專利名稱：凝血因子viii聚合物偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包含與至少一種水溶性聚合物(包括聚環(huán)氧烷，例如聚乙二醇) 相結(jié)合的凝血因子VIII (FVIII)的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。此外，本發(fā)明還涉及用于延長患有與 FVIII功能缺陷或缺乏相關(guān)的出血性疾病的哺乳動物的血液中FVIII的體內(nèi)半衰期的方 法。
背景技術(shù)：
血漿中的凝血因子VIII (FVIII)以很低的濃度循環(huán)并且非共價地結(jié)合于馮威勒 布蘭特因子(von Willebrand factor, VffF)。在止血期間，F(xiàn)VIII與VWF分開，并作為協(xié)同 因子，在鈣和磷脂或者細(xì)胞膜存在的情況下，通過提高活化速度，用于受被活化的凝血因子 IX(FIXa)調(diào)節(jié)的凝血因子X(FX)的活化。FVIII被合成為具有結(jié)構(gòu)域A1-A2-B-A3-C1-C2的大約270_330kD的單鏈前體。當(dāng) FVIII被從血漿中純化時(比如是“來源于血漿的”或者“血漿的”)，F(xiàn)VIII由重鏈(A1-A2-B) 和輕鏈(A3-C1-C2)組成。輕鏈分子量是80kD，然而由于B結(jié)構(gòu)域內(nèi)的蛋白質(zhì)水解，重鏈分 子量在90-220kD的范圍內(nèi)。FVIII也可被合成為重組蛋白質(zhì)用于出血性疾病的治療使用。已經(jīng)設(shè)計了不同的 體外試驗來確定重組體FVIlKrFVIII)作為治療藥物的潛在有效性。這些試驗?zāi)M內(nèi)源性 FVIII的體內(nèi)效果。正如體外分析所測定的那樣，F(xiàn)VIII的體外凝血酶處理導(dǎo)致它的促凝血 活性急劇增加和隨后的減少?；罨褪Щ钆c重鏈和輕鏈兩者中的特異的限制性蛋白質(zhì)水解 一致，限制性蛋白質(zhì)水解可改變FVIII中的不同結(jié)合表位的可用性，比如允許FVIII與VWF 分離并且結(jié)合至磷脂表面、或者改變與某些單克隆抗體的結(jié)合能力。FVIII的缺乏或者功能障礙與最常見的出血性疾病即甲型血友病相關(guān)。甲型血友 病的治療手段選擇是采用來源于血漿的濃縮物或者rFVIII濃縮物的替代療法。FVIII水平 低于的重癥甲型血友病患者通常采用預(yù)防性療法，目的是在給藥之間保持FVIII在 以上?？紤]到血液循環(huán)中不同的FVIII產(chǎn)物的平均半衰期，該目的通常通過每周給藥兩至 三次FVIII來實現(xiàn)。在市場上有許多濃縮物用于甲型血友病的治療。這些濃縮物之一是重組體產(chǎn)物 Advate ，其在CHO細(xì)胞中被生產(chǎn)出來，并且由巴克斯特保健公司制造。在細(xì)胞培養(yǎng)工藝、 純化、或該產(chǎn)品的最終配制中沒有加入人或動物血漿蛋白或者白蛋白。目前許多FVIII濃縮物和治療性多肽類藥物的制造商的目標(biāo)是開發(fā)下一代產(chǎn)品， 該產(chǎn)品具有增強的藥效和藥物動力學(xué)特性，同時保持所有其他的產(chǎn)品特征。治療性多肽類藥物可被蛋白水解酶快速降解并被抗體中和。這降低了它們的半衰期和循環(huán)時間，因此限制了它們的療效。已經(jīng)有研究顯示，添加可溶性聚合物或者碳水 化合物至多肽可以抑制降解并延長多肽的半衰期。例如，將多肽類藥物聚乙二醇化可保護(hù) 它們并且增強它們的藥效和藥物動力學(xué)特性(Harris J M et Chess R B, Nat Rev Drug DiscOV2003 ;2 :214-21)。聚乙二醇化方法可將聚乙二醇(PEG)的重復(fù)單元連接至多肽藥 物。分子的聚乙二醇化可以導(dǎo)致藥物對酶降解的抗性增加、體內(nèi)半衰期增加、給藥頻率降 低、免疫原性降低、物理和熱穩(wěn)定性增加、溶解性增加、液體穩(wěn)定性增加和凝聚減少。因此，比如通過聚乙二醇化，添加可溶性聚合物是提高FVIII產(chǎn)物性能的一種方 法。現(xiàn)有技術(shù)狀況已有不同的專利和專利申請記載

美國專利申請6，037，452描述了聚(環(huán)氧烷)FVIII或者FIX偶聯(lián)物，其中蛋白質(zhì) 通過所述FVIII的羰基被共價連接至聚(環(huán)氧烷)上。EP1258497B1描述了一種制備FVIII與生物相容性聚合物的偶聯(lián)物的方法。該專 利被R0stin等人的出版物(Bioconj Chem 2000 ；11 :387_96)進(jìn)行了補充。偶聯(lián)物包括被刪 除的且被單甲氧基聚乙二醇修飾的重組FVIII。偶聯(lián)物降低了 FVIII功能，并且促凝血活性 隨著修飾度的增加而快速地降低。WO 4075923A3描述了一種共聚物-FVIII分子偶聯(lián)物，其包含多個偶聯(lián)物，其中每 個偶聯(lián)物都有一至三個被共價連接至FVIII分子上的水溶性聚合物。該FVIII分子的B結(jié) 構(gòu)域已被刪除。美國專利4，970，300描述一種被修飾的FVIII，其中包含具有FVIII活性的蛋白質(zhì) 的不溶性偶聯(lián)物被共價連接至無抗原性配體。美國專利6，048，720描述了多肽和生物相容性聚合物的偶聯(lián)物。W094/15625描述了連接于聚乙二醇的FVIII，該聚乙二醇具有不超過5000道爾頓 的優(yōu)選分子量。仍需要一種含有被連接的可溶性聚合物以便延長FVIII體內(nèi)半衰期的FVIII，比 如聚乙二醇化的FVIII，如含有被偶聯(lián)的大于10000道爾頓的PEG的全長FVIII，與非聚乙 二醇化的FVIII相比，其保留了功能活性同時提供延長的體內(nèi)半衰期。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含經(jīng)由凝血因子VIII中的碳水化物部分而 偶聯(lián)至水溶性聚合物的凝血因子VIII分子。本發(fā)明還涉及其制備方法。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供一種將水溶性聚合物偶聯(lián)至FVIII中被氧化的 碳水化物部分的方法，包括在允許偶聯(lián)的條件下將被氧化的碳水化物部分與被活化的水溶 性聚合物相接觸。在一個相關(guān)的方面，所述水溶性聚合物選自下組PEG、PSA和葡聚糖。在 另一方面，所述被活化的水溶性聚合物選自下組PEG-酰胼、PSA-胼和醛活化的葡聚糖。在 本發(fā)明的另一方面，所述碳水化物部分是通過在包含NaIO4的緩沖液中溫育被氧化的。而 在另一方面，所述FVIII中被氧化的碳水化物部分位于FVIII的B結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供根據(jù)如上所述方法中的任一方法所產(chǎn)生的被 修飾的FVIII。而在另一個實施方式中，提供一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含(a)凝血因子VIII 分子；和(b)至少一個連接至所述凝血因子VIII分子的水溶性聚合物，其中所述水溶性聚 合物通過一個以上位于凝血因子VIII的B結(jié)構(gòu)域中的碳水化物部分而被連接于凝血因子VIII。在本發(fā)明的一個相關(guān)的方面，所述水溶性聚合物選自下組PEG、PSA和葡聚糖。


圖1顯示用 SDS-PAGE及隨后的免疫印跡法測定的rFVIII與PEG偶聯(lián)后的條帶變 寬和質(zhì)量增加。圖2顯示在血友病小鼠中PEG-rFVIII偶聯(lián)物與未偶聯(lián)FVIII相比的藥物動力學(xué)。 空心正方形PEGrFVIII，200IU FVIII/kg 劑量。實心菱形天然 rFVIII，200IU FVII I/kg劑量。圖3顯示通過使用不同抗FVIII抗體的SDS-PAGE進(jìn)行的聚乙二醇化位點的詳細(xì) 分析。圖4顯示凝血酶誘導(dǎo)的天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的活化和失活。圖5顯示表示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的結(jié)構(gòu)域的條帶。圖6顯示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的不同結(jié)構(gòu)域的聚乙二醇化程度。圖7顯示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的凝血酶失活速度。
具體實施例方式本發(fā)明是一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含含有至少一部分完整B結(jié)構(gòu)域的FVIII分 子，該FVIII分子連接至水溶性聚合物上，水溶性聚合物包括聚環(huán)氧烷、聚乙烯基吡咯 烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇蛘咛妓衔锶缇弁僖核?PSA)或者葡聚 糖。在本發(fā)明的一個實施方式中，水溶性聚合物是分子量大于10000道爾頓的聚乙二醇分 子。在另一個實施方式中，水溶性聚合物的分子量從大于10000道爾頓至大約125000道爾 頓，大約15000道爾頓至20000道爾頓，或者大約18000道爾頓至大約25000道爾頓。在 一個實施方式中，構(gòu)建體保留了標(biāo)準(zhǔn)的治療性FVIII產(chǎn)品的全部功能活性，并且與標(biāo)準(zhǔn)治 療性FVIII產(chǎn)品相比較，體內(nèi)半衰期得到延長。在另一個實施方式中，相對于天然凝血因 子 VIII,構(gòu)建體保留至少 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140 或 150 百分比(% )的生物活性。在一個 相關(guān)方面，構(gòu)建體和天然凝血因子VIII的生物活性通過顯色活性與FVIII抗原值的比值 (FVI11 Chr FVIII Ag)來確定。在本發(fā)明的另一個實施方式中，相對于天然凝血 因子VIII的體內(nèi)半衰期，構(gòu)建體的半衰期減少或者增加0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、 1. 2,1. 3,1. 4,1. 5、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 倍。本發(fā)明的起始物質(zhì)是FVIII，可以來源于人血漿或者通過重組工程技術(shù)產(chǎn)生，如同 在美國專利 4，757，006,5, 733，873,5, 198，349,5, 250，421,5, 919，766、EP306968 中所描述 的那樣。此處，術(shù)語“凝血因子VIII”或者“FVIII”指的是含有至少一部分完整B結(jié)構(gòu)域的 任何FVIII分子，并且可展示出與天然FVIII相關(guān)的生物活性。在本發(fā)明的一個實施方式 中，F(xiàn)VIII分子是全長凝血因子VIII。FVIII分子是蛋白質(zhì)，被能與編碼因子VIIIC的DNA 雜交的DNA序列所編碼。這種蛋白質(zhì)可以在A1-A2-B-A3-C1-C2結(jié)構(gòu)域之間或者域內(nèi)的不 同位點處含有氨基酸缺失(美國專利4，868，112)。FVIII分子也可以是天然FVIII的類似物，其 中一個以上的氨基酸殘基通過定點突變而被替代。用于本發(fā)明的FVIII分子包括全長蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的前體、蛋白質(zhì)生物活性或功 能性的亞基或片斷、它們功能性衍生物、以及如下所述的它們的變體。提及的FVIII指的是 包括這種蛋白質(zhì)的所有可能形式，并且其中FVIII的每個形式含有至少一部分或者完整的 天然B結(jié)構(gòu)域序列。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“重組凝血因子VIII”(rFVIII)可以包括任何通過重組DNA技術(shù) 獲得的異源的或者天然產(chǎn)生的rFVIII，或者它們的生物活性衍生物。在某些實施方式中，該 術(shù)語包括如上所述的蛋白質(zhì)和編碼本發(fā)明rFVIII的核酸。這種核酸包括，比如但不限于 基因、前mRNA、mRNA、多態(tài)性變體、等位基因、合成的和自然產(chǎn)生的突變體。術(shù)語rFVIII包含 的蛋白質(zhì)包括，比如但不限于上述那些蛋白質(zhì)和多肽、被上述核酸編碼的蛋白質(zhì)、種間同 源物和如下的其它多肽⑴在至少約25、約50、約100、約200、約300、約400個或者更多 個氨基酸的范圍內(nèi)(直至成熟的天然蛋白質(zhì)的406個氨基酸的全長序列)，含有的氨基酸序 列相較于此處描述的標(biāo)準(zhǔn)核酸編碼的多肽或者氨基酸序列具有約60 %、約65 %、約70 %、 約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約98%、約99%或者更大的氨基酸序列一致性；和/或(2)特異性結(jié)合抗體，比如多 克隆或者單克隆抗體，該抗體是針對包含此處描述的引用的氨基酸序列的免疫原、它的免 疫原片斷和/或它的保守修飾的變體而產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明的編碼rFVIII的聚核苷酸，包括但不限于(1)在嚴(yán)格雜交條件下可與編 碼此處描述的引用的氨基酸序列進(jìn)行特異性雜交的聚核苷酸和它的保守修飾變體；(2)在 至少約25、約50、約100、約150、約200、約250、約500、約1000個或者更多個核苷酸的范圍 內(nèi)(直至成熟蛋白質(zhì)的1218個核苷酸的全長序列)，含有的核酸序列相較于此處描述的引 用的核酸序列具有約95 %、約96 %、約97 %、約98 %、約99 %或者更高的核苷酸序列一致 性。此處使用的術(shù)語“內(nèi)源性FVIII”包括來源于準(zhǔn)備接受治療的哺乳動物的FVIII。 該術(shù)語還包括由存在于所述哺乳動物中的轉(zhuǎn)基因或者其它任何外源DNA轉(zhuǎn)錄而來的 FVIII。此處使用的“外源性FVIII”包括并非來源于所述哺乳動物的FVIII。變體(或者類似物)多肽包括插入型變體，其中一個以上氨基酸殘基被添加至本 發(fā)明的FVIII氨基酸序列中。插入可以位于蛋白質(zhì)的任一末端或者兩個末端，并且/或者 可以位于FVIII氨基酸序列的內(nèi)部區(qū)域內(nèi)。在任一末端或者兩個末端具有附加的殘基的插 入型變體，包括比如，融合蛋白質(zhì)或者包括氨基酸標(biāo)記物或者其他氨基酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。在 一個方面，F(xiàn)VIII分子可以任選地含有N-末端蛋氨酸，尤其是當(dāng)分子在細(xì)菌細(xì)胞比如大腸 桿菌(E.coli)中被重組表達(dá)時。在缺失型變體中，去除此處所描述的FVIII多肽中一個以上氨基酸殘基。缺失可 以在FVIII多肽的一個末端或者兩個末端發(fā)生，并且/或者在FVIII氨基酸序列內(nèi)去除一 個以上的殘基。因此缺失型變體包括FVIII多肽序列的所有片段。在取代型變體中，F(xiàn)VIII多肽中一個或多個氨基酸殘基被去除并且用可選 的殘基來取代。在一個方面，取代實際上是保守性的，并且這種保守性取代在本領(lǐng)域 中是已知的。可選擇地，本發(fā)明還包括那些非保守性的取代。典型的保守性取代在 Lehninger[Biochemistry,
第2 版；Worth Publishers 公司，New York(1975)，第 71-77 頁]中被描述，并且 列在下文中。保守件取代側(cè)鏈特征氨基酸 非極性(疏水性)A.脂肪族ALIVPB.芳香族FffC.含硫MD.邊緣類G非荷電的極性A.羥基STYB.酰胺NQC.巰基CD.邊緣類G帶正電(堿性)KRH帶負(fù)電(酸性)DE可選擇地，示例的保守性取代列在下文中。保守件取代II初始?xì)埢纠匀〈锉彼?A)纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸精氨酸(R)賴氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺天冬酰胺(N)谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸天冬氨酸(D)谷氨酸半胱氨酸(C)絲氨酸谷氨酰胺(Q)天冬酰胺谷氨酸(E)天冬氨酸組氨酸(H)天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸異亮氨酸(I)亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸，亮氨酸(L)異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸賴氨酸(K)精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺甲硫氨酸(M)亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸苯丙氨酸(F)亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、丙氨酸脯氨酸(P)甘氨酸絲氨酸(S)蘇氨酸蘇氨酸(T)絲氨酸色氨酸(W)酪氨酸酪氨酸(Y)色氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸纈氨酸(V)異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸“天然存在的”聚核苷酸或多肽序列典型地來自于哺乳動物，包括但不限于靈長類如人；嚙齒類如大鼠、小鼠、倉鼠；牛，豬，馬，羊或者任何哺乳動物。本發(fā)明的核酸和蛋 白質(zhì)可以是重組分子(如異源的和編碼野生型序列或者其變體的，或者非天然存在的)。 引用的聚核苷酸和多肽序列包括，比如文獻(xiàn)UniProtKB/Swiss-Prot P00451 (FA8_人)； Gitschier J等人，人凝血因子 VIII 基因的鑒定，Nature，312 (5992) 326-30 (1984) ；Vehar GH 等人，人凝血因子 VIII 的結(jié)構(gòu)，Nature，312 (5992) :337_42 (1984)；和 Thompson AR.凝 血因子VIII基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，Semin Thromb Hemost, 2003 29 ； 11-29 (2002)中 所述的(參考文獻(xiàn)全部并入本文)。 此處使用的術(shù)語“生物活性衍生物”或者“生物活性變體”包括基本上含有與所述 分子相同功能和/或生物性質(zhì)如結(jié)合性質(zhì)的、和/或相同結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)如肽主鏈或基本聚合物 單元的分子的任何衍生物或者變體。此處使用的術(shù)語“來源于血漿的FVIII”或者“血漿的”包括從哺乳動物獲得的血 液中發(fā)現(xiàn)的具有活化凝血途徑的蛋白質(zhì)的所有形式。在不同的方面，rFVIII的生產(chǎn)包括本領(lǐng)域中已知的任意方法，該方法(i)通過基 因工程技術(shù)產(chǎn)生重組DNA，(ii)通過比如但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔或者顯微注射將重組DNA 引入原核或者真核細(xì)胞，(iii)培養(yǎng)所述被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，(iv)組成性地或者誘導(dǎo)性地表達(dá) rFVIII,以及(ν)從培養(yǎng)基分離所述rFVIII或者通過收獲被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以便(vi)得到純 化的 rFVIII。在其它方面，通過在經(jīng)表征是能生產(chǎn)藥理學(xué)上可接受的rFVIII分子的合適的原 核或者真核寄主系統(tǒng)中表達(dá)來生產(chǎn)rFVIII。真核細(xì)胞的例子有哺乳動物細(xì)胞，比如CH0、 COS、HEK293、BHK、SK-Hep 和 H印G2。在另一方面，很寬范圍內(nèi)的載體可被用于制備rFVIII，它們選自真核和原核表達(dá) 載體。用于原核表達(dá)的載體的例子包括質(zhì)粒，比如但不限于，pRSET、pET和pBAD，其中用于 原核表達(dá)載體中的啟動子包括但不限于，一種以上lac、trc、trp、recA或者araBAD。用于 真核表達(dá)的例子包括(i)對于在酵母中表達(dá)，載體比如是但不限于pAO、pPIC、pYES或者 pMET，使用的啟動子比如是但不限于A0X1、GAP、GAL1或者AUGl ； (ii)對于在昆蟲細(xì)胞中表 達(dá)，載體比如是但不限于pMT、pAc5、pIB、pMIB或者pBAC，使用的啟動子比如是但不限于PH、 10、10\405、0 記24 64或者？0111 ；和(iii)對于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，載體比如是但 不限于pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3或者pBPV，并且在一個方面，載體是來源于病毒系統(tǒng)比 如但不限于牛痘病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒或者逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的載體，使用的啟動子比如 是但不限于 CMV、SV40、EF-I、UbC、RSV、ADV、BPV 禾Π β -肌動蛋白。在某些方面，可通過多種化學(xué)方法(Roberts JM等人，Advan Drug Delivery Rev2002 ；54 :459_76)中的任何一種將FVIII分子偶聯(lián)至水溶性聚合物上。比如，在一個實 施方式中，通過使用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯將PEG偶聯(lián)至蛋白質(zhì)上游離氨基基團(tuán)，使 FVIII聚乙二醇化。在另一個實施方式中，水溶性聚合物比如PEG，通過利用馬來酰亞胺的 化學(xué)性質(zhì)將PEG偶聯(lián)至游離SH基團(tuán)，或者在事先氧化后使PEG酰胼或PEG胺偶聯(lián)至FVIII 的碳水化合物部分。在另一個實施方式中，F(xiàn)VIII可被偶聯(lián)至其他的水溶性聚合物，其中水溶性聚合物 比如是聚環(huán)氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉、聚丙烯酰基嗎啉、碳水化合物或者 多糖如聚唾液酸(PSA)或者葡聚糖。水溶性聚合物的偶聯(lián)可以通過直接偶聯(lián)至蛋白質(zhì)或者經(jīng)由連接物分子來進(jìn)行?；瘜W(xué)連接物的一個例子是MBPH(4-[4馬來酰亞胺基苯基]丁酸 胼)，其包含碳水化合物選擇性的酰胼和具巰基反應(yīng)性的馬來酰亞胺基團(tuán)(Chamow等人，J Biol Chem 1992;267:15916-22)。偶聯(lián)可以通過在形成穩(wěn)定的鍵的條件下將水溶性聚合物直接偶聯(lián)(或者通過 連接物系統(tǒng)偶聯(lián))至凝血因子VIII而進(jìn)行。此外，可降解的、可釋放的、可水解的連接 物系統(tǒng)可以被用于本發(fā)明(Tsubery 等人 J Biol Chem 2004 ；279 :38118-24/Greenwald 等人，J Med Cheml999 ;42 :3657-67/Zhao 等人，Bioconj Chem 2006;17:341-51/ W02006/138572A2/US7259224B2/US7060259B2)。正如此處所討論的，本發(fā)明的一個實施方式是將被活化的水溶性聚合物偶聯(lián)至 FVIII中被氧化的碳水化合物部分。此處使用的術(shù)語“被活化的水溶性聚合物”指的是用于 與FVIII偶聯(lián)的具有活性功能性基團(tuán)的水溶性聚合物，該活性功能基團(tuán)允許水溶性聚合物 化學(xué)偶聯(lián)至連接物或者直接偶聯(lián)至FVIII (含有活性醛基)。此處使用的術(shù)語“被氧化的碳 水化合物部分”指的是含有游離醛基的FVIII，游離醛基通過氧化劑如NaIO4產(chǎn)生。在本發(fā) 明的一個方面，醛活化的葡聚糖(含有活性醛基)通過二酰胼連接物被偶聯(lián)至FVIII的醛 基。根據(jù)FVIII 的糖基化模式(Lenting 等人；Blood，92 :3983_96 (1998))，F(xiàn)VIII 通過 碳水化合物部分的偶聯(lián)應(yīng)當(dāng)很可能發(fā)生在FVIII的B結(jié)構(gòu)域。將B結(jié)構(gòu)域作為這種偶聯(lián)反 應(yīng)的目標(biāo)是期望的，因為B結(jié)構(gòu)域在FVIII的活性中不起作用。酶促糖基偶聯(lián)被描述在美 國專利 2008/00700275 中。在本發(fā)明的一個實施方式中，通過利用包含活性N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)例如 琥珀酰亞胺琥珀酸酯、琥珀酰亞胺戊二酸酯或者琥珀酰亞胺丙酸酯的聚乙二醇衍生物，經(jīng) 由賴氨酸殘基來修飾FVIII。這些衍生物在溫和條件下與FVIII中的賴氨酸殘基反應(yīng)形成 一種穩(wěn)定的酰胺鍵。在本發(fā)明的一個實施方式中，PEG衍生物的鏈長是5，000道爾頓。鏈 長是500至2000道爾頓、2000至5000道爾頓、大于5000至10000道爾頓或者大于10000 直至20000道爾頓、或者大于20000直至150000道爾頓的其他PEG衍生物，包括線性和支 鏈的結(jié)構(gòu)，被用于不同的實施方式。用于氨基聚乙二醇化的另一個方法是與PEG碳酸酯通過形成氨基甲酸乙酯鍵的 化學(xué)偶聯(lián)，或者通過還原胺化形成第二個酰胺鍵的與醛類或者酮類的反應(yīng)。在本發(fā)明中，F(xiàn)VIII分子是使用市場上可買到的PEG衍生物而被化學(xué)修飾的。這 些PEG衍生物可以具有線性或者支鏈結(jié)構(gòu)。包含NHS基團(tuán)的PEG衍生物例子列于下文中。下列PEG衍生物是購自內(nèi)科塔治療公司(NektarTherapeutics) (Huntsville, Ala.；參見 www. nektar. com/PEG 試劑目錄；Nektar Advanced PEGylation,價格表 2005-2006)的例子 mPEG-丙酸琥珀酰亞胺酯(mPEG-SPA)
權(quán)利要求
1.一種將水溶性聚合物偶聯(lián)至凝血因子VIII中被氧化的碳水化物部分的方法，其包 括在允許偶聯(lián)的條件下將所述被氧化的碳水化物部分與被活化的水溶性聚合物相接觸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶性聚合物選自下組PEG、PSA和葡聚糖。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述被活化的水溶性聚合物選自下組 PEG-酰胼、PSA-胼和醛活化的葡聚糖。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳水化物部分通過在包含NaIO4的緩沖 液中溫育被氧化。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述FVIII中被氧化的碳水化物部分位于凝 血因子VIII的B結(jié)構(gòu)域。
6.一種通過如權(quán)利要求1-5中任一項所述方法所生產(chǎn)的被修飾的凝血因子VIII。
7.一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含(a)凝血因子VIII分子；和(b)至少一個被連接于所述凝血因子VIII分子的水溶性聚合物，其中所述水溶性聚 合物經(jīng)由一個以上的位于凝血因子VIII的B結(jié)構(gòu)域的碳水化物部分而被連接于凝血因子VIIIo
8.如權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述水溶性聚合物選自下組PEG、 PSA和葡聚糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含經(jīng)由凝血因子VIII中的碳水化物部分而被偶聯(lián)至水溶性聚合物的凝血因子VIII分子，本發(fā)明還涉及其制備方法。在本發(fā)明的一個實施方式中，水溶性聚合物選自下組聚乙二醇(PEG)、多聚唾液酸(PSA)或者葡聚糖。
文檔編號A61K47/48GK102112156SQ200980130950
公開日2011年6月29日 申請日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者于爾根·西科曼, 皮特·圖雷切克 申請人:巴克斯特保健股份有限公司, 巴克斯特國際公司