專利名稱：微小隱孢子蟲ctl多表位基因和融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種微小隱孢子蟲CTL多表位基因和融合蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)是一種主要由微小隱孢子蟲 (Cryptosporidium parvum)引起的人獸共患傳染病，在免疫功能正常的機(jī)體中，可引起自限性腹瀉，在免疫功能缺陷患者如艾滋病(AIDS)病人中，可導(dǎo)致嚴(yán)重甚至威脅生命的疾病。隱孢子蟲病已被列為世界最常見6種腹瀉病之一，并被WHO和美國疾病預(yù)防控制中心列入新發(fā)傳染病。目前對該病尚無特效藥物，絕大多數(shù)抗生素、抗寄生蟲藥均無效，因此隱孢子蟲病的免疫預(yù)防和治療就愈發(fā)顯得重要。在以往的隱孢子蟲疫苗研究中，人們通常在重組疫苗中編碼一個全長的隱孢子蟲抗原蛋白。但是，此類疫苗并未獲得滿意的免疫保護(hù)效果。其原因可能是隱孢子蟲基因組巨大，生活史復(fù)雜，抗原種類繁多，單一的抗原無法徹底阻斷病原在宿主體內(nèi)的生活周期?？紤]使用多抗原疫苗時，由于載體容量有限，并且大分子蛋白可能會造成動物免疫病理反應(yīng)， 所以在單一載體中加入多個抗原存在很大的局限性。近年來國際上興起了利用抗原表位預(yù)測工具，開展抗原表位預(yù)測，構(gòu)建多表位疫苗(multi-印itope vaccine)的熱潮，而且也取得了階段性成果，尤其在抗瘧疾多表位疫苗研制領(lǐng)域，已設(shè)計合成了多個基因工程疫苗和合成肽疫苗，取得了較好的免疫保護(hù)效果。目前國內(nèi)外尚沒有隱孢子蟲多表位疫苗的研究報道。CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)在抗細(xì)胞內(nèi)病原的保護(hù)性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。微小隱孢子蟲的免疫機(jī)制目前尚不清楚，普遍認(rèn)為與機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)有關(guān)，有學(xué)者認(rèn)為CD8+T細(xì)胞可能在?？刮⑿‰[孢子蟲感染中起重要作用。 因此對隱孢子蟲CTL表位進(jìn)行研究具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決缺少隱孢子蟲多表位疫苗的技術(shù)問題，提供一種微小隱孢子蟲CTL 多表位基因和融合蛋白，該CTL多表位基因和融合蛋白可用于制備抗隱孢子蟲病的多表位疫苗。此外，還需要提供一種微小隱孢子蟲CTL多表位基因和融合蛋白在制備預(yù)防或治療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種微小隱孢子蟲CTL多表位融合蛋白，其包含 SEQ IDN0. 1 10所示CTL表位序列以任意順序相互串聯(lián)形成的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述CTL表位序列之間設(shè)有柔性氨基酸組成的接頭序列。在各個CTL表位序列之間加入柔性氨基酸組成的接頭序列，能使各個CTL抗原表位在空間上互相獨(dú)立，防止各表位多肽分子由于空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而阻礙其和MHC(Major Histocompatibility Complex，主要組織相容性復(fù)合體，具有抗原呈遞作用)分子的結(jié)合；同時在各個CTL表位之間用接頭序列連接，可適當(dāng)提高免疫肽分子量，以增強(qiáng)多表位融合蛋白的免疫原性。更優(yōu)選的，所述融合蛋白具有SEQ ID NO. 11所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種微小隱孢子蟲CTL多表位基因，其包含編碼上述融合蛋白的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述微小隱孢子蟲CTL多表位基因具有編碼SEQ ID NO. 11所示氨基酸序列的核苷酸序列。更優(yōu)選的，所述微小隱孢子蟲CTL多表位基因具有SEQ ID N0. 12所示的核苷酸序列。 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述微小隱孢子蟲CTL多表位基因的重組載體。所述重組載體包括重組克隆載體或重組表達(dá)載體，重組表達(dá)載體包括重組原核表達(dá)載體、重組真核表達(dá)載體。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種疫苗，包含上述微小隱孢子蟲CTL多表位基因和表達(dá)載體。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含上述重組載體，或已用上述微小隱孢子蟲CTL多表位基因序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種微小隱孢子蟲CTL多表位融合蛋白在制備預(yù)防或治療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，將融合蛋白與弗氏不完全和完全佐劑、Montanide ISA 206等充分混勻制備亞單位疫苗。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種微小隱孢子蟲CTL多表位基因在制備預(yù)防或治療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，將微小隱孢子蟲CTL多表位基因克隆到真核載體如pVAXl、pcDNA3. 1 等，或共同插入細(xì)胞因子基因，構(gòu)建成核酸疫苗。本發(fā)明微小隱孢子蟲CTL多表位基因，經(jīng)原核表達(dá)后所得的重組蛋白，通過 Western blot和免疫小鼠血清抗體ELISA檢測結(jié)果顯示，該重組蛋白具有較好的免疫原性和反應(yīng)原性；同時動物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)顯示，該重組蛋白制成的亞單位疫苗對小鼠隱孢子蟲感染有極好的免疫保護(hù)效果。此外，本發(fā)明構(gòu)建的含微小隱孢子蟲CTL多表位基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，作為核酸疫苗進(jìn)行動物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該重組真核表達(dá)質(zhì)粒具有很好的免疫保護(hù)效果。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明實(shí)施例3重組表達(dá)質(zhì)粒pET-CpCTL10的雙酶切鑒定圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例3重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例3純化的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例4重組表達(dá)產(chǎn)物的Western blot圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例5微小隱孢子蟲多表位基因CpCTLlO (e)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定圖； 圖6是本發(fā)明實(shí)施例5重組克隆載體pMD-CpCTL10 (e)雙酶切鑒定圖；圖7是本發(fā)明實(shí)施例5真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX-l-CpCTL10的雙酶切鑒定圖；圖8是本發(fā)明實(shí)施例6重組表達(dá)蛋白rCpCTLlO免疫后小鼠隱孢子蟲鼠基因型卵囊排出曲線圖；圖9是本發(fā)明實(shí)施例6核酸疫苗免疫后小鼠隱孢子蟲鼠基因型卵囊排出曲線圖。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.第3版，北京科學(xué)出版社，2002)中所述的方法進(jìn)行。本發(fā)明應(yīng)用多個服務(wù)器對微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)候選疫苗抗原的氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測可能存在的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CDS+cytotoxic T lymphocyte，⑶8+CTL)表位。從6種常見的免疫效果較好的候選疫苗抗原基因CP15、 gpl5/45/60、GP900、cpal35、TRAP-Cl、CP15/60中選出10個分值較高的表位基因以任意順序進(jìn)行相互串聯(lián)，形成多表位基因，進(jìn)行人工合成，各表位之間用柔性氨基酸鏈接。將該多表位基因克隆到原核表達(dá)載體中進(jìn)行原核表達(dá)，并對表達(dá)的融合蛋白的免疫原性和反應(yīng)原性進(jìn)行驗(yàn)證；將該多表位基因克隆到真核表達(dá)載體中，構(gòu)建核酸疫苗；將原核重組表達(dá)蛋白和真核重組表達(dá)質(zhì)粒分別免疫小鼠，觀察亞單位疫苗和核酸疫苗的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，重組表達(dá)蛋白制成的亞單位疫苗免疫組始終未檢測到卵囊排出，而PBS空白對照組和佐劑對照組均有較多的卵囊排出，提示該重組亞單位疫苗對小鼠隱孢子蟲鼠基因型感染有極好的免疫保護(hù)效果。由真核重組表達(dá)質(zhì)粒制成的核酸疫苗，免疫小鼠的攻擊感染試驗(yàn)結(jié)果表明，與空載體對照組與生理鹽水空白對照組相比，核酸疫苗免疫組的排出卵囊數(shù)量顯著減少，開始排出卵囊時間明顯延后，卵囊排出持續(xù)時間明顯縮短，提示該真核重組表達(dá)質(zhì)粒具有很好的免疫保護(hù)效果。實(shí)施例1微小隱孢子蟲CTL疫苗候選抗原表位預(yù)測從文獻(xiàn)中查找目前報道的潛在的微小隱孢子蟲候選疫苗抗原，記錄其GeneBank 登錄號，從NCBI中下載相關(guān)蛋白序列。運(yùn)用表位預(yù)測服務(wù)器SYFPEITHI(http://WWW. syfpeithi. de/home. htm)、ProPred-I (http://www. imtech. res. in/raghava/propredl/) 和 NetMHC 3. 0 (http: //www. cbs. dtu. dk/services/NetMHC/)，分別對微小隱孢子蟲各個抗原的可能產(chǎn)生9個氨基酸殘基的H2-d(包括H2-Kd、H2-Ld和H2_Dd)限制性CTL表位進(jìn)行預(yù)測。本發(fā)明預(yù)測9個氨基酸殘基的CTL表位，主要是由于大部分能與MHC-I類分子結(jié)合的多肽都有嚴(yán)格的長度，一股為8-10個氨基酸殘基組成，其中9肽最為常見。具體方法為 預(yù)測H2-Kd，H2-Ld限制性表位時，將抗原氨基酸序列分別輸入服務(wù)器，保存SYFPEITHI預(yù)測分值大于20的9肽；同時保存ProPred-I返回結(jié)果的前15位；尋找二者的重復(fù)序列。按照文獻(xiàn)[PanagiotopoulosC，Qin H，Tan R，et al. Identification of a β -cell-specific HLA class I restrictedepitope in type 1 diabetes[J]. Diabetes，2003，52(11) 2647-2651]報道的方法，計算兩者所含MHC I類分子結(jié)合9肽的得分并排序，選取得分明顯大于其他肽段的序列。同時結(jié)合NetMHC 3.0預(yù)測結(jié)果，進(jìn)行綜合分析。預(yù)測H2_Dd限制性表位時，保存ProPred-I返回結(jié)果的前15位，結(jié)合NetMHC 3. O預(yù)測結(jié)果，進(jìn)行綜合分析。結(jié)果從文獻(xiàn)報道中收集到31個隱孢子蟲疫苗候選抗原，對其進(jìn)行抗原表位預(yù)測，共獲得H2-d型CTL表位226個。其中H2_Kd型CTL表位136個、H2_Ld型CTL表位69 個、H2-Dd型CTL表位21個。實(shí)施例2微小隱孢子蟲CTL多表位基因的設(shè)計和合成從目前研究較多的微小隱孢子蟲候選疫苗抗原CP15、gpl5/45/60、GP900、Cpal35、 TRAP-Cl、CP15/60中選取10段預(yù)測分值較高的CTL表位(見下表1)串聯(lián)在一起，表位之間用柔性氨基酸GGGGS或GPGPG鏈接，使10個CTL抗原表位在空間上互相獨(dú)立并各自發(fā)揮作用。最終設(shè)計合成了一條編碼137個氨基酸(SEQ ID NO. 11)的多表位基因。為便于重組載體的構(gòu)建，在CTL多表位基因5’端依次加上保護(hù)性堿基CCAAT、酶切位點(diǎn)BamH I、 kozac序列、起始密碼子(ATG)、防錯位保護(hù)堿基GCT ;3’端加上保護(hù)性堿基CCAAT，酶切位點(diǎn)Hind III、終止密碼子TTA，全長442bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示，將該基因命名為CpCTLlO。序列由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成并連接到pMD-18T載體上，命名為pMD-CpCTL10，該pMD-CpCTL10重組載體為克隆重組載體。表16個疫苗候選抗原中用于多表位基因CpCTLlO合成的CTL表位預(yù)測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種微小隱孢子蟲CTL多表位融合蛋白，其特征在于，包含SEQ ID NO. 1 10所示 CTL表位序列以任意順序相互串聯(lián)形成的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小隱孢子蟲CTL多表位融合蛋白，其特征在于，所述CTL表位序列之間設(shè)有柔性氨基酸組成的接頭序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微小隱孢子蟲CTL多表位融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQ ID NO. 11所示的氨基酸序列。
4.一種微小隱孢子蟲CTL多表位基因，其特征在于，包含編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微小隱孢子蟲CTL多表位基因，其特征在于，具有編碼SEQ IDN0. 11所示氨基酸序列的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微小隱孢子蟲CTL多表位基因，其特征在于，具有SEQID NO. 12所示的核苷酸序列。
7.一種重組載體，其特征在于，包含權(quán)利要求4所述的微小隱孢子蟲CTL多表位基因。
8.一種疫苗，其特征在于，包含權(quán)利要求4所述的微小隱孢子蟲CTL多表位基因和表達(dá)載體。
9.權(quán)利要求1所述的微小隱孢子蟲CTL多表位融合蛋白在制備預(yù)防或治療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求4所述的微小隱孢子蟲CTL多表位基因在制備預(yù)防或治療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微小隱孢子蟲CTL多表位融合蛋白，其包含SEQ ID NO.1～10所示CTL表位序列以任意順序相互串聯(lián)形成的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了微小隱孢子蟲CTL多表位基因，其包含編碼上述融合蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明微小隱孢子蟲CTL多表位基因和融合蛋白，能制成亞單位疫苗和核酸疫苗，對小鼠隱孢子蟲感染具有很好的免疫保護(hù)效果，適于作為抗隱孢子蟲病的多表位疫苗。
文檔編號A61K39/002GK102219858SQ201010200509
公開日2011年10月19日 申請日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者周鵬, 李艷, 米榮升, 陳兆國, 黃燕 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所