專利名稱：槲皮素二聚體黃酮用于制備抗氧化藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一個(gè)槲皮素二聚體黃酮或其可 藥用鹽用于制備抗氧化劑的藥物用途。對(duì)該化合物的藥理學(xué)試驗(yàn)表明該化合物具有體外 清除超氧陰離子自由基的活性；此外，該化合物還表現(xiàn)出很強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的大鼠腎 上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用， 說明其對(duì)保護(hù)腦細(xì)胞組織抗氧化和腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥有積極作用，可以預(yù) 期用于制備該類藥物的用途。再者，該化合物還對(duì)黃嘌呤氧化酶顯示一定的抑制作用，可以 預(yù)期用于制備治療由黃嘌呤氧化酶引起的痛風(fēng)病的藥物。
背景技術(shù)：
眾多研究表明自由基與神經(jīng)系統(tǒng)疾病如老年性癡呆癥(阿茲海莫癥，AD)、帕 金森癥、腦卒中等密切相關(guān)。其原因主要與腦組織代謝特點(diǎn)有關(guān)腦組織耗氧量大，脂肪 含量高，而各種抗氧化酶的含量相對(duì)于其它組織而言偏少，因而易受自由基攻擊造成損傷 (GiIgun-Sherki,Y.等,Antioxidant therapy in acute central nervoussystem injury current state, Pharmacol. Rev.，2002，54，271-284)。因而，目前認(rèn)為自由基參與了 AD 患者的病理過程。此外，自由基還可引起β淀粉樣蛋白沉積，與細(xì)胞膜產(chǎn)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì) 胞內(nèi)氧化損傷。因此，研發(fā)腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗氧化劑是治療老年性癡呆的有效途徑之一， 從近期褪黑素(Melatonin)的風(fēng)靡可略見一斑(Green, K.N.等，Melatonin, aging, and age-related diseases -perspectives for prevention, intervention, and therapy, J. Physiol (Lond)，2002，541 (3) 1013-1023)。因此，尋找新型有效抑制腦細(xì)胞氧化損傷的 先導(dǎo)化合物或藥物既有巨大的社會(huì)效益又有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。近年來，國際醫(yī)藥界持續(xù)不斷地投入了大量的人力、物力、財(cái)力，努力尋找抗氧化 作用顯著、具有強(qiáng)效神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的抗氧化劑先導(dǎo)化合物。目前比較肯定的用于研究 老年性癡呆癥(主要是膽堿能神經(jīng)系統(tǒng))的體外細(xì)胞模型主要有3種原代培養(yǎng)的海馬、皮 層、基底前腦神經(jīng)細(xì)胞，PC12細(xì)胞和海馬HT22細(xì)胞株。本試驗(yàn)采用的PC12細(xì)胞以其在培 養(yǎng)過程中的易獲得性和細(xì)胞均一性成為神經(jīng)科學(xué)離體研究中的重要工具細(xì)胞，并用于研究 多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如老年癡呆癥、帕金森病等[王健，陳沙維，調(diào)心方對(duì)H2O2氧化損傷PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用研究，中華醫(yī)藥雜志，2004年4卷7期；崔旭等，復(fù)方益智散對(duì)PC12細(xì)胞增 值和抗凋亡作用，中華老年心腦血管雜志，2006，8 (3)，198-201 ；徐鷹等，大豆苷元對(duì)氧自由 基所致PC12細(xì)胞細(xì)胞毒作用的影響，中藥藥理與臨床，2007，5期]。此外，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論證實(shí)痛風(fēng)病的致病因素之一是黃嘌呤氧化酶(EC1. 2. 3. 2，簡 稱為X0)。此酶是體內(nèi)核酸代謝的一個(gè)重要酶，能催化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸和超氧陰 離子，若機(jī)體不能及時(shí)清除產(chǎn)生的尿酸，使尿酸結(jié)晶鹽在關(guān)節(jié)處沉積，就會(huì)引起痛風(fēng)；產(chǎn)生 過多的超氧陰離子也可引起多組織受損，因此測定化合物對(duì)XO的作用對(duì)發(fā)現(xiàn)新的XO抑制 劑和其抗氧化作用有重要意義。從天然產(chǎn)物以及其衍生物中篩選出黃嘌呤氧化酶抑制劑先 導(dǎo)化合物也是開發(fā)治療痛風(fēng)病新藥的重要任務(wù)。
槲皮素是藥用價(jià)值很高的一個(gè)天然黃酮醇類化合物，關(guān)于其抗氧化作用等藥理學(xué) 研究可參見綜述[王玉強(qiáng)等，槲皮素抗氧化作用研究，齊魯藥事，2006年25卷8期；王艷芳， 王新華等，槲皮素藥理作用研究進(jìn)展，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003年15卷2期]。然而，槲 皮素二聚體卻鮮有人研究。該黃酮二聚體是由Hirose等于1999年報(bào)道，其發(fā)現(xiàn)槲皮素在 脂質(zhì)過氧化過程中可以形成二聚體[Hirose等，Chemistry Letters，1999，8，775-776]。該 二聚體結(jié)構(gòu)比槲皮素分子量大幾乎一倍，分子中含有更多羥基等活性基團(tuán)，或許會(huì)比槲皮 素具有更強(qiáng)的保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞、抗氧化損傷的能力。至今為止，未見到該槲皮素二聚體應(yīng)用于研發(fā)清除自由基、保護(hù)PC12細(xì)胞免受氧 化損傷、以及用于制備防治腦神經(jīng)氧化受損造成的老年性癡呆癥之藥物的報(bào)道；也未見到 該二聚體化合物抑制黃嘌呤氧化酶活性制備防治由黃嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛風(fēng)病 的藥物或藥物組合物的報(bào)道。因此發(fā)明人制備了此二聚體黃酮醇并將其作為保護(hù)腦神經(jīng)細(xì) 胞、抗氧化損傷活性先導(dǎo)物測試對(duì)象，據(jù)此完成本發(fā)明。 本發(fā)明的目的是提供一種下式所示的槲皮素二聚體黃酮即化合物l，3，lla_三羥 基-9-(3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮-2)-5a-(3,4- 二羥基苯基)-5，6，11-六 氫-5，6，11-三氧-并四苯-12-酮或其可藥用鹽用于制備一種氧自由基清除劑暨抗氧化劑 藥物的用途。 具體而言，本發(fā)明的目的之一是提供了式(1)所示結(jié)構(gòu)之槲皮素二聚體黃酮或其 可藥用鹽用于制備防治由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的老年性癡呆癥藥物的用途。本發(fā)明的另一目的是提供了式(1)所示結(jié)構(gòu)之槲皮素二聚體黃酮或其可藥用鹽 用于制備防治由黃嘌呤氧化酶引起的痛風(fēng)病之藥物的用途。本發(fā)明的又一目的是提供了一種用于防治自由基引起的老年性癡呆癥以及由黃 嘌呤氧化酶引起的痛風(fēng)病藥物組合物，其中含有治療有效量的式(1)所示結(jié)構(gòu)之槲皮素二 聚體黃酮或其可藥用鹽和藥用輔料。本發(fā)明還提供了一種制備式(1)所示的槲皮素二聚體黃酮類化合物的方法，其特 征是用市售或者自制的槲皮素在無水條件下，有銀鹽催化進(jìn)行自由基偶合反應(yīng)偶聯(lián)而得。本發(fā)明的槲皮素二聚體黃酮化合物(1)與天然黃酮木脂素類化合物槲皮素相比 較，具有諸多結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)上差異化的特征，包括其疏水性、芳香性、吉布斯自由能、氫鍵 受體、電性、分子間范德華力、以及3D構(gòu)象、伸展方向、分子重心、共軛程度、電性分布中心 等特質(zhì)均與槲皮素有著明顯不同；且化合物(1)分子量比槲皮素增大了 300個(gè)質(zhì)量單位。 上述特征都決定了式(1)所示化合物之三維構(gòu)象與靶標(biāo)受體或酶之3D空間結(jié)構(gòu)相結(jié)合之 配體-受體結(jié)合復(fù)合物形態(tài)和結(jié)合方式都可能產(chǎn)生較大的差別，其結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合模式、
發(fā)明內(nèi)容其結(jié)合自由能等均會(huì)產(chǎn)生較大的改變，因而可能在清除自由基、保護(hù)PC12細(xì)胞免受氧化損 傷、抑制黃嘌呤氧化酶方面有著意想不到的效果。綜上所述，本發(fā)明涉及一個(gè)槲皮素二聚體黃酮的多種抗氧化機(jī)制藥效學(xué)活性及其 用于制備相關(guān)疾病藥物的用途。經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)該化合物具有清除超氧陰離子自由基活性和對(duì) 抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，從而可以預(yù)期發(fā)展成為能于體內(nèi)清除自由基的藥物 或藥物組合物，尤其是可以用于制備防治腦神經(jīng)氧化受損造成的老年性癡呆癥之藥物。此 外，該化合物還表現(xiàn)出一定的抑制黃嘌呤氧化酶活性，因而還可以預(yù)期進(jìn)一步開發(fā)成為治 療由黃嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛風(fēng)病的藥物或藥物組合物。本發(fā)明的有益之處在于槲皮素二聚體黃酮類衍生物具有強(qiáng)效清除自由基、對(duì)抗 自由基引起的PC12細(xì)胞損傷和黃嘌呤氧化酶抑制等藥效作用，且其活性強(qiáng)于槲皮素，顯示 該化合物可以預(yù)期應(yīng)用于制備治療新的適應(yīng)癥藥物，對(duì)于開發(fā)新的抗老年性癡呆癥和痛風(fēng) 病這兩種常見病及多發(fā)病創(chuàng)新型藥物提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有潛在的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效 益。再一特點(diǎn)是該化合物來源于天然產(chǎn)物的半合成結(jié)構(gòu)改造，制備步驟簡便，成本低，污染 小，利于大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面首先用實(shí)施例的形式說明化合物制備的過 程，實(shí)施例給出了化合物的部分物理和化學(xué)及波譜學(xué)數(shù)據(jù)，其中OEt是指乙氧基(OCH2CH3)。 必須說明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì) 對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1 化合物(1)的制備 在干燥的反應(yīng)瓶中加入343毫克槲皮素(本室自行制備，HPLC檢測純度98%)， 550毫克碳酸銀，于氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入20毫升干燥過的丙酮和60毫升無水苯溶液，在 55-60°C之間攪拌20小時(shí)。混合物靜置，濾除不溶物。母液減壓濃縮，得黃色固體。以 200 300目硅膠柱層析，以氯仿/甲醇(20 1)洗脫。得黃色固體182mg。Rf (氯仿甲 醇=10 1) = 0. 18 ；紅外 IR(KBr 壓片)CnT1 :3195，1689，1647，1588，1495 ；核磁共振氫譜 1H NMR (400MHz，氘代丙酮)6.05(雙峰，J = 2. OHz, 1H, Η_6' )，6· 10 (雙峰，J = 2. OHz, 1Η, Η-8' )，6· 28 (雙峰，J = 2. OHz, 1Η, Η_6)，6· 62 (雙峰，J = 2. OHz, 1Η, Η_8)，6· 81 (雙 峰，J = 8· 4Hz, 1Η, Η-13)，7· 16 (雙雙峰，J = 2. 4,8. 4Hz, 1Η, Η-14 ' )，7· 29 (雙峰，J = 8. OHz, 1Η, Η-13' )，7· 35 (雙峰，J = 2. 4Hz, H-IO' )，7· 96 (雙峰，J = 2. OHz, 1Η, H-10)， 8. 00(雙雙峰，J = 2.0，8.8Hz，lH，H-14)；核磁共振碳譜 13C NMR(100MHz，氘代丙酮，Sppm) 91. 4(C-3 ‘ )，94. 6 (C-8)，97. 3 (C-8 ‘ )，98.0(C_6 ‘ )，99. 3 (C—6)，100. 9 (C—4 ‘ a)，101. 6(C-2' )，104. 2(c-4a)，115. 4(C-9' )，116. 5 (C_14' )，117. 7 (C—10)，118. 2 (C—13)， 121. KC-10 ‘ )，123. 4(C-14)，126. 2(C-9 ‘ )，126. 9 (C—13)，137. 6 (C—3)，141. 8 (C—11)， 143. 0(C-12)，145. 4(C-2，C-Il ‘ )，147.6(C_12 ‘ )，157. 8 (C_8a)，160. 7 (C—8 ‘ a)， 162. 3(C-4a)，165. 1(C-5 ‘ )，165. 2(C-7)，169.2 (C-7 ‘ )，176. 7(C-4)，189. 0(C-4 ‘)；電 噴霧質(zhì)譜 ESI-MS :m/z 603[M+H] + (100)。式(1)化合物具有多種重要的生物活性，本發(fā)明通過多種藥效學(xué)試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)該化 合物抗氧自由基活性進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)其具有確切的體外清除超氧陰離子自由基的活性。 此外，該類化合物還表現(xiàn)出很強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng) 細(xì)胞的大鼠腎上嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用。說明其對(duì)保護(hù)腦神經(jīng)抗氧 化、防治老年性癡呆癥有積極作用，可以用于制備保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥藥 物的用途。此外，該化合物還被發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)效抑制黃嘌呤氧化酶活性的作用，因而可以預(yù)期 作為治療痛風(fēng)類疾病的藥物。本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備 用于治療自由基引起的老年性癡呆癥之藥物或藥物組合物。上述藥物或藥物組合物可以采 用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的抗自由基氧化劑藥物 如超氧化物歧化酶(SOD)等聯(lián)合使用，制備得到具有防御自由基引起的損害活性的抗氧化 藥物組合物，用于治療上述疾病。其也可與其他保護(hù)腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥之藥 物聯(lián)合使用，得到抗老年性癡呆藥物組合物。上述藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊 劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。本發(fā)明的式(1)化合物或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的治療痛風(fēng)病藥物如黃 嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇等聯(lián)合使用，制備得到具有治療痛風(fēng)病的藥物組合物，用于痛風(fēng) 病的臨床治療。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴 丸劑、外用搽劑等劑型。本發(fā)明中所述劑型如片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑和外用搽 劑以及其各種緩釋、控釋劑型或納米制劑都可以根據(jù)現(xiàn)已公認(rèn)的藥劑學(xué)常識(shí)經(jīng)由常規(guī)制備 而得，在這些公知知識(shí)和技術(shù)基礎(chǔ)上制備出的含有本發(fā)明權(quán)利要求化合物或其可藥用鹽的 藥物或藥物組合物之其他劑型都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面分別用藥理相關(guān)實(shí)施例的形式列舉式(1)化 合物對(duì)超氧陰離子自由基抑制作用試驗(yàn)、對(duì)雙氧水H2O2所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用試驗(yàn) 以及對(duì)黃嘌呤氧化酶XO的抑制作用試驗(yàn)之結(jié)果，說明其在制藥領(lǐng)域中的用途以及用于制 備相關(guān)抗氧化劑藥物的根據(jù)。藥理相關(guān)實(shí)施例給出了化合物的部分活性數(shù)據(jù)。同樣必須說 明，本發(fā)明列舉的這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí) 質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例2 式⑴化合物體外清除超氧陰離子自由基的活性試驗(yàn)2. 1實(shí)驗(yàn)材料與樣品2. 1. 1實(shí)驗(yàn)試劑2. 1. 1. 1 吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate, PMS)、硝基四氮唑蘭 (nitroblue tetrazolium, NBT)、菲口各嗪(ferrozine)購自 Sigma 公司；
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2. 1. 1. 2槲皮素(quercetin)由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究室實(shí)驗(yàn)室提 供(純度為99% )；2. 1. 1. 3Tris 堿，DMEM 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；2. 1. 1. 43- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2 , 5-dipheny 11etrazo 1 ium bromide (MTT)和NADH (還原型輔酶I)購自Amresco公司；2. 1. 1.5其它試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?，購自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司。2. 1. 2 儀器2. 1. 2. 1 酶標(biāo)儀=Synergy-HT 型，BIO-TEK 公司；2. 1. 2. 2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX_40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；2. 1. 2. 3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；2. 1. 2. 4超純水系統(tǒng)UPWS-I_60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；2. 1. 2. 5 除菌過濾器:Sterifil500 型，Millipore 公司；2. 1. 2. 6氣浴恒溫振蕩器THZ_C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。2. 2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1式(1)化合物清除超氧陰離子自由基能力的檢測乃使用吩嗪-N甲硫酸 4k-NADH(phenazine methosulfate-NADH) ΜΜ,^Β^ΜΜ. (nitroblue tetrazolium) 原方法檢定。2. 2. 2用3毫升含有78 μ M的NADH、50 μ M四唑氮藍(lán)和10 μ M吩嗪-N甲硫酸鹽在 PH值為8.0的16mM Tris-HCl緩沖液中產(chǎn)生出超氧陰離子自由基，對(duì)不同濃度的式(1)化 合物檢測其活性。超氧陰離子自由基和四唑氮藍(lán)反應(yīng)生成物的顏色用分光光度計(jì)在560nm 波長下監(jiān)測，槲皮素被用作陽性對(duì)照藥物。2. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見表一。表一 2.4結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，式(1)化合物具有相當(dāng)強(qiáng)效的超氧陰離子自由基清除作 用，在同一濃度下，其清除能力甚至高于槲皮素11%。結(jié)論該槲皮素二聚體屬于具有相當(dāng) 強(qiáng)效的清除超氧陰離子自由基的抗氧化物質(zhì)，可預(yù)期進(jìn)一步發(fā)展成為強(qiáng)效抗氧化損傷、抗 老年癡呆藥物。實(shí)施例3 式(1)化合物對(duì)雙氧水H2O2所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用活性試驗(yàn)3. 1實(shí)驗(yàn)材料與樣品3. 1. 1細(xì)胞大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(PC12)購自中科院上海細(xì)胞所。3. 1.2實(shí)驗(yàn)試劑:3·1·2·1 雙氧水(hydrogen peroxide，H2O2)、硝基四氮唑蘭(nitrobluetetrazolium, NBT)、菲口各嗪(ferrozine)購自 Sigma 公司；3. 1. 2. 2槲皮素(quercetin)由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究室實(shí)驗(yàn)室提 供(純度為99% )；3. 1. 2. 3Tris 堿，DMEM 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；3. 1. 2. 43- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2 , 5-dipheny 11etrazo 1 ium bromide (MTT)購自 Amresco 公司；3. 1. 2. 5小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；3. 1. 2. 6青霉素和鏈霉素由石家莊制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；3. 1. 2. 7其它試劑均為國產(chǎn)分析純，購自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司。3. 1. 3 儀器3. 1. 3. 1 酶標(biāo)儀=Synergy-HT 型，BIO-TEK 公司；3. 1. 3. 2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX_40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；3. 1. 3. 3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；3. 1. 3. 4超純水系統(tǒng)UPWS-I_60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；3. 1. 3. 5 除菌過濾器:Sterifil500 型，Millipore 公司；3. 1. 3. 6氣浴恒溫振蕩器THZ_C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；3. 1. 3. ICO2細(xì)胞培養(yǎng)箱MMM，德國公司；3. 1. 3. 8倒置顯微鏡XD_2型，重慶光電儀器有限公司。3. 2實(shí)驗(yàn)原理=H2O2是一種主要的活性自由基的前體，它可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞 的凋亡，PC12細(xì)胞(大鼠腎上嗜鉻細(xì)胞瘤)可模擬腦神經(jīng)細(xì)胞，因此常用它來作為研究藥 物與神經(jīng)細(xì)胞之間關(guān)系的模型，用MTT測細(xì)胞的存活率，如果待測化合物有清除由H2O2引起 的自由基、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，則其細(xì)胞存活率高，OD值就高；反之就低。本發(fā)明采用對(duì) 唐希燦所報(bào)道的方法(Xiaoqiu Xiao等，NeurosciLetter，1999，275 :73_76)并對(duì)之加以改 進(jìn)，用以測定化合物對(duì)PC12細(xì)胞的抗氧化損傷保護(hù)作用。3. 3細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞用含10%小牛血清，IOOU/毫升青霉素和100微克/毫升 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。3. 4實(shí)驗(yàn)方法3. 4. 1細(xì)胞毒性的測定首先用改良的MTT法測定了待測化合物對(duì)PC12細(xì)胞增殖 的作用。PC12細(xì)胞用胰酶-EDTA消化液消化，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋至8000個(gè)/毫升的密度，然后接種于96孔細(xì)胞板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)， 24小時(shí)后，分別將新配的待測的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中化合物的 最終濃度分別為16、8和4微克/毫升。72小時(shí)后，加入10微升MTT (5毫克/毫升)的生 理鹽水溶液，繼續(xù)在37°C，5% CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，棄去原液，每孔中加入 150微升二甲亞砜，振蕩溶解生成的MTT晶體甲臜，用酶標(biāo)儀在570nm波長下比色，細(xì)胞生長 抑制率計(jì)算公式如下%細(xì)胞生長抑制率=(0D溶劑對(duì)照-OD樣品)/OD溶劑對(duì)照X 100%。3. 4. 2式(1)化合物對(duì)H2O2所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的測定PC12細(xì)胞用 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10%牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素。細(xì)胞 以每孔8000個(gè)的密度加到96孔板中，在37°C，50% CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。
8用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化以及用MTT法測定細(xì)胞的存活率。細(xì)胞經(jīng)36小時(shí)的孵 育后，分別將新配的式(1)化合物的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中。作用2小時(shí) 后加入新配的H2O2 (終濃度為600 μ Μ)作用3小時(shí)，顯微鏡觀察記錄，棄去原培養(yǎng)液，加入新 的培養(yǎng)液100微升，然后加入MTT 10微升，3小時(shí)后，小心吸去培養(yǎng)液，加入150微升DMSO 溶解甲臜，于570nm處讀數(shù)。采用槲皮素為陽性對(duì)照藥物。3.4.3試驗(yàn)結(jié)果見表二。表二式(1)化合物及對(duì)照品對(duì)雙氧水損傷PC12細(xì)胞保護(hù)作用 3. 5結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，式⑴化合物具有較強(qiáng)的對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞 損傷作用，即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有明確的抗氧化損傷保護(hù)作用。而且在同一濃 度下，其保護(hù)PC12細(xì)胞免受自由基損傷能力大大強(qiáng)于陽性對(duì)照槲皮素，是相同測試濃度下 槲皮素對(duì)PC12細(xì)胞保護(hù)能力的2.1倍。實(shí)屬罕見的強(qiáng)效保護(hù)PC12細(xì)胞活性化合物。說明 該槲皮素二聚體黃酮醇屬于具有極其強(qiáng)效保護(hù)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞作用的抗氧化 物質(zhì)。測定化合物對(duì)H2O2所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可作為初步探討其保護(hù)中樞腦 神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)理之依據(jù)。故據(jù)該化合物表現(xiàn)出對(duì)雙氧水損傷所致PC12細(xì)胞的強(qiáng)效保 護(hù)作用，可以預(yù)期其對(duì)老年性癡呆癥的治療有非常積極的作用，有望進(jìn)一步開發(fā)成抗氧化 損傷、防治老年性癡呆的先導(dǎo)化合物。實(shí)施例4 式(1)化合物對(duì)黃嘌呤氧化酶XO的抑制作用試驗(yàn)4. 1實(shí)驗(yàn)材料與樣品4. 1. 1試驗(yàn)動(dòng)物SD(Sprague-daWley)大鼠于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購得。合格 證號(hào)SCXK (浙 2007-0029)。4. 1. 2實(shí)驗(yàn)試劑4. 1. 2. 1 吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate, PMS)、硝基四氮唑蘭 (nitroblue tetrazolium，NBT)、黃嘌呤、菲咯嗪(ferrozine)購自 Sigma 公司；4. 1. 2. 2Triton X-100 購自 Gibco 公司；
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4. 1. 2. 3陽性對(duì)照藥物別嘌醇，泰州美通藥業(yè)有限公司；4. 1. 2. 4磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀及其它試劑均為國產(chǎn)分析純(杭州華東試劑公 司)。4. 1. 3 儀器4. 1. 3. 1 酶標(biāo)儀=Synergy-HT 型，BIO-TEK 公司；4. 1. 3. 2立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX_40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；4. 1. 3. 3紫外分光光度計(jì)UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；4. 1. 3. 4超純水系統(tǒng)UPWS-I_60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；4. 1. 3. 5 除菌過濾器:Sterifil500 型，Millipore 公司；4. 1. 3. 6氣浴恒溫振蕩器THZ_C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；4. 1.3. 7玻璃勻漿器國產(chǎn)。4. 2實(shí)驗(yàn)方法4. 2. 1取SD大鼠，斷頭處死，迅速取出肝臟至預(yù)冷的磷酸緩沖液(100mM，pH 8. 75) 中，去除血管，剪碎后用磷酸緩沖液1 l(w/v)稀釋后在冰上直接勻漿，于-20°C保存，用前 用磷酸緩沖液(1 7)稀釋，4°C條件下離心(8000rpm/10分鐘)，取上清作為酶原。4.2.2 化合物對(duì)XO的抑制作用測定采用酶聯(lián)免疫ELISA法樣品孔中加入底物黃嘌呤(0. 1毫克 /毫升，600微升)，酶(30微升)，化合物1,3,11a-三羥基-9- (3,5,7-三羥基—4H-1-苯 并吡喃-4-酮-2)-5a-(3，4-二羥基苯基)-5，5a，6，11，Ila-六氫-5，6，11-三氧-并四 苯-12-酮用二甲亞砜溶解，用磷酸緩沖液稀釋，每孔30微升，使其終濃度為40微克/毫升、 20微克/毫升和10微克/毫升，加入硝基蘭四氮唑和吩嗪甲硫酸酯(30微升)，最后加入 Triton X-100 (0. 4%,10微升)，在37°C中水浴保溫2小時(shí)，于550nm波長下比色測定?；?合物對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制率由樣品OD值對(duì)于空白和對(duì)照OD值計(jì)算。黃嘌呤氧化酶抑制率
(% ) = [(OD 標(biāo)準(zhǔn)管_0D空白管)_(〇D樣品管_0D樣品空白管)]/(0D標(biāo)準(zhǔn)管_0D空白管)X 100%。4. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果式(1)化合物對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制率見表三。表三式(1)化合物及對(duì)照品對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制作用 4. 4 結(jié)論:陽性對(duì)照藥物別嘌醇對(duì)黃嘌呤氧化酶顯示出極高的抑制活性。式(1)化合物在 各個(gè)濃度都沒有別嘌醇得抑制活性高。但是令人欣喜的是在高濃度和低測試濃度時(shí)式 (1)化合物都顯示出比槲皮素高效的抑制黃嘌呤氧化酶的活性，其在高濃度時(shí)的抑制活性 (85.7%)已經(jīng)接近于相同濃度下別嘌醇的抑制活性(89.2%)；屬于及其強(qiáng)效的黃嘌呤氧 化酶抑制劑，且其抑制活性呈顯著的量效關(guān)系。說明該槲皮素二聚體黃酮醇類化合物具有 進(jìn)一步發(fā)展成為療效確切的黃嘌呤酶抑制劑的潛能。在上述說明書闡述本發(fā)明時(shí)，提供藥理相關(guān)實(shí)施例的目的是舉例說明本發(fā)明的實(shí) 際操作過程和本發(fā)明的意義。在進(jìn)入本發(fā)明權(quán)利要求和其等同物范圍內(nèi)時(shí)，本發(fā)明的實(shí)際 應(yīng)用包括所有一般變化、配合，或改進(jìn)。
權(quán)利要求
式(1)所示的槲皮素二聚體黃酮或其可藥用鹽在制備防治老年性癡呆癥藥物中的應(yīng)用。FSA00000134424900011.tif
2.式(I)所示的槲皮素二聚體黃酮或其可藥用鹽在制備防治痛風(fēng)病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及槲皮素二聚體黃酮用于制備抗氧化藥物的用途，具體涉及一個(gè)槲皮素二聚體黃酮類化合物用于制備防治老年性癡呆癥或痛風(fēng)病藥物的用途。藥效學(xué)試驗(yàn)證實(shí)該化合物具有強(qiáng)效清除超氧陰離子自由基、對(duì)抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用即對(duì)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用，從而可以預(yù)期發(fā)展成為保護(hù)腦神經(jīng)、防治由自由基損傷引起的老年性癡呆癥的藥物。該化合物還具有高效抑制黃嘌呤氧化酶的活性，因而可以預(yù)期其發(fā)展成為治療痛風(fēng)病的藥物。
文檔編號(hào)A61P19/06GK101912386SQ201010181800
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者宋麗艷, 巫秀美, 李海波, 白麗, 譚仁祥, 趙昱, 陳紹媛, 雷婷 申請(qǐng)人:大理學(xué)院