專利名稱：一種人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞游離表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA，特別是一種人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞游離表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
基因治療技術(shù)是隨著DNA重組技術(shù)的成熟而逐漸發(fā)展起來的，是當(dāng)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的一個(gè)新的研究領(lǐng)域?；蛑委熓峭ㄟ^一定方式將正常基因或有治療作用的DNA序列導(dǎo)入靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷而發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病的目的。自從20世紀(jì)90年代初首次成功進(jìn)行基因治療的臨床試驗(yàn)以來，迄今已完成了數(shù)千例基因治療臨床試驗(yàn)。作為一種分子藥物治療形式，基因治療為許多遺傳性和獲得性疾病提供一種新的治療方式。從早期單基因遺傳病的治療，目前已擴(kuò)展到對(duì)人類健康威脅嚴(yán)重的多基因疾病，包括遺傳病、惡性腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病，以及感染性疾病(如AIDS、乙型肝炎)等。
載體(vector)是將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞的運(yùn)載工具。基因治療載體系統(tǒng)包括病毒與非病毒兩種。目前大多數(shù)臨床基因治療仍采用轉(zhuǎn)染率較高的病毒載體，外源基因整合到宿主的染色體上，存在著潛在的致癌性、自身免疫原性和/或造成細(xì)胞病理改變等。和病毒載體相比，非病毒載體雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但其轉(zhuǎn)染效率低，持續(xù)表達(dá)時(shí)間短，大多為瞬時(shí)表達(dá)，如要穩(wěn)定持久地表達(dá)，載體必須整合到宿主細(xì)胞染色體上，載體的隨機(jī)整合會(huì)引起插入突變或?qū)е罗D(zhuǎn)基因的沉默。此外，目前所用的基因治療表達(dá)載體都包含原核質(zhì)粒的序列，如在大腸桿菌中起復(fù)制起始作用的DNA序列、在細(xì)菌中篩選陽(yáng)性克隆的抗藥性基因標(biāo)志等，這些DNA序列便于插入真核基因后能在大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組DNA克隆、并復(fù)制繁殖得到足夠使用的數(shù)量。但是這些原核質(zhì)粒序列在真核宿主細(xì)胞并不具備任何功能，并且基因治療導(dǎo)入宿主細(xì)胞后對(duì)患者存在潛在的危險(xiǎn)，如由于抗藥性抗性基因失控導(dǎo)致的隨機(jī)分布、某些未知表達(dá)信號(hào)激活等。因此，構(gòu)新型、高效、安全的基因治療表達(dá)載體，是基因治療中亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種安全性能好、效率高的人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞游離表達(dá)載體。本發(fā)明的技術(shù)方案是，其特征在于所述載體的多克隆位點(diǎn)下游和上游分別含有人源性的MAR和有治療作用的外源基因DNA片段且只含有真核表達(dá)元件的表達(dá)載體。此載體可作為基因治療的應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較具有安全性能好、效率高的顯著優(yōu)點(diǎn)。


圖1是pEGFP-Cl初始載體結(jié)構(gòu)圖，載體購(gòu)自clontech公司，其上帶有啟動(dòng)子CMV和EGFP基因。 圖2使中間載體pE麗構(gòu)建流程圖，其中MCS位點(diǎn)含有Bgl 11 、 Xho I 、 Sac I 、 Hindi 11 、EcoRI、 Pstl、 Sail (Accl)、 Kpnl(Asp7181) 、 SacII、Apal(Bspl201) 、 Xmal、 Smal、 BamHI。
圖3是游離性表達(dá)載體pEVW的構(gòu)建流程圖，其中MCS位點(diǎn)含有Bgl 11 、Xho1 、 Sacl 、
3HindlII、EcoRI、Pstl、 SalI(AccI)。 圖4是pEVWN載體的結(jié)構(gòu)圖，HindlII/SalI酶切pEVW及P-hNGF基因片段，連接，載體大小為6919bp。
具體實(shí)施例方式
pEGFP-Cl載體為人類及哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體，其上含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhance green fluorescent protein gene， EGFP)基因，EGFP基因?yàn)閳?bào)告基因，其主要作用是為了在宿主細(xì)胞中容易檢測(cè)目的基因的表達(dá)。因此本發(fā)明中首先將EGFP基因刪除，替換為一段新合成的含CMV啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn)(multiple cloning site，MCS)的DNA序列。此外，pEGFP-Cl載體含有kan/Neo篩選標(biāo)記及原核表達(dá)調(diào)控元件，這些篩選標(biāo)記及原核表達(dá)調(diào)控元件在載體的克隆、篩選具有重要作用，但基因治療導(dǎo)入宿主細(xì)胞后對(duì)患者存在潛在的危險(xiǎn)因素。因此，本發(fā)明引入了一個(gè)新的ClaI酶切位點(diǎn)，使構(gòu)建的pEVW載體具備2個(gè)相同的Clal酶切位點(diǎn)。在載體構(gòu)建、克隆完成后，利用Clal酶切位點(diǎn)酶切pEVW載體，刪除原核質(zhì)粒元件，然后用T4DNA連接酶連接，純化后用于人類的基因治療。
結(jié)合以下實(shí)施例具體說明本發(fā)明所述載體pEVW的構(gòu)建過程與應(yīng)用。
本發(fā)明實(shí)施例中所使用的質(zhì)粒載體pEGFP-Cl(質(zhì)粒圖譜如圖1所示)購(gòu)自clontech公司，所使用的菌株E.coli DH5 a購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，所使用
的試劑均為市售商品。 實(shí)施例1 :中間載體pE麗構(gòu)建 (l)PCR擴(kuò)增以下DNA片段。設(shè)計(jì)以下PCR引物Pl :5' -CTCACATGTTCTATCGATTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTG-3'(下劃線為Pcil酶切位點(diǎn)；斜體為Clal酶切位點(diǎn))，P2 :5'-TCGAGATCTGCTAGCGGATCTGACGGTTCACT-3'(下劃線為Bgl11酶切位點(diǎn))。
(2)以pEGFP-Cl為模板，PCR擴(kuò)增上述片段，PCR反應(yīng)體系為10X擴(kuò)增緩沖液10 ii 1 ， 4種dNTP混合物各200 ii mol/L，引物各50pmol，模板DNA 1 ii g， Taq DNA聚合酶5U，Mg2+1. 5mmol/L，加雙或三蒸水至100 ii 1。 PCR條件采用程序如下95 °C 3min，94。C 40s，58。C 30s，72。C 40s，30個(gè)循環(huán)，72°C 3min。 PCR產(chǎn)物1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行膠回收，用紫外分光光度計(jì)測(cè)0D260值。生物公司測(cè)序，結(jié)果擴(kuò)增出的DNA片段大小為668bp，測(cè)序結(jié)果與Genbank登錄的pEGFP-Cl的CMV啟動(dòng)子完全一致。 (2)Pcil/Bg111酶切上述合成片段及pEGFP-Cl，酶切體系如下 凝膠回收DNA片段，T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E. coliDH5 a ，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，構(gòu)
建中間載體pE麗(圖2)。 實(shí)施例2 :P-干擾素MAR的克隆及鑒定 根據(jù)Axygen血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取人外周血基因組DNA，根據(jù)GenBank報(bào)道的P -干擾素MAR (Genbank no :M83137. 1)序列設(shè)計(jì)如下引物，P1 :5' -ACT￡GTACCTCGCCACGCACAAGATCAAT-3'(下劃線為Kpnl酶切位點(diǎn))，P2 :5' -CGAGGATCCAGCGGGAACATCACTGCAAA-3'(下劃線為BamHI酶切位點(diǎn))。PCR擴(kuò)增P -干擾素MAR， PCR反應(yīng)體系為:10X擴(kuò)增緩沖液10iil，4種dNTP混合物各200iimol/L，引物各50pmol，模板DNA 1 y g，Taq DNA聚合酶5U， Mg2+1. 5mmol/L，加雙或三蒸水至100 ii 1 。
PCR條件采用程序如下95 °C 3min，94。C 40s，56。C 30s，72。C 40s，30個(gè)循環(huán)，72°C 3min。 PCR產(chǎn)物1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行膠回收，用紫外分光光度計(jì)測(cè)0D260值。生物公司測(cè)序，結(jié)果擴(kuò)增出的DNA片段大小為2200bp，測(cè)序結(jié)果與GenBank登錄的P -干擾素MAR完全一致。 實(shí)施例3 :游離性表達(dá)載體pEVW的構(gòu)建 (1)酶切反應(yīng)Kpnl/BamHI酶切P -干擾素MAR及pE麗載體，采用常規(guī)的酶切方法和瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果，凝膠回收MAR片段及pE麗線形載體。(2)目的基因與載體的連接酶切后的pEVW質(zhì)粒DNA和目的DNA按1 : 5 (摩爾比)進(jìn)行連接，反應(yīng)體系10 y L，T4DNA連接酶1 iU， 16。C過夜反應(yīng)；(3)重組載體的提取在感受態(tài)E. coliDH5 a菌中加入連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，接種在卡那霉素陽(yáng)性平皿37t:過夜，挑選單菌落，37t:搖菌300r/min過夜，采用SDS堿裂解法提取重組載體質(zhì)粒；取5 iil重組載體DNA用Kpnl/BamHI雙酶切鑒定，測(cè)序，結(jié)果證明構(gòu)建的表達(dá)載體pEVW正確。 實(shí)施例4 :人神經(jīng)生長(zhǎng)因子13亞基(13 -hNGF)基因的克隆 根據(jù)人P-hNGF基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物Pl :5 ' -GTCAAGCTTATGTCCATGTTGT-3 '(下劃線為Hindi II酶切位點(diǎn))，下游引物P2 :5' -CCTGTCGACTCAGCTCTTCTC-3'(下劃線為SalI酶切位點(diǎn))。 提取人外周血基因組DNA， PCR擴(kuò)增P -干擾素MAR， PCR反應(yīng)體系為10 X buffer10 ii 1， 4禾中dNTP混合物各200 ii mol/L，引物各50pmo1，模板DNA1 ii g， Taq DNA聚合酶5U，Mg2+1. 5mmol/L，加雙或三蒸水至100 yl。 PCR程序如下95。C預(yù)變性5min，94。C變性30s，6(TC退火30s，72t:延伸60s，30個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果片段大小正確，回收目的DNA然后送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明成功克隆出人13 -hNGF基因片段。
實(shí)施例4 :表達(dá)載體pEVWN的構(gòu)建 (1)酶切反應(yīng)對(duì)pEVW質(zhì)粒DNA和人P -hNGF基因片段分別進(jìn)行HindiII和Sail雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，回收DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)0D260值。(2)目的基因與載體的連接酶切后的pEVW質(zhì)粒DNA和人13 -hNGF基因片段按1 : 5 (摩爾比)進(jìn)行連接，反應(yīng)體系10 ii 1，T4DNA連接酶1 iil， 16。C過夜反應(yīng)；(3)重組載體的提取在感受態(tài)E. coli DH5 a菌中加入連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，接種在卡那霉素陽(yáng)性平皿37t:過夜，挑選單菌落，37t: 300r/min搖菌過夜，采用SDS堿裂解法提取重組載體質(zhì)粒；取重組載體DNA用HindiII和Sail雙酶切鑒定，測(cè)序，結(jié)果證明構(gòu)建的表達(dá)載體pEVWN正確。
實(shí)施例5 :神經(jīng)生長(zhǎng)因子游離表達(dá)載體的產(chǎn)生 上述構(gòu)建好的提取pEVWN質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliDH5 a ，過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，按常規(guī)質(zhì)粒提取方法抽提純化pEVWN質(zhì)粒，測(cè)定0D260質(zhì)粒濃度，測(cè)序鑒定產(chǎn)物正確性。Clal酶切刪除原核表達(dá)調(diào)控片段，回收真核表達(dá)盒片段，T4DNA連接酶連接，測(cè)序鑒定產(chǎn)物正確性。 實(shí)施例6 :神經(jīng)生長(zhǎng)因子游離表達(dá)載體在基因治療中的應(yīng)用 取純品質(zhì)粒配制成針劑或制成口服膠囊，用于神經(jīng)系統(tǒng)病變引起的疾病的治療。質(zhì)粒表達(dá)載體可在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子，治療各種顱腦損傷、脊髓損傷、外周神經(jīng)損傷，如骨折、創(chuàng)傷。中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血，缺氧，神經(jīng)元退行性疾病變和神經(jīng)組織移植的輔助治療。大腦功能發(fā)育不全，中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)不良，意識(shí)障礙，早老性癡呆，糖尿病性
5周圍神經(jīng)病變，化療引起的末梢神經(jīng)病變。本發(fā)明人類和哺乳動(dòng)物游離表達(dá)載體可應(yīng)用于治療各類腫瘤的藥物。
權(quán)利要求
一種人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞游離表達(dá)載體，其特征在于所述載體的多克隆位點(diǎn)下游和上游分別含有人源性的MAR和有治療作用的外源基因DNA片段且只含有真核表達(dá)元件的表達(dá)載體。
2. 權(quán)利要求1所述的一種人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞游離表達(dá)載體，其特征在于此載體可作為基因治療的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞游離表達(dá)載體。本發(fā)明涉及一種DNA。本發(fā)明的目的是提供一種安全性能好、效率高的人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞游離表達(dá)載體。本發(fā)明的技術(shù)方案是，所述載體的多克隆位點(diǎn)下游和上游分別含有人源性的MAR和有治療作用的外源基因DNA片段且只含有真核表達(dá)元件的表達(dá)載體。本發(fā)明用于基因治療。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101781662SQ20101011620
公開日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2010年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月24日
發(fā)明者井長(zhǎng)勤, 張俊河, 張秀華, 張繼紅, 李琴, 王天云, 王芳, 董衛(wèi)華 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院