專利名稱：含芐基黃酮木脂素用于制備治療乙肝藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及式(1)所示的黃酮木脂素或其 可藥用鹽用于制備清除乙肝e抗原、抑制HBVDNA復(fù)制、治療乙型病毒性肝炎藥物之用途，該 黃酮木脂素經(jīng)藥效學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)效抑制乙肝e抗原活性，且其抑制強(qiáng)度在低濃度20微 克/毫升下便遠(yuǎn)高于陽性對(duì)照一線用藥拉米呋啶和_干擾素，同時(shí)20微克/毫升時(shí)該化合 物還對(duì)HBV DNA顯示出大于50%的抑制率，從而可預(yù)期發(fā)展成為降低乙肝e抗原藥物、抑制 HBV DNA復(fù)制或治療乙肝病毒感染疾病的藥物。
背景技術(shù)：
乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒HBV引起的傳染病。HBV是嗜肝DNA病毒科 hepadnaviridae的一員，其形狀為直徑42納米的球形顆粒。HBV是奇特的病毒，在其它動(dòng) 物中較少有傳染性，唯有在人體或者靈長類動(dòng)物黑猩猩體內(nèi)才能得以復(fù)制。該病毒通過乙 肝病毒攜帶者和乙肝病人的血液、唾液、精液、陰道分泌物進(jìn)行傳播，具有慢性攜帶狀態(tài)。本 病在我國廣泛流行，因其有垂直傳播、水平傳播、家庭內(nèi)傳播、醫(yī)源性傳播和性傳播等多種 方式，對(duì)人群感染率高，在某些地區(qū)感染率達(dá)到35%以上。據(jù)有關(guān)資料，肝炎檢測(cè)陽性的患 者已經(jīng)達(dá)到1.89億，而應(yīng)就診未就診人數(shù)(攜帶者)將近4億，是當(dāng)前危害人民健康最嚴(yán) 重的傳染病之一。乙肝臨床表現(xiàn)多樣化，易發(fā)展為慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化，少數(shù)病人 可轉(zhuǎn)變?yōu)樵l(fā)性肝癌。乙肝e抗原HBeAg是乙肝病毒HBV內(nèi)核的結(jié)構(gòu)蛋白，在乙肝病毒繁殖時(shí)大量產(chǎn)生。 乙肝病毒HBV具有所有已知DNA病毒中最小的基因組(僅3. 2kb)，其基因主要編碼五種蛋 白(S、C、E、P、X)，其中C蛋白為病毒核心蛋白，而E蛋白是C蛋白的一部分，成為乙肝e抗 原(HBeAg)，其是已經(jīng)編碼好但未組裝到病毒顆粒中的蛋白，在病毒復(fù)制時(shí)會(huì)分泌到患者血 液中去。臨床上，通常將血清HBeAg作為HBV復(fù)制、傳染性、病情嚴(yán)重程度以及對(duì)其治療應(yīng) 答進(jìn)行評(píng)價(jià)的重要標(biāo)志物。該抗原與HBV DNA密切相關(guān)，是臨床上表達(dá)病毒復(fù)制非常實(shí)用 的血清標(biāo)志物。血清標(biāo)志物HBeAg陽性患者說明其體內(nèi)有HBV復(fù)制，故而有較高的傳染性， 患者HBeAg表達(dá)越高說明該患者傳染性越強(qiáng)。同理，抑制HBeAg的分泌和復(fù)制也是研發(fā)抗 乙肝病毒藥物中的一個(gè)重要靶標(biāo)和檢測(cè)標(biāo)的。HBeAg清除說明體內(nèi)有著持續(xù)的HBV抑制， ALT正常，組織炎癥壞死減輕，肝硬化發(fā)生的幾率降低。因此，血清HBeAg被認(rèn)為能夠反映更 為穩(wěn)定的治療效果，HBeAg血清清除標(biāo)志著患者免疫系統(tǒng)開始發(fā)揮作用。2002年，在《新英 格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表研究結(jié)果之研究者認(rèn)為對(duì)于CHB患者，如在肝硬化前獲HBeAg清除， 則其肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)生率將降低10倍。美國肝病研究協(xié)會(huì)AASLD、亞太肝臟研究協(xié)會(huì) APASL和歐洲肝臟研究協(xié)會(huì)EASL的指南中均將HBeAg血清清除作為治療終點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)之 一。所以，能夠抑制、降低HBeAg活性或表達(dá)的藥物也即屬于治療乙肝病毒感染疾病的有效 藥物。目前，對(duì)乙肝患者的用藥主要分為保肝降酶、抗病毒、抗肝纖維化和調(diào)節(jié)免疫 等數(shù)個(gè)大類。近些年來取得進(jìn)展的還是在于抗病毒藥物治療方面的研究。抗病毒是根本方法，而保肝降酶只是輔助治療，多治標(biāo)而鮮見治本。然而，目前對(duì)于病毒性乙肝臨 床上抗病毒的治療方案只能達(dá)到抑制HBV復(fù)制和繼發(fā)感染，最主要藥物仍是核苷類藥物 如拉米呋啶(3-TC)、恩替卡韋、阿德福韋(ADV)、替比夫定等，還有處于臨床試驗(yàn)期中的 emtricitabine、tenofovir、clevuding等。在我國，拉米呋啶已經(jīng)成為醫(yī)保用藥，應(yīng)用于大 批HBV患者。核苷類藥物部分優(yōu)點(diǎn)為生物利用度高，口服較安全。然而，它們雖然能有效地 控制病情，但一則售價(jià)昂貴；二則長期使用均可出現(xiàn)耐藥性，以及停藥后出現(xiàn)HBV DNA、ALT 及肝組織學(xué)的不同程度的反彈；三是長期使用核苷類藥物出現(xiàn)的較為明顯的不良作用，例 如腎臟損傷、嬰兒致畸等。最為頭痛的是病毒耐藥的出現(xiàn)大大降低了治愈率，因?yàn)楹塑疹?藥物對(duì)病毒復(fù)制是可逆的，所以對(duì)大部分患者若欲達(dá)到最大療效，療程必須在一年以上，如 此其耐藥性隨之出現(xiàn)，就達(dá)不到預(yù)期之效果。此外，核苷類藥物還有難以清除cccDNA、治療 一年后HBsAg難以陰轉(zhuǎn)等不足之處。干擾素(α、β _干擾素)以及重組干擾素類等來源于人白細(xì)胞的生物工程類抗病 毒藥物近期成為研究和治療慢性乙肝CHB熱點(diǎn)藥物，其具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重作用。 其既可通過抗病毒作用抑制病毒復(fù)制從而減輕肝臟細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少肝細(xì)胞損害，延緩 病情發(fā)展從而起到改善病人臨床癥狀和肝臟生理功能；又可以增強(qiáng)免疫作用，通過加強(qiáng)體 內(nèi)自然殺傷細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞的作用，尤其是可以促進(jìn)殺傷T細(xì)胞去殺傷被病毒感染細(xì) 胞，因此間接起到抗病毒作用。干擾素治療CHB患者獲得的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換比拉米呋啶更 為持久，2003年《消化道》雜志上一項(xiàng)研究顯示干擾素治療組HBeAg的3年復(fù)發(fā)率顯著低 于拉米呋啶組；且長效干擾素可以每周使用一次，較為方便。因此，干擾素日漸成為臨床上 用于治療慢性乙肝病毒的首選藥物之一，但其副作用和不良反應(yīng)報(bào)道較多，總有效率不高， 價(jià)格昂貴，患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)大，因而造成臨床上難以廣泛使用。抑制乙肝病毒在體內(nèi)增殖的另外一個(gè)根本環(huán)節(jié)在于抑制HBVDNA的復(fù)制。HBV DNA 水平的降低或者低于檢測(cè)水平是檢驗(yàn)抗病毒藥物的另外一把金鑰匙。所以，亞太肝臟研究 學(xué)會(huì)和歐洲肝臟研究學(xué)會(huì)均將HBV DNA檢測(cè)不到作為乙型肝炎病毒患者治療終點(diǎn)之一。我 國新藥開發(fā)指南中也將受測(cè)化合物對(duì)于HBV DNA的抑制強(qiáng)度視為必須完成的測(cè)試項(xiàng)目之 一。拉米呋啶之所以能夠成為首選核苷類藥物便是因?yàn)槠渚哂袕?qiáng)效的抑制HBV DNA復(fù)制之 活性。因此，既能抑制HBV DNA復(fù)制又能抑制HBeAg的化合物將更有希望成為治療乙肝的 創(chuàng)新性藥物。必須說明的是目前使用的抗病毒藥物其實(shí)只是病毒復(fù)制的抑制劑，并不能直接 殺滅病毒或破壞病毒體，否則就會(huì)損傷宿主細(xì)胞。這些抗病毒藥物(多為核苷類藥物)還 存在上述毒副作用大、易引起病毒基因突變、停藥后易反跳等缺點(diǎn)。因此，開發(fā)新型抗病毒 藥物是當(dāng)今藥物研發(fā)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急，其對(duì)于治療我國大量的乙肝患者和病毒攜帶者、控 制傳染源等都有著極其重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。所以，從民族民間長期使用的天然藥 物中發(fā)現(xiàn)新的非核苷類乙肝病毒抑制劑及此類能夠降低HBeAg和/或抑制HBV DNA復(fù)制的 先導(dǎo)化合物有著很大的指導(dǎo)性意義，并有著遼闊的發(fā)展前景?；诖四康?，發(fā)明人以前曾完成多項(xiàng)抗乙肝病毒天然產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)改造衍生物 的專利和文章，發(fā)現(xiàn)了多種抑制乙肝病毒e抗原HBeAg活性、或抑制HBV DNA復(fù)制的化合 物，從而說明從天然產(chǎn)物及其合成衍生物中篩選出抑制乙肝e抗原、防治乙肝病毒感染的 創(chuàng)新性藥物是可行的[參見“一類對(duì)映桉烷醇類倍半萜抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(趙
4昱、劉光明、于榮敏、李海波等；ZL 200610053827. 4) ；“2 β -羥基冬青酸抑制乙肝病毒的醫(yī) 藥用途”(李校堃、趙昱、黃可新、李海波等；ZL 200610053749. 8) ；“2 α，3 β - 二羥基-5， 11 (13)-二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(趙昱、張禮和、孫漢董、李海波等； ZL 200610053601.4)；“艾里莫芬烷內(nèi)酯抑制乙肝病毒的用途及其藥物組合物”(趙昱、李 海波、楊雷香、周長新等；ZL03153691. 3)；“一種艾里莫芬內(nèi)酯酸天然產(chǎn)物及其應(yīng)用”(趙 昱、周長新、施樹云、王曉雨等；ZL 200610053575. 5)；“一種桉烷型倍半萜酸及其用途”(趙 昱、劉光明、李海波、巫秀美等；ZL200610053579. 3)；“六棱菊屬植物提取物抑制單純皰疹 病毒及乙肝病毒的用途”(趙昱、周長新、于榮敏、白驊；CN 1989989Α) ；“1β-氧代_5， 11(13) - 二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(趙昱、李校堃、黃可新、李海波等；CN 1927197Α) ；“1 β -羥基冬青酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(趙昱、李校堃、黃可新、巫秀美 等；CN1935131Α)；“對(duì)映艾里莫芬烷酸及其抑制乙肝表面抗原的醫(yī)藥用途”(黃可 新、李校堃、...王曉雨、趙昱等；CN 101239054) ； “ 1_氧-取代苯甲?？崴峄衔?及其抑制乙肝病毒用途”(李校堃、胡利紅、...巫秀美、趙昱等；CN 101293836)；發(fā)明 人已發(fā)表之抑制HBeAg和HBV DNA等活性文章參見“In Vitro Antiviral Activity ofThree Enantiomeric Sesquiterpene Lactones from Senecio SpeciesAgainst Hepatitis B Virus”，Haibo Li (李海波)，Changxin Zhou(周長新)，...Xiumei Wu(巫 ff _ )， Yu Zhao*( MS), Antiviral Chemistry&ChemotherEipy，2005，16，277—282 ； "Evaluation of Antiviral Activityof Compounds Isolated from Ranunculus sieboldii Miq. and Ranunculussceleratus L，，,Haibo Li (李海波)，Changxin Zhou (周長 新)，· · · XiumeiWu (巫秀美)，Yu Zhao* (趙昱)，Planta Medica，2005，71 (12)，1128-1133 ； "Application of high-speed counter-current chromatographyfor the isolation of antiviral eremophilenolides from Lihulariaatroviοlacea", Shi, Shu-Yun(施 W S ) Hai-Bo (李海'波)，..· Zhao, Yu ( M S ), Biomedical Chromatography, 2008, 22 (9),985-991 ；"Purification and identification of antiviral components from Laggerapterodonta by high-speed counter-current chromatography", Shuyun Shi (施 樹云)，...Yu Zhao ( MS )等，Journal of Chromatography B，2007，859，119-124]。毋 庸置疑，繼續(xù)從天然產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)改造衍生物中尋找能夠清除HBeAg或抑制HBV DNA復(fù)制 的先導(dǎo)化合物是非常有必要性和緊迫性的，也因此被國家科技部列為新藥研制重大專項(xiàng)之在上述治療CHB藥物中，還有一類作為輔助藥物的是保肝類藥物，其臨床大量使 用之典型為存在于菊科植物水飛薊的種子中的水飛薊素。水飛薊已在臨床上廣泛應(yīng)用，在 市場(chǎng)上其商品名為Legalon 利肝隆或Flavobion 。該藥作用主要有以下幾點(diǎn)(一)抗自 由基活性水飛薊素對(duì)于由四氯化碳、半乳糖胺、醇類和其他肝毒素造成的肝損害具有保護(hù) 作用。1990年Lotteron等人報(bào)道了在小鼠肝微粒體內(nèi)，水飛薊素能減少由四氯化碳代謝弓I 起的體外脂質(zhì)過氧化及由還原型輔酶單獨(dú)引起的過氧化作用，這些都表明水飛薊素為鏈中 斷抗氧化劑或?yàn)樽杂苫宄齽?二)保護(hù)肝細(xì)胞膜通過抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)維持細(xì)胞膜 的流動(dòng)性，保護(hù)肝細(xì)胞膜。還能阻斷真菌毒素鬼筆毒環(huán)肽和α-鵝膏蕈堿等與肝細(xì)胞上特 異受體的結(jié)合，抑制其對(duì)肝細(xì)胞的攻擊及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，中斷其肝腸循環(huán)，從而增強(qiáng)肝細(xì)胞膜對(duì)于多種損害因素的抵抗力。(三)促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)和再生水飛薊賓進(jìn)入細(xì)胞后可以與 雌二醇受體結(jié)合，并使之激活，活化的受體可以增強(qiáng)肝細(xì)胞核內(nèi)RNA聚合酶1的活性，使RNA 轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，促進(jìn)酶及蛋白質(zhì)的合成，并間接促進(jìn)DNA的合成，有利于肝細(xì)胞的修復(fù)和再生。 (四)抗腫瘤作用各種活性氧能氧化鳥嘌呤形成8-羥基鳥嘌呤，造成DNA損傷，進(jìn)而引起 腫瘤，水飛薊賓作為一個(gè)有效的抗自由基物質(zhì)也顯示了預(yù)防和治療腫瘤的作用。三十多年 的臨床實(shí)驗(yàn)證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱Flora，K.等，Am. J. Gastroenterol, 1998,93,139-143 ；Sailer R. Drugs, 2001,61 (14), 2035-2063 ； Gazak5 R.等，Curr·
Med. Chem. 2007，14，315-338 ； Svagera, Ζ.等，Phytother. Res. 2003，17，524-530 ； Gazak, R.等，Bioorg. Med. Chem. 2004,12, 5677-5687 ；Varga, Ζ.等，Phytothe. Res. 2001,15, 608-612. Singh, R. P.等，Curr. Cancer Drug Tar. 2004，4，1-11)。水飛薊中黃酮木脂素水飛 薊賓含量最多，活性也最高。黃酮木脂素化合物屬于雜木質(zhì)素類，是由一分子苯丙素和一分 子黃酮結(jié)合而成的一類天然產(chǎn)物。因此，以水飛薊賓為代表的黃酮木脂素類化合物引起了 越來越多的關(guān)注，如發(fā)明人于2006-2009年間制備并報(bào)道的多個(gè)系列水飛薊賓類衍生物也 具有H著的抗氧化 舌t生(楊I(lǐng)l香，趙§等，"Design，synthesis andexamination of neuron protective properties of alkenylated and amidateddehydro-silybin derivatives", Journal of Medicinal Chemistry，2009，52 (23)，7732-7752 ；汪峰，趙昱等，“Pr印aration ofC-23esterified silybinderivatives and evaluation of their lipid peroxidation inhibitory and DNAprotective properties", Bioorganic&Medicinal Chemistry,2009, 17(17) ,6380-6389 ；楊雷香，趙昱等，“Synthesis and Antioxidant PropertiesEvaluation of Novel Si lybin Analogues，，，Journal of Enzyme Inhibitionand Medicinal Chemistry, 2006，21(4), 399-404 ；等等)。在發(fā)明人報(bào)道的這些文章中，經(jīng)發(fā)明人設(shè)計(jì)并合 成出的多個(gè)系列之A環(huán)、B環(huán)、E環(huán)和23位取代的黃酮木脂素類化合物都顯示出強(qiáng)效捕獲 DPPH自由基和超氧陰離子自由基的活性、抗氧化活性、以及保護(hù)PC12細(xì)胞的活性。但是上 述研究僅限于研究水飛薊賓類黃酮木脂素的抗氧化作用和細(xì)胞保護(hù)作用。以水飛薊賓為代表的黃酮木脂素化合物雖然具有以上所述之抗氧化療效，然而其 抗病毒治療方面幾乎未見報(bào)道，黃酮木脂素類化合物治療DNA類病毒感染尤其是其用于抗 乙肝病毒方面(包括抑制乙肝e抗原HBeAg或抑制HBV DNA復(fù)制)的新用途尚未得到有效 開發(fā)。近期(2006年)，謝軍報(bào)道了聯(lián)合應(yīng)用具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重作用的干擾素和 保肝護(hù)肝的水飛薊賓磷脂復(fù)合物治療慢性乙肝的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥對(duì)患者體內(nèi)ALT、AST 值降低比單獨(dú)用干擾素效果明顯，說明水飛薊賓磷脂復(fù)合物能加強(qiáng)干擾素的治療慢性乙肝 之作用。但是，類似的治療方案仍是將水飛薊賓等黃酮木脂素作為輔助用藥，且主要是用 于保護(hù)肝細(xì)胞膜而非直接用其實(shí)施抗病毒作用。左國營等(左國營，劉樹玲，徐貴麗，世界 華人消化雜志，2006年14卷13期，1241-1246頁)綜述了近20年來藥用植物成分體外抗 HBV活性的研究進(jìn)展，文中論及多種天然產(chǎn)物，其中并沒有報(bào)道任何黃酮木脂素類化合物具 有抗HBV活性的相關(guān)記錄。尤其是水飛薊賓類天然產(chǎn)物及其衍生物，國內(nèi)幾乎無人涉及，而 本發(fā)明對(duì)其進(jìn)行了前人未加注意的結(jié)構(gòu)改造和抗HBV活性研究。我們的目的之一是希望 發(fā)現(xiàn)能降低HBeAg或抑制HBV DNA復(fù)制的黃酮木脂素先導(dǎo)化合物，從而將其進(jìn)一步開發(fā)成 具有能清除HBeAg、或抑制HBV DNA復(fù)制治療CHB的創(chuàng)新性藥物。綜上，從黃酮木脂素中尋找抗乙肝病毒領(lǐng)域的活性化合物、也即將黃酮木脂素結(jié)構(gòu)改造使其具有抗DNA類病毒活性是一個(gè)嶄新的領(lǐng)域。從其中發(fā)現(xiàn)抑制HBeAg或抑制HBV DNA復(fù)制的先導(dǎo)化合物更是前人所未嘗試過的挑戰(zhàn)。為了探索這個(gè)領(lǐng)域，我們制備了與水飛 薊賓結(jié)構(gòu)有所差異的一種新的黃酮木脂素衍生物，也即在E環(huán)引入新的芐氧基取代基來取 代已有的甲氧基，形成了 E環(huán)上新型取代結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素二氫黃酮醇類化合物(新型黃酮木 脂素化合物)，以期發(fā)現(xiàn)超乎尋常的抑制乙肝病毒e抗原或抑制HBV DNA復(fù)制的活性乃至 先導(dǎo)化合物。經(jīng)本發(fā)明人詳細(xì)的文獻(xiàn)查閱，到目前為止，尚無有關(guān)本發(fā)明涉及的式(1)化合 物治療乙肝病毒感染性疾病和制備抗乙肝病毒藥物的報(bào)道。黃酮木脂素式(1)化合物對(duì)于 HBeAg和HBV DNA強(qiáng)效抑制均屬于意想不到的發(fā)現(xiàn)，有著極為顯著地原創(chuàng)性，據(jù)此完成本發(fā) 明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了式(1)所示的黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備降低乙 肝e抗原或抑制HBV DNA復(fù)制的治療乙型病毒性肝炎藥物中之新用途。 式(1)化合物的名稱為(士)-2-[2，3_ 二氫-3-(3_芐氧基-4-羥基苯基)-2_羥 甲基-1,4-苯并二氧六環(huán)-6]-2, 3- 二氫-3,5,7-三羥基-4H-1-苯并吡喃_4_酮。式(1)化合物可以由化學(xué)合成方法得到。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種用于降低乙肝e抗原或抑制HBV DNA復(fù)制、治 療乙型病毒性肝炎的藥物組合物，其特征為由含有治療有效量的作為活性成分的式(1)化 合物或者它的可藥用鹽和可藥用輔料組成的混合物。其藥物劑型可以是片劑、膠囊劑、注射 劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、貼片劑、皮下植埋劑、外用搽劑、口服液或軟膏劑，還可以采 用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。本發(fā)明的黃酮木脂素化合物(1)與天然產(chǎn)物水飛薊賓相比較，具有諸多結(jié)構(gòu)和物 化性質(zhì)上差異化的特征，包括其疏水性、芳香性、吉布斯自由能、氫鍵受體、電性、分子間范 德華力、以及3D構(gòu)象等特質(zhì)均與水飛薊賓有著明顯不同；且化合物(1)分子量比水飛薊賓 增大了 76個(gè)質(zhì)量單位。上述特征都決定了式(1)所示之化合物三維構(gòu)象與HBeAg或HBV DNA之3D空間結(jié)構(gòu)相結(jié)合之配體-受體結(jié)合復(fù)合物形態(tài)和結(jié)合方式都可能產(chǎn)生較大的差 別，其結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合模式、其結(jié)合自由能等均會(huì)產(chǎn)生較大的改變，因而可能在抑制HBeAg 或抑制HBV DNA復(fù)制方面有著意想不到的效果。式(1)所示的黃酮木脂素既有結(jié)構(gòu)上的獨(dú)特性，又有抗病毒作用方面研究的新穎 性，并在抗乙肝病毒活性測(cè)試中發(fā)現(xiàn)了超乎尋常的抑制乙肝e抗原的活性，有望成為降低 HBeAg或抑制HBV DNA復(fù)制及治療CHB之先導(dǎo)化合物。我們測(cè)試了該化合物對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞的生長抑制作用，同時(shí)測(cè)試了其對(duì) H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙型肝炎e抗原HBeAg及對(duì)HBV
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DNA復(fù)制的抑制活性。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中合成得到的木質(zhì)素二氫黃酮醇類 化合物即(士)-2- [2，3- 二氫-3- (3-芐氧基-4-羥基苯基)-2-羥甲基-1，4-苯并二氧六 環(huán)-6] -2，3- 二氫-3,5,7-三羥基-4H-1-苯并吡喃_4_酮對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙型 肝炎e抗原HBeAg具有極為顯著的強(qiáng)效抑制活性，其活性遠(yuǎn)超過陽性對(duì)照(也是臨床治療 乙肝病毒患者一線用藥)拉米夫啶和α-干擾素；此外，藥效學(xué)測(cè)試結(jié)果還顯示式(1)所 示之黃酮木脂素化合物對(duì)乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)的復(fù)制具有相當(dāng)強(qiáng)的抑 制作用，其在較低劑量(20微克/毫升)時(shí)對(duì)乙肝病毒HBV DNA的復(fù)制抑制活性就已經(jīng)超 過50%。屬于強(qiáng)效非核苷類抑制乙肝病毒天然產(chǎn)物；以上均說明式(1)化合物有著非常顯 著的抗HBV效果，從而可以預(yù)期作為降低乙肝e抗原或抑制HBVDNA復(fù)制、治療乙型病毒性 肝炎之先導(dǎo)化合物繼續(xù)開發(fā)。本發(fā)明有益之處在于制備了 E環(huán)上芐氧基代替甲氧基取代的水飛薊賓類黃酮木 脂素類醚，并首次發(fā)現(xiàn)此醚具有降低乙肝e抗原、抑制HBV DNA復(fù)制、防治乙肝病毒方面的 成藥潛力，為開發(fā)治療乙肝病毒創(chuàng)新藥物、開發(fā)降低乙型肝炎e抗原HBeAg或抑制HBV DNA 復(fù)制之創(chuàng)新藥物提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有潛在巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明再一 特點(diǎn)為本發(fā)明之合成起始物來源方便，合成方便。其制備方法簡單易行，原料來源方便易 得，成本低，污染小，利于節(jié)能減排條件下的大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)業(yè)化前景十分明確。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過化學(xué)合成，并通過層析手段得到該既能有效抑制乙肝e抗原 (HBeAg)的分泌又能有效抑制HBV DNA復(fù)制的一個(gè)黃酮木脂素類活性化合物，又經(jīng)質(zhì)譜和 核磁共振波譜等綜合解析推導(dǎo)出其化學(xué)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，式(1)化合物對(duì)IfepG2.2. 15 細(xì)胞的生長無明顯抑制作用，而對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙肝e抗原(HBeAg)的分泌和 HBV DNA的復(fù)制具有顯著的抑制作用，提示該化合物具有用藥安全、降低乙肝病毒e抗原及 抑制HBV DNA復(fù)制高效的特點(diǎn)。因此，根據(jù)本發(fā)明人的研究，本發(fā)明的式(1)所示之黃酮木 脂素化合物可以用于制備治療乙肝病毒感染性疾病的藥物。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面分別用式(1)化合物的制備及其對(duì) H印G2. 2. 15細(xì)胞生長抑制作用以及對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的HBeAg及HBV DNA復(fù)制之抑 制作用的試驗(yàn)結(jié)果，說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。實(shí)施例給出了式(1)化合物的部分合 成、結(jié)構(gòu)鑒定和活性數(shù)據(jù)。必須說明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的 限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1 式⑴化合物(士)-2-[2，3_ 二氫-3-(3_芐氧基-4-羥基苯基)-2_羥 甲基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6] -2，3- 二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡喃_4_酮的制備本發(fā)明用從頭合成法制備了式(1)所示之黃酮木脂素化合物，除此方法之外，還 可以用市售黃杉素和芐氧基取代之松柏醇直接進(jìn)行氧化偶聯(lián)反應(yīng)，一步生成式(1)化合 物。所用儀器與試劑包括紫外光譜用Shimadzu UV-240紫外分光光度計(jì)測(cè)定；核磁共振 氫譜1H-NMR由INOVA型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(VARIAN IN0VA-400MHz)測(cè)定(四甲基硅 醚TMS為內(nèi)標(biāo))；電噴霧質(zhì)譜ESI-MS由BrukerEsquire 3000+質(zhì)譜儀測(cè)定，柱層析用硅 膠(100-200，200-300和300-400目)以及薄層層析用硅膠GF254 (10-40目)均由青島海 洋化工廠生產(chǎn)；所用試劑均為分析純，其中石油醚沸程為60-90°C ；薄層制備層析(PTLC)用Merck公司的鋁箔硅膠板；柱色譜用葡聚糖凝膠S印hadex LH-20采用瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB 公司產(chǎn)品；反相硅膠 RP-18 采用日本 Fuji Silysia Chemical 公司 的Chromatorex產(chǎn)品；MCI為日本三菱化工公司產(chǎn)品，薄板(TLC)檢測(cè)用254nm和365nm的 紫外燈；顯色劑用碘蒸氣、10%硫酸-乙醇以及磷鉬酸溶液。1.1化合物2即3，4，2' ,4'， 6' _五甲氧甲氧基查爾酮的制備 8. 4克氫氧化鉀溶于100毫升無水甲醇中，攪拌降至室溫后加入溶解有3克2，4， 6_三甲氧甲氧基苯乙酮和2. 3克3，4_ 二甲氧甲氧基苯甲醛的20毫升甲醇溶液，于室溫 攪拌10小時(shí)，減壓蒸去溶劑，殘留物中加入50毫升水，醋酸乙酯提取，合并有機(jī)相，飽和食 鹽水洗滌，無水硫酸鈉Na2SO4干燥，過濾，濃縮得棕色殘留物，經(jīng)柱層析得黃色油狀物3. 8 克。收率77% ;Rf(石油醚/醋酸乙酯=3/1) :0. 10 ；核磁共振氫譜1H NMR (400MHz，氘代 氯仿，δ in ppm) δ :3· 36 (單峰，6Η, OCH3)，3· 47 (單峰，9Η, OCH3)，5· 14 (單峰，4Η, OCH2O)， 5. 22 (單峰，2Η, OCH2O)，5. 25 (單峰，4Η, OCH2O)，6. 58 (單峰，2Η，Η-3 ‘，5 ‘ )，6. 83 (雙峰， J = 16. 0Hz, 1Η, H- α ), 7. 16 (雙峰，J = 8. OHz, 1Η, Η-5)，7. 24 (雙雙峰，J = 2. 0,8. OHz, 1Η，Η-6)，7. 26 (雙峰，J = 16. OHz，1Η，H- β )，7. 45 (雙峰，J = 2. OHz，1Η，Η-2)；電噴霧質(zhì)譜 ESI-MS :m/z 507[M+H] +。1.2化合物3即3，4，2' ,4' ,6'-五甲氧甲氧基環(huán)氧查爾酮的制備 取1. 1步驟中得到的化合物2即3，4，2' ,4' ,6'-五甲氧甲氧基查爾酮2. 5克 溶解于60毫升甲醇中，于攪拌狀態(tài)下加入2N氫氧化鈉3毫升以及30%過氧化氫4毫升， 于室溫?cái)嚢?小時(shí)，取樣做紫外分析，UV (MeOH) λ max nm 由209，330變?yōu)?09，282，當(dāng)330nm 的吸收峰完全消失后說明反應(yīng)完全，減壓蒸去溶劑，在殘留物中加入50毫升水，醋酸乙酯 提取(3X30毫升)。合并有機(jī)相后用飽和食鹽水(40毫升)洗滌，無水硫酸鈉干燥。過濾， 濃縮得黃色油狀物2. 4克，收率88%。產(chǎn)物直接用于下一步反應(yīng)。1.3化合物4即(士)-tranS-3，5，7，3'，4'-五羥基二氫黃酮醇的制備 取1.2步驟中得到的化合物3即3，4，2'，4'，6'-五甲氧甲氧基環(huán)氧查爾酮 2. 4克溶解于60毫升甲醇和20毫升四氫呋喃的混合溶劑中，向其中滴加3毫升濃鹽酸， 于50-55°C攪拌15分鐘，減壓蒸去溶劑，醋酸乙酯提取(3X30毫升)，合并有機(jī)相后依次 用水，飽和食鹽水(各40毫升)洗滌，無水硫酸鈉干燥。過濾，濃縮，殘留物用氯仿-甲醇 (10 1)作洗脫劑，經(jīng)柱層析得到淺黃色固體1克，收率73% ;Rf (氯仿甲醇=10 1) 0. 30 ；核磁共振氫譜 1H NMR(400MHz，氘代丙酮，δ inppm) 4. 61 (雙雙峰，J = 4. 4，11. 6Hz， 1Η，Η-3)，4· 71 (雙峰，J = 4. 4Hz, 1Η，3-0Η)，5. 02(雙峰，J = 11. 6Ηζ, 1Η，Η_2)，5· 95(雙峰， J = 2. 4Ηζ，Η-6)，5· 98 (雙峰，J = 2. 4Hz, 1Η, Η_8)，6. 85-7. 07 (多重峰，3Η, Ar-H)，11· 71 (單 峰，1Η，5-0Η)；電噴霧質(zhì)譜 ESI-MS :m/z 303[M_H] +。1. 4化合物(1)的制備 在干燥氮?dú)獗Ｗo(hù)的反應(yīng)瓶中加入0.6克步驟1.3中得到的化合物4即 (±)-tranS-3，5，7，3' ,4'-五羥基二氫黃酮醇和3-芐氧基-4-羥基肉桂醇0. 75克，用 無水丙酮40毫升和無水苯120毫升溶解，于55-60°C攪拌20分鐘，再加入1. 5克碳酸銀，繼 續(xù)攪拌12小時(shí)，過濾，母液濃縮，經(jīng)柱層析得淺黃色粉末30. 8毫克，收率28%?；衔?1)即(士)-2-[2，3_ 二氫-3-(3_芐氧基-4-羥基苯基)-2_羥甲基-1， 4-苯并二氧六環(huán)-6]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4!1-1-苯并吡喃_4_酮淺黃色粉 末；C31H26Oltl ；Rf值(氯仿醋酸乙酯草酸=25 1 0. 25) :0. 15;核磁共振氫譜 1H-NMR(氘代丙酮，400MHz) δ 3. 50 (1Η，多重峰，H_23a)，3. 73 (1H，多重峰，H_23b)，4. 16 (1H, 多重峰，H-10) ,4. 68 (1H,雙峰，J = 11. 6Hz, Η_3)，4· 98 (1Η,雙峰，J = 8. OHz，H-11)， 5. 11(1H，雙峰，J= 11.6Hz，H-2)，5. 19(2H，單峰，-CH2Bn)，5. 98(1H，單峰，H_6)，6. 00 (1Η, 單峰，Η-8)，6. 93-7. 51 (11Η,多重峰，Ar-H)，11. 71 (1Η,單峰，5-0Η)；電噴霧質(zhì)譜 ESI-MS :m/ ζ 557[M-H]+。實(shí)施例2 化合物(1)對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制 作用2. 1細(xì)胞培養(yǎng)將H印G2. 2. 15細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升 鏈霉素，100微克/毫升G418的DMEM培養(yǎng)基中，置37°C，5% C02，100%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱
中培養(yǎng)。2. 2采用MTT法測(cè)定式(1)化合物對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞生長的抑制作用取對(duì)數(shù)生長期的H印G2. 2. 15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成1 X IO5個(gè)/毫升，接種 于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37°C，5% CO2,100%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小 時(shí)后加入用培養(yǎng)基稀釋的化合物(1)，濃度分別為1000微克/毫升，200微克/毫升，40微 克/毫升和8微克/毫升，每孔200微升，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，置于37°C，5% CO2,100%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加入MTT試劑10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄 去培養(yǎng)基，每孔加入DMS0200微升，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長下用酶標(biāo)儀測(cè)定OD 值。以只加培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔為對(duì)照孔。抑制率(％)=(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì) 照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。測(cè)定化合物對(duì)乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制作用取對(duì)數(shù)生長期的H印G2. 2. 15 細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成ι χ IO5/毫升，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100毫升，在 37°C,5% C02，100%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后加入用培養(yǎng)基稀釋的樣品，濃度分 別為20微克/毫升、4微克/毫升和0. 8微克/毫升，每孔200微升，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔， 置于37°C，5% C02，100%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換含相同濃度樣品的培養(yǎng)基，將 同一樣品同一濃度的換出的培養(yǎng)基等體積混勻，作為待測(cè)樣品。用ELISA試劑盒測(cè)定培養(yǎng) 基中HBeAg濃度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)為陽性對(duì)照1 (注拉米夫啶測(cè)試濃度為 100微克/毫升、20微克/毫升和4微克/毫升)；以α -干擾素為陽性對(duì)照2 (注α -干 擾素測(cè)試濃度為10000單位/毫升、5000單位/毫升和1000單位/毫升)。2. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，式(1)化合物有顯著的抑制乙型肝炎e抗原(HBeAg)的作 用。其對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞的生長無明顯抑制作用，但對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的HBeAg在 第八天時(shí)抑制活性高達(dá)84. 1%，而陽性對(duì)照1拉米呋啶在最高濃度(100微克/毫升)時(shí) 對(duì)HBeAg抑制活性為零；陽性對(duì)照2即α-干擾素在第8天最高測(cè)試濃度(10000單位/毫 升)時(shí)對(duì)HBeAg僅有16. 9%的抑制活性，化合物(1)在20微克/毫升時(shí)對(duì)HBeAg抑制活性 高于α-干擾素將近400%。表1.樣品第八天時(shí)對(duì)H印G2. 2. 15分泌的乙型肝炎e抗原抑制率 該實(shí)施例結(jié)果說明式⑴所示之黃酮木脂素化合物(士)-2-[2，3_ 二 氫-3- (3-芐氧基-4-羥基苯基)-2-羥甲基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6] -2，3- 二氫-3，5，7-三 羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙型肝炎e抗原(HBeAg)具有顯 著的抑制作用，其在20微克/毫升時(shí)對(duì)HBeAg抑制活性即已經(jīng)大于80 %，在此濃度下有84. 1 %的HBeAg活性被抑制，而陽性對(duì)照拉米呋啶在最大濃度100微克/毫升時(shí)對(duì)HBeAg 抑制活性仍為零；另外一個(gè)陽性對(duì)照一線用藥α-干擾素在最高測(cè)試濃度(10000單位/毫 升)時(shí)第8天對(duì)HBeAg僅有16.9%的抑制活性，比化合物(1)低了 4倍左右。可見該黃酮 木脂素有極為顯著的抑制乙肝病毒分泌乙肝e抗原活性，因而可預(yù)期發(fā)展為降低乙型肝炎 e抗原、控制病毒性乙型肝炎癥狀的藥物。實(shí)施例3 式(1)化合物對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸 (HBV DNA)復(fù)制的抑制作用3.1細(xì)胞培養(yǎng)方法同實(shí)施例2。3. 2采用MTT法測(cè)定式(1)所示之黃酮木脂素化合物對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞生長的抑 制作用方法同實(shí)施例2。3. 3測(cè)定式(1)所示之黃酮木脂素化合物對(duì)乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV DNA)復(fù)制的抑制作用取對(duì)數(shù)生長期的H印G2. 2. 15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成1 X IO5個(gè) /毫升，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37°C，5% CO2,100%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)24小時(shí)后加入用培養(yǎng)基稀釋的式(1)所示之黃酮木脂素化合物，濃度分別為20微 克/毫升、4微克/毫升和0. 8微克/毫升，每孔200微升，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，置于37°C， 5% C02，100%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換含相同濃度樣品的培養(yǎng)基，將同一樣品同 一濃度的換出的培養(yǎng)基等體積混勻，作為待測(cè)樣品。第8天時(shí)用HBV DNA定量PCR試劑盒 測(cè)定培養(yǎng)基中HBV DNA濃度。以拉米呋啶(3-TC)為陽性對(duì)照1 (測(cè)試濃度為100、20和4 微克/毫升)，以α-干擾素為陽性對(duì)照2 (測(cè)試濃度為10000、5000和1000單位/毫升)。3. 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，從頭合成的黃酮木脂素式(1)化合物具有強(qiáng) 效的抑制乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸復(fù)制的作用。表2樣品第8天時(shí)對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞的HBV DNA復(fù)制的抑制率 該實(shí)施例結(jié)果說明式(1)所示之黃酮木脂素化合物對(duì)乙型肝炎病毒脫氧核糖核 酸(HBV DNA)的復(fù)制具有相當(dāng)強(qiáng)的抑制作用，其在較低劑量(20微克/毫升)時(shí)對(duì)HBV DNA 的復(fù)制抑制活性就已經(jīng)超過50%。而陽性對(duì)照α-干擾素在第8天最高測(cè)試濃度(10000 單位/毫升)時(shí)對(duì)HBV DNA有38. 2 %的抑制活性，化合物(1)在20微克/毫升時(shí)對(duì)HBVDNA抑制活性高于10000單位/毫升濃度時(shí)的α _干擾素，屬于強(qiáng)效非核苷類抑制乙肝病毒 天然產(chǎn)物，值得進(jìn)一步關(guān)注和深入研究，并可預(yù)期優(yōu)化發(fā)展為抑制HBV DNA復(fù)制的藥物。
在上述說明書闡述本發(fā)明時(shí)，同時(shí)提供了實(shí)施例的目的是舉例說明本發(fā)明的實(shí)際 操作過程和本發(fā)明的意義。在進(jìn)入本發(fā)明權(quán)利要求和其等同物范圍內(nèi)時(shí)，本發(fā)明的實(shí)際應(yīng) 用包括所有一般變化、配合，或改進(jìn)。
權(quán)利要求
由式(1)所示的黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備治療乙型病毒性肝炎藥物之用途，其特征為式(1)化合物的名稱為(±) 2 [2，3 二氫 3 (3 芐氧基 4 羥基苯基) 2 羥甲基 1，4 苯并二氧六環(huán) 6] 2，3 二氫 3，5，7 三羥基 4H 1 苯并吡喃 4 酮。FSA00000134429500011.tif
2.由式(1)所示的黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備清除乙肝e抗原HBeAg藥物之用 途，其特征為 式(1)化合物的名稱為(士)-2-[2，3-二氫-3-(3-芐氧基-4-羥基苯基)-2_羥甲 基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6] -2，3- 二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡喃_4_酮。
3.由式(1)所示的黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備抑制乙型肝炎病 酸HBV DNA復(fù)制藥物之用途，其特征為 式(1)化合物的名稱為(士)-2-[2，3-二氫-3-(3-芐氧基-4-羥基苯基)-2_羥甲 基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6] -2，3- 二氫-3，5，7-三羥基-4Η-1-苯并吡喃_4_酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及含芐基黃酮木脂素用于制備治療乙肝藥物的用途，具體而言，本發(fā)明涉及一種黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備清除乙肝e抗原、抑制乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸HBV DNA復(fù)制、治療乙型病毒性肝炎的藥物之用途。該黃酮木脂素具有抑制乙肝病毒e抗原HBeAg活性，且其抑制強(qiáng)度在低濃度20微克/毫升下便遠(yuǎn)高于陽性對(duì)照一線用藥拉米呋啶和-干擾素，同時(shí)20微克/毫升時(shí)該化合物還對(duì)HBV DNA顯示出大于50％的抑制率，從而可預(yù)期用于制備清除乙肝e抗原藥物和抑制HBV DNA復(fù)制的治療乙型肝炎病毒感染疾病的藥物的用途。
文檔編號(hào)A61K31/357GK101912387SQ20101018182
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者馮玉冰, 姜皞, 巫秀美, 彭芳, 李峰, 蔣凌云, 趙昱, 郝小江 申請(qǐng)人:大理學(xué)院