA分子降低一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的表達；或一種或多種編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因的缺失。缺失或破壞一種或多種內(nèi)源基因的方法在隨附實施例中描述。例如，為了通過同源重組破壞基因，"基因替代，，載體可以以一種使其包括可選擇的標記基因的方式構(gòu)建。這些可選擇的標記基因可以在5'和3'端與長度足以介導(dǎo)同源重組的基因部分可操作地連接。所述可選擇的標記可以是多種基因之一，所述基因或者補足宿主細胞的營養(yǎng)缺陷型(auxotrophy)，或者提供抗生素抗性，包括URA3、LEU2和HIS3基因。其它合適的可選擇標記包括CAT基因，其賦予酵母細胞氯霉素抗性，或lacZ基因，其導(dǎo)致因表達p-半乳糖脊酶產(chǎn)生的藍色菌落。然后使用本領(lǐng)域公知的方法(見下文)將基因替代載體的線性化DNA片段引入細胞。線性片段向基因組中的整合和基因的破壞可以基于所述選擇標記來測定，并且可以通過例如Southern印跡分析來聰、證。如在隨附實施例中詳述的，在可選"^的標記在選"^中使用之后，可以將其從宿主細胞的基因組去除，通過例如Cre-loxP系統(tǒng)(見下文)?；蛘?，基因替代載體可以以一種使其包括待破壞基因的部分的方式構(gòu)因編碼序列的失活片段。"失活片段"是這樣的基因片段，其編碼的蛋白質(zhì)具有，例如，產(chǎn)自所述基因全長編碼序列的蛋白質(zhì)的活性的低于約10%(例如，低于約9%,低于約8%,低于約7%，低于約6%，低于約5%,低于約4%,低于約3%,低于約2%,低于約1%,或0%)。將這種基因部分以如下方式插入載體，即沒有已知啟動子序列與該基因序列可操作連接，但是終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止序列與所述基因序列的所述部分可操作地連接。然后可以同源重組的方式，于是將這種線性化的載體整合入所述基因的內(nèi)源對應(yīng)物(counterpart)中。表達載體可以是自主性的或整合型的。可以將重組核酸(例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的野生型或突變形式的重組核酸)以表達載體的形式引入細胞，所述表達載體例如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘?；虿《绢w粒。重組核酸可以保持在染色體外，或者它可以被整合入酵母細胞染色體DNA。表達載體可以含有選擇標記基因，其編碼細胞在選擇條件下生存所需的蛋白質(zhì)(例如，URA3，其編碼尿嘧啶生物合成所需要的酶；或TRPl,其編碼色氨酸生物合成所需要的酶)，以允許檢測和/或選擇那些用期望的核酸轉(zhuǎn)化的細胞(參見，例如，美國專利No.4,704,362)。表達載體也可以包括自主復(fù)制序列(ARS)。例如，美國專利No.4,837,148描述了自主復(fù)制序列，其為在巴斯德畢赤酵母中保持質(zhì)粒提供了適合的方法。將美國專利No.4，837，148的^Hf內(nèi)容通過所述整體并入本文。整合型載體在例如美國專利No.4,882,279(將其公開內(nèi)容通過所述整體36并入本文)中披露。整合型載體通常包括連續(xù)排列的至少有第一可插入DNA片段、可選擇的標記基因和第二可插入DNA片段的序列。所述第一和第二可插入DNA片段的長度各為約200個(例如，約250,約300，約350,約400,約450，約500或約1000或更長)核香酸并且具有與待轉(zhuǎn)化物種基因組DNA中的部分同源的核苷酸序列。將用于表達的含有感興趣的基因(例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因)的核苷酸序列插入這種載體的第一和第二可插入DNA片段之間，在標記基因之前或是之后?？梢栽诮湍皋D(zhuǎn)化之前將整合型載體線性化以促進感興趣的核苷酸序列整合入宿主細胞基因組。表達載體可以包含(feature)在酵母(例如，解脂西洋蓍霉、」rxw/"^/ew'm'vorara,或其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母種)啟動子調(diào)控下的重組核酸，所述啟動子使得它們能夠在酵母中表達。合適的酵母啟動子包括例如，ADC1、TPIl、ADH2、hp4d、POX和GallO(參見，例如，Guarente等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79(23):7410)啟動子。另外的合適啟動子在例如Zhu和Zhang(1999)Bioinformatics15(7-8):608-611和美國專利No.6,265,185中記載，將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。在將表達載體引入動物細胞(例如哺乳動物細胞)的情況下，所述表達載體可以包含在適合用于在感興趣的宿主細胞中表達的動物細胞啟動子調(diào)控下的重組核酸。哺乳動物啟動子的實例包括，例如，SV40或巨細胞病毒(CMV)啟動子。啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型(條件性)的。組成型啟動子應(yīng)理解為這樣的啟動子，其表達在標準培養(yǎng)條件下是恒定的。誘導(dǎo)型啟動子是響應(yīng)于一種或多種誘導(dǎo)信號(inductioncue)的啟動子。例如，可以對誘導(dǎo)型啟動子進行化學(xué)調(diào)節(jié)(例如，其轉(zhuǎn)錄活性受到化學(xué)誘導(dǎo)劑的存在或缺失調(diào)節(jié)的啟動子，所述化學(xué)誘導(dǎo)劑例如醇、四環(huán)素、類固醇、金屬或其它小分子)或物理調(diào)節(jié)(例如，其轉(zhuǎn)錄活性受到物理誘導(dǎo)物的存在或缺失調(diào)節(jié)的啟動子，所述物理誘導(dǎo)物例如光或高溫或低溫)。誘導(dǎo)型啟動子也可以直接通過一種或多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，所述轉(zhuǎn)錄因子本身直接受到化學(xué)或物理信號的調(diào)節(jié)。細胞的遺傳工程化還包括激活存在于宿主細胞中，但是通常在所述細胞中不表達或在所述細胞中不以顯著水平表達的內(nèi)源基因(例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因)。例如，可以修飾內(nèi)源基因的調(diào)節(jié)序列(例如，基因啟動子或增強子)從而使可操作連接的編碼序列展現(xiàn)增加的表達。同源遺傳工程化的細胞中所顯現(xiàn)的調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)模式。用于引入基因的調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子或增強子)的改變的合適方法記載著，例如，美國專利申請公開No.20030147868中，將其7>開內(nèi)容通過所述整體并入本文。應(yīng)理解的是，其它遺傳工程化的修飾也可以是條件性的。例如，可以將基因條件性地缺失，使用例如位點特異性DNA重組酶如Cre-loxP系統(tǒng)(參見，例如，Gossen等(2002)Ann.Rev.Genetics36:153-173和美國申請No.20060014264,將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述完整并入本文)?？梢允褂枚喾N方法將重組核酸引入本文所述的細胞，所述方法例如原生質(zhì)球技術(shù)或全細胞氯化鋰酵母轉(zhuǎn)化方法。其它對于將質(zhì)粒或線性核酸載體轉(zhuǎn)化入細胞有用的方法記載在，例如，美國專利No.4,929,555;Hinnen等(1978)Proc.Nat.Acad.Sci.USA75:1929;Ito等(1983)J.Bacteriol.153:163;美國專利No.4,879,231;和Sreekrishna等(1987)Gene59:115中，將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述完整并入本文。電穿孔和PEG1000全細胞轉(zhuǎn)化方法也可以使用，如Cregg和Russel，MethodsinMolecularBiology:PichiaProtocols,Chapter3，HumanaPress,Totowa,N丄，第27-39頁(1998)中所述，將其公開內(nèi)容通過所述完整并入本文。動物細胞的轉(zhuǎn)染可以包括，例如，使用磷酸鈣、電穿孔、熱激、脂質(zhì)體或轉(zhuǎn)染試劑如FUGENE⑧或LIPOFECTAMINE⑧或通過使棵核酸載體與細胞在溶液中接觸(參見，例如，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManualSecondEditionvol.1,2and3.ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NewYork,USA,Nov.1989;將其公開內(nèi)容通過所述完整并入本文)將載體引入細胞?？梢酝ㄟ^使用合適的技術(shù)來選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母細胞，所述技術(shù)包括但不限于，在轉(zhuǎn)化之后在缺乏所需生化產(chǎn)物(由于細胞的營養(yǎng)缺陷型)條件下培養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型細胞，選擇和檢測新的表型，或在對于缺乏轉(zhuǎn)化體中所含抗性基因的酵母為毒性的抗生素存在下進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化體也可以通過將表達盒整合入基因組來選擇和/或驗證，其可以通過例如Southern印跡或PCR分析來評定。在將載體卩1入感興趣的靶麵胞之前，可以將載體在細菌細胞如大腸桿菌(￡.co/Z)中培養(yǎng)(例如，擴增)。載體DNA可以通過任何本領(lǐng)域已知的方法從細菌細胞分離，所述方法致使載體DNA從細菌環(huán)境中純化。經(jīng)純化的載體DNA可以用酚、氯仿和醚粗提(extractextensively),以確保沒有大腸桿菌蛋白存在于質(zhì)粒DNA制備物中，因為這些蛋白質(zhì)對于哺乳動物細胞是毒性的。如本文所述，遺傳工程化可以用于表達(例如，過表達)多種基因、向多種基因中引入修飾或缺失多種基因，例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因。這些基因包括，例如，ALG7、ALG13、ALG14、ALG1、ALG2、ALGll、RFT1、ALG3、ALG9、ALG12、ALG6、ALG8、ANL1、ALGIO、ALG5、OST3、OST4、OST6、STT3、OSTl、OST5、職P1、SWP1、OST2、DPM1、SEC59、OCHl、MNN9、VAN1、M麗8、MNNIO、MNNll、HOCl、MNN2、M麗5、MNN6、KTR1、YUR1、MNN4、KRE2、KTR2、KTR3、MNN1、MNS1、MNN4、PNOl、MNN9、葡糖苷酶I、葡糖苷酶II、或內(nèi)切甘露糖苷酶(endomannosidase)。編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因可以來自任何含有這樣的基因的物種(例如，低等真核生物(例如，真菌(包括酵母)或錐蟲)，植物，或動物(例如，昆蟲、鳥、爬行動物或哺乳動物(例如，嚙齒動物如小鼠或大鼠、犬、貓、馬、山羊、牛、豬、非人靈長類動物或人))。編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因可以從中獲得的示例性真菌菌種包括，但不限于，異常畢赤酵母(尸/c/n'fla"oma/a)、牛腸畢赤酵母CP/c/z/a幻v&)、力口拿大畢赤酵母(尸/c/z/aozwo^e"w."、/Vc/,ac<amomY、并分4犬畢赤酵母(/Vc/n'a/an,wose)、發(fā)酵畢赤酵母(/7c/z/a/ermew^z/w)、；必液畢赤酵母(尸/c/z/a_/7w:o^w)、膜醭畢赤酵母(尸/c/2/amew6ra朋e/act'em)、膜醭畢赤酵母CP/c/z/amem6rawaey^c/era)、并且卄士念J朱菌(Caw//<iava/Wa)、白念；朱菌(Ca"(i/(iaa/6/cam1)、Cawd油asca/a//2油r,、Ca/^Waaw//2/:dae、南極念珠菌(Caw/油勘torc"ca)、大西洋念珠菌(Cawd油af/aw"ca)、Ca"d油a加os//zaeWca、Qwcfe/aWfl"ae、Qwiiz'c/acmpop/H7a、Ca"(i油ceramZyc油r騰、Ca"cfeiac/zaw/zWes、Ca"(i油co^/a/z's、GaWdat/aw，'、都柏林念珠菌(Ca"6f油cMMm.em7's)、Caroi油erg她似/s、Cawci油^/h/c加、光滑念珠菌(Ca"A(iag/Wrato)、發(fā)酵念珠菌(C""<i/<ia/erwe"to")、季也蒙念珠菌(QmdWagM/〃/ermowc//0、希木隆念多朱菌(C"a"(i/(ia/zaew"/ow/0、C"awt//<ia/"seCame/ts、昆蟲念J朱菌(Ca"AVfaz'""ctoram)、間型念5朱菌(C""cfe/az>7&rwe<i/a)、Ca"(iz'da)e#rew7、乳酒念珠菌(Owc/WaA:e^r)、克魯斯念珠菌(Ca"t&b^rw化/)、葡萄牙念玉朱菌(Cawii/(ia/imYam'ae)、Caw/z'^/a(yxoso//^7a、CVm&c/ama/tosa、醭月莫念玉朱菌(Cb"(i/(ia附e附6n3f/7^/^"'e"^、wn'//eW、G(3"d/dao/eo//nYa、奧里戈念珠菌(Cam^.cfaorego"em7》、近平滑念珠菌(Ca"t/油para戶7os7》、桔念珠菌(C朋(i油，erc浙w—、休哈塔念珠菌(Caw(i油Ae/^ea)、Qwt/油,e/w"oc/z//ae、纖纟田念J朱菌(Ca"(i/(iate"M/力、熱帶念玉朱菌(Ca"d/(ia/廠0/^"http://力、Cawd油加c/z—e、Ca"t/油w'wo/a6ora""'畫、普油念珠菌(C"w(i油—"e)、維斯念珠菌(Ca"^iav&wa"aA")、產(chǎn)朊念珠菌(C朋^iaWz7/力、膜醭畢赤酵母、(尸/c/7/aw7ve欲/"、膜醭畢赤酵母、尸/c/z/ac/zo^"、膜醭畢赤酵母、膜醭畢赤酵母、戶/c/^m/"wcw/e、巴斯德畢赤酵母、假多形畢赤酵母(尸/c/z/fl/weM(iopo/_ymo/7/w)、才樂畢赤酵母(尸/c/z/a《wercjww)、尸/c/z/aroZer/s//、齋藤畢赤酵母(尸/c/w,asazYc^.)、尸z'c/n.aw7veWn、/、斯i也畢赤酵母(尸/c/n'asZnxs^z^geww^)、陸生畢赤酵母(尸/c/w.ate/r/co/")、尸/c//ava"n)7、尸jewdoz，aj"to/r,/c<3、紅冬孑包酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、纟工酵母(i^ot/oton^/ag7w"m's)、貝酵母(*S*acc/zflram_yc&s6ayawM力、貝酵母、Sacc/2(arcw^ceywcwz^/n^7.cw、葡萄汁酵母(Sacc/7flrawycesmvotmw)、貝酵母、西良酒酵母、二孑包酵母(iSacc/^rawyces6一or—、薛瓦酵母(5^cc/z(3ram少cesc/zeva/z'en')、德爾布酵母(iSacc/2flra，ces(ie/Z^wech7)、少孑包酵母((Sacc/zar函ycesex/gwo—、發(fā)酵性酵母(iSacc/zoromyces1/^環(huán)e"/加,)、脆壁酵母(&cc/2anmyces々agz7&)、馬克思酵母(iSacc/zaromycesmanc/a/ii)、蟲奪蜜酵母(5""cc/2flromyc&sme〃&)、羅斯酵母(Sacc/za廠o附^ycesrase/)、魯酵母(6"acc/zar麵;;c&sra腿7)、葡萄汁酵母、威爾酵母(Sacc/wrawjc&sw/〃/a"w力、^各德、酵母3各《急酵母、(Sacc/^ram^yco/wzica/ww/or/s、4口嚢復(fù)膜孑包酵母(5^<%^^0附_>^0/&/6"/&^(3)、扣嚢復(fù)月莫孑包酵母、大麥曲內(nèi)孑包霉(五"(icw少c^/wde/)、EWo，co戸'sybW/gera、5^w潔'5pora扁.toz'、八孑包裂殖酵母(/Sc/7/zosacc/7ara附y(tǒng)cesocto^or—、粟酒裂歹直酵母(iSc/z/zosacc/zaramycas/9om6e)、西方"i午旺酵母(5bMvcw"/ow少cesocc/cfewtofe)、戴爾有孑包圓酵母(7brw/ay/orafife/6rMecA://)、戴爾有孑包圓酵母、大連酵母(5"flcc/2ara/w少cesda/re似/力、戴爾有孑包圓酵母、發(fā)酵有孑包圓酵母(7^^/05/0^3_/^77￡;^"")、發(fā)酵性酵母、戴爾有孢圓酵母、羅斯有孢圓酵母(ronz/a^orara化/)、羅斯酵母(&cc/7fl/w^cesmye/)、戴爾有孢圓酵母、羅斯酵母、戴爾有孢圓酵母、德爾布酵母、戴爾有孑包圓酵母、德'爾布酵母、々gosacc/zaram^yc&smcwgo/Zcws、(Dora/as;9orag/oZ)osa)、；求形德-巴利酵母CDe^a7^omycesg7oZ)asw力、圓&jM以酵酵母(7Wc/asporowcw她e調(diào))、三角酵母(7HgW7o/w^va〃'aZ//^)、力口利3畐尼亞擬威爾酵母(附'〃/o;w/51ca/zybrm'ca)、擬威爾酵母(附〃/o戸.ss她w—、二孑包接合酵母(Zjgos(3Cc/zara，ces6—w"力、二孢接合酵母、(Detor;w^cesofc;on^)、二孢酵母、二孢接合酵母、二孢酵母、蟲奪蜜接合酵母(^vgc^acc/7aramycesme脂)、^vg。sacc/j"ra附y(tǒng)ces、(Zygc^acc/wra，c&srawx"m)、魯接合酵母(々gwacc/z(3ra，c&srawx//)、(Z_vgoMcc/wram_yc&yZ^Aen')、魯酵母、魯接合酵母、大接合酵母(Zygaracc/zaramyc&ym"乂or)、魯酵母、異常畢赤酵母、牛腸畢赤酵母、加拿大畢赤酵母、P/c&'acwwm'"粉狀畢赤酵母、發(fā)酵畢赤酵母、泌液畢赤酵母、膜醭畢赤酵母、假多形畢赤酵母、櫟畢赤酵母、P/c/;/ara6er加7、尸"w&2^附a爿"to/T"CG、紅冬孢酵母、紅冬孢酵母、紅酵母、貝酵母、貝酵母、二孢酵母、釀酒酵母、薛瓦酵母、德爾布酵母、發(fā)酵性酵母、脆壁酵母、路德酵母、粟酒裂殖酵母、西方許旺酵母、戴爾有孢圓酵母、rww/asporag/o6oM、三角酵母、加利福尼亞擬威爾酵母、擬威爾酵母、二孢接合酵母、蜂蜜接合酵母、魯接合酵母或任何其它本領(lǐng)域已知的或本文描述的真菌(例如，酵母)。示例性低等真核生物還包括曲霉屬(vl^erg/〃^)的多個種，包括但不限于，淺藍灰曲霉(Jsperg/〃Mscaew'e〃w力、亮白曲霉(/^/ez-g/〃^s、肉色曲霉(y^/erg飾scaweiw)、棒曲霉(A/erg/〃z^c/avof加)、彎頭曲霉(y^/er^〃w^c/e^/7ecZw力、黃曲霉(v4s/erg〃/ws_/7avM>s)、》因曲霉(^s;erg/〃t^/w附/gflft^)、灰纟錄曲霉(y^/erg/〃twg/awc—、構(gòu)巢曲霉(v4，rg/〃船w油/a—、黑曲霉、赭曲霉(yl5perg7'〃woc/7racew力、米曲霉(y^e,g/〃w寄生曲霉(y4iperg7'〃w/arasWc—、青霉狀曲霉(A/erg7'〃j^戸m'c/〃o/(i&y)、局卩艮曲霉(Aperg贏smstn'c^s)、醬油曲霉(J^erg7'〃wssoy'ae)、聚多曲霉(」5pe尸g/〃^s;/(iovW)、溜曲霉(y^/^g/〃z^to應(yīng)〃')、土曲霉(A;grg7.〃^fe廳et^)、焦曲霉(/^/7Wg7.〃WSM虛5)或雜色曲霉(^^ewz7/wve^cofo。。編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因可以從中獲得的示例性原蟲屬包括，但不限于，芽短膜蟲屬(說wtocr欣Wa)、短膜蟲屬(CWAWa)、腸錐蟲屬C&26fo^少/7fl"w附)、旬滴蟲屬(/ferpeto附owos)、利什曼原蟲屬(丄e/A柳(3m'a)、細滴蟲屬(丄e/tomo"os)、才直生滴蟲屬(尸/^tomcwos)、4,蟲屬(7)j/7a"asom(3)(例io，布氏4,蟲(7:^Mceh')、岡比亞4,蟲(7:gam&e似e)、羅德西亞錐蟲(r/zoafew'erae)和克氏4偉蟲(Z"wz())和應(yīng)該理解的是，如本文所述，遺傳工程化可以用于表達(例如過表達)、引入修飾至、或缺失多種基因(例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因)和/或本文所述任何基因中一種或多種(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15或20種或更多種)的任意組合。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞缺乏ALG3(Genbank⑧登錄號XM一503488;GenolevuresRef:YALI0E03190g)基因或其基因產(chǎn)物(例如，mRNA或蛋白質(zhì))。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞表達(例如過表達)ALG6(Genbank登錄號XM—502922，GenolevuresRef:YALI0D17028g)蛋白。在一些實施方案中，所迷經(jīng)遺傳工程化的細胞表達MNN4基因(Genbank登錄號XM—503217,GenolevuresRef:YALI0D24101g)。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞缺乏0CH1和/或MNN9基因或其基因產(chǎn)物(例如，mRNA或蛋白質(zhì))。在一些實施方案或蛋白質(zhì))。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞表達葡糖苷酶II的a或(3亞基(或a和p亞基二者)，所述葡糖苷酶II例如解脂西洋蓍霉或布氏錐蟲的葡糖苦酶II。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞表達變聚糖酶(mutantase),例如哈茨木霉的變聚糖酶。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞可以具有這些修飾的任意組合。例如，在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞可以缺乏ALG3(例如，由Genbank⑧登錄號XM—503488,GenolevuresRef:YALI0E03190g示例的ALG3基因)基因或其基因產(chǎn)物(例如，mRNA或蛋白質(zhì))；可以過表達ALG6(例如，如由Genbank⑧登錄號XM—502922，GenolevuresRef:YALI0D17028g示例的ALG6)蛋白；可以過表達葡糖苷酶II(例如解脂西洋蓍霉、布氏錐蟲或任何其它本文所述的物種的葡糖苷酶II)的a和/或p亞基；可以過表達a-l，2-甘露糖苷酶；并且過表達如下中的一種或多種(和任意組合)糖苷酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、糖-核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白、糖-核苷酸修飾酶。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞不缺乏0CH1基因或其基因產(chǎn)物(例如，mRNA或蛋白質(zhì))。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞可以含有甘露糖苷酶活性(例如，a-甘露糖苷酶活性)。所述甘露糖苷酶活性可以靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。所述甘露糖苦酶可以具有至少7.5以下的最適pH(例如，至少7.4以下，至少7.342以下，至少7.2以下，至少7.1以下以下，至少6.7以下，至少6.6以下以下，至少6.2以下，至少6.1以下以下，至少5.7以下，至少5.6以下以下，至少5.2以下，至少5.1以下以下或至少4.7以下)。所述甘露糖苦酶可以是MNS1。例如，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞可以過表達甘露糖香酶(例如，a-l，2-甘露糖香酶或任何其它本文所述的甘露糖苷酶)，但是不缺乏OCH1基因或其基因產(chǎn)物(例如，mRNA或蛋白質(zhì))。所述甘露糖香酶可以是所述蛋白質(zhì)的野生型形式，或者可以是突變形式，例如含有甘露糖苷酶和HDELER-保留氨基酸序列的融合蛋白(參見實施例)。(應(yīng)該理解可以將任何具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)工程化改造成包含HDEL序列的融合蛋白)。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞可以含有能夠促進目標分子的改變的N-糖基化形式進行甘露糖基磷酸化的活性。例如，可以將編碼促進N-聚糖進行磷酸化的活性的核酸(例如MNN4，MNN6，PN01)引入遺傳工程化的細胞，所述細胞能夠增加目標分子的N-糖基化的磷酸化。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞可以含有能夠去除甘露糖殘基的活性(例如，甘露糖苷酶，如來自JackBean的甘露糖苷酶)，所述甘露糖殘基遮蔽N-糖基化改變的分子的磷酸化。在一些實施方案中，所述經(jīng)遺傳工程化的細胞能夠從Man5GlcNAc2去除葡萄糖殘基。例如，所述經(jīng)遺傳修飾的細胞可以過表達具有a-l，3-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)，例如，但不限于，變聚糖酶或葡糖香酶II(例如解脂西洋蓍霉、布氏錐蟲或本文所述的任何其它真菌菌種的葡糖苷酶II)的a和/或f3亞基。在具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)源自與表達該蛋白質(zhì)的細胞不同類型(例如，不同種)的細胞的實施方案中，可以為了在特定的感興趣的細胞中表達而對編碼所述蛋白質(zhì)的核酸進行密碼子優(yōu)化。例如，可以對來自布氏錐蟲的編碼具有N-糖基化的蛋白質(zhì)的核酸進行密碼子優(yōu)化用于在酵母細胞(例如解脂西洋蓍霉)中表達。這種密碼子優(yōu)化可以用于增加蛋白質(zhì)在感興趣的細胞中的表達。用于對編碼蛋白質(zhì)的核酸進行密碼子優(yōu)化的方法是本領(lǐng)域已知,至少7.0以下，至少6.9以下，至少6.8，至少6.5以下，至少6.4以下，至少6.3,至少6.0以下，至少5.9以下，至少5.8,至少5.5以下，至少5.4以下，至少5.3，至少5.0以下，至少4.9以下，至少4.8的，并且記載在例如Gao等(Biotechnol.Prog.(2004)20(2):443-448)，Kotula等(Nat.Biotechn,(1991)9，1386—1389)和Bennetzen等(J.Biol.Chem.(1982)257(6):2036-3031)中。也可以對細胞進行遺傳工程化以主要產(chǎn)生作為哺乳動物(例如，人)糖基化途徑的中間體的N-聚糖。例如，可以將編碼具有N-糖基化活性的人的蛋白的一種或多種核酸引入細胞。在一些實施方案中，可以將人的蛋白引入細胞，并且可以抑制(例如，缺失或突變)一種或多種具有N-糖基化活性的內(nèi)源酵母蛋白。用于"人源化，，真菌糖基化途徑的技術(shù)記載在，例如，Choi等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(9):5022-5027;Verveken等(2004)Appl.Environ.Microb.70(5):2639-2646;和Gerngross(2004)NatureBiotech.22(11):1410-1414中，將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。在遺傳工程化涉及例如改變蛋白質(zhì)的表達或外源蛋白(包括內(nèi)源蛋白的突變形式)的表達的情況下，可以使用多種技術(shù)來測定經(jīng)遺傳工程化的細胞是否表達該蛋白質(zhì)。例如，編碼所述蛋白質(zhì)的mRNA或蛋白質(zhì)本身的存在可以如下檢測，分別使用例如Northern印跡或RT-PCR分析或Western印跡分析。具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的胞內(nèi)定位可以通過使用多種技術(shù)來分析，所述技術(shù)包括亞細胞分級和免疫熒光。另外的遺傳修飾和將它們引入本文描述的任何細胞的方法可以根據(jù)例如，美國專利Nos.7,029,872;5,272,070;和6,803,225;和美國專利申請公開Nos.20050265988、20050064539、20050170452和20040018588的/>開內(nèi)容修改適用，將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。盡管在雙態(tài)性酵母菌種中為了實現(xiàn)體內(nèi)產(chǎn)生Man5GlcNAc2和Man3GlcNAc2而進行的工程化步驟可能與在其它酵母菌種中進行的工程化步驟不同，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚在雙態(tài)性酵母中體內(nèi)產(chǎn)生經(jīng)修飾的糖蛋白(具有MansGlcNAc2和Man3GlcNAc2核心N-聚糖結(jié)構(gòu))的工程化技術(shù)可以根據(jù)常規(guī)實驗法從包括但不限于美國專利No.7,326,681和美國公開Nos.200400185卯、20060040353和20060286637(將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文)中公開方法修改獲得。由此可以將經(jīng)修改的方法用于實現(xiàn)糖蛋白的產(chǎn)生，所述糖蛋白經(jīng)修飾而具有人類型雜合和復(fù)合的N-聚糖。這些復(fù)合N-聚糖可以在上文指定的核心聚糖上具有2-5個以GlcNAc殘基起始的分支，其可以進一步延伸，例如，用半乳糖、果糖、唾液酸殘基延伸。在一些實施方案中，具有N-糖基化活性的突變蛋白或野生型蛋白可以從經(jīng)遺傳工程化的細胞中使用標準技術(shù)分離。例如，在所述經(jīng)遺傳工程化的細胞中表達突變蛋白或野生型蛋白之后，可以從該細胞本身或從培養(yǎng)該細胞的培養(yǎng)基分離所述蛋白質(zhì)。分離蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的并且包括，例如，液相層析(例如，HPLC)、親和層析(例如，金屬螯合或免疫親和層析)、離子交換層析、疏水相互作用層析、沉淀或差示溶解(differentialsolubilization)。在一些實施方案中，可以將具有N-糖基化活性的分離的蛋白質(zhì)冷凍、凍干或固定，并且儲存在合適條件下，所述條件允許該蛋白質(zhì)保持活性。本公開還提供本文描述的任何經(jīng)遺傳工程化的細胞的基本上純的培養(yǎng)物。如用于本文，經(jīng)遺傳工程化的細胞的"基本上純的培養(yǎng)物"是這樣的細胞培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中活細胞總數(shù)的低于約40%(即，低于約35%;30%;25%;20%;15%;10%;5%;2%;1%;0.5%;0.25%;0.1%;0,01%;0.001%;0.0001%;或甚至更低)是除所述經(jīng)遺傳工程化的細胞之外的活細胞，例如，細菌、真菌(包括酵母)、支原體或原生動物細胞。術(shù)語"約"在本文上下文中指相關(guān)的百分比可以比指定百分比高或低所述指定百分比的15%。因此，例如，約20%可以是170/。-23%。這樣的經(jīng)遺傳工程化的細胞的培養(yǎng)物包括細胞和培養(yǎng)、儲存或轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以是液體、半固體(例如，膠狀培養(yǎng)基)或是冷凍的。培養(yǎng)物包括培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中或培養(yǎng)在半固體培養(yǎng)基中/上的細胞、或儲存或轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基(包括冷凍儲存或轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基)中儲存或轉(zhuǎn)運的細胞。培養(yǎng)物可以在培養(yǎng)容器或儲存容器或基底(例如，培養(yǎng)皿、燒瓶或管或儲存小瓶或管)中。本文描述的經(jīng)遺傳工程化的細胞可以如下儲存，例如，作為冷凍細胞懸液，例如，在含有冷凍保護劑如甘油或蔗糖的緩沖劑中，作為凍干的細胞?；蛘?，它們可以例如作為干燥的細胞制備物儲存，通過例如流化床干燥或噴霧干燥，或任何其它合適的干燥方法。產(chǎn)生N-糖基化改變的分子的方法本文描述產(chǎn)生目標分子的改變的N-糖基化形式的方法。所述方法通常涉及使目標分子與來自經(jīng)遺傳工程化的細胞(例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍霉、/1rx"/aa&m'mVwwM或本文所述的任何其它關(guān)的雙態(tài)性酵母細胞)、植物細胞或動物細胞(例如，線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人))的一種或多種N-糖基化活性接觸。所述方法可以是基于細胞的或不基于細胞的。基于細胞的方法可以包括向經(jīng)遺傳工程化而具有至少一種經(jīng)修飾N-糖基化活性的細胞(例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍霉、爿no/A3aAw'w'voraraN-糖基化的目標分子的核酸，其中所述細胞以改變的N-糖基化形式產(chǎn)生所述目標分子。所述目標分子可以是，例如，蛋白質(zhì)如任何本文所述的目標蛋白。在目標蛋白是脂質(zhì)的實施方案中，核酸可以是編碼一種或多種促進脂質(zhì)合成的酶的核酸。通過對細胞進行遺傳工程化來產(chǎn)生的修飾的類型在本文描述(參見隨附實施例和上文的"遺傳工程化的細胞")。用于引入核酸的方法是本領(lǐng)域已知的并且記載在隨附實施例和上文中。在遺傳工程化的細胞中引入或表達目標分子(例如，目標蛋白)可以導(dǎo)致運輸目標分子通過細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或高爾基體，由此產(chǎn)生目標分子的改變的N-糖基化形式。在對目標分子進行加工之后(例如，在經(jīng)遺傳修飾的細胞中)，目標分子(例如，目標蛋白)的改變的N-糖基化形式可以含有一種或多種N-聚糖結(jié)構(gòu)。例如，目標分子的改變形式可以含有一種或多種特定的N-具體結(jié)構(gòu)如Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I或VII;圖4),Man8GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I;圖4)，Man9GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式II;圖4)，Man3GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式XIV;圖4)，Glc!Mari5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式VIII;圖4),或Glc2Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式IX;圖4)("Man，，是甘露糖；"Glc，，是葡萄糖；而"GlcNAc，，是N-乙酰葡糖胺)。產(chǎn)生自經(jīng)遺傳工程化的細胞的N-糖基化改變的目標分子可以是均質(zhì)的(即，全部N-糖基化改變的分子含有相同的特定N-聚糖結(jié)構(gòu))或者可以是基本上均質(zhì)的。"基本上均質(zhì)"是指改變的目標分子是由經(jīng)遺傳工程化的細胞產(chǎn)生的改變N-糖基化的目標分子的至少約25%(例如，至少約27%,至少約30%，至少約35%，至少約40%，至少約45%，至少約50%，至少約55%，至少約60%，至少約65%,至少約70%，至少約75%,至少約80%,至少約85%，至少約90%或至少約95%或至少約99%)。在經(jīng)遺傳工程化的細胞包括一種或多種影響N-聚糖磷酸化的N-糖基化活性的情況下，目標分子的改變的N-糖基化形式可以具有至少約25%(例如，至少約27%，至少約30%,至少約35%，至少約40%，至少約45%,至少約50%，至少約55%，至少約60。/0，至少約65%，至少約70%，至少約75%或至少約80%)的它的甘露糖基殘基是磷酸化的。在遺傳工程化的細胞的任何遺傳修飾在誘導(dǎo)信號(例如，化學(xué)或物理信號)存在下為誘導(dǎo)型或條件性的情況下，可以任選地將所述遺傳工程化的細胞在引入核酸之前、過程中或之后在誘導(dǎo)劑存在下培養(yǎng)。例如，在引入編碼目標蛋白的核酸之后，可以將所述細胞曝露于化學(xué)誘導(dǎo)劑，所述化學(xué)誘導(dǎo)劑能夠促進一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的表達。在多種誘導(dǎo)信號誘導(dǎo)一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)條件性表達的情況下，可以使細胞與多種誘導(dǎo)信號接觸。在通過一種或多種N-糖基化活性加工之后，將改變的目標分子分離。改變的目標分子可以經(jīng)由編碼序列(外源核酸所固有的或工程化至表達載體中的)提供的機制分泌至培養(yǎng)基中，所述編碼序列指導(dǎo)所述分子從細胞分泌。細胞裂解物或培養(yǎng)基中改變的目標分子的存在可以通過多種用于檢測分子存在的標準規(guī)程來驗證。例如，在改變的目標分子是蛋白質(zhì)的情況下，這樣的規(guī)程可以包括，但不限于，使用對于所述改變的目標蛋白(或目標蛋白本身)特異性的抗體進行的免疫印跡或放射免疫沉淀，對于所述改變的目標蛋白(或目標蛋白本身)特異性的配體進行的結(jié)合，或測試改變的目標蛋白(或目標蛋白本身)的特異性酶活性。在一些實施方案中，可以將分離的改變的目標分子冷凍、凍干或固定，并且儲存在合適條件下，例如，所述條件允許改變的目標分子保持生物學(xué)活性?？梢詫δ繕朔肿拥母淖兊腘-糖基化形式進一步進行體內(nèi)加工(例如，在經(jīng)遺傳工程化的細胞中)，或者可以在從經(jīng)遺傳工程化的細胞或細胞培養(yǎng)基分離之后進行體外加工。進一步加工可以包括對改變的目標分子的一種或多種N-聚糖殘基的修飾或?qū)Ω淖兊哪繕朔肿拥腘-聚糖殘基之外的修飾。改變的目標分子的額外的加工可以包括添力o(共價或非共價結(jié)合)異源模塊如聚合物或載體。進一步的加工也可以包括對改變的目標分子進行的酶或化學(xué)處理。酶處理可以包括使改變的目標分子與一種或多種糖苦酶(例如，甘露糖香酶或甘露聚糖酶)、磷酸二酯酶、磷脂酶、糖基轉(zhuǎn)移酶或蛋白酶接觸足以誘導(dǎo)對所述改變的目標分子的修飾的時間。酶處理也可以包括使所述改變的目標分子與能夠從Mari5GlcNAc2去除一種或多種葡萄糖殘基的酶接觸，所述酶例如，但不限于，甘露糖苷酶或葡糖苷酶II的a和/或(3亞基?；瘜W(xué)處理可以例如包括使改變的目標分子與酸(例如氫氟酸)接觸足以誘導(dǎo)對所述改變的目標分子的修飾的時間。特定條件下的氫氟酸處理特異性地去除與聚^f唐以磷酸二酯鍵連接的甘露糖殘基，同時在聚糖上保留磷酸。改變的目標分子可以通過從一個或多個N-聚糖添加或去除磷酸基團來進一步加工。例如，可以使改變的目標分子與甘露糖基激酶或甘露糖基磷酸酶接觸。在一些實施方案中，任何文描述的改變的目標分子可以在分離之后與異源模塊附接，例如，使用酶或化學(xué)方法。"異源模塊"是指與改變的目標分子結(jié)合(例如，共價或非共價)的任何成分，所述成分不同于原始存在于所述改變的目標分子之上的成分。異源模塊包括，例如，聚合物、載體、佐劑、免疫毒素或可檢測(例如，熒光、發(fā)光或放射性)的模塊在一些實施方案中，可以向改變的目標分子添加額外的N-聚糖。應(yīng)該理解的是，可以，但不需要在遺傳工程化的細胞中加工目標分子。例如，本公開還包括無細胞的產(chǎn)生具有改變的N-糖基化形式的目標分子的方法，所述方法包括使目標分子在N-糖基化條件下與制備自細胞(例如，真菌細胞(例如，解月旨西洋蓍霉、^n;w/aafifem'm'vorara或本文描述的任何其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母細胞)、植物細胞或動物細胞(例如，線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人))的細胞裂解物接觸的步驟，所述細胞經(jīng)遺傳工程化而具有至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，其中使目標分子與所述細胞裂解物接觸產(chǎn)生目標分子的改變的N-糖基化形式。"N-糖基化條件"是指將混合物(例如，目標分子和細胞裂解物的混合物)在允許改變的N-糖基化的條件下溫育(如上所述)。用于獲得細胞裂解物(在所述裂解物中保留一種或多種N-糖基化活性的活性或完整性)的合適方法可以包括使用合適的緩沖液和/或抑制劑，包括核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制劑，其保護或最小化細胞裂解物中N-糖基化活性的改變。這些抑制劑包括，例如，螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇雙(P-氨基乙醚)N，N,N1，Nl-四乙酸(EGTA),蛋白酶抑制劑如苯曱基磺酰氟化物(PMSF)、抑肽酶、亮抑肽酶、抗痛素等，和磷酸酶抑制劑如磷酸鹽、氟化鈉、釩酸鹽等。抑制劑可以這樣選擇，即它們不干擾或僅最小程度負面影響N-糖基化活性或感興趣的活性。用于獲得含有酶活性的裂解物的合適的緩沖齊寸禾口條4牛i己載在，例^口,Ausubel等CurrentProtocolsinMolecularBiology(Supplement47)，JohnWiley&Sons,NewYork(1999);Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress(1988》HarlowandLane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(1999);TietzTextbookofClinicalChemistry,3rded.BurtisandAshwood，eds.W.B.Saunders，Philadelphia,(1999)中?？梢詫⒓毎呀馕镞M一步加工以使當?shù)叵蜃頳、化干擾物質(zhì)的存在。如有需要，可以通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將細胞裂解物分級，所述方法包括亞細胞分級和層析技術(shù)，如離子交換、疏水和反向、大小排阻、親牙口、發(fā)u7JC電荷i秀導(dǎo)層沖斤等(參見，例i口，Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,thirdedition,Springer-Verlag,NewYork(1993);Burton和Harding,J.Chromatogr.A814:71-81(1998))。在一些實施方案中，可以制備細胞裂解物，其中全部細胞器保持完整和/或有功能。例如，裂解物可以含有完整的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、完整的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或完整的高爾基體中的一種或多種。用于制備含有完整的細胞器的裂解物和測試細胞器的功能性的合適方法記載在，例如，Moreau等(1991)J.Biol.Chem.266(7):4329-4333;Moreau等(1991)J.Biol.Chem.266(7):4322-4328;Rexach等(1991)J.CellBiol.U4(2):219-229;和Paulik等(1999)Arch.Biochem.Biophys.367(2):265_273中；將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。本公開還提供產(chǎn)生具有改變的N-糖基化形式的目標分子的方法，其包括使目標分子在N-糖基化條件下與一種或多種具有N-糖基化活性的分離的蛋白質(zhì)接觸的步驟，其中使所述目標分子與一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸產(chǎn)生目標分子的改變的N-糖基化形式，并且其中所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)制備自經(jīng)遺傳工程化而具有至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性的細胞(例如真菌細胞(例如，解脂西洋蓍霉、^"xw/aatfew/m'wrara或本文描述的任何其它相關(guān)的雙態(tài)性酵母細胞)、植物細力包或49動物細胞(例如，線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人))?？梢允褂萌缟纤龅臉藴始夹g(shù)將一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)純化?？梢允鼓繕朔肿优c一種或多種蛋白質(zhì)在合適的緩沖液中接觸足以誘導(dǎo)對目標分子的修飾的時間，如例如，Lee和Park(2002)30(6):716-720以及Fujita和Takegawa(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.282(3):678-682中所述，將所述公開內(nèi)容通過所述完整并入本文。在一些實施方案中，可以使目標分子僅與一種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸。在一些實施方案中，可以使目標分子與超過一種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸?？梢允鼓繕朔肿优c超過一種蛋白質(zhì)同時或相繼接觸。在將目標分子與超過一種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)相繼接觸的情況下，可以，但不需要，將目標分子在一個或多個步驟之后純化。即，可以使目標分子與蛋白活性A接觸，然后在將所述分子與蛋白活性B接觸之前進行純化，等等。在無細胞方法的一些實施方案中，在使目標分子與一種或多種N-糖基化活性接觸之前將目標分子與固相支撐物連接可能是有利的。這樣的連接能夠使N-糖基化修飾之后的純化更簡單。合適的固相支撐物包括，但不限于，多孔測定平板、顆粒(例如，^磁性或編碼顆粒)、柱或膜。用于檢測目標分子的N-糖基化(例如，改變的N-糖基化)的方法包括DNA測序儀輔助型(DSA)、熒光團輔助型糖電泳(FACE)(如隨附實施例中所述)或表面增強型激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOFMS)。例如，分析可以利用DSA-FACE，其中，例如，將糖蛋白變性，其后固定在例如膜上。然后可以將糖蛋白用合適的還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)或p-巰基乙醇還原。蛋白質(zhì)的巰氬基可以使用酸如碘乙酸來羧化。然后，可以使用酶如N-糖苷酶F將N-聚糖從蛋白質(zhì)釋放。任選地，N-聚糖可以通過還原性氨基化重建和衍生化。然后可以將衍生化的N-聚糖濃縮。適合用于N-聚糖分析的儀器包括，例如，ABIPRISM377DNA測序儀(AppliedBiosystems)。數(shù)據(jù)分析可以使用例如GENESCAN3.1軟件(AppliedBiosystems)進4亍。任選地，可以將分離的甘露糖蛋白進一步用一種或多種酶處理以確認它們的N-聚糖狀態(tài)。示例性的酶包括，例如，a-甘露糖普酶或a-l，2甘露糖苷酶，如隨附實施例中所述。另外的N-聚糖分析方法包括，例如，質(zhì)譜(例如，MALDI-TOF-MS)，正相、反相高壓液相層析(HPLC)和離子交換層析(例如，當未標記聚糖時使用脈沖電流計檢測，而如果對聚糖進行了合適的標記則使用UV吸光度或萸光)。還參見Callewaert等(2001)Glycobiology11(4):275-281和Freire等(2006)Bioconjug.Chem.17(2):559-564,將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文?？捎蒒-糖基化改變的分子處理的病癥本文描述的分離的、N-糖基化改變的分子(例如，N-糖基化改變的蛋白質(zhì)或多萜醇)可以用于治療多種疾病，所述疾病可以通過施用一種或多種N-糖基化改變的分子來治療(例如，N-糖基化改變的蛋白質(zhì))。能夠通過施用N-糖基化改變的分子(例如，改變的N-糖蛋白或改變的N-糖基化的多萜醇)治療或預(yù)防的一些特定醫(yī)學(xué)狀況的實例在下節(jié)中評述。(i)代謝紊亂代謝紊亂是影響個體人(或動物)細胞內(nèi)能力產(chǎn)生的病癥。大多數(shù)代^f紊亂是遺傳性的，盡管一些可以因飲食、毒素、感染等而"獲得"。遺傳性代謝紊亂也稱作代謝的先天性缺陷。概括而言，遺傳性代謝紊亂是由遺傳缺陷引起的，所述缺陷導(dǎo)致缺失或不正確地構(gòu)建細胞代謝過程中的一些步驟所必須的酶。最大幾類的代謝紊亂是糖代謝的紊亂、氨基酸代謝的紊亂、有機酸代謝的紊亂(有機酸尿癥(organicacidurias)),脂肪酸氧化和線粒體代謝的紊亂，卟啉代謝的紊亂，嘌呤或嘧啶代謝的紊亂，類固醇代謝的紊亂，線粒體功能的紊亂，過氧化物酶體功能的紊亂和溶酶體貯積病(LSD)。能夠通過使用一種或多種本文描述的N-糖基化改變的分子(或其藥物組合物)來治療的代謝紊亂的實例包括，例如，遺傳性血色病(hereditaryhemochromatosis)、目艮皮月夫白4匕病(oculocutaneousalbinism)、蛋白C(proteinCdeficiency)、I型遺傳性血管性水胂(typeIhereditaryangioedema)、先天性蔗糖酶-異麥芽糖酶在失乏(congenitalsucrase-isomaltasedeficiency)、克-纟內(nèi)二氏II型(Crigler-Najjartype11)、Laron綜合征(Laronsyndrome)、遺傳性髓過氧化物酶(hereditaryMyeloperoxidase)、原發(fā)性甲狀A(yù)泉才幾能減退(primaryhypothyroidism)、先天性長QT綜合征(congenitallongQTsyndrome)、酪氨酸結(jié)合3求蛋白缺乏(tyroxinebindingglobulindeficiency)、家族性高膽固醇血癥(familialhypercholesterolemia)、家族性乳糜微粒血癥(familialchylomicronemia)、a卩-月旨蛋白血癥(a(3-lipoproteinema)、葉氐原生質(zhì)月旨蛋白A平(lowplasmalipoproteinAlevels)、伴有肝損傷的遺傳性氣月中(hereditaryemphysemawithliverinjury)、先天性曱狀^>才幾能減退(congenitalhypothyroidism)、成骨不全(osteogenesisimperfecta)、遺傳性血纖維蛋白原過少(hereditaryhypofibrinogenemia)、a-1#元月夷)疑乳蛋白酶擊失乏(a-1antichymotrypsindeficiency)、腎原性尿崩癥(nephrogenicdiabetesinsipidus)、垂體^申纟至^卩尿崩癥(neurohypophysealdiabetesinsipidus)、il^香脫氨酶缺乏(adenosinedeaminasedeficiency)、佩-邁二氏病(PelizaeusMerzbacherdisease)、IIA型馮維勒布蘭德病(vonWillebranddiseasetypeIIA)、結(jié)合性因子V和VIII缺乏(combinedfactorsVandVIIIdeficiency)、遲發(fā)性脊推骨媒發(fā)育不全(spondylo-epiphysealdysplasiatarda)、無月7:M各月莫(ch0r0ideremia)、I纟田月包病(Icelldisease),白頓氏病(Battendisease)、共濟失調(diào)性毛細血管擴張癥(ataxiatelangiectasias)、常染色體顯性多嚢性腎病(ADPKD-autosomaldominantpolycystickidneydisease)、微絨毛包含病(microvillusinclusiondisease)、纟*核性石更化(tuberoussclerosis)、Lowe目艮腦腎綜合4正(oculocerebro-renalsyndromeofLowe)、月幾蓁纟宿'l"生柳J索石更4b(amyotrophiclateralsclerosis)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplasticsyndrome)、棵淋巴細胞綜合征(Barelymphocytesyndrome)、丹吉爾病(Tangierdisease)、家力矣性肝內(nèi)月旦汁郁積(familialintrahepaticcholestasis),X連鎖的腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥(X-linkedadreno-leukodystrophy)、Scott綜合征(Scottsyndrome)、1型和2型海-普二氏綜合征(Hermansky-Pudlaksyndrometypes1and2)、左爾威格氏綜合征(Zellwegersyndrome)、月支才艮點^大庫欠骨發(fā)育異常(rhizomelicchondrodysplasiapuncta)、常染色體隱性原發(fā)性高草酸尿(autosomalrecessiveprimaryhyperoxaluria)、MohrTranebjaer綜合征(MohrTranebjaergsyndrome)、脊骨逸延髓月幾萎縮(spinalandbullarmuscularatrophy)、原發(fā)性睫運動障礙(primaryciliarydiskenesia)(卡》荅才各內(nèi)氏綜合4正(Kartagener，ssyndrome))、巨人癥詳口月支端月巴大癥(giantismandacromegaly)、享L溢(galactorrhea)、艾迪遜氏病(Addison'sdisease)、腎上腺性男性化(adrenalvirilism)、庫興氏綜合征(Cushing，ssyndrome)、酮酸中毒(ketoacidosis)、原發(fā)性或繼發(fā)性醛固酮增多癥(primaryorsecondaryaldosteronism)、米-迪綜合征(MillerDiekersyndrome)、無腦回(lissencephaly)、運動3申經(jīng)元病(motorneurondisease)、阿史爾氏綜合4正(Usher，ssyndrome)、威-阿二氏綜合征(Wiskott-Aldrichsyndrome)、奧4風(fēng)齊氏綜合4正(Optizsyndrome)、亨廷頓氏病(Huntington'sdisease)、遺傳性月夷腺炎(hereditarypancreatitis)、抗石舞脂綜合4正(anti-phospholipidsyndrome)、重疊結(jié)締組織病(overlapconnectivetissuedisease),斯耶格倫氏綜合征(Sj6gren，ssyndrome)、僵體綜合征(stiff-mansyndrome)、Brugada綜合征(Brugadasyndrome)、芬蘭型先天性腎病綜合征(congenitalnephriticsyndromeoftheFinnishtype)、；fi-約二氏綜合征(Dubin-Johnsonsyndrome)、X連鎖4氐石奔酸鹽血癥(X-linkedhypophosphosphatemia)、佩德里得綜合征(Pendredsyndrome)、嬰兒期持續(xù)性高血胰島素低血糖(persistenthyperinsulinemichypoglycemiaofinfancy)、遺傳性J求形紅細胞增多癥(hereditaryspherocytosis)、無血漿酮藍蛋白血癥(acemloplasminemia)、嬰JL^申纟至元蠟才羊月旨4曷質(zhì);^禾口、癥(infantileneuronalceroidlipofuscinosis)、假性軟骨發(fā)育不全和多發(fā)性骨骺發(fā)育不良(不全)(pseudoachondroplasiaandmultipleepiphyseal)、Stargardt樣黃斑發(fā)育不良(Stargardt-likemaculardystrophy)、X連鎖夏-馬-圖三氏病(X-linkedCharcot-Marie-Toothdisease)、常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性(autosomaldominantretinitispigmentosa)、Wolcott-Rallison綜合征(Wolcott-Rallisonsyndrome)、庫興氏病(Cushing，sdisease)、月支帶月幾營養(yǎng)不良(limb-girdlemusculardystrophy)、IV型粘多糖貝i積病(mucoploy-saccharidosistypeIV)、芬蘭遺傳性家力矣性淀并分才羊變性(hereditaryfamilialamyloidosisofFinish)、安德才l氏病(Andersondisease)、肉瘤(sarcoma)、十曼性髓單核細胞性白血病(chronicmyelomonocyticleukemia)、心肌病(cardiomyopathy)、面生殖發(fā)育異常(faciogenitaldysplasia)、Torsion病(Torsiondisease)、亨廷牽頁禾口脊骨逸小月鹵姿纟宿(Huntingtonandspinocerebellarataxias)、hereditaryhyperhomosyteinemia、多神經(jīng)病(polyneuropathy),下運動神經(jīng)元病(lowermotorneurondisease)、色素性視網(wǎng)膜炎(pigmentedretinitis)、血清陰性多關(guān)節(jié)炎(seronegativepolyarthritis),間質(zhì)月申纖維化(interstitialpulmonaryfibrosis)、雷諾氏現(xiàn)象(Raynaud'sphenomenon)、韋才各纟內(nèi)氏肉芽月中病(Wegner，sgranulomatosis),蛋白尿(preoteinuria)、CDG-Ia、CDG-Ib、CDG-Ic、CDG-Id、CDG-Ie、CDG畫If、CDG-IIa、CDG陽IIb、CDG-IIc、CDG-IId、埃-當二氏綜合征(Ehlers-Danlossyndrome)、多發(fā)性外生骨疣(multipleexostoses)、格里斯塞利氏綜合征53(Griscellisyndrome)(1型或2型)或X連鎖性非特異性腦力發(fā)育遲緩(X-linkednon-specificmentalretardation)。此夕卜，4戈i射紊亂還可包4舌溶酶體貯積病例^口，但不限于，法布里氏病、法勃氏病(Farberdisease)、高歇爾氏病、GMi神經(jīng)節(jié)糖苷沉積癥(GM廣gangliosidosis)、泰-沙二氏病、桑德霍夫氏病(Sandhoffdisease)、GM2激活病(GM2activatordisease)、克臘伯氏病(Krabbedisease)、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(metachromaticleukodystrophy)、尼-皮二氏病(Niemann-Pickdisease)(A、B和C型)、赫勒氏病(Hurlerdisease)、沙4尹氏病(Scheiedisease)、Hunter病(Hunterdisease)、桑菲歹寸普氏病(Sanfilippodisease)、莫爾基奧氏病(Morquiodisease)、馬-垃病(Maroteaux-Lamydisease)、透明質(zhì)酸酶缺乏(hyaluronidasedeficiency)、天門冬酰氨酸葡萄糖胺尿癥(aspartylglucosaminuria)、巖藻糖香貝i積病(fbcosidosis)、甘露糖香過多癥(mannosidosis)、"i射爾德氏病(Schindlerdisease)、1型p垂液酸擊夾乏病(sialidosistypel)、旁姆普氏病、致密性成骨不全(Pycnodysostosis)、蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(ceroidlipofuscinosis)、膽固醇酯沉積病(cholesterolesterstoragedisease)、烏爾曼氏病(Wolmandisease)、多發(fā)性硫酸酯酶缺乏(Multiplesulfatasedeficiency)、乳液唾液異常增多(galactosialidosis)、粘月旨貯積病(mucolipidosis)(11、III和IV型)、月光氨酸病(cystinosis)、唾液酸貯積病(sialicacidstoragedisorder)、伴有馬-斯二氏綜合征的乳糜微粒留滯病(chylomicronretentiondiseasewithMarinesco-Sj6grensyndrome)、海-普二氏綜合征(I-Iermansky-Pudlaksyndrome)、切-希二氏綜合征(Chediak-Higashisyndrome)、Danon病(Danondisease)或Geleophysic發(fā)育不良(Geleophysicdysplasia),代謝紊亂的癥狀多種多樣，并且可以包括如下的一種或多種，例如，貧血、疲勞、容易挫傷(bruisingeasily)、血小板低、肝增大、脾增大、骨骼脆弱(skeletalweakening)、肺損傷、感染(例如，胸部感染或肺炎)、腎損傷、進行性腦損傷、發(fā)作、胎糞過厚、咳嗽、哮鳴、唾液或粘液過量產(chǎn)生、氣短(shortnessofbreath)、腹痛、腸或消化道閉塞(occludedbowelorgut)、生育力問題、鼻內(nèi)息肉、杵狀指/趾曱和皮膚(clubbingofthefinger/toenailsandskin)、手或扭卩疼痛(paininthehandsorfeet)、血管角質(zhì)瘤(angiokeratoma)、4非汗減少、角月莫和晶狀體混法(cornealandlenticularopacities)、白內(nèi)障(cataracts)、二尖瓣垂牙口/或回；危(mitralvalveprolapseand/orregurgitation)、心、臟月巴大(cardiomegaly)、溫度不耐受、行走困難、吞咽困難、進行性視力喪失、進行性聽力喪失、張力減退、巨舌、反射消失、下腰痛、睡眠呼吸暫停、端坐呼吸、嗜睡、脊柱前凸或脊柱側(cè)凸。應(yīng)理解的是，由于^:陷或缺乏蛋白質(zhì)和所導(dǎo)致疾病表型(例如，代謝紊亂的癥狀顯現(xiàn))的不同性質(zhì)，給定病癥將通常^f又出現(xiàn)對于特定病癥為特征性的癥狀。例如，患有法博氏病的患者可以出現(xiàn)上述癥狀中的特定亞組，例如，但不限于，溫度不耐受、角膜眩暈(comealwhirling)、疼痛、皮滲、惡心或腹瀉?；加懈咝獱柺暇C合征(Gauchersyndrome)的患者可以出現(xiàn)脾大、肝硬變、驚厥、張力過高、呼吸暫停、骨質(zhì)疏;^或皮膚變色。除了施用本文描述的一種或多種N-糖基化改變的分子，代謝紊亂也可以通過適當?shù)臓I養(yǎng)和維生素(例如，輔因子療法)、物理療法和疼痛藥物療法來治療。依賴于給定代謝紊亂的特定性質(zhì)，患者可以在任何年齡出現(xiàn)這些癥狀。在許多情況下，癥狀可以在兒童期或成人期早期出現(xiàn)。例如，法博氏病的癥狀可以在年輕時(earlyage)出現(xiàn)，在10或11周歲的年齡。如用于本文，"有風(fēng)險發(fā)展出代謝紊亂"(例如本文所述的代謝紊亂)的受試者是具有發(fā)展出紊亂的傾向(predisposition)的受試者，即，由于酶中的突變而產(chǎn)生的發(fā)展出代謝紊亂的遺傳傾向，所述酶例如a-L-艾杜糖苷酸酶、(3-D-半乳糖苷酶、|3-葡糖苷酶、J3-己糖胺酶、P-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、P-D-葡糖醛酸酶、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苷酶、a-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。顯然，"有風(fēng)險發(fā)展出代謝紊亂"的受試者不是感興趣的物種中的全部受試者。"疑似患有病癥"的受試者是具有病癥(例如，代謝紊亂或任何其它本文所述的病癥)的一種或多種癥狀(例如，任何本文所述的那些癥狀)的受試者。(ii)癌癥癌癥是一類這樣的疾病或病癥，其特征在于細胞不受控制的分裂和這些細胞擴散的能力，所述擴散或者通過侵入直接生長進入相鄰組織或者通過轉(zhuǎn)移植入遠距離位點(其中癌細胞經(jīng)過血流或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)運)。癌癥可以侵襲各個年齡的人，但是風(fēng)險有隨年齡增加的趨勢。癌癥的類型可以包括，例如，肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌(hematologicalcancer)、神經(jīng)組織癌(neuraltissuecancer)、黑素瘤、曱狀腺癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌、宮頸癌、陰道癌或膀胱癌。如用于本文，"有風(fēng)險發(fā)展出癌癥，，的受試者是具有發(fā)展出癌癥的傾向的受試者，即，發(fā)展出癌癥的遺傳傾向，例如，腫瘤抑制基因中的突變(例如，BRCA1、p53、RB或APC中的突變)或已經(jīng)曝露于能夠?qū)е掳┌Y的條件。因此，當受試者已經(jīng)曝露于誘變或致癌水平的特定化合物(例如，香煙煙霧中的致癌化合物例如丙烯醛、砷、苯、苯并蒽(Benz{a}anthracene)、苯并芘(Benzo{a}pyrene)、釙-210(氡)、氨基甲酸酉旨(Urethane)或氯乙烯)時，所述受試者也可以是"有風(fēng)險發(fā)展出癌癥，，的受試者。此外，當受試者已經(jīng)曝露于例如大劑量的紫外線或X線輻射或曝露于(例如感染)引起腫瘤/與腫瘤相關(guān)的病毒如乳頭狀瘤病毒、EB病毒(Epstein-Barrvims)、乙型肝炎病毒或人T-細胞白血病-淋巴瘤病毒時，所述受試者可以是"有風(fēng)險發(fā)展出癌癥，，的受試者。從上文可以清楚的是"有風(fēng)險發(fā)展出癌癥，，的受試者不是感興趣的物種中的全部受試者。"疑似患有癌癥"的受試者是具有癌癥的一種或多種癥狀的受試者。癌癥的癥狀是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且包括，但不限于，乳腺肺塊、乳頭變化、乳腺嚢中、乳腺疼痛、體重減輕、虛弱、過度疲勞、進食困難、食欲喪失、久咳、惡化的呼吸急促(worseningbreathlessness)、咳血、血尿、血{更、惡心、嘔吐、肝轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、腹脹、氣脹、腹膜腔積液(fluidinperitonealcavity)、陰道出血、便秘、腹脹、結(jié)腸穿孔、急性腹膜炎(感染、發(fā)熱、疼痛)、疼痛、吐血、大量出汗(heavysweating)、發(fā)熱、高血壓、貧血、腹瀉、黃疸、眩暈、寒戰(zhàn)、肌肉痙攣、結(jié)腸轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、膀胱轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、腎轉(zhuǎn)移和胰腺轉(zhuǎn)移、吞咽困難等。除了施用一種或多種本文所述的N-糖基化改變的分子，也可以通過化療劑、電離輻射、免疫治療劑或超高溫治療劑來治療癌癥。化療劑包括，例,"頃4白(cisplatin)、卡4白(carboplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、環(huán)石壽酰胺(cyclophosphamide)、喜樹威(camptothecin)、阿霉素(adriamycin)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安、亞硝基脲、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博來霉素(bleomycin)、普卡霉素、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊普(etoposide)、verampil、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、4也莫昔芬(tamoxifen)、^"斥》醇(taxo1)、(transplatinum)、5-氟尿嘧咬(5-flurouracil)、長春新石威(vincristin)、長春石成(vinblastin)和甲氨蟲萊。令(methotrexate)。(iii)炎性病癥如用于本文，"炎性病癥"是指其中一種或多種物質(zhì)(例如，非天然存在于受試者中的物質(zhì))，藉由白細胞(例如，B細胞、T細胞、巨噬細胞、單核細胞或樹突細胞)的作用，不適當?shù)匾l(fā)病理學(xué)應(yīng)答(例如，病理學(xué)免疫應(yīng)答)的過程。因此，所述炎性應(yīng)答中涉及的這些細胞稱作"炎性細胞"。不適當菌)存在于受試者中或受試者上的應(yīng)答。不適當?shù)匾l(fā)的應(yīng)答可以是其中自身成分(例如，自體抗原)被炎性細胞靶向的應(yīng)答(例如，自身免疫病如多發(fā)性例如，過敏反應(yīng)。因此，不適當?shù)匾l(fā)的應(yīng)答的原因可以是存在微生物感染(例如，病毒、細菌或真菌的)。炎性病癥的類型(例如，自身免疫病)可以包括，但不限于，骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis(RA))、脊推關(guān)節(jié)病(spondyloarthropathies)、POEMS綜合征(POEMSsyndrome)、克朗氏病(Crohn'sdisease)、多中心性卡斯爾氏病(multicentricCastleman，sdisease)、系統(tǒng)性紅斑狼齊(systemiclupuserythematosus(SLE))、多發(fā)性硬化(MS)、肌營養(yǎng)不良(musculardystrophy(MD))、胰島素依賴性糖尿病(insulin-dependentdiabetesmellitus(IDDM))、皮月幾炎(dermatomyositis)、多月幾炎(polymyositis)、炎性4申經(jīng)病(inflammatoryneuropathies)例3口歸伯二氏綜合^正(GuillainBarresyndrome)、脈管炎(vasculitis)例如韋格納肉芽月中病(Wegener'sgranulomatosus)、結(jié)節(jié)性多動脈炎(polyarteritisnodosa)、風(fēng)濕性多月幾痛(polymyalgiarheumatica)、顳動脈炎(temporalarteritis)、舍格倫綜合征(Sjogren'ssyndrome)、貝賽特氏病(Bechet，sdisease)、丘-施二氏綜合j正(Churg-Strausssyndrome)或高安氏動脈炎(Takayasu，sarteritis),炎性病癥還包括特定類型的變態(tài)反應(yīng)例如鼻炎(rhinitis)、鼻竇炎(sinusitis)、蕁麻疹抗原、病毒、細菌、真硬化)。(urticaria)、尋麻滲(hives)、血管性7jc月中(angioedema)、特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis)、食物變態(tài)反應(yīng)(foodallergies)(例如，(堅果變態(tài)反應(yīng)(nutallergy))、藥物變態(tài)反應(yīng)(drugallergies)(例如，青霉素)、昆蟲變態(tài)反應(yīng)(insectallergies)(例如，針對蜂螫的變態(tài)反應(yīng))或肥大細胞病(mastocytosis)。炎性病癥也可包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis)和哮喘(asthma)。"有風(fēng)險患上炎性病癥"的受試者是指具有一種或多種炎性病癥的家族史(例如，一種或多種炎性病癥的遺傳傾向)的患者或曝露于一種或多種炎癥誘導(dǎo)條件的受試者。例如，受試者可能已經(jīng)曝露于病毒或細菌超抗原，例如，但不限于，葡萄球菌腸毒素(staphylococcalenterotoxins)(SEs)、酉良膿鏈球菌夕卜毒素(streptococcuspyogenesexotoxin)(SPE)、金黃色葡萄球菌中毒性休克-綜合征毒素(staphylococcusaureustoxicshock-syndrometoxin)(TSST-1)、鏈球菌促有絲分裂外毒素(streptococcalmitogenicexotoxin)(SME)和鏈球菌超抗原(streptococcalsuperantigen)(SSA)。從上文可以清楚的是"有風(fēng)險發(fā)展出炎性病癥"的受試者不是感興趣的物種中的全部受試者。"疑似患有炎性病癥"的受試者是出現(xiàn)炎性病癥的一種或多種癥狀的受試者。炎性病癥的癥狀是本領(lǐng)域熟知的并且包括，但不限于，發(fā)紅、腫脹(例如，關(guān)節(jié)肺脹)、觸石並發(fā)熱的關(guān)節(jié)(jointsthatarewarmtothetouch)、關(guān)節(jié)痛、僵硬、關(guān)節(jié)功能喪失、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疲勞、精力喪失(lossofenergy)、頭痛、食欲喪失、肌肉僵硬、失眠、瘙癢、鼻塞、噴嚏、咳嗽、一種或多種神經(jīng)學(xué)癥狀如眩暈、發(fā)作或疼痛。除了施用一種或多種本文所述的N-糖基化改變的分子之外，炎性病癥也可以通過非類固醇抗炎藥(NSAID)、緩解病情的抗風(fēng)濕藥(DMARD)、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑或皮質(zhì)類固醇來治療。生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑包括，例如，抗TNF劑(例如，可溶性TNF受體或?qū)NF特異性的抗體如adulimumab、英夫利昔單抗(infliximab)或依刃卩西普(etanercept)使用N-糖基化改變的分子(或其藥物組合物)、適用于治療(例如，預(yù)防藥物組合物和治療方法N-糖基化改變的分子(例如，目標分子如目標蛋白的改變的N-糖基化形式)可以并入藥物組合物，所述藥物組合物含有治療有效量的所述分子和一58種或多種佐劑、賦形劑、載體和/或稀釋劑?？山邮艿南♂寗?、載體和賦形劑通常不負面影響受體的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)(例如電解質(zhì)平衡)。可接受的載體包括生物相容性、惰性或生物可吸收的鹽、緩沖劑、寡糖或多糖、聚合物、粘度改善齊'J(viscosity-improvingagent)、防腐劑等。一種示例性載體是生理鹽水(0.15MNaCl,pH7.0-7.4)。另一種示例性載體是50mM磷酸鈉、100mM氯化鈉。關(guān)于配制和施用藥物組合物的技術(shù)的進一步細節(jié)可以在例如Remington'sPharmaceuticalSciences(MaackPublishingCo.,Easton,Pa.)中找到。也可以將輔助性活性化合物(supplementaryactivecompound)并入組合物中。含有N-糖基化改變的分子的藥物組合物的施用可以是系統(tǒng)的或局部的。可以將藥物組合物這樣配制，即令它們適用于胃腸外和/或非胃腸外施用。具體使用方式(administrationmodality)包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、鞘內(nèi)、口服、直腸、口腔、局部、鼻、眼、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、支氣管、淋巴、陰道和子宮內(nèi)施用。施用可以通過定期注射所述藥物組合物的推注(bolus)，或者可以是不間斷或連續(xù)地通過從外部儲器(reservoir)(例如，IV包)或內(nèi)部儲器(例如，生物可腐蝕性植入物(bioerodableimplant)、生物人工器官(bioartificialorgan)或植入的產(chǎn)生N-糖基化改變的分子的細胞集落)進行靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用。參見，例如，美國專利Nos.4，407，957、5,798,113和5,800,828,將它們通過所述整體并入本文。藥物組合物的施用可以使用合適的遞送手,爻(deliverymeans)來實現(xiàn)，所述遞送手,殳例如泵(參見，例如，AnnalsofPharmacotherapy,27:912(1993);Cancer,41:1270(1993);CancerResearch,44:1698(1984)，通過所述整體并入本文)；微嚢化(參見，例如，美國專利Nos.4,352,883;4,353,888;和5,084,350,通過所述整體并入本文)；連續(xù)釋放聚合物植入物(continuousreleasepolymerimplant)(參見，例如，Sabel，美國專利No.4,883,666,通過所述整體并入本文)；大囊化(macroencapsulation)(參見，例如，美國專利Nos.5,284,761、5,158,881、4,976,859和4,968,733，和/>開的PCT專利申請W092/19195、WO95/05452,將它們每一篇的公開內(nèi)容通過所述整體并入本文)；皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)注射或注射至其它合適部位；或在膠嚢、液體、片劑、丸劑(pill)或延長釋放制劑(prolongedreleaseformulation)中口月l施用。胃腸外遞送系統(tǒng)的實例包括乙埽-乙酸乙烯共聚物顆粒、滲透泵(osmoticpump)、可才直入輸注系統(tǒng)(implantableinfbsionsystem)、泵遞送(pumpdelivery)、嚢j匕纟田月包遞送(encapsulatedcelldelivery)、月旨質(zhì)體遞送(liposomaldelivery)、4十遞送注射(needle-deliveredinjection)、無針注射(needle-lessinjection)、噴霧器(nebulizer)、霧化器(aerosolizer)、電穿孑L和經(jīng)皮貝占片(transdermalpatch)。適合于胃腸外施用的制劑通常含有N-糖基化改變的分子的無菌含水制備物，其優(yōu)選與受體的血液等滲(例如，生理鹽水溶液)。制劑可以以單位劑量或多劑量形式存在。適合于口服施用的制劑可以作為離散單位如膠嚢、扁嚢劑(cachet)、片劑或錠劑(lozenges)存在，其各自含有預(yù)定量的N-糖基化改變的分子；或含水液體中或非水液體中的懸液，如糖漿、酏劑、乳劑或飲劑(draught)?？梢詫⑦m合于局部施用的N糖基化改變的分子(例如，目標分子例如目標蛋白的改變的N-糖基化形式)向哺乳動物(例如，人患者)作為例如乳膏(cream)、噴霧、泡沫、凝膠、軟膏(ointment)、油膏(salve)或干燥摩擦劑(drymb)施用。干燥摩擦劑可以在施用部位再水合。N-糖基化改變的分子也可以直接注入(例如，浸入并干燥)其后可以進行局部應(yīng)用的繃帶、紗布或貼片。也可以將N-糖基化改變的分子以半液態(tài)、凝膠(gelled)態(tài)或完全液態(tài)保持在用于局部施用的繃帶、紗布或貼片中(參見，例如，美國專利No.4,307,717，將其內(nèi)容通過所述整體并入本文)?？梢韵蛐枰氖茉囌咭员绢I(lǐng)域技術(shù)人員可以確定的給藥方案施用治療有效量的藥物組合物。例如，可以向受試者施用組合物，例如，以每劑0.01|ig/kg-10，000嗎/kg受試者體重的劑量系統(tǒng)性施用。在另一實例中，劑量是每劑1嗎/kg-100pg/kg受試者體重。在另一實例中，劑量是每劑1pg/kg-30叫/kg受試者體重，例如，每劑3pg/kg-10嗎/kg受試者體重。為了優(yōu)化治療效力，可以首先以不同的給藥方案施用N-糖基化改變的分子。單位劑量和方案依賴于多種因素，包括，例如，哺乳動物的種類、其免疫狀態(tài)、哺乳動物的體重。通常，組織中N-糖基化改變的分子的水平可以使用適合的、作為臨床測試流程一部分的篩查測定法監(jiān)測，例如，來測定給定治療方案的效力。N-糖基化改變的分子的給藥頻率在醫(yī)療工作者(medicalpractitioner)(例如，醫(yī)生或護士)的技術(shù)和臨床判斷范圍之內(nèi)。通常，施用方案通過臨床試驗建立，所述試驗可以建立最適施用參數(shù)。然而，從業(yè)者可以根據(jù)受試者的60年齡、健康、重量、性別和醫(yī)療狀態(tài)改變這些治療方案。給藥頻率可以依賴于治療是預(yù)防性還是治療性的而變化。這些N-糖基化改變的分子(例如，目標分子例如目標蛋白的改變的N-糖基化形式)或其藥物組合物的毒性和治療效力可以通過已知的藥學(xué)方法在例如細胞培養(yǎng)物或?qū)崱€動物中測定。這些方法可以用于例如測定LD50(對群體的50。/。致死的劑量)和ED50(在群體的50%中治療有效的劑量)。毒性和治療效果的劑量比是治療指數(shù)并且可以表示為LD50/ED50的比例。展現(xiàn)高治療指數(shù)的藥物組合物是優(yōu)選的。盡管可以使用展現(xiàn)毒性副作用的藥物組合物，應(yīng)該注意設(shè)計使這些化合物靶向患病組織的部位以盡量減小對正常細胞的損害(例如，非靶細胞)，并且由此降低副作用。從細胞培養(yǎng)測定法和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制用于適當受試者(例如，人患者)中的劑量范圍。這些藥物組合物的劑量通常在如下循環(huán)濃度的范圍內(nèi)，所述濃度包括ED50且?guī)缀鯚o毒或無毒。劑量可以在這個范圍內(nèi)依賴于采用的劑量形式和使用的施用途徑而變化。對于如本文所述使用的藥物組合物(例如，用于治療受試者中的代謝紊亂)，最初可以從細胞培養(yǎng)測定法估計治療有效劑量。可以在動物模型中配制劑量以實現(xiàn)包括在細胞培養(yǎng)物中測定的IC50(即，實現(xiàn)對癥狀的最大抑制的一半的藥物組合物濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。這種信息可以用于更精確地測定在人中有用的劑量。血漿中的水平可以例如通過高效液相層析測量。如本文所定義的，"治療有效量，，的N-糖基化改變的分子是能夠在受治療的受試者中產(chǎn)生期望的醫(yī)學(xué)結(jié)果的分子的量(例如，改善代謝紊亂的一種或多種癥狀或減少癌細胞增殖)。N-糖基化改變的分子的治療有效量(即，有效劑量)包括毫克或」微克量的所述化合物每千克受試者或樣品重量(例如，約1微克每千克至約500毫克每千克，約IOO微克每千克至約5毫克每千克，或約1微克每千克至約50微克每千克)。受試者可以是任何哺乳動物，例如，人(例如，人患者)或非人靈長類(例如，黑猩猩(chimpanzee)、狒狒(baboon)或猴(monkey))、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、倉鼠、馬、牲畜類型(例如，牛、豬、綿羊或山羊)、犬、貓或鯨。可以將本文描述的N-糖基化改變的分子或其藥物組合物與另一治療作為聯(lián)合療法向受試者施用，所述另一治療例如用于代謝紊亂(例如，溶酶體貯積病)的治療。例如，聯(lián)合療法可以包括向受試者(例如，人患者)施用一種或多種額外的為受試者提供治療益處的劑(agent)，所述受試者患有或有風(fēng)險發(fā)展出(或疑似患有)代謝紊亂(例如，溶酶體貝i積病)。由此，化合物或藥物組合物和所述一種或多種額外的劑同時施用?；蛘撸梢允紫燃皶r(intime)施用N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)或多碎醇)，并其次及時施用所述一種或兩種額外的劑?？梢允紫燃皶r施用所述一種或兩種額外的劑，并其次及時施用N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)或多辟醇)。N-糖基化改變的分子可以替代或加強先前施用或當前施用的療法。例如，當用本發(fā)明的N-糖基化改變的分子治療時，一種或多種額外的劑的施用可以停止或減少，例如，以較低水平施用。也可以保持先前療法的施用。在一些情況下，可以將先前療法保持到N-糖基化改變的分子的水平(例如，劑量或進度(schedule))達到足以提供治療效果的水平?？梢月?lián)合施用兩種療法。應(yīng)該理解的是在先前治療有特定毒性的情況(例如，具有顯著副作用譜的用于代謝紊亂的治療)下，N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)或多萜醇)的施用可以用于將先前治療的量抵消和/或減少到足以給出相同或改進的治療益處、但是沒有毒性的水平。在一些情況下，當向受試者施用本發(fā)明的N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)、多薛醇或與多碎醇連接的脂質(zhì))或藥物組合物時，將第一種療法中斷。可以監(jiān)測受試者的第一種預(yù)先選擇的結(jié)果，例如，代謝紊亂的一種或多種癥狀的改善，例如任何本文所述的那些(見上文)。在一些情況下，在觀察到第一種預(yù)先選擇的結(jié)果的情況下，減少或中斷使用N-糖基化改變的分子(例如，N-糖基化改變的蛋白質(zhì)或N-糖基化改變的多碎醇)的治療。然后在使用N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)或多碎醇)的治療之后，可以監(jiān)測受試者第二種預(yù)先選擇的結(jié)果，例如，代謝紊亂的癥狀的惡化。當觀察到所述第二種預(yù)先選定的結(jié)果時，可以恢復(fù)或增加向受試者施用N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)或多萜醇)，或恢復(fù)所述第一種治療的施用，或?qū)κ茉囌呤┯肗-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)、多萜醇或與多萜醇連接的脂質(zhì))和第一種治療二者或量增加的N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)或多碎醇)和所述第一種治療方案。N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)或多萜醇)也可以與用于疾病(例如，代謝紊亂)的一種或多種癥狀的治療一起施用。例如，N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質(zhì)、多萜醇或與多萜醇連接的脂質(zhì))可以與例如疼痛用藥(painmedication)共同施用(例如，同時或通過上述聯(lián)合方案)。應(yīng)該理解的是在一些實施方案中，N-糖基化改變的分子是其中改變的糖基化使所述分子產(chǎn)生醫(yī)學(xué)相關(guān)產(chǎn)物的能力增加的分子。例如，N-糖基化改變的分子可以是能夠產(chǎn)生治療性產(chǎn)物(例如，小分子或治療性肽)的酶，所述酶的活性通過糖基化增加或優(yōu)化。這些產(chǎn)物和使用所述產(chǎn)物的方法在本公開的范圍之內(nèi)。本文所述的任何藥物組合物可以與施用說明書一起包括在容器、包裝或散發(fā)器(dispenser)中。以下是本發(fā)明的實踐的實施例。不應(yīng)將它們理解為以任何方式對本發(fā)明范圍的限制。實施例實施例1.質(zhì)粒、引物和菌抹表l含有在本文所述實驗中所用載體(例如，表達載體)和缺失盒的構(gòu)建中使用的全部質(zhì)粒的列表。在所述實驗中使用了解脂西洋蓍霉的MTLY60菌林。表2含有在以下實施例中使用的引物(引物的名稱)和引物應(yīng)用的列表。表l_<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>性克隆中缺失2328bp片段(包括C/W"而存在1075bp的1075bp(不含C/^43)片段。對2個陽性克隆進行了Southern印跡分析以檢查是否發(fā)生了異常DNA整合。將基因組DNA(gDNA)用EcoRV/HindlII雙重消化，進行瓊脂糖凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將所述膜用來自質(zhì)粒H(9C7W戶rT(9戶0的500bpSpel/I-Scel片段探查(probe)。AocWPUT中存在1456bp的片段，而AocWPT中存在2066bp的片段且野生型菌抹中存在2893bp的片段。制定使MAW9失活的構(gòu)建策略并示于圖6。通過Notl/PacI雙重消化將破壞片段從質(zhì)粒F/MAW9尸LTrO戶0切下并轉(zhuǎn)化至MTLY60和AocWPT克隆9。對于兩種菌抹獲得了數(shù)個WM3陽性克隆，在分離了單克隆之后通過對gDNA進行PCR來篩選它們中構(gòu)建體的正確整合。使用引物y/MVA^戶>和17MVW9rrv.(表2)在破壞體(disruptant)菌林中擴增了2349bp的片段，而在非轉(zhuǎn)化體中擴增了2056bp的片段。為了分析通過突變菌抹合成的N-聚糖結(jié)構(gòu)，對從甘露糖蛋白衍生的聚糖進行了DSA-FACE(圖7)。野生型(MTLY60)菌林作為主要核心類型聚糖結(jié)構(gòu)主要具有Man8GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I;圖4)和大量的Man9GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式II;圖4),后者最可能含有因Ochlp活性產(chǎn)生的額外的甘露糖。另外，可以觀察到一些較大的結(jié)構(gòu)。AocW菌林主要具有Man8GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I)和小部分的Man9GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式II;圖4),其二者均對a-l;甘露糖苷酶處理敏感(表明AocWa-l,2-man),導(dǎo)致剪切(trimming)成Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式IV;圖4)。Am""9菌株積累比AocW菌抹更多的Man9GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式II;圖4)，這表明Mnn9p涉及接著Ochlp活性發(fā)生的聚糖結(jié)構(gòu)的延伸。雙突變AocWAw""9展現(xiàn)了一種類似AocW菌抹的糖基化表型。實施例的誘變(ERa-l,2-甘露糖苷酶)涉及將Man9GlcNAc2剪切Man8GlcNAc2并且具有嚴格的底物特異性，因為它僅能剪切與中央臂的a-l，3-甘露糖連接的a-l，2-甘露糖(圖2)。為了測定能夠在何處誘變層57基因從而使其底物特異性轉(zhuǎn)換成高爾基型a-l,2-甘露糖苷酶，將幾種ER型甘露糖苷酶的初級序列與高爾基型甘露糖苷酶進行了比較。鑒定了一個在所述兩類之間不同的區(qū)域。此外，還分析了在高爾基型甘露糖普酶的催化位點中結(jié)晶的寡糖進入酵母MV57(anoligosaccharidethatwascrystallisedinthecatalyticsiteoftheGolgitypemannosidaseintotheyeastMV57)以鑒定可能的4唐和蛋白質(zhì)之間的相互作用。令人驚訝的是，使用兩種方法鑒定了相同的位點。將來自釀酒酵母(GenBank⑧登錄號Z49631,sgd:YJR131W)的MNS1基因突變從而改變其底物特異性。在相同區(qū)域內(nèi)制造了三種突變版本兩種具有一個突變(R2"L和R2"G)，和一種具有3個突變(R269S/S272G/R273L):A)R273L(精氨酸273成為亮氨酸)B)R2"G(精氨酸273成為甘氨酸)C)R269S/S272G/R273L(精氨酸269成為絲氨酸/絲氨酸272成為甘氨酸/精氨酸273成為亮氨酸)。全部突變使用QuickChange(Stratagene)誘變試劑盒制造。使構(gòu)建體在強組成型TPI1啟動子調(diào)控下表達3種不同的突變基因。使用寡核苷酸CGACTATCCGGTTCGGATCATTGGGTGATTCTTTTTATGAG(SEQIDNO:40)和CTCATAAAAAGAATCACCCAATGATCCGAACCGGATAGTCG(SEQIDNO:41)來生成突變R273L，并使用寡核苦酸CGACTATCCGGTTCGGATCAGGTGGTGATTCTTTTTATGAG(SEQIDNO:42)和CTCATAAAAAGAATCACCACCTGATCCGAACCGGATAGTCG(SEQIDNO:43)使用野生型基因作為模板來生成突變R273G。使用寡核苦酸GGTGCTTCGACTATCAGTTTCGGAGGATTGGGTGATTCTTTTTATG(SEQIDNO:44)和CATAAAAAGAATCACCCAATCCTCCGAAACTGATAGTCGAAGCACC(SEQIDNO:45)施用突變R273L作為模板DNA來獲得突變R269S/S272G/R273L。通過使用寡核苦酸CCCGATATCGGATCCATGAAGAACTCTGTCGGTATTTC(SEQIDNO:46)和GGGAAGCTTAACGCGGTTCCAGCGGGTCCGGATACGGCACCGGCGCACCCAACGACCAACCTGTGGTCAG(SEQIDNO:47)的PCR反應(yīng)，在突變體和野生型MNS1開^L閱讀框的3'端添加E-標記物的編碼序列從而允許在表達之后的蛋白檢測。對構(gòu)建策略的概括示于圖8。將三種構(gòu)建體以及未突變的基因(作為陰性對照)轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌株XW27(MATaleu2腦3trplhis3ade2lys2ochl::LEU2mnnl::URA3mnn6::ADE2)，使用TRP1作為選褲，標記，在用Xbal消化質(zhì)粒之后將構(gòu)建體引導(dǎo)至釀酒酵母基因組中的TRP1基因座。在后菌抹能夠合成統(tǒng)一的Man8GlcNAc2(在其糖蛋白上)。如果經(jīng)突變的酶是活性的，那么這種Man8GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I;圖4)應(yīng)該被剪切成Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式IV;圖4)、Man6GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式V;圖4)和/或Man7GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式VI;圖4)。分離了色氨酸原養(yǎng)型菌株，培養(yǎng)在液體SDC-trp培養(yǎng)基中，并制備了甘露糖蛋白。通過DSA-FACE分析源自甘露糖蛋白的N-聚糖。能夠從圖9看出，來自含有R273G和R269S/S272G/R273L突變的菌抹的小量Man8GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I;圖4)被轉(zhuǎn)化成MansGlcNAc2(結(jié)構(gòu)式IV;圖4)、Man6GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式V;圖4)和Mari7GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式VI;圖4)。其它突變體或野生型基因的表達引起改變的N-糖基化表型。為了評估全部突變體是否同樣表達良好，使用對E-標記物(添加至MNSl蛋白的13個氨基酸的表位)特異性的抗體進行了Western印跡分析。全部突變蛋白以及野生型MNSl蛋白等均同樣表達良好。實施例4.增加磷酸化解脂西洋蓍霉MNN4的表達為了增加Man8GlcNAc2的磷酸化，將解脂西洋蓍霉MWW(巴斯德畢赤酵母/WO的同源物)在解脂西洋蓍霉中過表達以促進N-聚糖的核心型磷酸化。使用引物GGCGGATCCATGGTGCTGCACCCGTTTCSaw///>;SEQIDNO:34)和GGCCCTAGGCTACTCAAACTCCTCGCGAATC^vr//rv;SEQIDNO:35)擴增了解脂西洋蓍霉MNN4(XM—503217,YALI0D24101g)基因的編碼序列。將此開放閱讀框(ORF)使用BamHI和Avrll位點克隆至質(zhì)粒中，其將所述ORF置于質(zhì)粒pYlHURA3的hp4d啟動子調(diào)控下，所述質(zhì)粒pYlHURA3含有作為選擇標記的t//L43dl基因和用于改善隨機整合的zeta序列(圖10)。在轉(zhuǎn)化入MTLY60AocW菌抹之前，用Eco47IH(用于整合入基因座)、Pvul(用于整合入MAW4基因座)或Rsrll/BstBI(用于隨機整合)消化含有MNN4表達盒的質(zhì)粒。通過PCR使用hp4d啟動子中的引物和一個丄/尸2終止子中的引物分析了靶向和MWW基因座的轉(zhuǎn)化體。通過Southern印跡分析評估了隨機整合了構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體。為了評估甘露糖磷酸化是否增加，我們在YPD培養(yǎng)基中的48小時培養(yǎng)之后通過DSA-FACE毛細管電泳分析了自分泌的糖蛋白衍生的N-聚糖(圖11)。MansGlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I)的量劇烈降低有利于(infavourof)兩種結(jié)構(gòu)，所述兩種結(jié)構(gòu)遷移更快(與MansGlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I;圖4)相比)并且4艮有可能分別含有單(P)(結(jié)構(gòu)式X或XI;圖4)和雙(PP)(結(jié)構(gòu)式XII;圖4)(圖11)。因此，可以總結(jié)隨機整合的表達盒按順序比整合入基因座或MV7W基因座的表達盒表現(xiàn)更好。MZ2展現(xiàn)了最高的磷酸化水平。假設(shè)兩個峰均衍生自Man8GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I;圖4)峰，測定了轉(zhuǎn)化成磷酸化聚糖的Man8GlcNAc2的量(表3)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>表3圖例高度和面積是指從電泳圖譜測定的峰的高度和峰的面積。"％信號，，是指每種聚糖在N-聚糖混合物中的比例。由星號表示的數(shù)顯示磷酸化說明書第61/80頁的Man8Gn2的比例(頂部)和非磷酸化的Man8Gn2的比例(底部)。這些結(jié)果表明在過表達基因的菌抹中多于80%的存在于親本△ocW中的Man8GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式I;圖4)是磷酸化的。實施例5.通過在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與脂質(zhì)連接的寡糖修飾修飾糖基化材料和方法霧錄、培#奈伴和試^/。將大腸桿菌菌株MCI061或TOP10或DH5a用于重組質(zhì)粒DNA的擴增并且在37°C在補充有100pg/ml羧芐青霉素或50jag/ml卡那霉素(根據(jù)使用的質(zhì)粒)的Luria-Broth(LB)培養(yǎng)基中在熱振蕩器(thermalshaker)中培養(yǎng)使用解脂西洋蓍霉MTLY60("ra3/ew2)菌林作為親本菌抹。將全部酵母培養(yǎng)在28。C保溫箱中。將它們在YPD培養(yǎng)基(2。/。葡萄糖，2%細菌蛋白胨和1。/o酵母提取物)或合成葡萄糖完全(SDC)培養(yǎng)基(0.17。/。w/o氨基酸且不含硫酸銨的YNB，1%葡萄糖，0.5%NH4C1，50mMK/Na磷酸鹽緩沖液pH6.8和0.0770/。完全補充混合物(QbiogeneInc，MorganIrvine,CA))上。為了選沖奪Ura+和Leu+轉(zhuǎn)化體，分別加入0.077%CSM—ura或CSM—leu。標雀遽傳拔術(shù)。解脂西洋蓍霉的轉(zhuǎn)化用感受態(tài)細胞如Boisrame等(1996)J.Biol.Chem.271(20):11668-75所述制備，將其公開內(nèi)容通過所述整體并入本文。使用7>開的規(guī)程(Epicenter試劑盒目錄號MPY80200;EpicenterBiotechnologies,Madison,WI)分離全部酵母菌抹的基因組DNA。所述規(guī)程涉及在65。C的非酶促細胞溶解，其后通過沉淀去除蛋白質(zhì)，并進行核酸沉淀和重懸。PCR擴增在50pl終體積中進行，其中含有5pl10x緩沖液(200mMTris-HClpH8.4和500mMKCl),可變量的MgCl2，2.5pMdNTP,50ng模板，50pmol的正確引物和2.5單位的Taq或PfiiDNA聚合酶。使用的循環(huán)條件如下94。C變性10分鐘，其后是熱啟動和30個循環(huán)的94°C45秒、在合適的退火溫度進行45秒和在72°C每kb延伸1分鐘，其后是在72°C延伸10分鐘。使用NucleoSpinextractII(Macherey-Nagel)純化乂人凝月交回收的DNA片段(PCR產(chǎn)物或片段)。通過VIBGeneticServiceFacility(Antwerp,Belgium)進行DNA測序。我體溝建(i)ALG3基因的敲除(基因替代)。將ALG3基因(GenBank⑧登錄號XM—503488，Genolevures:YALI0E031卯g)的啟動子片段(P)從解脂西洋蓍霉MTLY60菌抹的基因組DNA通過PCR擴增，所述PCR使用5'CAGTGCGGCCGCACTCCCTCTTTTCACTCACTATTG3'(SEQIDNO:48)和5'CATTACCCTGTTATCCCTACGCTCAGATCCAATTGTTTTGGTGGTC3'(SEQIDNO:49)分別作為正向和反向引物，使用Taq聚合酶(Invitrogen)。用T4DNA聚合酶(Fermentas,Ontario,Canada)去除突出的(overhanging)A核苷酸。通過PCR從解脂西洋蓍霉MTLY60菌林擴增ALG3基因的終止子片段(T),所述PCR使用5，GTAGGGATAACAGGGTAATGCTCTCAAGGACGGACCAGATGAGACTGTTATCG3，(SEQIDNO:50)和C3，(SEQIDNO:51)分別作為正向和反向引物，使用校正讀碼PfuDNA聚合酶(Fermentas)。由于含有ISceI限制位點的重疊的引物序列，可以通過PCR將兩個片段連接，所述PCR使用P-正向引物和T-反向引物。然后將這種共擴增子(co-amplicon)亞克隆至pCR-2.1TOPOTA(Invitrogen)載體中，并且通過測序確認所述共擴增子的序列正確性。然后將共擴增子^f吏用Notl-Pacl位點克隆入中間載體(intermediatevector)。(ii)ALG6基因的過表達。將ALG6ORF(1725bp)連同ALG6基因(GenBank⑧登錄號XM—502922，Genolevures:YALI0D17028g)的終止子(415bp下游)從解脂西洋蓍霉MTLY60菌抹的基因組DNA通過PCR克隆，所述PCR使用5'CAGTGGATCCATGAACTCTCCTATTTTCACTACCG3，(SEQIDNO:52)和5'GACTCCTAGGAAGCTTCCAGGTTACAAGTTGTTAC3，(SEQIDNO:53)分別作為正向和反向引物，使用校正讀碼PfUDNA聚合酶(Fermentas)。將所述序列克隆至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)中并且通過測序確認ALG6ORF序列的正確性(如上)。然后，將ALG6ORF通過BamHI和AvrII克隆至含有hp4d啟動子的載體(pYLHmA)中，然后再通過ALG3的終止子片段中存在的獨特的限制位點Clal和HindIII克隆至中間載體中。(iii)選擇標記盒。為了從宿主基因組DNA去除可選擇的標記URA3，使用了Cre-toc重組系統(tǒng)，例如，如Fickers等所述((2003)J.Microbiol.Methods55(3):727-737所述，將其公開內(nèi)容通過所述整體并入本文)。在從質(zhì)粒pRRQ2(hp4d-cre,丄五t/2)(來自InstitutNationaldeRechercheAgronomique(INRA)6勺饋贈)表達Cre重組酶時，通過兩個/ox位點之間的重組將標記切除。在兩種具有和不具有ALG6過表達盒的構(gòu)建體中，將由fox位點側(cè)接的URA3選擇標記插入在載體的P和T片段之間引入的I-Scel位點,產(chǎn)生"PUT"構(gòu)建體。的劍務(wù)。將酵母菌抹在28°C保溫箱中以250rpm旋轉(zhuǎn)在50mlFalcon管中的10ml標準YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。然后通過在4°C以4000rpm離心使細胞沉淀。去除上清液，并且將細胞首先用2ml0.9。/。NaCl溶液清洗，其后用2ml水清洗兩次，再重懸在微量離心管中1.5ml0.02M檸檬酸鈉pH7中。在將管在121。C高壓滅菌90分鐘之后，渦旋振蕩所述管并且通過離心使細胞碎片沉淀。收集上清液并且用4倍體積的曱醇在4。C以旋轉(zhuǎn)運動過夜沉淀。然后通過離心所述用醇沉淀的材料荻得沉淀物。使粒狀沉淀(pellet)干燥并溶解在50|il水中。潛#浙。使用ABI3130DNA測序儀如Callewaert等(2001;見上文)所述進行了DNA測序儀輔助型(DSA)、熒光團輔助型糖電泳(FACE)。簡言之，將糖蛋白在RCM緩沖液(8M尿素，360mMTrispH8.6和3.2mMEDTA)中上。膜的預(yù)潤濕用300|^1MeOH進行，用300)il水和50^1RCM清洗3次，然后真空去除。用50plO.IM二硫蘇糖醇將糖蛋白還原1小時，再用300(al水清洗3次。在黑暗中與50jil0.1M碘乙酸一起溫育30分鐘，用于將SH基團羧曱基化，其后用300pl水清洗3次。然后將平板與100pl1%聚乙烯吡咯烷酮360溫育1小時以飽和膜上未被占據(jù)的結(jié)合位點，再用300)il水清洗3次。接下來，通過用50fil10mMTris-乙酸pH8.3中的肽N-糖苷酶F(PNGaseF)xU處理3小時來釋放N-聚糖?；厥誑-聚糖并且用熒光團8-氨基芘-1，3，6-三磺酸酯(8-aminopyrene-l,3,6-trisulfonate)(APTS)通過還原性氨基化來衍生化。這通過在37°C與1.2M檸檬酸中20mMAPTS和DMSO中1MNaCNBH3的1^11:1混合物過夜(ON)溫育并通過加入4^1水猝滅來實現(xiàn)。通過在SephadexG-10樹脂上進行大小分級來去除過量的標記。然后將余下的標記的N-聚糖通過蒸發(fā)進行濃縮。包括RNA酶B的N-聚糖和寡麥芽糖梯子作為大小標志物。<吏用Genemapper⑧軟^f牛(AppliedBiosystems)進4亍凄t據(jù)分才斤。對標記的糖的糖芬酶消化在37°C在100mMNH4ACpH5中過夜進4亍。在過夜消化之后加入額外的Jackbean(JB)甘露糖苷酶并且再在37°C放置24小時。解脂西洋蓍霉中ALG3基因的破壞為了破壞ALG3基因，生成包括ALG3的終止子和啟動子的部分并且具有URA3選擇標記盒的載體，并命名為pYLalg3PUT。整合Notl和Pacl位點以線性化所述載體并由此去除與大腸桿菌相關(guān)的DNA元件。使用在啟動子和終止子位點的雙同源重組來用URA3可選擇的標記替代ALG3,這產(chǎn)生了a/g3::URA3突變菌林。應(yīng)用的敲除策略由Fickers等(2003;見上文)描述并且利用Cre-lox重組系統(tǒng)，其促進有效的標記拯救(markerrescue)。當整合入基因組^LG^重疊群(contig)時，Alg3pa-l,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性應(yīng)該喪失。這通過分析幾個轉(zhuǎn)化體的甘露糖蛋白的糖基化型來監(jiān)測。將源自甘露糖蛋白的N-聚糖通過DSA-FACE(毛細管電泳)分析并且用選擇的外切糖苷酶進行處理以揭示結(jié)構(gòu)。24個轉(zhuǎn)化體中的7個在糖基化譜中給出了變化(將其中三個示于圖13)。在全部7個轉(zhuǎn)化體中，能夠通過PCR確認敲除盒在基因組中的正確整合。通過分析所述譜發(fā)現(xiàn)了三種主要的聚糖結(jié)構(gòu)(i)一種(結(jié)構(gòu)式VII;圖4)與RNA酶B的Man5GlcNAc2結(jié)構(gòu)(后者為結(jié)構(gòu)式IV;圖4)運行在同樣大小；(ii)一種距離一個額外的葡萄糖單位；和(iii)一種距離兩個額外的葡萄糖單位。(圖13)這些結(jié)果表明將這些細胞中的ALG3破壞。a-l,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶Alg6。的過表達開發(fā)了一種策略，其中將用于第一葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(即Alg6p)的組成性活性過表達盒并入alg3基因替代載體。將這種載體命名為pYLalg3PUT-ALG6。將這種載體的Notl/PacI片段轉(zhuǎn)化入解脂西洋蓍霉MTLY60菌抹。以這種方法，實現(xiàn)對ALG3的破壞和ALG6在hp4d啟動子調(diào)控下的過表達。再次通過PCR確認了基因組中的正確整合。對源自甘露糖蛋白的N-聚糖進行的DSA-FACE分析顯示半數(shù)的轉(zhuǎn)化體，即，24個中的12個，與WT菌抹相比展現(xiàn)出糖基化型的變化。^LG6的過表達導(dǎo)致了輕度克隆變異(圖13)。N-聚糖結(jié)構(gòu)的鑒定為了進一步揭示來自上述實驗的聚糖結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，用選擇的外切糖苷酶對源自甘露糖蛋白的聚糖(如上)進行了體外消化。用以下酶分析甘露糖蛋白聚糖a-l，2-甘露糖苦酶；a-甘露糖苷酶(JB)和葡糖苷酶II。三種觀察到的聚糖結(jié)構(gòu)為Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式VII;圖4)、GlcMan5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式VIII;圖4)和Glc2Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式IX;圖4)(圖14)。這些結(jié)果表明由a-1,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，Ochlp)進行的甘露糖延伸非常少甚至沒有。為了測定ALG6過表達對于促進N-糖基化位點占據(jù)是否是必須的，在三種不同的菌抹(西洋蓍霉MTLY60,MTLY60Aa/g3和MTLY60Aa/g3^丄G6)中表達了來自解脂西洋蓍霉的脂肪酶2(LIP2)。從INRA獲得了在TEF組成型啟動子調(diào)控下的用于解脂西洋蓍霉LIP2的構(gòu)建體。將所述表達盒轉(zhuǎn)化至上述菌抹并且通過對制備自經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞的上清液進行SDS-PAGE分析(圖28)來驗證蛋白質(zhì)的表達。Lip2p蛋白具有2個糖基化位點。將源自"/g3-缺陷型("敲除")酵母菌林的Lip^蛋白通過SDS-PAGE解析成三條不同的條帶，使用考馬斯藍染色凝膠使所述條帶可見(圖28)。為了確認凝膠中蛋白質(zhì)的三種形式是Lip2p蛋白的不同糖基化形式，對獲得自"/g3缺陷型("敲除")酵母菌林的Lip2p蛋白進行用PNGaseF(從糖蛋白去除寡糖殘基的酶)的處理，然后再進行SDS-PAGE分析，如上所述。用PNGaseF處理Lip2p蛋白在考馬斯藍染色后的凝膠上產(chǎn)生了單一條帶，表明先前觀察到的全部三種形式的蛋白質(zhì)是相同的Lip2p分子的不同糖基化形式。對于源自alg3ALG6菌林的Lip2p也是如此。然而，還原性糖基化形式的蛋白質(zhì)量降低。因此，可以總結(jié)出ALG6的過表達能夠(至少部分)恢復(fù)在a/g3敲除的突變酵母菌抹中減少的N-糖基化位點的占據(jù)。去除加帽的葡萄糖結(jié)構(gòu)接下來，為了體內(nèi)去除單葡萄糖基化的(結(jié)構(gòu)式VIII;圖4)和雙葡萄糖基化的(結(jié)構(gòu)式IX;圖4)MansGlcNAc2(結(jié)構(gòu)式VII;圖4)結(jié)構(gòu)，將細胞遺傳工程化以過表達葡糖苷酶II的a-亞基。西洋蓍霉的葡糖苷酶II(GenBank登錄號XM—500574)的a亞基和布氏錐蟲的葡糖苷酶n(GenBank⑧登錄號AJ865333)的a亞基作為兩種策略獨立地克隆以過表達所述蛋白質(zhì)。選擇布氏錐蟲葡糖苷酶II的a亞基的原因是它的天然底物是GlcMan5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式VIII;圖4)。將兩種基因克隆在組成型hp4d啟動子的調(diào)控下，并且它們的質(zhì)粒含有W^j標記。將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入帶有和不帶有^LG6過表達的a/g3突變酵母菌林。從源自含有所述構(gòu)建體的經(jīng)培養(yǎng)細胞的分泌蛋白制備寡糖并且通過DSA-FACE分析測定寡糖譜。全部轉(zhuǎn)化體給出相同的DSA-FACE譜，將每種葡糖苷酶IIct的兩個不同的克隆示于圖29。從這些結(jié)果總結(jié)出西洋蓍霉或錐蟲葡糖苷酶IIa亞基的過表達對單葡萄糖基化的(結(jié)構(gòu)式VIII;圖4)和雙葡萄糖基化的(結(jié)構(gòu)式IX;圖4)Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式VII;圖4)結(jié)構(gòu)僅具有較小的作用。用HDEL序列標記的解脂西洋蓍霉和布氏錐蟲葡糖苷酶IIa-亞基的表逸為了改進西洋蓍霉或錐蟲葡糖苷酶IIa亞基的表達對從Man5GlcNAc2體內(nèi)去除葡萄糖殘基的作用，使用分子生物學(xué)技術(shù)將編碼HDEL標記的核酸符合讀框地添加至編碼所述兩種GlsIIa酶中每一種的核酸的3，端。HDEL標記意欲充當從高爾基到ER的恢復(fù)機制(retrievalmechanism)。將編碼在hp4d啟動子調(diào)控下的、HDEL標記的來自解脂西洋蓍霉(K/.)和布氏錐蟲(7:6.)的葡糖苷酶II序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至過表達或不過表達ALG6基因的a/g3KO菌抹。如圖30中可見，解脂西洋蓍霉葡糖苷酶IIa亞基的過表達對葡萄糖基化結(jié)構(gòu)的量僅具有較小的作用。相反，過表達帶有額外的HDEL標記的布氏錐蟲a-葡糖苷酶II的a亞基導(dǎo)致單葡萄糖峰的降低(參見圖31)。用變聚糖酶處理葡萄糖基化聚糖上述結(jié)果示范了一種減少Man5GlcNAc2的單葡萄糖基化形式的示例性方法。為了從糖蛋白降低Man5GlcNAc2的雙葡萄糖基化形式，作為一種潛在解決方法研究了哈茨木霉的變聚糖酶。從Novozymes(Novozyme234;Bagsvaerd,Denmark)獲得酶制備物并用于體外消化寡糖。即，將不同濃度的變聚糖酶添加至源自a/g3/^G6菌林的寡糖(聚糖Man5GlcNAc2、GlcMan5GlcNAc2和Glc2Man5GlcNAc2)。如圖32的DSA-FACE譜中所示，將在寡糖中觀察到的雙葡萄糖峰有效降低。接下來，體內(nèi)過表達哈茨木霉的變聚糖酶。按照為了在解脂西洋蓍霉中表達經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA合成了含有HDEL序列的變聚糖酶。將成熟蛋白符合讀框地與LIP2前信號序列一起克隆在TEF1啟動子的調(diào)控下(圖33)。將76這種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入過表達和不過表達J丄G6的"/g3突變酵母菌4朱。從含有所述構(gòu)建體的經(jīng)培養(yǎng)細胞制備了寡糖并且通過DSA-FACE分析測定寡糖譜。預(yù)期DSA-FACE譜將顯示在所述寡糖中觀察到的雙葡萄糖峰的降低。從這些結(jié)果將總結(jié)出變聚糖酶的體內(nèi)過表達在與不過表達變聚糖酶的細胞相比降低寡糖中觀察到的雙葡萄糖峰方面有效。YlGlsIIa亞基和[3亞基的共表達已知葡糖苷酶II的a亞基和p亞基形成異源二聚體復(fù)合物，其中(3-亞基負責將所述復(fù)合體恢復(fù)到ER并且也涉及底物識別，而a-亞基含有催化活性。由于僅過表達葡糖苷酶II的a-亞基對雙葡萄糖寡糖結(jié)構(gòu)具有的效果小，所以共表達a-和卩-亞基。從基因組DNA擴增了P-亞基(YALI0B03652g)的開放閱讀框，所述基因組DNA使用PCR分離自MTLY60菌抹，并且將所述開放閱讀框克隆在TEF1和hp4d啟動子的調(diào)控下。將構(gòu)建體制成具有LEU2作為選擇標記并具有在TEF1和hp4d啟動子調(diào)控下的葡糖苷酶III3-亞基。將這些轉(zhuǎn)化至過表達和不過表達ALG6、且過表達帶有和不帶有HDEL序列標記的解脂西洋蓍霉葡糖苷酶IIa亞基的a/g3敲除菌林。從分泌自細胞的蛋白質(zhì)制備N-聚糖，并且將所述N-聚糖的DSA-FACE譜示于圖33和圖34(a/g3敲除且過表達ALG6)。從這些譜可以總結(jié)，過表達來自解脂西洋蓍霉的葡糖苷酶IIp亞基對剪切葡萄糖基化的糖確實具有正面效果。概括而言，當在TEF1啟動子下表達時葡糖苷酶II的卩亞基的效力得到改善。當解脂西洋蓍霉葡糖苷酶IIa亞基含有IIDEL標記時，葡萄糖基化結(jié)構(gòu)的降低甚至更大(圖33和34)。對于不過表達ALG6的a/gj缺陷型細胞，對于不同的細胞群體觀察到了有關(guān)葡萄糖基化結(jié)構(gòu)降低的相似結(jié)果(圖35)。曲霉GlsIIa和b亞基的表達為了從a/g3-缺陷型背景中存在的含有葡萄糖的結(jié)構(gòu)去除葡萄糖殘基，按照為了在解脂西洋蓍霉中表達經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA合成了黑曲霉成熟(缺乏信號肽)葡糖苷酶IIa和|3(a-亞基(SEQIDN0:7;圖36A-36B)卩-亞基(SEQIDN0:8;圖37)。將黑曲霉(An)葡糖苷酶a亞基克隆在組成型TEF1和hp4d啟動子的調(diào)控下，并且具有URA3基因作為選擇標記。將所述表達盒(在TEF1和hp4d調(diào)控下的ORF)轉(zhuǎn)化至解脂西洋蓍霉alg3ALG6菌抹。將轉(zhuǎn)化體候選培養(yǎng)在YPD中，并且通過DSA-FACE分析了來自分泌蛋白的聚糖。從圖38能夠推導(dǎo)出與非轉(zhuǎn)化體(o/g3ALG6)相比在轉(zhuǎn)化體菌林中兩種葡萄糖基化結(jié)構(gòu)較不豐富。為了進一步降低葡萄糖基化聚糖結(jié)構(gòu)，制備了具有在TEF1啟動子或hp4d啟動子調(diào)控下的黑曲霉葡糖香酶II(3-亞基和作為選#^標記的LEU2的構(gòu)建體。將這種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至表達An葡糖苷酶IIa-亞基的解脂西洋蓍霉fl/^ALG6菌抹。預(yù)期黑曲霉葡糖苷酶II13-亞基的表達將導(dǎo)致解脂西洋蓍霉細胞中葡萄糖基化結(jié)構(gòu)的減少。實施例6.鑒定HAC內(nèi)含子以及克隆和分離HAC1基因^^西^孝,/^C7，V4在^。基于解脂西洋蓍霉和真菌里氏木霉以及構(gòu)巢曲霉中HAC1內(nèi)含子區(qū)之間的序列同源性，鑒定了解脂西洋蓍霉HAC1(Genbank:XM—500811，Genolevures:YaliOB12716g)的潛在剪接位點。預(yù)期5，和3'剪接位點定位在特征性環(huán)結(jié)構(gòu)中并且計算內(nèi)含子為29bp長。在所述剪接位點周圍開發(fā)了引物從而鑒定所述內(nèi)含子。使用基因特異性引物，從來自UPR(未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答)誘導(dǎo)型(通過在二硫蘇糖醇(DTT)中培養(yǎng))和非誘導(dǎo)型培養(yǎng)物(陰性對照)的分離的mRNA合成了第一鏈cDNA。然后對第一鏈使用引物HAC1FW06-003和HAClRv06-001進行了PCR。在1.5%瓊脂糖凝膠上分析了擴增產(chǎn)物。預(yù)期對于非誘導(dǎo)型細胞將擴增+/-400bp的片段，預(yù)期對于誘導(dǎo)型細胞將擴增29bp的較小的片段。從非誘導(dǎo)型和UPR誘導(dǎo)型細胞獲得了正確大小的片段。對于UPR誘導(dǎo)型培養(yǎng)物獲得了額外兩種擴增產(chǎn)物。中部的片段與獲得自非誘導(dǎo)型培養(yǎng)物的條帶大小相同，并且被理解為未剪接的HAC1。將底部的最突出的條帶從凝膠純化并且克隆入測序載體。在測序所述構(gòu)建體之后，進行了序列比對以鑒定剪接位點(圖15)。從所述序列比對能夠看出，剪接位點位于從解脂西洋蓍霉和(里氏木霉和構(gòu)巢曲霉)HAC1序列的比較中預(yù)測的位置。所述剪"l妻位點為29bp長。為了分離活性全長HAC1序列，將引物工程化為具有適合于克隆至表達載體中的限制為點。引物序列如下HaclylRv07-018:CCTAGGTCACTCCAATCCCCCAAACAGGTTGCTGACGCTCGACTCATAGTGAGCTAGATCAGCAATAAAGTCG(SEQIDNO:54)和HAClFw06陽002:GGATCCATGTCTATCAAGCGAGAAGAGTCC(SEQIDNO:55)。將10ml酵母細胞培養(yǎng)物在5mMDTT存在下溫育1.5小時以誘導(dǎo)UPR應(yīng)答。溫育之后，從經(jīng)DTT處理的細胞分離了RNA并且從所述分離的RNA使用逆轉(zhuǎn)錄酶制備了第一鏈cDNA，并且PCR使用所述cDNA作為模板和上述引物。所述PCR擴增的序列含有經(jīng)剪接的HACl，將所述序列使用標準分子生物學(xué)技術(shù)插入pCR-blunt-TOPO克隆載體并測序。S身/^舉^發(fā)母/￡4C7#"凝/丈《?；诎退沟庐叧嘟湍负歪劸平湍窱IAC1基因的內(nèi)含子區(qū)的序列同源性，在巴斯德畢赤酵母HACl基因中鑒定了潛在的剪接位點(圖16)。預(yù)期所述5，和3，剪接位點定位在特征性環(huán)結(jié)構(gòu)中并且計算所述內(nèi)含子長度為322bp。在預(yù)期的剪接位點周圍開發(fā)了引物(HAC1Fw06-004和HAC1Rv06-005)以鑒定所述內(nèi)含子(參見表4)。當內(nèi)含子被去除時預(yù)期將擴增257個核苷酸的片段，若內(nèi)含子仍然存在則預(yù)期擴增579bp片段。從來自UPR誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型培養(yǎng)物的分離的mRNA合成了第一鏈cDNA。UPR通過向10ml指數(shù)生長的細胞培養(yǎng)物加入5mMDTT來誘導(dǎo)。將所述細胞在DTT存在下培養(yǎng)1.5小時。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析所述擴增產(chǎn)物。從來自非誘導(dǎo)型和誘導(dǎo)型細胞二者的cDNA獲得了約257bp的片段。表4.引物<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>引物代碼序列5'-->3'信息ACTppRv07-003CCACCGATCCATACGGAGTACT(SEQIDN0:61)用于QPCR的Actl反向引物HAClppFw07-008CGACCTGGAATCTGCACTTCAA(SEQIDNO:62)Hacl正向引物QPCRHACIppRV07-004CGGTACCACCTAAGGCTTCCAA(SEQIDNO:63)Hacl反向引物QPCRKar2ppFw07-009CCAGCCAACTGTGTTGATTCAA(SEQIDNO:64)Kar2正向引物QPCRKar2ppRv07-005GGAGCTGGTGGAATACCAGTCA(SEQIDNO:65)Kar2反向引物QPCR為了驗證未剪接的巴斯德畢赤酵母HAC1基因的長度，使用引物IIAC1-Karl和HAC1Rv06-005對基因組DNA進行了PCR。將獲得的片段的長度與從來自誘導(dǎo)型細胞培養(yǎng)物的cDNA獲得的PCR產(chǎn)物的長度比較。從基因組DNA擴增的片段比使用相同引物源自cDNA的擴增子長約300bp，這表明內(nèi)含子存在于基因組DNA序列而從經(jīng)剪接的mRNA中缺失。從凝膠分離了257bp的cDNA片段并且克隆至測序載體中。對所述片段進行測序并且進行了比對以鑒定剪接位點(圖17)。為了分離并克隆經(jīng)剪接的巴斯德畢赤酵母HAC1基因，開發(fā)了具有用于克隆入表達載體的限制酶位點的PCR引物(HAC1-Karl和HAClRv06-009)。將10ml培養(yǎng)物用5mMDTT進行1.5小時的UPR誘導(dǎo)。使用逆轉(zhuǎn)錄酶從分離的RNA制備了第一鏈cDNA,然后再使用上述引物對所述cDNA模板DNA進行了PCR。分離了經(jīng)剪接的HAC1并克隆至pCR-bkmt-TOPO克隆載體中用于測序。將經(jīng)剪接的基因也克隆至表達載體i^丄/Z/S/X中在曱醇誘導(dǎo)型A0X1啟動子的調(diào)控下，以獲得載體j^丄///51/^//JCh;^'ce丄HAC1基因向表達載體中的正確插入使用PCR和限制酶分析來確認。在釀酒酵母中，在剪接時，將未剪接mRNA中C-末端IO個氨基酸的編碼序列用18個氨基酸的編碼序列替代。同樣(inaccordance),在巴斯德畢赤酵母中揭示了未剪接HAC1中C-末端45個氨基酸在剪接時也由18個氨基酸的編碼序列替代，所述18個氨基酸與來自釀酒酵母序列的同源(圖18)。實施例7.經(jīng)剪接HAC1基因向解脂西洋蓍霉中的轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)將解脂西洋蓍霉細胞(MTLY60菌林)用載體"PYHMAXHAClylspliced"轉(zhuǎn)化，所述載體含有在hp4d啟動子的表達調(diào)控下的經(jīng)剪接的HAC1cDNA(上文)和作為選擇標記的URA3基因。所述載體向酵母基因組中的整合4吏用PCR驗證。將用PYHMAXHAClylspliced轉(zhuǎn)化的MTLY60菌林在2ml在YPG中的培養(yǎng)物中在28。C培養(yǎng)24小時。將培養(yǎng)的細胞用YNB清洗兩次，然后稀釋至0D6Q()0.6，再在用50mM磷酸鹽緩沖液pH:6.8緩沖的YTG中培養(yǎng)24小時。然后將所述細胞稀釋至OD6{)()0.2并且再培養(yǎng)3代從而收獲中指數(shù)期(mid-exponentialphase)的細胞。向細胞的粒狀沉淀加入1mlRNApureTM溶液連同1g玻璃珠。通過劇烈振蕩破壞細胞。通過加入150pl氯仿并用異丙醇使RNA沉淀來從破碎的細胞提取RNA。將提取的RNA也用DNA酶處理以去除任何共沉淀的DNA雜質(zhì)。使用iScriptTMcDNASynthesisKit(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)在20fil總體積的反應(yīng)中從800ng的RNA制備第一鏈cDNA。將20ngRNA當量用于實時PCR分析以測定細胞中HAC1mRNA的量。使用SYBR⑧綠(SYBRgreen)作為檢測試劑(熒光的)(Eurogentec)運行實時PCR。除了設(shè)計用于檢測細胞中HAC1mRNA的量的引物，還設(shè)計了對作為對照用于所述實時PCR的ACT1(持家基因)和KAR2(UPR應(yīng)答基因)基因進行定量的引物。使用肌動蛋白(持家基因)作為表達對照從比較性閾循環(huán)值計算細胞中各種基因的相對量。通過測量UPR的表達確認了所述細胞對UPR應(yīng)答的誘導(dǎo)。在組成型啟動子調(diào)控下表達HAC1的菌林中的KAR2以及HAC1的表達水平比野生型菌林MTLY60高(圖39)。實施例8.經(jīng)剪接的HAC1基因向巴斯德畢赤酵母中的轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)乂##差對于以下實驗，使用了三種類型的培養(yǎng)基BMY(用于酵母的緩沖型培養(yǎng)基100mM磷酸鉀pH:6.0/1.34。/。無氨基酸的YNB/l。/。酵母提取物/2%蛋白胨)；BGMY(用于酵母的緩沖型甘油-復(fù)合培養(yǎng)基100mM磷酸鉀pH:6.0/1.34。/。無氨基酸的YNB/P/。酵母提取物/2。/。蛋白胨/l。/。甘油)；和BMMY(用于酵母的緩沖型曱醇-復(fù)合培養(yǎng)基100mM磷酸鉀pII:6.0/1.34。/。無氨基酸的YNB/P/。酵母提取物/2。/。蛋白胨/0，5。/。甘油)。按照來自畢赤酵母表達試劑盒(Invitrogen目錄號K1710-01)的電穿孔規(guī)程轉(zhuǎn)化了巴斯德畢赤酵母細胞。將載體/^￡///5/;^;//^671^/^^/在HIS4基因線性化以使所述構(gòu)建體耙向HIS4基因組進行整合。將10微克的DNA轉(zhuǎn)化入酵母細胞。在分離單菌落之后，使用對基因組DNA進行的PCR(引物HAC1-Karl和HAClRv06-005)驗證了構(gòu)建體的正確整合。從獲得自所述經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞的DNA擴增了915kb和1237kb的片段，而在非轉(zhuǎn)化體中(未整合所述構(gòu)建體的細胞)擴增了1237kb的片段。將由此鑒定為質(zhì)粒整合陽性的克隆在誘導(dǎo)之前在10mlBMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。用BMY將細胞清洗一次。向非誘導(dǎo)型培養(yǎng)物加入BMGY，而向誘導(dǎo)型培養(yǎng)物加入BMY。每12小時，為誘導(dǎo)型培養(yǎng)物補料0.5%曱醇(終濃度)。將誘導(dǎo)進行24小時，之后通過離心收獲細胞。為了制備RNA，將細胞與1mlRNApure(GenhunterCorporation,Nashville,NY)和1g玻璃珠組合，并且通過劇烈振蕩裂解。通過加入150pl氯仿并用異丙醇沉淀來提取RNA。對提取并沉淀的RNA進行DNA酶處理，使用獲得自Qiagen的不含RNA酶的DNA酶(目錄號79254)。使用寡dT引物和SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，目錄號18064-014)對400ng的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在實時PCR反應(yīng)中使用20ngRNA當量。通過PrimerExpress軟件(AppliedBiosystems)設(shè)計了引物序歹'J(序列參見引物表)。利用SYBR綠色熒光試劑(Eurogentec)的實時PCR在來自BioRad的iCycler儀器中運行。使用持家基因肌動蛋白作為對照從比較性閾循環(huán)值計算mRNA的相對量。對UPR的定量通過對UPR-靶基因KAR2的表達分析來進行。當將未經(jīng)誘導(dǎo)的克隆與用甲醇誘導(dǎo)的相同克隆比較時，獲得了高3-7倍的KAR2表達(圖19)。通過定量PCR測定了來自另外兩個克隆6和克隆8的HAC1mRNA的相對量，并且與Kar2的mRNA的相對量進行了比較。在兩個克隆中均)現(xiàn)察到了對HAC1的強誘導(dǎo)。KAR2mRNA的相對量似乎與HAC1mRNA的相對量相關(guān)，較高的HAC1表達水平導(dǎo)致較高的KAR2表達水平(圖20)。使用熒光流式細胞儀(FFC)進行經(jīng)曱醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的細胞凋亡研究，并且與未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的細胞凋亡比較。每次分析測量了數(shù)萬細胞。在12、36和48小時的誘導(dǎo)之后，在FACScalibur(BectonDickinson)上分析細胞。GlycoSwitchM5(GSM5)菌抹具有主要為Man5GlcNAc2(結(jié)構(gòu)式IV;圖4)的主要核心型聚糖結(jié)構(gòu)。為了檢查對Haclp的誘導(dǎo)是否對N-聚糖結(jié)構(gòu)有影響，對1ml培養(yǎng)基進行了DSA-FACE分析。在對經(jīng)剪接Haclp進行48小時誘導(dǎo)之后獲得的聚糖譜與親本GSM5菌株的鐠相似。制作了生長曲線以檢查Haclp誘導(dǎo)是否損害了巴斯德畢赤酵母的生長。與用空載體轉(zhuǎn)化的菌抹相比在Haclp誘導(dǎo)菌抹中未見生長缺陷(圖22)。實施例9.Y1MNN6的表達在釀酒酵母中，MNN6將磷酸甘露糖殘基轉(zhuǎn)移至N-聚糖。因此，解脂西洋蓍霉中Y1MNN6的過表達能夠?qū)е铝姿峄脑黾?。此外，對解脂西洋蓍霉磷酸化的額外作用通過過表達Y1MNN4和Y1MNN6獲得。將Y1MNN6編碼區(qū)(Genbank⑧登錄號XM—499811,GenolevuresRef:YALI0A06589g)使用PCR引物Y1MNN6BamHIfw(GCGGGATCCATGCACAACGTGCACGAAGC(SEQIDNO:34))和Y1MNN6AvrIIrv(GCGCCTAGGCTACCAGTCACTATAGTTCTCC(SEQIDNO:35))從基因組以PCR擴增，并克隆入pYHmAX表達載體中用于在hp4d啟動子調(diào)控下的表達。將質(zhì)粒使用zeta序列轉(zhuǎn)化至解脂西洋蓍霉菌林MTLY60以改善隨機整合。從培養(yǎng)在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上的細胞克隆收集分泌的糖蛋白，并且使用DSA-FACE分析合成所述糖蛋白的聚糖組成。然而，未觀察到磷酸化的增力口(圖22)。實施例10.Haclp表達的效果對異源蛋白分泌評估Haclp過表達。將含有在誘導(dǎo)型A0X1啟動子(pPIChygppHAClspliced)調(diào)控下或在組成型GAP啟動子調(diào)控下(pGAPhygHAClppspliced)的潮霉素抗性標記和經(jīng)剪接的/L4C7cDNA的載體轉(zhuǎn)化至表達在誘導(dǎo)型A0X1啟動子調(diào)控下的mlL-10蛋白的GS115菌抹。將巴斯德畢赤酵母細胞按照來自畢赤酵母表達試劑盒(Invitrogen目錄號K1710-01，Invitrogen,Carlsbad,CA)的電穿孔規(guī)程轉(zhuǎn)化。將所述載體在A0X1或GAP啟動子中線性化以使Haclp基因的整合分別靶向AOX1或GAP基因座。使用PCR確認了所述質(zhì)粒向宿主基因組中的整合。將來自鑒定為陽性的克隆的預(yù)培養(yǎng)物(5ml)在YPD中培養(yǎng)24小時。測量了培養(yǎng)物中細胞在600nm(OD6oo)波長的濃度(OD)并且將培養(yǎng)物在24孔平板的各個孔中的2mlBMGY培養(yǎng)基中稀釋至OD6o0為1。將培養(yǎng)物在BMGY中培養(yǎng)48小時，用BMY清洗兩次，然后在BMMY中誘導(dǎo)24小時。83每8-12小時，為培養(yǎng)物再次補料含1°/。甲醇(終濃度)的培養(yǎng)基。誘導(dǎo)之后，收獲細胞的上清液并且使用三氯乙酸(TCA)從1ml上清液沉淀蛋白質(zhì)。對沉淀的蛋白質(zhì)進行15%SDS-PAGE。從SDS-PAGE，在不同的克隆之間觀察到在至少一種蛋白質(zhì)(mIL-10)的表達方面的克隆變異。例如，對于組成型(在GAP啟動子調(diào)控下)表達Haclp蛋白的克隆，未觀察到表達水平的改進，而對于誘導(dǎo)型(AOXl啟動子)表達Haclp的克隆，可以鑒定出兩個克隆展現(xiàn)了更高的mIL-10蛋白的表達水平(圖40和圖41)。將各個克隆的mlL-10表達與由表達mlL-10的參照GS115菌抹產(chǎn)生的mIL-10表達比較。對于這些克隆進行了新的誘導(dǎo)。將培養(yǎng)24小時的預(yù)培養(yǎng)物在帶擋板的搖瓶中的20mlBMGY中稀釋至OD1。將細胞在BMGY中培養(yǎng)48小時，清洗兩次，然后在BMMY中誘導(dǎo)。每8-12小時為培養(yǎng)物再次補料含1%曱醇的培養(yǎng)基。誘導(dǎo)之后，收獲細胞的上清液并且使用TCA從1ml的所述上清液沉淀蛋白質(zhì)。在對沉淀的蛋白質(zhì)進行15%SDS-PAGE之前，用PNGaseF處理所述蛋白質(zhì)(或不處理)以去除全部糖基化(圖41)。SDS-PAGE解析出來自表達Haclp的菌抹的上清液的蛋白質(zhì)含有75kDa的顯著條帶，該條帶在參照菌抹中不存在。通過質(zhì)i普的方法鑒定了這個條帶為Kar2p,其是最主要的UPR靶基因。使用細胞因子珠測定法(cytokinebeadarray)(CBA)能夠證明IIaclp和mIL-10蛋白的同時誘導(dǎo)型表達能夠?qū)е?倍高的mIL-10蛋白表達(克隆l,圖41)。CBA是對經(jīng)endoH處理的mIL-lO蛋白進行的。對異源蛋白的表面表達評估Haclp過表達。將含有在誘導(dǎo)型AOX1啟動子調(diào)控下(pPIChygppHAClspliced)或在組成型GAP啟動子調(diào)控下(pGAPhygHAClppspliced)的潮霉素抗性標記和經(jīng)剪接的//JC7cDNA的載體轉(zhuǎn)化至分別在誘導(dǎo)型AOX1啟動子調(diào)控下表達成熟人干擾素-p/a-凝集素融合蛋白、成熟小鼠干擾素Y/a-凝集素融合蛋白、成熟人促紅細胞生成素/a-凝集素融合蛋白或a-凝集素和小鼠凝血調(diào)節(jié)蛋白的凝集素樣結(jié)構(gòu)域(lectin-likedomainofmousethrombomodulin)的融合蛋白的GlycoswitchMan5菌抹中。按照來自畢赤酵母表達試劑盒(Invitrogen目錄號K1710-Ol)的電穿孔規(guī)程轉(zhuǎn)化了巴斯德畢赤酵母細胞。將所述載體在AOX1或GAP啟動子中線性化以使Haclp基因分別靶向AOX1或GAP基因座進行整合。使用PCR確認了所述質(zhì)粒向宿主基因組中的整合。將來自鑒定為陽性的克隆的預(yù)培養(yǎng)物(5ml)在YPD中培養(yǎng)24小時。測量了OD麵并且將培養(yǎng)物在24孔平板的各個孔中的2mlBMGY培養(yǎng)基中稀釋至OD6。。為1。將培養(yǎng)物在BMGY中培養(yǎng)24小時，用去離子水清洗兩次，然后在BMMY中誘導(dǎo)(使用含1%甲醇的培養(yǎng)基)24小時。通過直接使用對V5表位特異性的抗體進行免疫染色證明表面表達，所述抗體與VhH編碼序列在C-末端融合。誘導(dǎo)之后，將在補充有0.1%牛血清清蛋白的1mlPBS(pH7.2)(PBS/BSA)中的107細胞與1pl/ml所述抗V5抗體(lHgl;Invitrogen)—起溫育，用PBS/BSA清洗，并且與lpl/mlAlexafluor488標記的羊抗小鼠IgG分子探針)一起溫育。在用PBS/BSA清洗兩次之后，通過流式細胞儀分析細胞(表5)。表5.通過流式細胞儀測定的MFI值<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>MFP從流式細胞儀分析獲得的平均熒光強度。對于組成型表達Haclp蛋白的菌株，與僅表達表面蛋白的參照菌林相比，對于全部四種蛋白在表面表達水平方面沒有觀察到改進或觀察到非常小的差異。在表達人干擾素-|3的細胞中，觀察到了表面表達水平的顯著降低。對于過表達誘導(dǎo)型Haclp(表5)的菌抹，可以觀察到如下l)在人干擾素-y表面表達菌抹中，與僅表達人干擾素-pa-凝集素融合物的參照菌抹相比能夠觀察到表面表達水平1.8倍的降低；2)對于表面表達人促紅細胞生成素a-凝集素融合蛋白的菌抹，與參照菌林相比能夠觀察到表面表達水平1.3倍的降低；3)在表面表達人干擾素-P的菌林中，與參照菌抹相比沒有觀察到表面表達水平的差異；和4)在表面表達小鼠凝血調(diào)節(jié)蛋白凝集素樣結(jié)構(gòu)域的菌林中，與參照菌株相比能夠觀察到表面表達水平1.9倍的增加。Haclp的it^達對磷脂合成的影響。為了測定Haclp產(chǎn)物的過表達(自經(jīng)剪接的HAC1cDNA產(chǎn)生)是否對巴斯德畢赤酵母中的脂質(zhì)代謝有影響，用上述經(jīng)剪接的HAC1cDNA轉(zhuǎn)化細胞并且通過電子顯孩史鏡分析測定Haclp對細胞中脂質(zhì)代謝的影響。將細胞在BMGY上培養(yǎng)48小時，用PBS清洗一次，然后在BMMY上再培養(yǎng)48小時。每8-12小時將細胞再次培養(yǎng)(nextculture)在含有1%曱醇的培養(yǎng)基中。然后按照Baharaeen的方法(Baharaeen等(20(M)Mycopathologia)制備用于電子顯微鏡的細胞。簡言之，使含有戊二醛(3。/o)和低聚曱醛(para-formaldehyde)(1.5%，在pH7.2的0.05M二曱胂酸鈉中緩沖)的初期固定劑與所述細胞在水上接觸2小時。然后將細胞用0.05M二甲胂酸鈉清洗三次20分鐘。清洗之后，將細胞與6%高錳酸鉀溶液在室溫接觸l小時，然后用0.05M二曱胂酸鈉清洗三次20分鐘。將實驗結(jié)果示于圖54。巴斯德畢赤酵母中Haclp產(chǎn)物(自經(jīng)剪接的HAC1cDNA產(chǎn)生)的過表達導(dǎo)致離散的膜堆疊的區(qū)域，如示于圖54的電子顯微照片(EM)中所示。這些結(jié)果證明Haclp的過表達通過其對脂質(zhì)代謝中涉及的基因的轉(zhuǎn)錄激活而確實對巴斯德畢赤酵母中的脂質(zhì)代謝有強烈效果。實施例11.ManHDEL的表達對于與由Aochl菌林表達的糖蛋白結(jié)合的Man5GlcNAc2,可以表達a-l,2-甘露糖苷酶以將Man8GlcNAc2切割成Man5GlcNAc2(即，高爾基型a-l,2-甘露糖苷酶活性)。這種甘露糖苷酶應(yīng)該靶向分泌系統(tǒng)。與釀酒酵母前原交配因子(prepromatingfactor)融合并且用HDEL序列標記的里氏木霉a-l，2-甘露糖苷酶(Genbank⑧登錄號.AF212153)能夠在巴斯德畢赤酵母中以及在里氏木霉和黑曲霉中將Man8GlcNAc2體內(nèi)剪切成Man5GlcNAc2。制備了在解脂西洋蓍霉中在組成型hp4d啟動子調(diào)控下過表達MFManHDEL(與里氏木霉a-l,2-甘露糖苷酶融合的用HDEL序列標記的釀酒酵母前原a-交配因子)的表達構(gòu)建體(圖23)。在用限制酶Notl消化質(zhì)粒pYHmAXManHDEL之后，將所述表達盒轉(zhuǎn)化入細胞，其后使用瓊脂糖凝膠電泳分離期望的片段。使用DSA-FACE分析從來自經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞的甘露糖蛋白衍生的聚糖。僅一'J、部分Man8GlcNAc2被轉(zhuǎn)化成Man5GlcNAc2(圖24)。Man8GlcNAc2向Mari5GlcNAc2的不完全轉(zhuǎn)化可能是因為非最適的分泌信號。因此，將所述釀酒酵母分泌信號用源自良好表達的解脂西洋蓍霉LIP2(LIP2pre)的分泌信號替代。LIP2pre序列通過將合成寡核苷酸LIP2prefWGATCCATGAAGCTTTCCACCATCCTCTTCACAGCCTGCGCTACCCTGGCCGCGGTAC(SEQIDNO:66)和Lip2preprorvGTACCGGCCGGCCGCTTCTGGAGAACTGCGGCCTCAGAAGGAGTGATGGGGGAAGGGAGGGCGGC(SEQIDNO:67)雜交來制備并將所述DNA克隆入pYLHmA載體(在BamHI/Avrl1位點)，產(chǎn)生以下構(gòu)建體pYLHUdL2pre。使用寡核苷酸ManHDELEco47IHfw(GGCAGCGCTACAAAACGTGGATCTCCCAAC(SEQIDNO:68》和ManHDELAvrIIrv(GGCCCTAGGTTACAACTCGTCGTGAGCAAG(SEQIDNO:69))從pGAPZMFManHDELPCR擴增了ManHDEL編碼序列，并將該序列克隆入pYLHUdL2pre。所述構(gòu)建策略示于圖25。在用Notl消化質(zhì)粒并分離正確片段(見上)之后將所述表達盒(具有在組成型啟動子hp4d調(diào)控下的L2preManHDEL)轉(zhuǎn)化至解脂西洋蓍霉Aochl菌株。經(jīng)由DSAFACE分析從分泌蛋白衍生的聚糖。發(fā)生了一些Man8GlcNAc2向Man5GlcNAc2的轉(zhuǎn)化，但是所述反應(yīng)是不完全的(存在Mari8GlcNAc2以及中間產(chǎn)物Man7GlcNAcjpMan6GlcNAc2;圖26)。為了進一步改進將Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2和Man6GlcNAc2剪切成Man5GlcNAc2,將所述里氏木霉a-1,2甘露糖苷酶針對在解脂西洋蓍霉中的表達進行密碼子優(yōu)化(SEQIDNO:9;圖42)并與LIP2前信號序列融合。將這種融合構(gòu)建體在4中不同的啟動子調(diào)控下表達(i)hp4d,(ii)GAP(SEQIDNO:10;圖43),(iii)POX2,和(iv)TEF1。將最終的表達質(zhì)粒命名為pYLHUXdL2preManHDEL(SEQIDNO:11;圖44A-C)pYLGUXdL2preManHDEL(SEQIDNO:12;圖45A-)pYLPUXdL2preManHDEL(SEQIDNO:13;圖46A-C)pYLTUXdL2preManHDEL(SEQIDNO:14;圖47A-C)。在用Notl切割質(zhì)粒并分離含有ManHDEL表達盒的片段之后，將全部4種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至解脂西洋蓍霉MTLY60AocW菌抹(在實施例2中描述)。將具有在hp4d、GAP和TEF啟動子調(diào)控下的ManHDEL(質(zhì)粒pYLHUXdL2preManHDEL、pYLGUXdL2preManHDEL和pYLTUXdL2preManHDEL)的轉(zhuǎn)化菌林培養(yǎng)在YPD中。通過DSAFACE分析從轉(zhuǎn)化菌抹的分泌蛋白原生的聚糖。結(jié)果示于圖48?；蛘?，將轉(zhuǎn)化體(包括整合了pYLPUXdL2preManHDEL質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體)培養(yǎng)在含有油酸的培養(yǎng)基中(蛋白質(zhì)產(chǎn)生條件)，并通過DSA-FACE分析聚糖。有關(guān)所述載體之一pYLTUXdL2preManHDEL的數(shù)據(jù)示于圖49。從所述數(shù)據(jù)中能夠總結(jié)出，通過48小時的培養(yǎng)，幾乎全部聚糖轉(zhuǎn)化成Man5GlcNAc2。實施例12.用于受P0X2啟動子調(diào)控的基因表達的培養(yǎng)條件培養(yǎng)始于新鮮平;^反的單菌落，并且在50mL管中的10mLYPD中于28。C在定軌搖床上以250rpm過夜培養(yǎng)。然后，用所述預(yù)培養(yǎng)物以0.2的最終OD600接種含有22mL生產(chǎn)培養(yǎng)基(productionmedium)(包括2.5mL油酸乳劑)的250mL搖瓶。將這種培養(yǎng)物在28°C在定軌搖床上以250rpm溫育。在96小時過程中在不同時間點取培養(yǎng)物的樣品。油酸乳劑(20%)按照如下方法制備向無菌50ml容器加入20ml無菌水j5ml油酸；和125|alTween40。導(dǎo)致乳劑形成的超聲處理在75Hz進行1分鐘。生產(chǎn)培養(yǎng)基由如下組成1%酵母提取物；2%胰蛋白胨；1%葡萄糖；和50mM磷酸鹽pH6.8。實施例13:人葡糖腦芬酯酶的表達按照為了在解脂西洋蓍霉中的表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA(SEQIDNO:15;圖50)以化學(xué)方法合成了人葡糖腦苷酯酶(GLCM,SwissProt條目號P0楊2)。將成熟蛋白的編碼序列融合至LIP2前信號序列的編碼序列。將這種融合構(gòu)建體克隆在油酸誘導(dǎo)型POX2啟動子的調(diào)控下。將所得質(zhì)粒命名為pYLPUXL2preGLCM(=pRAN21))。在轉(zhuǎn)化之前，將質(zhì)粒用Notl消化并且將含有所述表達盒的片段分離并轉(zhuǎn)化至解脂西洋蓍霉菌林MTLY60、MTLY60AocW(上文實施例2中描述)，和MTLY60AocWManHDEL(實施例11中描述)。將在這三種菌抹中獲得的轉(zhuǎn)化體如實施例12中所述培養(yǎng)。如上所述將蛋白質(zhì)從上清液沉淀，進行SDS-PAGE并使用大鼠單克隆抗葡糖腦香西旨酶抗體進行免疫印跡(Alessandrini等(2004)J.Invest.Dermatol23(6):1030-6)。示例性免疫一進分析示于圖51。從圖51可以認識到在破壞了ochl的菌抹中沒有出現(xiàn)拖尾(泳道1、2和3),而在WT細胞中作為拖尾觀察到了蛋白質(zhì)的異質(zhì)性(泳道4和6)。在獲得自表達ManHDEL的酵母菌抹的蛋白質(zhì)中沒有觀察到蛋白質(zhì)拖尾。這些結(jié)果證明使用遺傳工程化的解脂西洋蓍霉細胞MTLY60Aochl和MTLY60AochlManHDEL能夠獲得更均質(zhì)的目標蛋白群體。實施例14:人促紅細胞生成素的表達以化學(xué)方法合成針對在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人促紅細胞生成素(Epo，SwissProt條目號P01588)的cDNA(SEQIDNO:16;圖52)。將所述成熟蛋白的cDNA編碼序列與LIP2前信號序列的編碼序列融合。將這種融合構(gòu)建體克隆在油酸誘導(dǎo)型POX2啟動子的調(diào)控下。將所得質(zhì)粒命名為pYLPUXL2prehuEPO。在轉(zhuǎn)化之前將質(zhì)粒用Notl切割并將含有表達盒的片段分離并轉(zhuǎn)化至解脂西洋蓍霉菌抹MTLY60AocW(在實施例2中描述)。將轉(zhuǎn)化體候選如實施例12中所述培養(yǎng)，并通在使用來自R&D系統(tǒng)的單克隆小鼠抗人Epo抗體(克隆AE7A5)進行SDSPAGE之后通過Western印跡分析分泌的蛋白質(zhì)。獲得自所述細胞的EPO產(chǎn)物展現(xiàn)了非常均質(zhì)的糖基化。實施例15:人的a-半乳糖香酶A的表達按照為了在解脂西洋蓍霉中表達而經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA(SEQIDNO:17;圖53)以化學(xué)方法合成了人a-半乳糖苷酶A(AGAL,SwissProt條目號P06280)編碼cDNA。將成熟蛋白的cDNA編碼序列與LIP2前信號序列的編碼序列融合。將這種融合構(gòu)建體克隆在油酸誘導(dǎo)型POX2啟動子的調(diào)控下。將所得質(zhì)粒命名為pYLPUXL2preaGalase。在轉(zhuǎn)化之前將所述質(zhì)粒用Notl切割并且將含有所述表達盒的片段分離并轉(zhuǎn)化至解脂西洋蓍霉菌抹MTLY60和MTLY60Aoc/z/MMW(在實施例4中描述)。將在這兩種菌抹中獲得的轉(zhuǎn)化體如實施例12中所述培養(yǎng)。在SDS-PAGE分析之后通過免疫印跡分析獲得自轉(zhuǎn)化體的胞外蛋白。使用對a-半乳糖普酶A特異性的抗體(獲得自Abeam的雞多克隆抗體(ab28962)和獲得自SantaCmzBiotechnology的兔多克隆抗體(sc-25823))檢測表達的人a-半乳糖苦酶A蛋白。實施例16.甘露糖苷酶在WT解脂西洋蓍霉中的表達為了測定單獨的甘露糖苷酶HDEL的表達是否能夠?qū)е聦φ婢毎磉_的蛋白質(zhì)更均質(zhì)的糖基化，將含有編碼甘露糖苷酶HDEL的核酸的表達盒(參見實施例ll)轉(zhuǎn)化入野生型解脂西洋蓍霉pold細胞。通過DSA-FACE分析從獲得自所述細胞的分泌蛋白衍生的聚糖(圖55)。經(jīng)分析的聚糖主要由MansGlcNAc2和小部分的Mari6GlcNAc2組成。這些結(jié)果證明，在缺乏對OCH1基因的任何破壞的條件下，單獨的甘露糖苷酶HDEL的表達導(dǎo)致對解脂西洋蓍霉表達的蛋白質(zhì)更均質(zhì)的糖基化。其它實施方案盡管以結(jié)合本發(fā)明的詳述描述了本發(fā)明，但前文所述意在進行示例說明而非對本發(fā)明的范圍進行限制，本發(fā)明的范圍由隨附權(quán)利要求的范圍限定。其它方面、優(yōu)勢和修飾形式在隨附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.產(chǎn)生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括提供解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans細胞，所述細胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性；和向細胞中引入編碼目標蛋白的核酸，其中所述細胞以改變的糖基化形式產(chǎn)生所述目標蛋白。2.權(quán)利要求1的方法，還包括分離所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述目標蛋白是外源蛋白。4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述目標蛋白是內(nèi)源蛋白。5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述目標蛋白是哺乳動物蛋白。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述目標蛋白是人蛋白。7.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述目標蛋白是病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細胞因子、趨化因子、抗體或其抗原結(jié)合片段，或融合蛋白。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述融合蛋白是病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細胞因子或趨化因子與抗體或其抗原結(jié)合片段的融合物。9.權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中所述目標蛋白是與溶酶體貯積病(LSD)相關(guān)的蛋白質(zhì)。10.權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中所述目標蛋白是葡糖腦苷酯酶或半乳糖腦苷酯酶。11.權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中所述目標蛋白選自下組a-L-艾杜糖苷酸酶、P-D-半乳糖苷酶、(3-葡糖苷酶、j3-己糖胺酶、p-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖苷-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、p-D-葡糖醛酸酶、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苷酶、a-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶、^L酯酶、組織蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。12.權(quán)利要求1-11中任一項的方法，其中所述改變的N-糖基化形式包括一種或多種N-聚糖結(jié)構(gòu)。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是MansGlcNAc2。14.權(quán)利要求12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Mari8GlcNAc2。15.權(quán)利要求12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Mari9GlcNAc2。16.權(quán)利要求12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Mari3GlcNAc2。17.權(quán)利要求12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Glc,Mari5GlcNAc2。18.權(quán)利要求12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Glc2Man5GlcNAc2。19.權(quán)利要求12-18中任一項的方法，其中所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式是均質(zhì)的。20.權(quán)利要求12-18中任一項的方法，其中所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式基本上是均質(zhì)的。21.權(quán)利要求20的方法，其中含有改變的糖基化的改變的目標分子之部分是至少約20%。22.權(quán)利要求20的方法，其中含有改變的糖基化的改變的目標分子之部分是至少約30%。23.權(quán)利要求20的方法，其中含有改變的糖基化的改變的目標分子之部分是至少約40%。24.權(quán)利要求19-23中任一項的方法,其中所述改變的糖基化是Man5GlcNAc2。25.權(quán)利要求19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是Man8GlcNAc2。26.權(quán)利要求19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是Man9GlcNAc2。27.權(quán)利要求19-23中任一項的方法，,其中所述改變的糖基化是Man3GlcNAc2。28.權(quán)利要求19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是Glc'Man5GlcNAc2。29.權(quán)利要求19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是Glc2Man5GlcNAc2。30.權(quán)利要求1-29中任一項的方法，其中所述細胞經(jīng)遺傳工程化而缺乏至少一種N-糖基化活性。31.權(quán)利要求30的方法，其中N-糖基化活性是ALG3活性。32.權(quán)利要求30的方法，其中N-糖基化活性是OCHl活性。33.權(quán)利要求30的方法，其中N-糖基化活性是MNS1活性。34.權(quán)利要求30的方法，其中N-糖基化活性是MNN9活性。35.權(quán)利要求1-34中任一項的方法，其中所述至少一種修飾包含缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因。36.權(quán)利要求1-35中任一項的方法，其中所述至少一種修飾包含表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的突變形式。37.權(quán)利要求1-36中任一項的方法，其中所述至少一種修"沛包含引入或表達RNA分子，所述RNA分子干擾具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的功能性表達。38.權(quán)利要求1-37中任一項的方法，其中所述至少一種修飾包含表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述表達的蛋白質(zhì)是由細胞中的外源核酸編碼的蛋白質(zhì)。40.權(quán)利要求38的方法，其中所述N-糖基化活性是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性。41.權(quán)利要求38-40中任一項的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是ALG6。42.權(quán)利要求38的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是a-甘露糖苷酶。43.權(quán)利要求38的方法，其中所述a-甘露糖苷酶靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。44.權(quán)利要求42或43的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是融合蛋白，所述融合蛋白包含a-甘露糖苷酶多肽和HDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留肽。45.權(quán)利要求42的方法，其中所述a-甘露糖苷酶具有5.1以下的最適pll。46.權(quán)利要求38的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是能夠從Man5GlcNAc2去除葡萄糖殘基的蛋白質(zhì)。47.權(quán)利要求38或46的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是具有a-l,3-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。48.權(quán)利要求46或47的方法，其中所述蛋白質(zhì)是葡糖苷酶II。49.權(quán)利要求46-48中任一項的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含葡糖香酶II的ct和/或卩亞基。50.權(quán)利要求46的方法，其中所述蛋白質(zhì)是變聚糖酶。51.權(quán)利要求1的方法，其中所迷細胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少兩種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。52.權(quán)利要求51的方法，其中所述至少兩種經(jīng)修飾的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏和升高的ALG6活性水平。53.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少三種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。54.權(quán)利要求51的方法，其中所述至少三種經(jīng)修飾的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏；升高的ALG6活性水平；和升高的葡糖苷酶II活性水平。55.權(quán)利要求38-54中任一項的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是外源蛋白。56.權(quán)利要求38-54中任一項的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是哺乳動物蛋白。57.權(quán)利要求56的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是人蛋白。58.權(quán)利要求38-54中任一項的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是低等真核生物蛋白。59.權(quán)利要求45的方法，其中所述低等真核生物是真菌、錐蟲或原生動物。60.權(quán)利要求58的方法，其中所述低等真核生物選自下組布氏錐蟲、哈茨木霉和曲霉屬。61.權(quán)利要求1-60中任一項的方法，其中修飾包含表達能夠影響目標蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體。62.權(quán)利要求61的方法，其中所述能夠影響甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體是MNN4。63.權(quán)利要求61的方法，其中所述能夠影響甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體是PNOl。64.權(quán)利要求61的方法，其中所述能夠影響甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體是MNN6。65.權(quán)利要求61-64中任一項的方法，其中糖蛋白中至少約30%的甘露糖殘基是磷酸化的。66.權(quán)利要求1-65中任一項的方法，其中所述細胞未經(jīng)遺傳工程化而成為0CH1活性缺陷的。67.權(quán)利要求1-66中任一項的方法，還包括對糖蛋白的額外加工。68.權(quán)利要求67的方法，其中所述額外加工發(fā)生在體外。69.權(quán)利要求67的方法，其中所述額外加工發(fā)生在體內(nèi)。70.4又利要求67-69中任一項的方法，其中所述額外加工包括向^務(wù)飾的糖蛋白添加異源模塊。71.權(quán)利要求55的方法，其中所述異源模塊是聚合物或載體。72.權(quán)利要求67-71中任一項的方法，其中所述額外加工包括對所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式進行酶處理或化學(xué)處理。73.權(quán)利要求67的方法，其中所述額外加工包括用甘露糖苷酶、甘露聚糖酶、磷酸二酯酶、葡糖苷酶或糖基轉(zhuǎn)移酶處理所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式。74.權(quán)利要求72的方法，其中所述額外加工包括用氫氟酸處理所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式。75.權(quán)利要求67-74中任一項的方法，其中所述額外加工包括將所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式磷S吏化。76.具有改變的N-糖基化的分離的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是通過權(quán)利要求1-75中任一項的方法產(chǎn)生的。77.分離的解脂西洋蓍霉或v4ra"/a"A"/"/wnmy細胞，所述細胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。78.權(quán)利要求77的分離的細胞，其中N-糖基化活性是ALG3活性。79.權(quán)利要求77或78的分離的細胞，其中N-糖基化活性是0CH1活性。80.權(quán)利要求77-79中任一項的分離的細胞，其中N-糖基化活性是MNS1活性。81.權(quán)利要求77-79中任一項的分離的細胞，其中N-糖基化活性是MNN9活性。82.權(quán)利要求77-79中任一項的分離的細胞，其中所述修飾包含缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的基因。83.權(quán)利要求77-79中任一項的分離的細胞，其中所述修飾包含表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的突變形式。84.權(quán)利要求77-83中任一項的分離的細胞，其中所述修飾包含引入或表達RNA分子，所述RNA分子干擾具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)的功能性表達。85.權(quán)利要求77-83中任一項的分離的細胞，其中所迷修飾包含表達具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)。86.權(quán)利要求85的分離的細胞，其中所述N-糖基化活性是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性。87.權(quán)利要求85或86的分離的細胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是ALG6。88.權(quán)利要求85的分離的細胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是a-甘露糖苷酶。89.權(quán)利要求88的分離的細胞，其中所述oc-甘露糖苷酶靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。90.權(quán)利要求88或89的分離的細胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是融合蛋白，所述融合蛋白包含a-甘露糖苷酶多肽和HDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留肽。91.權(quán)利要求85的分離的細胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是能夠從Man5GlcNAc2去除葡萄糖殘基的蛋白質(zhì)。92.權(quán)利要求85或91的分離的細胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是具有a-l,3-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。93.權(quán)利要求91或92的分離的細胞，其中所述蛋白質(zhì)是葡糖苷酶II。94.權(quán)利要求91-93中任一項的分離的細胞，其中所述蛋白質(zhì)包含葡糖苦酶II的a和/或(3亞基。95.權(quán)利要求91的分離的細胞，其中所述蛋白質(zhì)是變聚糖酶。96.權(quán)利要求77-95中任一項的分離的細胞，其中所述細胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少兩種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。97.權(quán)利要求96的分離的細胞，其中所述至少兩種經(jīng)修飾的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏和升高的ALG6活性水平。98.權(quán)利要求77-97中任一項的分離的細胞，其中所述細胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少三種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。99.權(quán)利要求98的分離的細胞，其中至少三種經(jīng)修飾的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏；升高的ALG6活性水平；和升高的葡糖普酶II活性水平。100.利要求77-99中任一項的分離的細胞，其中所述細胞未經(jīng)遺傳工程化而成為0CH1活性缺陷的。101.權(quán)利要求85-100中任一項的分離的細胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)是人蛋白。102.利要求77-101中任一項的分離的細胞，其中所述修飾包含表達能夠促進經(jīng)修飾的糖蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體。103.權(quán)利要求102的分離的細胞，其中所述能夠影響甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體是MNN4。104.權(quán)利要求103的分離的細胞，其中所述影響甘露糖基磷酸化的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性變體是PNOl。105.—種治療病癥的方法，所述病癥可以通過施用具有改變的N-糖基化的蛋白質(zhì)來治療，所述方法包括向受試者施用權(quán)利要求76的蛋白質(zhì)，其中所述受試者是患有或疑似患有可以通過施用具有改變的N-糖基化的蛋白質(zhì)來治療的受試者。106.權(quán)利要求105的方法，其中所述病癥是代謝紊亂。107.權(quán)利要求106的方法，其中所述代謝紊亂是溶酶體貯積病(LSD)。108.權(quán)利要求107的方法，其中溶酶體貯積病是高歇爾氏病、泰-沙二氏病、旁姆普氏病、尼-皮二氏病或法布里氏病。109.權(quán)利要求105-108中任一項的方法，其中所述蛋白質(zhì)是與LSD相關(guān)的蛋白質(zhì)。110.權(quán)利要求109的方法，其中所述蛋白質(zhì)是葡糖腦苷酯酶或a-半乳糖苷酶。111.權(quán)利要求I09的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自下組a-L-艾杜糖苷酸酶、p-D-半乳糖苷酶、P-葡糖苷酶、P-己糖胺酶、P-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖普酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖脊-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、(3-D-葡糖醛酸酶、透明質(zhì)酸酶、a-L-甘露糖苷酶、a-神經(jīng)氨酸酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。112.權(quán)利要求105-111中任一項的方法，其還包括確定所述受試者是否患有可以通過施用具有改變的N-糖基化的蛋白質(zhì)來治療的疾病。113.權(quán)利要求105-112中任一項的方法，其中所述受試者是人。114.產(chǎn)生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括使目標蛋白與制備自解脂西洋蓍霉或Jrx"/a^fem'm'vorara細胞的細胞裂解物接觸，所述細胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，其中使所述.目標蛋白與所述細胞裂解物接觸導(dǎo)致該目標蛋白的改變的N-糖基化形式。115.產(chǎn)生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括使目標蛋白與一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸，其中所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)獲得自解脂西洋蓍霉或Aw/aacfem'm'vorara細胞，所述細胞經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性，并且其中使所述目標分子與所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質(zhì)接觸導(dǎo)致該目標蛋白的改變的N-糖基化形式。116.解脂西洋蓍霉或Jnro/Gacfem'm'vorara細胞的基本上純的培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物中的大量經(jīng)遺傳工程化而包含至少一種經(jīng)修飾的N-糖基化活性。117.權(quán)利要求87的基本上純的細胞培養(yǎng)物，其中所述細胞培養(yǎng)物含有一種或多種細胞亞群，每個亞群包含不同的經(jīng)修飾的糖基化活性。118.分離的核苷酸序列，其包含SEQIDNO:l或SEQIDNO:2。119.分離的核苷酸序列，其包含與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2至少80%相同的序列。120.由權(quán)利要求118或119的分離的核苷酸序列編碼的多肽。121.分離的核酸，其包含(a)核苷S交序列，其在高嚴緊條件下與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的補體雜交；或(b)所述核苦酸序列的補體。122.包含權(quán)利要求118-121中任一項的核酸序列的載體。123.包含權(quán)利要求118-121中任一項的核酸序列的表達載體。124.包含權(quán)利要求123的表達載體的培養(yǎng)的細胞或所述細胞的子代，其中所述細胞表達所述多肽。125.產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在允許表達所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求124的細胞。126.權(quán)利要求125的方法，其還包括在培養(yǎng)細胞之后，從細胞或培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基分離多肽。全文摘要本文描述的是可用于產(chǎn)生目標分子的改變的N-糖基化形式的方法和遺傳工程化細胞。還描述用于治療多種病癥例如代謝紊亂的方法和N-糖基化改變的分子。文檔編號C12N9/10GK101680014SQ200880018736公開日2010年3月24日申請日期2008年4月3日優(yōu)先權(quán)日2007年4月3日發(fā)明者卡倫·J·馬塞爾德波爾克,史蒂文·C·J·蓋森斯,尼科·L·M·卡爾沃爾特,沃特·弗維肯,芒娜·古爾法爾申請人:奧克西雷恩(英國)有限公司