專利名稱：Toll樣受體3的選擇性激動(dòng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提供一種TOLL樣受體3 (TLR3)的激動(dòng)劑，所述激動(dòng)劑用作抗感染劑 (例如，用于治療或預(yù)防由至少一種或多種細(xì)菌、原生動(dòng)物或病毒引起的感染)、抗增殖劑 (例如用于至少治療包括病毒誘導(dǎo)的癌在內(nèi)的癌)和/或免疫刺激劑(例如用于通過在使 用或不使用預(yù)防接種時(shí)刺激免疫而治療至少傳染病或癌)。本發(fā)明還提供醫(yī)學(xué)治療方法和 藥物制備方法。
背景技術(shù)：
如聚(I:C) (poly (I:C))等雙鏈RNA已被用作TLR3激動(dòng)劑。但其作為藥物的有用 性受其毒性限制。因此尋求改進(jìn)的藥物，所述改進(jìn)藥物可以通過特異性靶向TLR3、而不靶向 屬于該家族的其它受體而用作抗感染劑、抗增殖劑、和/或免疫刺激劑。例如，理想的藥物 會(huì)具有較高的治療指數(shù)(例如產(chǎn)生毒性作用的劑量除以產(chǎn)生治療作用的劑量之比，如LD5tl 除以ED5tl),以用于治療初期感染或已建立的感染、治療前癌性或癌性病況，而不會(huì)引起過度 的由TLR3介導(dǎo)的促炎性響應(yīng)。雙鏈核糖核酸(dsRNA)通過dsRNA依賴性細(xì)胞內(nèi)抗病毒防御機(jī)制(包括2 ‘， 5'-寡腺苷酸合成酶/RNA酶L和p68蛋白激酶途徑)觸發(fā)先天性免疫(例如產(chǎn)生宿主 防御)。但聚(I:C)還激活TLR3，并由此誘導(dǎo)促炎性趨化因子和細(xì)胞因子的分泌。參見 W02006/060513第3_4頁。這會(huì)引發(fā)或增強(qiáng)有害的炎癥過程，而不是選擇性激活TLR3從而 介導(dǎo)有益免疫的發(fā)展。據(jù)認(rèn)為聚(I:C)引起與以下病況相關(guān)的壞死炎癥、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng) 綜合征、感染相關(guān)的急性細(xì)胞因子風(fēng)暴和諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎性腸病等慢性自身免疫 疾病。W02006/060513教導(dǎo)使用TLR3拮抗劑作為用于各種適應(yīng)癥的藥物會(huì)是有益的。因 此，令人驚奇的是，在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)了 TLR3的選擇性激動(dòng)劑作為藥物的應(yīng)用。
來自HEMISPHERx Biopharma 的 AMPLIGEN poly(I:C12U)是特別 構(gòu)造的dsRNA，其具有抗病毒性和免疫刺激性，但展示出較低的毒性。AMPLIGEN poly (I: C12U)通過多效活性(pleiotropic activities)抑制病毒和癌細(xì)胞生長(zhǎng)如同其它 dsRNA分子那樣，其調(diào)節(jié)2' ,5'-寡腺苷酸合成酶/RNA酶L和p68蛋白激酶途徑。本發(fā)明 人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的經(jīng)特別構(gòu)造的dsRNA通過充當(dāng)TLR3的特異性激動(dòng)劑而在體內(nèi)介導(dǎo)其 效應(yīng)。令人驚奇的是，與僅對(duì)特定微生物有效的其它化學(xué)治療劑(例如，抗細(xì)菌的青霉素、 抗皰疹的碘苷和抗瘧疾的氯喹)不同，本發(fā)明教導(dǎo)指出，聚(I:Cn_14U)作為通過直接作用于 免疫系統(tǒng)而對(duì)治療細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物有效的抗微生物化學(xué)治療劑上具有廣泛應(yīng)用。施 用聚(I:Cn_14U)避免了對(duì)于聚(I:C)觀察到的副作用，例如引發(fā)或增強(qiáng)有害炎癥過程。本發(fā)明的目的在于為需要抗感染劑、抗增殖劑和/或免疫刺激劑的患者提供治療。與聚(I:C)相比，本發(fā)明特別構(gòu)造的dsRNA是TLR3的更具有選擇性的激動(dòng)劑，雖然這 兩種雙鏈RNA結(jié)構(gòu)相似。由此對(duì)選擇性TLR3激動(dòng)劑的長(zhǎng)期以來的需要得到解決。本發(fā)明 還提供了用于治療受試對(duì)象的方法和藥物(特別是涉及傳染病、細(xì)胞增殖和/或預(yù)防接種 的藥物)的制備方法。以下描述其它目的和優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明可用于治療罹患初期或已建立的微生物感染、特征在于異常細(xì)胞增殖(例 如贅生物或腫瘤)的病理性狀況的受試對(duì)象(例如，人類或動(dòng)物)，或用作免疫刺激劑以治 療受試對(duì)象的由感染、異常細(xì)胞增殖或者因自身免疫或神經(jīng)退行性變所致細(xì)胞損傷中的至 少一者引起的疾病或病況。優(yōu)選的是，所用的錯(cuò)配雙鏈核糖核酸(dsRNA)的量足以結(jié)合受 試對(duì)象免疫細(xì)胞上的TOLL樣受體3 (TLR3)?？梢杂纱擞|發(fā)先天性免疫或適應(yīng)性免疫。具體 而言，可以使用特別構(gòu)造的dsRNA來激活TLR3而不會(huì)激活諸如TLR4等其它Toll樣受體或 諸如RIG-I或mda-5等RNA解旋酶，或不會(huì)引起如采用非選擇性TLR3激動(dòng)劑聚(I:C)所看 到的過度的促炎性響應(yīng)。受試對(duì)象可以被至少一種或多種細(xì)菌、原生動(dòng)物或病毒感染。對(duì)受試對(duì)象施用由 其量足以結(jié)合TLR3的特別構(gòu)造的dsRNA組成的藥物組合物。因此與未用特別構(gòu)造的dsRNA 治療的受試對(duì)象相比，如對(duì)于恢復(fù)時(shí)間的降低、免疫提高(例如，增加的抗體滴度、淋巴細(xì) 胞增殖、受感染細(xì)胞的殺傷或自然殺傷(NK)細(xì)胞活性)、微生物分裂或生長(zhǎng)的減少或者其 任意組合所檢測(cè)，受試對(duì)象的感染得以減少或消除。優(yōu)選治療所誘導(dǎo)的免疫對(duì)微生物具有 特異性。受試對(duì)象可以罹患異常細(xì)胞增殖(例如，贅生物或腫瘤、其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞)。對(duì)受試 對(duì)象施用由其量足以結(jié)合TLR3的特別構(gòu)造的dsRNA組成的藥物組合物。因此與未用特別 構(gòu)造的dsRNA治療的受試對(duì)象的情況相比，如對(duì)于發(fā)病率或死亡率的改善、免疫的提高(例 如，增加的抗體滴度、淋巴細(xì)胞增殖、增殖細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的殺傷、NK細(xì)胞活性)、增殖細(xì)胞 或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的分裂或生長(zhǎng)的減少或者其任意組合的檢測(cè)，受試對(duì)象中的疾病得以減少或消 除?？梢栽谑茉噷?duì)象中誘導(dǎo)樹突細(xì)胞成熟。可以將能夠攝取抗原的未成熟的樹突細(xì)胞 誘導(dǎo)分化成能夠呈遞抗原和啟動(dòng)適應(yīng)性免疫響應(yīng)的更成熟的樹突細(xì)胞(例如抗原特異性T 細(xì)胞)。在從未成熟樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟樹突細(xì)胞期間，其至少可以主要組織相容性復(fù)合 物(MHC)分子、共刺激分子(costimulatory molecule)、粘附分子或趨化因子受體的細(xì)胞 表面表達(dá)的改變；抗原攝取的減少；趨化因子、細(xì)胞因子或蛋白酶分泌的增加；樹突過程的 生長(zhǎng)；其細(xì)胞骨架的重組(reorganize)；或這些方面的組合。可以誘導(dǎo)樹突細(xì)胞通過血液 或淋巴遷移到炎癥或淋巴樣組織的位點(diǎn)，從而接近微生物、贅生物或腫瘤細(xì)胞或其它轉(zhuǎn)化 細(xì)胞?？梢葬槍?duì)至少一種感染或癌對(duì)受試對(duì)象進(jìn)行預(yù)防接種。有時(shí)，可以治療例如病毒 誘導(dǎo)的癌、同時(shí)治療感染和癌。即臨接種前、接種期間或接種后即刻(例如，接種10天內(nèi))， 對(duì)受試對(duì)象施用由其量足以結(jié)合TLR3的特別構(gòu)造的dsRNA組成的藥物組合物。由此刺激 針對(duì)疫苗或樹突細(xì)胞制劑的免疫響應(yīng)。疫苗或樹突細(xì)胞制劑可以包含殺死的、固定的或減 毒的全微生物或細(xì)胞(例如增殖或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)；微生物或細(xì)胞(例如增殖或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)的裂解物或純化組分；一種或多種分離的微生物抗原(例如，天然的、化學(xué)合成的或重組產(chǎn) 生的)；或一種或多種分離的腫瘤抗原(例如，天然的、化學(xué)合成的或重組產(chǎn)生的)。原位接 種可以通過在某位點(diǎn)或朝向該位點(diǎn)的循環(huán)處的受試對(duì)象的抗原(例如，天然感染或細(xì)胞生 長(zhǎng)中產(chǎn)生的抗原、或脫落抗原(shed antigen))的生成而實(shí)現(xiàn)，并且特別構(gòu)造的dsRNA在其 上充當(dāng)佐劑?？乖蔬f細(xì)胞(例如B淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)和粘膜組織(例如胃上皮 和呼吸道上皮)是特別構(gòu)造的dsRNA的優(yōu)選體內(nèi)靶標(biāo)。可以呈遞微生物抗原或腫瘤抗原，并 且所述抗原應(yīng)該易受專一地充當(dāng)TLR3激動(dòng)劑的特別構(gòu)造的dsRNA的單獨(dú)作用的影響。微 生物、癌細(xì)胞或其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能易受由專一地充當(dāng)TLR3激動(dòng)劑的特別構(gòu)造的dsRNA激活 的特定細(xì)胞因子響應(yīng)模式的影響。優(yōu)選通過以下方式施用特別構(gòu)造的dsRNA:靜脈內(nèi)輸注； 皮內(nèi)注射、皮下注射或肌內(nèi)注射；鼻內(nèi)吸入或氣管內(nèi)吸入；或者口咽施用或舌下施用。本發(fā)明還提供了藥物的應(yīng)用和制備方法。然而，應(yīng)該注意，涉及產(chǎn)品的權(quán)利要求不 必受這些方法限制，除非在產(chǎn)品權(quán)利要求中陳述了方法的特定步驟。根據(jù)以下對(duì)具體實(shí)施方式
的描述和權(quán)利要求以及對(duì)其的概括，本發(fā)明的其它方面 將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員變得顯而易見。


圖1顯示使用5 μ g α -DEC-gag和50 μ g聚(I C)的初免-加強(qiáng)免疫提供針對(duì)痘 苗gag病毒(vaccinia gag virus)的氣道攻擊(airway challenge)的保護(hù)性免疫。(A) 平均體重減損和(B)肺中的痘苗空斑形成(plaque-forming)滴度以來自六個(gè)實(shí)驗(yàn)(BALB/c 和C57BL/6小鼠各3個(gè)(除對(duì)照Ig-p24外；BALB/c中η = 2))的攻擊后平均值士 SD表示。 使用指定疫苗以6周的間隔對(duì)小鼠進(jìn)行初免和加強(qiáng)。對(duì)另一組僅在加強(qiáng)時(shí)使用α -DEC-p24 和聚(I:C)進(jìn)行免疫。加強(qiáng)后6周 8周，使用5X104PFU痘苗-gag對(duì)小鼠在鼻內(nèi)進(jìn)行 攻擊。(C)平均體重減損和(D)肺中的痘苗空斑形成滴度以來自兩個(gè)類似實(shí)驗(yàn)之一(使用 α -DEC-p41對(duì)C57BL/6、DEC-205-/-和TLR3-/-小鼠各5只進(jìn)行免疫)的攻擊后平均值 士SD表示。加強(qiáng)后6周 8周，使用5 X IO4PFU痘苗-gag對(duì)小鼠在鼻內(nèi)進(jìn)行攻擊。圖2顯示聚(I: C12U)充當(dāng)TLR3依賴性方式的5 μ g α _DEC_p24疫苗的CD4+T細(xì) 胞免疫的佐劑。(A)對(duì)CxB6Fl小鼠腹膜內(nèi)注射ci-DEC-p24以及梯度劑量的聚(I:C)、聚 (I:C12U)或PBS的任一種，然后6周后用相同的條件進(jìn)行加強(qiáng)。加強(qiáng)后一周響應(yīng)于HIV gag pl7或p24混合物的產(chǎn)生IFN- γ的和增殖⑶3+⑶4+Τ細(xì)胞的百分比以平均值士SD表示(η =4只小鼠)。(B)在用兩次劑量的α -DEC-p24以及50 μ g聚(I C)或250 μ g聚(I C12U) 進(jìn)行免疫的野生型、TLR3-/"和MDA5-/-小鼠中由CD4+脾細(xì)胞的響應(yīng)于HIVgag p24肽的 IFN-Y分泌。圖3顯示對(duì)用α -DEC p24和聚(I C12U)進(jìn)行初免-加強(qiáng)免疫的HIV gag特異性 ⑶4+T細(xì)胞響應(yīng)進(jìn)行的表征。對(duì)C57BL/6小鼠皮下注射5 μ g的α -DEC_p24以及聚(I C12U) (2yg、10yg或50yg)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，然后6周后用相同的條件進(jìn)行加強(qiáng)。對(duì) 另一組僅在加強(qiáng)時(shí)用5 μ g的α -DEC-p24和50 μ g聚IC進(jìn)行免疫。兩周后，對(duì)響應(yīng)于HIV gag p24 肽混合物的門控(gated) CD3+ 脾 T 細(xì)胞中 IFN-γ+、TNF_ α +、IL_2+、CD4+T 細(xì)胞的 頻率進(jìn)行分析。㈧各疫苗組的產(chǎn)生IFN- y ,TNF- α或IL-2的⑶4+T細(xì)胞的總頻率。(B)通過餅示的各疫苗組中表達(dá)所有3種細(xì)胞因子的CD4+T細(xì)胞(紅色)、表達(dá)任何2種細(xì) 胞因子的⑶4+T細(xì)胞(藍(lán)色)和表達(dá)任何1種細(xì)胞因子的⑶4+T細(xì)胞(綠色)占總細(xì)胞因 子響應(yīng)的百分比。顯示出產(chǎn)生細(xì)胞因子的CD4+T細(xì)胞的總頻率。
具體實(shí)施例方式可以治療由微生物引起的感染。它們可以感染人類或動(dòng)物受試對(duì)象。感染可以是 初期感染或已建立的感染。微生物可以是細(xì)菌、原生動(dòng)物或病毒；特別是引起疾病的那些微 生物(即，病原性微生物)。這里，術(shù)語“微生物(microbe) ”和“微生物體(microorganism)，， 相互替換地使用。細(xì)菌可以是以下屬的種芽孢桿菌屬(Bacillus)(例如，炭疽芽孢桿菌 (B. anthracis)、蠟狀芽孢桿菌(B. cereus))、巴爾通氏體屬(Bartonella)(漢氏巴 爾通氏體(B. henselae))、博德特氏菌屬(Bordetella)(例如，百日咳博德特氏菌 (B. pertussis))、疏螺旋體屬(Borrelia)(例如，布氏疏螺旋體(B. burgdorferi))、布魯氏 菌屬(Brucella)(例如，流產(chǎn)布魯氏菌(B. abortus))、彎曲桿菌屬(Campylobacter)(例如， 空腸彎曲桿菌(C. jejuni))、衣原體屬(Chlamydia)(例如，肺炎衣原體(C. pneumoniae))、 梭菌屬(Clostridium)(例如，肉毒梭菌(C. botulinum)、艱難梭菌(C. difficile)、產(chǎn)
^II (C. perfringens) ,iRi^H^M (C. tetani))、_木干胃M (Corynbacterium) (例如，無枝菌酸棒桿菌(C. amycolatum)、白喉棒桿菌(C. diphtheriae))、埃希氏菌 屬(Escherichia)(例如，大腸埃希氏菌(E. coli 0175:H7))、嗜血菌屬(Haemophilus) (例如，流感嗜血菌(H. influenzae))、螺桿菌屬(Heliobacter)(例如，幽門螺桿菌 (H. pylori))、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)(肺炎克雷伯氏菌(K pneumoniae))、軍團(tuán)菌 屬(Legionella)(例如，嗜肺軍團(tuán)菌(L. pneumophila))、利斯特氏菌屬(Listeria)(例 如，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(L. monocytogenes))、分枝桿菌屬(Mycobacterium)(例如， 鳥分枝桿菌(M. avium)、牛分枝桿菌(M. bows)、布蘭德里分枝桿菌(M. branderi)、麻風(fēng)分 枝桿菌(M. 1印rae)、結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis))、支原體屬(Mycoplasma)(例如， 生殖支原體(M. genitalium)、肺炎支原體(M. pneumoniae))、奈瑟氏球菌屬(Neisseria) (例如，淋病奈瑟氏球菌(N. gonorrheae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis))、肺孢 子蟲屬(Pneumocystis)(例如，卡氏肺孢子蟲(P. carinii))、假單胞菌屬Pseudomonas) (銅綠假單胞菌(P. aeruginosa))、立克次氏體屬(Rickettsia)(例如，立氏立克次氏體 (R. rickettsis)、斑疹傷寒立克次氏體(R. typhi))、沙門氏菌屬(Salmonella)(例如，腸沙 門氏菌(S. enterica))、志賀氏菌屬(Shigella)(例如，痢疾志賀氏菌(S. dysenteriae))、 葡萄球菌屬(Staphylococcus)(例如，金黃色葡萄球菌(S. aureus)、表皮葡萄球菌 (S.印idermidis))、鏈球菌屬(Stiptococcus)(例如，肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)、釀膿 鏈球菌(S. pyogenes))、密螺旋體屬(Tr印onema)(例如，蒼白密螺旋體(T. pallidum))、弧 菌屬(Vibrio)(例如，霍亂弧菌(V. cholerae)、創(chuàng)傷弧菌(V. vulnificus))或耶爾森氏菌屬 (Yersinia)(例如，鼠疫耶爾森氏菌(V. pestis))。這些細(xì)菌包括革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽 性菌、衣原體、螺旋菌、分枝桿菌和支原體。原生動(dòng)物可以是以下屬的種隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)(例如，人隱孢子蟲 (C.hominis)、微小隱孢子蟲(C.parvum))、內(nèi)阿米巴屬(Entamoeba)(例如，溶組織內(nèi)阿米巴(E. histolytica))、賈第鞭毛蟲屬(Giardia)(例如，腸賈第鞭毛蟲(G. intestinalis)、 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(G. Iamblia))、利什曼原蟲屬(Leishmania)(例如，亞馬遜利什曼原蟲 (L. amazonensis)、巴西利什曼原蟲(L. brasiliensi)、杜氏利什曼原蟲(L. donovani)、墨 西哥利什曼原蟲(L.mexicana)、熱帶利什曼原蟲(L. tropica))、瘧原蟲屬(Plasmodium) (例如，惡性瘧原蟲(P. falciparum)、問日瘧原蟲(P. vivax))、弓形蟲屬(Toxoplasma)(例 如，剛地弓形蟲(T. gondii))、或錐蟲屬(Trypanosoma)(例如，布氏錐蟲(T. bruci)、克氏錐 蟲(T. cruzi)) ο病毒可以是感染人類和動(dòng)物的DNA或RNA病毒。DNA病毒包括屬于以下 科的病毒腺病毒科(Adenoviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、乳頭瘤病毒科 (Papillomaviridae)、多瘤病毒科(Polyomavirididae)和痘病毒科(Poxviridae)(第 I 組 雙鏈DNA病毒)；細(xì)小病毒科(Parvoviridae)(第II組單鏈DNA病毒)。RNA病毒包括屬 于以下科的病毒雙核糖核酸病毒科(Birnaviridae)和呼腸孤病毒科(Reoviridae)(第 III組雙鏈RNA病毒)；動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)、星狀病毒科(Astroviridae)、杯狀 病毒科(Caliciviridae)、肝炎病毒科(Hepeviridae)和桿狀套病毒科(Roniviridae)(第 IV組正單鏈RNA病毒)；和沙粒病毒科(Arenaviridae)、博爾納病毒科(Bornaviridae)、布 尼亞病毒禾斗(Bunyaviridae)、纖絲病毒禾斗(Filoviridae)、苜Ij粘病毒禾斗(Paramyxoviridae) 和彈狀病毒科(Rhabdoviridae)(第V組負(fù)單鏈RNA病毒)。還已知特別構(gòu)造的雙鏈核 糖核酸(dsRNA)能治療由來自皰疹病毒科(Herpesviridae)的DNA病毒以及來自黃病毒 禾斗(Flaviviridae)、月干 DNA 病毒禾斗(Hepadnaviridae)、正粘病毒禾斗(Orthomyxoviridae)、 小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)和披膜病毒科 (Togaviridae)的RNA病毒引起的感染；這些科的病毒可以包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，也可以 不包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。經(jīng)歷異常增殖的受試對(duì)象的細(xì)胞可以是贅生物或腫瘤(例如癌、肉瘤、白血病、淋 巴瘤)，特別是由腫瘤病毒(例如，攜帶轉(zhuǎn)化基因或癌基因的DNA病毒或RNA病毒)轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞或是被與癌相關(guān)的病毒感染的細(xì)胞。例如，Epstein-Barr病毒(EBV)與鼻咽癌、霍奇金 氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和其它B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)；人類乙型肝炎和丙型肝炎病毒(HBV 和HCV)與肝癌相關(guān)；人類皰疹病毒8 (HHV8)與卡波西肉瘤相關(guān)；人類乳頭瘤病毒(例如， HPV6、HPVll、HPV16、HPV18或其組合)與子宮頸癌、肛門癌和生殖器疣相關(guān)；嗜人T淋巴細(xì) 胞病毒(human T-Iymphotrophic virus，HTLV)與T細(xì)胞白血病或淋巴瘤相關(guān)。癌包括源自 以下器官系統(tǒng)的癌胃腸器官系統(tǒng)(例如，食道、結(jié)腸、小腸、回腸、直腸、肛門、肝、胰、胃)、 泌尿生殖器官系統(tǒng)(例如，膀胱、腎、前列腺)、肌肉骨骼器官系統(tǒng)、神經(jīng)器官系統(tǒng)、肺器官系 統(tǒng)(例如肺)或生殖器官系統(tǒng)(子宮頸、卵巢、睪丸)。聚(核糖肌苷)會(huì)與聚((核糖胞嘧啶)12尿嘧啶)部分雜交，并且能夠表示為 rIn*r(C12U)n。其它的可以使用的特別構(gòu)造的dsRNA基于選白聚(CnU)和聚(CnG)(其中η 為4 29的整數(shù))的共聚核苷酸，或是聚核糖肌苷酸和聚核糖胞苷酸的復(fù)合物的錯(cuò)配類 似物，其通過對(duì)!·〖,！·(；進(jìn)行修飾以便沿聚核糖胞苷酸(rCn)鏈并入未配對(duì)堿基(尿嘧啶 或鳥嘌呤)而形成。作為另一種選擇，錯(cuò)配dsRNA可以通過對(duì)聚核糖肌苷酸(rln)的核糖 基主鏈進(jìn)行修飾(例如通過包括進(jìn)2' -O-甲基核糖基殘基)而從r(I) T(C) dsRNA衍 生。錯(cuò)配dsRNA可以與諸如賴氨酸纖維素等穩(wěn)定RNA的聚合物配合。在rln 這些錯(cuò)配類似物中，優(yōu)選的錯(cuò)配類似物具有通式rln .r(C11-14U)n,并描述于美國(guó)專利4，024，222和 4，130，641中；通過參考將其并入。其中描述的dsRNA通常適于本發(fā)明的應(yīng)用。也見美國(guó) 專利 5，258，369?？梢砸匀魏魏线m的局部或系統(tǒng)途徑施用特別構(gòu)造的dsRNA，所述局部或系統(tǒng)途徑 包括經(jīng)腸施用(例如，口服、飼管、灌腸)、局部施用(例如，作用于上皮(印icutaneously) 的貼劑、作用于直腸或陰道的栓劑)和胃腸外施用(例如，透皮貼劑；皮下注射、靜脈內(nèi)注 射、肌肉內(nèi)注射、皮內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射；頰部施用、舌下施用或透粘膜施用；鼻內(nèi)或氣管 內(nèi)吸入或滴注)?？梢詫⒑怂嵛⒎刍杂糜谖耄芙庥谳d體(例如，無菌緩沖鹽水或水) 以用于注射或滴注，或包封于脂質(zhì)體或其它載劑以用于定向輸送。優(yōu)選的是可以將核酸靶 向位于抗原呈遞細(xì)胞或上皮上的TLR3受體的載劑。例如，未成熟樹突細(xì)胞可以與皮膚、粘 膜或淋巴樣組織接觸。可以理解，優(yōu)選途徑可能根據(jù)受試對(duì)象的狀況和年齡、感染性疾病或 贅生性疾病的性質(zhì)以及所選擇的活性成分而有所不同。所述核酸的推薦劑量取決于治療病毒性感染或負(fù)荷腫瘤期間受試對(duì)象的臨床狀 態(tài)和醫(yī)師或獸醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)。可以將特別構(gòu)造的dsRNA以約200mg 約400mg的劑量通過靜 脈內(nèi)輸注對(duì)70kg的受試對(duì)象以每周兩次的方案施用，但劑量和/或頻率可以由醫(yī)師或獸醫(yī) 師根據(jù)受試對(duì)象的狀況而改變。表達(dá)TLR3的細(xì)胞或組織是所述核酸優(yōu)選的輸送位點(diǎn)，特別 是抗原呈遞細(xì)胞(例如，樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)和內(nèi)皮(例如，呼吸系統(tǒng)和胃系統(tǒng))。特別 構(gòu)造的dsRNA的影響可以通過TLR3基因突變(例如，缺失)、其表達(dá)的下調(diào)(例如，siRNA)、 與TLR3配體結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)劑(例如，中和抗體)或受體拮抗劑的結(jié)合、或TLR3信號(hào)傳導(dǎo) 途徑的下游成分(例如，MyD88或TRIF)的干擾而受到抑制或阻斷。AMPLIGEN poly (I C12U)為剖析TLR3激活對(duì)免疫系統(tǒng)的影響提供了此前未 獲得的選擇性試劑。諸如TLR適體MyD88和TRIF等其它試劑分別通過所有TLR或TLR3/ TLR4介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)。因此，通過MyD88或TRIF的信號(hào)傳導(dǎo)的激活或抑制不會(huì)將生物學(xué) 效應(yīng)限制于由TLR3介導(dǎo)的那些效應(yīng)。由于TLR3的存在和其信號(hào)傳導(dǎo)是AMPLIGEN poly(I:C12U)充當(dāng)受體激動(dòng)劑的必要條件，可以在施用該激活劑之前，檢測(cè)受試對(duì)象的細(xì)胞 或組織中的TLR3突變的缺乏、TLR3蛋白的存在、無損的TLR3介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)或其任何組合。 可以在施用所述激動(dòng)劑之前、期間或之后進(jìn)行TLR3活性的這種確認(rèn)。所述激動(dòng)劑可用于將 免疫響應(yīng)限制于激活TLR3而不激活其它Toll樣受體或RNA解旋酶。例如，異常細(xì)胞因子 (例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12)的產(chǎn)生或共刺激分子(例如， CD80、CD83、CD86)的信號(hào)傳導(dǎo)可以由微生物引起的感染、異常細(xì)胞增殖、自身免疫損傷或神 經(jīng)退行性變中的至少一者引起?？梢酝ㄟ^使用聚(I:C12U)作為TLR3的特異性激動(dòng)劑來對(duì) 這種異常進(jìn)行再調(diào)節(jié)?？梢酝ㄟ^抗原(或其肽類似物)與配體(或受體)的綴合改進(jìn)抗原 呈遞，所述配體(或受體)特異性地結(jié)合到一種或多種抗原呈遞細(xì)胞的細(xì)胞表面(特別是 內(nèi)體-吞噬體內(nèi)化途徑(internalizing pathway)的成分)。所述特異性結(jié)合分子可以是 細(xì)胞表面分子的抗體或其衍生物(例如，F(xiàn)ab、scFv)。實(shí)施例實(shí)施例1人類受試對(duì)象通過帶知情同意書招募人類患者，并由研究負(fù)責(zé)人選擇作為用于進(jìn)行額外的血清細(xì)胞因子水平和樹突細(xì)胞成熟標(biāo)記物表達(dá)的分析的潛在志愿者。患者可以是新參加者，或 是重新開始聚(I:C12U)治療者。免疫調(diào)查組的表現(xiàn)我們的免疫調(diào)查組(Immune Panel)由細(xì)胞因子血清水平(干擾素、TNF-α、IL_6、 IL-10、IL-12)和血細(xì)胞上的免疫標(biāo)記物(⑶80、⑶83、⑶86)的測(cè)定組成。對(duì)于同意這些測(cè) 定的患者，在起始輸注200mg聚(I = C12U)和隨后輸注400mg聚(I = C12U)之前以及在輸注后 4士 1/2小時(shí)、24士2小時(shí)和72士2小時(shí)，從新參加的受試對(duì)象和重新開始聚(I = C12U)輸注的 受試對(duì)象收集血液樣品。選擇指定的收集時(shí)間以包含聚(I:C12U)輸注之間的時(shí)間點(diǎn)。對(duì)這 些樣品進(jìn)行免疫調(diào)查。對(duì)于細(xì)胞因子分析，將來自血液樣品的血清在-70°C冷凍，然后在冷 凍狀態(tài)從研究地點(diǎn)運(yùn)輸?shù)紿emispherx Biopharma, Inc. (New Brunswick，NJ)。還將肝素化 全血樣品在常溫從研究地點(diǎn)過夜運(yùn)送，以由Celldex Therapeutics, Inc. (Phillipsburg, NJ)進(jìn)行⑶80、⑶83和⑶86的流式細(xì)胞分析。使用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)試劑盒根據(jù)制造商說明測(cè)定干擾素(IFN-α、 IFN-β、IFN- γ )和炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IL_12p70)水平。ELISA 試劑盒所檢測(cè)細(xì)胞因子制造商批號(hào)IFN-aPBL Biomedical Laboratories 3659IFN-βBioSourceGL61204IFN-yBioSource1373742ΒTNF-αBioSource063704IL-6BioSource064004ΒIL-IOBioSource064405CIL-12p70BioSource065004i式齊Ll i 自 PBL Biomedical Laboratories, Piscataway, NJ 禾口 BioSource International, Camarillo, CA0Celldex Therapeutics, Inc. (Phillipsburg,NJ)承辦 CD80、CD83 和 CD86 表達(dá)的 流式細(xì)胞分析。過夜運(yùn)送后，在接收到1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行血液樣品的染色。使用標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞 法來進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記物分析和血紅細(xì)胞裂解?；趩魏思?xì)胞、淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞標(biāo)記物的低 表達(dá)水平以及高HLA-DR表達(dá)來鑒定樹突細(xì)胞。還根據(jù)⑶Ilc和⑶123的表達(dá)來表征樹突 細(xì)胞。通過側(cè)向散射分析和單核細(xì)胞譜系標(biāo)記物的表達(dá)來鑒定單核細(xì)胞。在細(xì)胞類型鑒定 后進(jìn)行對(duì)⑶80、⑶83和⑶86表達(dá)的分析。來自健康志愿者的測(cè)定值充當(dāng)對(duì)照，并且指示出 成熟DC的標(biāo)記物(例如⑶80、⑶83和⑶86)表達(dá)的正常分布和水平。結(jié)果細(xì)胞因子水平對(duì)各患者的細(xì)胞因子分析的結(jié)果示于表1和表2。對(duì)于相對(duì)于空 白標(biāo)準(zhǔn)物吸光度為負(fù)值的結(jié)果、或在制造商報(bào)告的試劑盒檢出限(DL)以下的結(jié)果使用O為 值。如果制造商未規(guī)定DL或指出DL小于給定值，則使用所有結(jié)果。如果制造商提供了預(yù) 期的正常細(xì)胞因子范圍，則將其包含作為參考。表1.聚(I = C12U)輸注后干擾素水平的動(dòng)力學(xué)
權(quán)利要求
一種啟動(dòng)僅由Toll樣受體3(TLR3)介導(dǎo)的先天性免疫響應(yīng)的方法，所述方法包括對(duì)受試對(duì)象至少施用聚(I:C11 14U)，所述聚(I:C11 14U)的量足以激活TLR3而不激活其它Toll樣受體或RNA解旋酶，或不會(huì)誘導(dǎo)過量的一種或多種促炎性細(xì)胞因子。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，受試對(duì)象中由自身免疫損傷或神經(jīng)退行性病變啟 動(dòng)的至少細(xì)胞因子產(chǎn)生或共刺激分子信號(hào)傳導(dǎo)受聚(I:Cn_14U)再調(diào)節(jié)。
3.一種治療受微生物感染的受試對(duì)象的方法，所述方法包括施用由聚(I:Cn_14U)組成 的藥物組合物，所述聚(I:cn_14u)的量足以與Toll樣受體3 (TLR3)結(jié)合并且減少或消除所 述微生物對(duì)所述受試對(duì)象的感染。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述受試對(duì)象受到選自由細(xì)菌、原生動(dòng)物或病毒組 成的組的微生物感染。
5.一種治療帶有腫瘤或其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞的受試對(duì)象的方法，所述方法包括施用由聚 (I:Cn_14U)組成的藥物組合物，所述聚(I:Cn_14U)的量足以與Toll樣受體3 (TLR3)結(jié)合并 且減少或消除所述受試對(duì)象中的所述腫瘤或其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述受試對(duì)象被致癌病毒感染。
7.一種治療至少受微生物感染或者帶有腫瘤或其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞的受試對(duì)象的方法，所述 方法包括施用由聚(I:cn_14u)組成的藥物組合物，所述聚(I:Cn_14U)的量足以誘導(dǎo)樹突細(xì) 胞成熟。
8.一種針對(duì)微生物或腫瘤對(duì)受試對(duì)象進(jìn)行預(yù)防接種的方法，所述方法包括施用(i) 誘導(dǎo)針對(duì)所述微生物或腫瘤的免疫響應(yīng)的疫苗或樹突細(xì)胞制劑，和(ii)由聚(I:Cn_14U)組 成的藥物組合物，所述聚(I:Cn_14U)的量足以與Toll樣受體3 (TLR3)結(jié)合并且在所述受試 對(duì)象中刺激所述疫苗或樹突細(xì)胞制劑的針對(duì)微生物或腫瘤抗原的免疫響應(yīng)。
9.如權(quán)利要求3 8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述微生物或癌或其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞易受 專一地充當(dāng)TLR3激動(dòng)劑的聚(I:Cn_14U)的單獨(dú)作用的影響。
10.如權(quán)利要求3 8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述微生物或癌或其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞易 受由專一地充當(dāng)TLR3激動(dòng)劑的聚(I:Cn_14U)激活的特定細(xì)胞因子響應(yīng)模式的影響。
11.如權(quán)利要求3 10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述微生物或癌或其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞表 達(dá)抗原，所述抗原被聚(I:Cn_14U)自發(fā)性選擇為原位標(biāo)靶從而啟動(dòng)針對(duì)所述抗原的免疫響 應(yīng)。
12.如權(quán)利要求3 11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，由受試對(duì)象中所述微生物或癌或其 它轉(zhuǎn)化細(xì)胞啟動(dòng)的至少細(xì)胞因子產(chǎn)生或共刺激分子信號(hào)傳導(dǎo)受聚(I:Cn_14U)再調(diào)節(jié)。
13.如權(quán)利要求1 11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受試對(duì)象是人類。
14.如權(quán)利要求1 13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將聚(I:Cn_14U)靜脈內(nèi)輸注。
15.如權(quán)利要求1 14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過以下方式施用聚(I:Cn_14U) 皮內(nèi)注射、皮下注射或肌內(nèi)注射；鼻內(nèi)吸入或氣管內(nèi)吸入；或者口咽施用或舌下施用。
16.錯(cuò)配雙鏈核糖核酸(dsRNA)在制備用于與受試對(duì)象免疫細(xì)胞上的Toll樣受體 3(TLR3)結(jié)合的藥物中的應(yīng)用，所述受試對(duì)象受微生物感染、帶有癌細(xì)胞或其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞、 或者進(jìn)行了針對(duì)微生物、癌細(xì)胞或其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞的預(yù)防接種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種錯(cuò)配雙鏈核糖核酸，所述錯(cuò)配雙鏈核糖核酸是Toll樣受體3(TLR3)的激動(dòng)劑，并在體內(nèi)或體外用作抗微生物劑、抗增殖劑和/或免疫刺激劑。聚(I:C11-14U)是比聚(I:U)更具有選擇性的TLR3激動(dòng)劑，雖然這兩種雙鏈RNA在結(jié)構(gòu)上類似。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101990435SQ200980112629
公開日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2009年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月15日
發(fā)明者大衛(wèi)·斯特雷耶, 威廉·A·卡特 申請(qǐng)人:海米斯費(fèi)克斯生物制藥公司