專利名稱：Toll樣受體7和8激動劑及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種激動劑，特別涉及一種Toll樣受體7和8(TLR7/8)激動劑及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對于病毒和腫瘤，直至目前，人們沒有很好的藥物來應(yīng)對，對于非自限性病毒和多種腫瘤，機體免疫系統(tǒng)仍是主要的防御力量。近年來，一些免疫調(diào)節(jié)劑，比如腫瘤壞死因子a(TNF-a)，自介素12(IL-12)和白介素6(IL_6)等細胞因子，被用于抗病毒和抗腫瘤治療中，療效比較理想，但是，價格昂貴，難以聯(lián)合使用。
自從90年代末期，Toll樣受體(TLR)發(fā)現(xiàn)以來，人們逐漸認識到多種TLR家族成員處于機體免疫前線，能夠特異性地識別不同的病原模式分子，啟動固有免疫，來阻擊外源性病原微生物的入侵和破壞。這些病原模式分子主要包括脂蛋白、脂多糖和核酸結(jié)構(gòu)的碎片等，由此可見，雖然病原微生物中的外殼蛋白可能早期接觸機體免疫系統(tǒng)，而核酸序列可能在病毒復(fù)制繁殖后，才被機體識別，因此，機體免疫系統(tǒng)往往處于“被動”防御的狀態(tài)。為了提高機體的“主動”防御機制，國內(nèi)外學(xué)術(shù)界認識到，根據(jù)TLR識別特征，來操控免疫調(diào)節(jié)，增進免疫力，可以提高抗病毒和抗腫瘤的效果。
2004年Heil小組在《科學(xué)》雜志上發(fā)表文章，首次提出了病毒中一組富含⑶結(jié)構(gòu)的單鏈RNA能夠被機體免疫細胞上的TLR7和TLR8特異性地識別，特別是，其中被稱為 ssRNA40的序列，結(jié)構(gòu)為GCCGUCUGUU⑶⑶GACUC，能夠刺激以TNF_a，IL-12和IFN-a為主的多種細胞因子高水平釋放，為細胞免疫治療提供了新的策略。
那么，科學(xué)利用TLR7/8識別病毒病原模式分子，并介導(dǎo)多種細胞因子釋放的特性，有利于增進機體免疫力；同時，TLR7/8的天然配基(核苷酸片段)相對于細胞因子，在價格上要便宜，質(zhì)量便于控制，安全性好，因此，尋找高效的TLR7/8天然激動劑或類天然激動劑，對于臨床抗病毒和抗腫瘤治療都具有積極的意義。
申請人長期從事Toll樣家族相關(guān)先天免疫研究，目前，針對TLR7/8識別病毒單鏈 RNA特征的規(guī)律，利用生物信息學(xué)技術(shù)，高通量分析了富含GU結(jié)構(gòu)的RNA基序，包括不同側(cè)翼堿基的組合排列特征序列，通過實驗篩選驗證，成功獲得了本發(fā)明的SSRNA120，其免疫效率在先前SSRNA40的兩倍以上，可作為未來抗病毒和抗腫瘤的輔助治療藥物。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種Toll樣受體7和8激動劑及用途。所述激動劑能特異性作用于TLR7/8，促使機體免疫細胞高效釋放TNF-a，IL-12和IFN_a等細胞因子，從而上調(diào)免疫功能，可用于抗病毒和抗腫瘤的輔助治療。
本發(fā)明的技術(shù)方案是
Toll樣受體7和8(TLR7/8)的強力激動劑，所述強力激動劑包含 ⑶CUGA⑶⑶⑶UCUUG的核苷酸序列片段。
上述激動劑在制備治療抗病毒和抗腫瘤藥物中的用途。
本發(fā)明所述激動劑基本結(jié)構(gòu)為5、-GUCUGAGUGUGUUCUUG-3"的核苷酸序列片段，其中富含GU結(jié)構(gòu)，以及相應(yīng)的側(cè)翼堿基組合排列特征，可通過硫代骨架修飾來穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。 本發(fā)明所述激動劑能與TLR7/8發(fā)生特異性結(jié)合，促使機體免疫細胞高效釋放TNF-a，IL-12 和IL-6等細胞因子，從而上調(diào)免疫功能。其效能是以往報道的SSRNA40的兩倍以上。
本發(fā)明所述激動劑的制備過程按上述核苷酸序列，通過普通RNA化學(xué)合成、硫代修飾并純化的方法獲得。所述激動劑劑型為粉末(水溶性)，使用時，經(jīng)HBS緩沖液稀釋， 并與DOTAP(陽離子脂質(zhì)體)形成混合液(按1 2體積比，詳見實施例1)。該激動劑可在體外誘導(dǎo)細胞活化后，進行回輸療法，或通過注射劑或輸液劑等形式給藥?？煞指咧械腿齻€劑量，酌情給藥針對體外誘導(dǎo)使用時，高劑量為25 μ g/lxlO6個靶細胞/ml，中劑量為 10yg/lxl06個靶細胞/ml，低劑量為Syg/lxlO6個靶細胞/ml ；刺激時間M小時后，進行回輸。針對成人可經(jīng)靜脈體內(nèi)誘導(dǎo)時，高劑量10mg，中劑量5mg，高劑量2. 5mg。可按每天一次，每周為一個療程，實際療程次數(shù)可按臨床具體情況而定。
由于本發(fā)明所述激動劑的作用靶點明確、活化效率高、安全性好的優(yōu)點，在免疫調(diào)節(jié)過程中，能有力增進機體免疫功能，可作為抗病毒、抗腫瘤的輔助治療藥物，以及相關(guān)研究實驗用的試劑，具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1為SSRNA120通過TLR7刺激細胞因子TNF_a釋放狀況；
圖2為ssRNA120通過TLR8刺激細胞因子TNF_a釋放狀況；
圖3為ssRNA120通過TLR8刺激細胞因子IL-12釋放狀況；
圖4為SSRNA120刺激人外周血單個核細胞釋放細胞因子狀況；具體實施方式
下面的實施例可詳細地說明本發(fā)明，但不以此限制本發(fā)明。
實施例1 :Toll樣受體7和8激動劑實例及制備
激動劑名稱ssRNA120
序列結(jié)構(gòu)GUCUGA⑶⑶⑶UCUUG
jf㈣ π I^J :rG氺rU氺rC氺rU氺rG氺rA氺rG氺rU氺rG氺rU氺rG氺rU氺rU氺rC氺rU氺rU氺rG (氺為ψι it修飾，r為RNA)
制備方式化學(xué)合成，委托美國htegrated DNA technologies (IDT)公司。初產(chǎn)量為 250 nmole RNA oligo，純化量為 45. 2 nmoles，即 255. 5 μ g。
使用配置1) ssRNA120由HBS緩沖液稀釋成0. 1 μ g/ μ 1 ；
2)陽離子脂質(zhì)體DOTAP由HBS緩沖液，以1 3比例稀釋；
3)將上述第1和2步試劑按1 2比例混合，作為工作液。
實施例2 :ssRNA 120通過TLR7的免疫活化效應(yīng)測定(ELISA法)
2. 1主要材料、試劑與設(shè)備
1)細胞株=RAff264. 7 (ATCC, USA.)。
2)細胞培養(yǎng)基:DMEM (Gibco, Inc.，USA)。
3)參考試劑fakeRNA120(5，-GACAGAGAGAGAACAAG-3，)
ssRNA40(5，-GCCGUCUGUU⑶⑶GACUC-3，)
(IDT, Inc.合成)
4)Elisa 試劑盒抗鼠 TNF_a(eBioscience，Inc.，USA)。
5)細胞培養(yǎng)箱FORMA 3111.
6)酶標儀全波長多功能酶標儀(Thermo Scientific, USA).
2. 2實驗方法將RAW264. 7細胞稀釋至1 X 106/mL，加入96孔板(200 μ L/孔)，置 37°C,5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后，加入5 μ g/ml ssRNA120為實驗組；5 μ g/mlssRNA40為陽性對照組；5 μ g/ml fakeRNA120為無效對照組；D0TAP-HBS緩沖液為空對照組，以上各組均設(shè) 4復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集上清，按試劑盒操作說明，進行Elisa實驗，以450nm處測定的各孔吸光度(OD45tl)值，獲取TNF-a濃度。
2. 3實驗結(jié)果ssRNA120與ssRNA40均能刺激7細胞釋放TNF_a，并且， ssRNA120刺激力顯著高于ssRNA40(P < 0. 001)，但是，fakeRNA120無刺激效應(yīng)，因此， 相對于fakeRNA120的GA結(jié)構(gòu)，說明ssRNA120的⑶結(jié)構(gòu)發(fā)揮了刺激作用；同時，相對于 SSRNA40，說明SSRNA120的GU結(jié)構(gòu)與相鄰堿基的不同排列后，能發(fā)揮更強的刺激作用。此外，由于7細胞本身含有TLR7而無TLR8，所以，此狀態(tài)下，該效應(yīng)主要為ssRNA120 經(jīng)TLR7介導(dǎo)的。如附圖1所示。
實施例3 :ssRNA 120通過TLR8的免疫活化效應(yīng)測定(ELISA法)
3. 1主要材料、試劑與設(shè)備
1)細胞株THP-1 (ATCC, USA.)。
2)細胞培養(yǎng)基RPMI1640 (Gibco, Inc.，USA)。
3) Elisa 試劑盒抗人 TNF_a 和抗人 IL_12p40 (eBioscience，Inc.，USA)。
4)細胞培養(yǎng)箱FORMA 3111.
5)酶標儀全波長多功能酶標儀(Thermo Scientific, USA).
3. 2實驗方法將THP-I細胞稀釋至1 X 106/mL，加入96孔板(200 μ L/孔)， 置37 °C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后，以1.25,2. 5, 5,10, 20 μ g/ml為濃度梯度，分別加入 SSRNA120設(shè)為各劑量實驗組；并以此梯度加入SSRNA40設(shè)立各劑量對照組，以上各組均設(shè)4 復(fù)孔。培養(yǎng)24h后收集上清，按試劑盒操作說明，進行Elisa實驗，分別檢測TNF-a和IL-12 的濃度。
3. 3實驗結(jié)果ssRNA120和ssRNA40均能刺激THP-1細胞釋放TNF_a和IL-12，而且，SSRNA120刺激效能約是SSRNA40的兩倍，并且量效關(guān)系明顯。同時，由于THP-I本身含有TLR8而無TLR7，故該效應(yīng)主要是ssRNA120通過TLR8介導(dǎo)的。如附圖2，圖3所示。
實施例4 :ssRNA 120對人外周血單個核細胞(hPBMC)的免疫活化效應(yīng)測定
3. 1主要材料、試劑與設(shè)備
1)細胞hPBMC (西南醫(yī)院血庫提高.)。
2)細胞培養(yǎng)基RPMI1640 (Gibco, Inc.，USA)。
3)Elisa 試劑盒抗人 TNF_a，抗人 IL_12p40，抗人 IL-6 (eBioscience，Inc.，USA)。
4)細胞培養(yǎng)箱FORMA 3111.
5)酶標儀全波長多功能酶標儀(Thermo Scientific, USA).
3. 2實驗方法將hPBMC細胞稀釋至1 X 106/mL，加入96孔板QOO μ L/孔)，置 370C ,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后，加入5 μ g/ml ssRNA120為藥物刺激組，D0TAP-HBS緩沖液為空對照組，各組設(shè)4復(fù)孔。培養(yǎng)24h后收集上清，按試劑盒操作說明，進行Elisa實驗，分別檢測各細胞因子濃度。
3. 3實驗結(jié)果由于hPBMC同時含有TLR7和8，實驗數(shù)據(jù)表明，相對于DOTAP組， ssRNA120能刺激hPBMC高水平釋放TNF_a，IL-12以及IL-6 (ρ < 0. 001)。如附圖4所示。
權(quán)利要求
1.一種iToll樣受體7和8激動劑，其特征在于激動劑包含⑶CUGAGUGUGUUCUUG的核苷酸序列片段。
2.權(quán)利要求1所述的激動劑在制備治療抗病毒和抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對Toll樣受體7和8激動劑及用途，所述激動劑為含有17個堿基特征的核苷酸序列片段，其基本結(jié)構(gòu)為GUCUGAGUGUGUUCUUG。所述激動劑能特異性與TLR7/8結(jié)合，促使機體免疫細胞高效釋放TNF-a，IL-12和IL-6等細胞因子，而上調(diào)免疫功能，可用于抗病毒和抗腫瘤的輔助治療。
文檔編號A61P31/12GK102499938SQ201110328040
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者周紅, 曹紅衛(wèi), 李彥, 祝元峰, 鄭江 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院