專利名稱：抗凝血真皮支架的制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療器械領域。更確切地說，本發(fā)明涉及一種用于皮膚損傷修復、具有
良好三維多孔結構和抗凝血性的人工真皮支架的制備方法。
背景技術：
皮膚是人體最大的器官，具有保持人體內水分、防止過度散熱、透氣和防止細菌侵 襲的功能。在人體受到外傷、燒傷、炎癥等損害時，尤其是當大面積的皮膚受到嚴重的燒傷 或損害時，傷口應該立即被保護起來。如果僅是皮膚的淺層或是小面積受損，新皮膚會自體 得以再生，但如果受到嚴重的創(chuàng)傷，皮膚就不能靠自己修復，通常須將身體其他部位的表層 皮膚移植到傷口上。 由于沒有可替代的皮膚來源，治療上多采用自體皮膚移植，如郵票植皮、網狀植 皮、嵌皮等方法——醫(yī)生需要從他們身體其它部位取下一塊完好的皮膚，重新植入創(chuàng)傷部 位。盡管能治愈創(chuàng)面，但在取皮部位卻留下了新的創(chuàng)傷，常常導致疤痕增生，甚至因取皮過 深，供皮區(qū)難以自愈，形成水皰和潰瘍，導致治好了舊傷又添了新傷。遇到大面積嚴重燒傷 的病人，如果其正常皮膚所剩無幾，缺乏自體皮膚來及時封閉創(chuàng)面，常常引起創(chuàng)面及全身嚴 重的感染等一系列并發(fā)癥，有可能危及生命。目前，國外已經產業(yè)化的人工皮膚產品，包括 Integra、Biobrane、Dermagraft等，在臨床上已經有大量的使用。國內經過十多年的研究， 第四軍醫(yī)大學金巖教授項目組的一個產品進入產業(yè)化，目前已開始正式進入臨床應用。
先進的人工皮膚大多具有表皮層和真皮層，當其植入損傷部位后，半滲透的表皮 層能起到保護、透氣和防止細菌侵襲等作用。而真皮層具有三維多孔支架結構，在術后2 3周，隨著支架不斷降解，成纖維細胞和毛細血管長入三維結構，在充足的血供下，長入的細 胞保持高的活力，細胞分泌出膠原蛋白，真皮得以重建。在上述人工皮膚使用中，細胞長入 重建的過程很大程度上取決于毛細血管長入的情況，有了充足的血供，細胞進行正常的周 期，才能分泌豐富的膠原蛋白，使真皮得以迅速的重建。在皮膚創(chuàng)傷愈合的過程中，有大量 的血小板在傷口聚集，容易產生凝血作用，在小傷口處產生凝血有利于傷口的俞合。然而， 在較大面積皮膚的創(chuàng)傷中，需要在人工皮膚的輔助下修復時，如果產生大量的凝血作用、出 現疤痕、使人工皮膚的真皮層與壞死組織接觸，不利于毛細血管向支架長入。
因此，開發(fā)新型的人工皮膚支架使其具有良好的三維結構及抗凝血性，具有重要 的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于皮膚損傷修復、具有良好三維多孔結構和抗凝血 性的人工真皮支架。 本發(fā)明的人工真皮支架由天然生物材料制成。 本發(fā)明的人工真皮支架由再生絲素蛋白、殼聚糖和肝素制成。
本發(fā)明所制備的人工真皮支架中，絲素蛋白與殼聚糖質量比為i : 3 3 : i。
本發(fā)明所制備的人工真皮支架中的肝素的含量為支架質量的0. 01% 0. 1%。本發(fā)明制備的人工真皮支架也可以稱為絲素蛋白/殼聚糖/肝素人工真皮支架。 本發(fā)明的另一個目的在于提供本發(fā)明的人工真皮支架的制備方法。 本發(fā)明的人工真皮支架制備步驟如下 1.制備O. 2M的醋酸溶液； 2.制備肝素溶液； 3.制備殼聚糖/肝素溶液； 4.制備絲素蛋白液； 5.制備絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液；
6.模具成型；
7.甲醇處理，即得。 本發(fā)明中，人工真皮支架具有三維多孔結構，孔隙率為85 98%，孔徑在100 250iim之間。該支架壓縮模量為2. 5 3. 8MPa，壓縮強度為150 480kPa，顯示出好的力 學性能。該支架具有大的溶脹率(45 70% )和高的吸水率(220 360% )，表現出良好 的親水性。 優(yōu)選的本發(fā)明的人工真皮支架制備步驟如下
本發(fā)明的人工真皮支架制備步驟是 1.制備0. 2M的醋酸溶液將1. 2g醋酸于用去離子水中溶解，滴定至100mL，得到 0. 2M的醋酸溶液。 2.制備肝素溶液在醋酸溶液中溶解一定質量的肝素，再用醋酸滴定至肝素加入 之前溶液的pH值。 3.制備殼聚糖/肝素溶液取40mL步驟2制備的肝素溶液，溶解一定量的殼聚糖，
使其濃度為3 5%，得到乳白色的粘稠液體。 4.制備絲素蛋白溶液使溶液中絲素蛋白的濃度為4%。 5.制備絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液將步驟3制備的殼聚糖/肝素溶液加 入步驟4制備的絲素蛋白溶液中，使絲素蛋白與殼聚糖的質量比例為1 : 3 3 : l，總濃 度為3 5%，攪拌15min，混合均勻。 6.模具成型將步驟5所制的絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液倒入的聚四氟乙 烯模具中，樣品在_201:冷凍24h后，再于冷凍干燥機里冷凍干燥48h (-54°C ， 80Pa)。
7.甲醇處理將冷凍干燥后的樣品從模具中取出，甲醇浸泡6h后，倒去甲醇，并繼 續(xù)冷凍干燥48h除去剩余的甲醇。最后得到膜狀的絲素蛋白/殼聚糖/肝素共混支架材料。
本發(fā)明的人工真皮支架的凝血酶原時間、部分凝血活酶時間和凝血酶時間分別 》42. 2±2. 8s、》32. 5±4. ls和^ 119. 1±6. 7s，比未加肝素的支架(分別為17. 8±1. 8s、 12.3±1. ls和35.0士1.0s)相比，均有較大的提高，說明所制人工真皮支架的抗凝血性顯 著改進。 最優(yōu)選的制備方法在實施例中。 本發(fā)明所制備的人工真皮支架具有緩釋肝素的性能。在體外釋放的前7天，大約 50%的肝素被釋放，其余部分結合在支架內部，隨著殼聚糖的降解而逐漸被釋放。釋放出的 肝素保持好的活性。
本發(fā)明所制備的人工真皮支架中，因為肝素的加入使得其凝血酶原時間、部分凝 血活酶時間和凝血酶時間與未加肝素的支架相比都顯著提高，表明其優(yōu)良的抗凝血性。
本發(fā)明的人工真皮支架與現有技術相比成本低廉，制備方法簡單，適合大規(guī)模生 產；具有優(yōu)良的三維結構，適宜細胞和毛細血管的長入，具有抗凝血因子的緩釋功能，減小 支架中的凝血，保持分泌細胞的活性，修復性強。
具體實施例方式
下面將結合實施例進一步說明本發(fā)明的人工真皮支架，但不作為本發(fā)明的限制。
實施例1 絲素蛋白和殼聚糖的比例為1 : 3，含肝素0.01%的絲素蛋白/殼聚糖/肝素人 工真皮支架制備如下 1.制備0.2M的醋酸溶液。將1.2g醋酸于去離子水中溶解，滴定至100mL，得到 0. 2M的醋酸溶液。 2.制備肝素溶液。在40mL步驟1制備的醋酸溶液中溶解0. 16mg的肝素，再用醋 酸滴定至肝素加入之前溶液的pH值。 3.制備3%殼聚糖/肝素溶液。取40mL步驟2制備的肝素溶液，溶解1.2g的殼 聚糖，得到乳白色的粘稠液體。 4.制備絲素蛋白溶液。使溶液中絲素蛋白的濃度為4%。 5.制備絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液。將步驟3制備的40mL醋酸/肝素溶 液加入步驟4制備的9mL絲素蛋白/殼聚糖混合溶液中，則絲素蛋白與殼聚糖的質量比例 為l : 3，總濃度為4%，攪拌15min，混合均勻。 6.模具成型。將步驟5所制的絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液倒入聚四氟乙烯 模具中，樣品在_201:冷凍24h后，再于冷凍干燥機里冷凍干燥48h (-54°C ， 80Pa)。
7.甲醇處理。將冷凍干燥后的樣品從模具中取出，甲醇浸泡6h后，倒去甲醇，并 繼續(xù)冷凍干燥48h除去剩余的甲醇。最后得到膜狀的絲素蛋白/殼聚糖/肝素共混支架材 料，其中，絲素蛋白和殼聚糖的比例為1 : 3，含肝素0.01%。 所制人工真皮支架的孔隙率為96. 5%，壓縮模量為2. 77MPa，壓縮強度為177kPa。 該支架溶脹率為56.2%，吸水率為270%，具有良好的親水性。該支架的凝血酶原時間、部 分凝血活酶時間和凝血酶時間分別為42. 2±2. 8s、32. 5±4. ls和119. 1±6. 7s，比未加肝 素的支架(分別為17.8±1.8s、12.3±l. ls和35.0士1.0s)相比，均有較大的提高，說明所
制人工真皮支架具有良好的抗凝血性。
實施例2 絲素蛋白和殼聚糖的比例為3 : 1，含肝素0.04%的絲素蛋白/殼聚糖/肝素人 工真皮支架制備如下 1.制備0.2M的醋酸溶液。將1.2g醋酸于去離子水中溶解，滴定至100mL，得到 0. 2M的醋酸溶液。 2.制備肝素溶液。在40mL步驟1制備的醋酸溶液中溶解2mg的肝素，再用醋酸滴 定至肝素加入之前溶液的pH值。 3.制備3%殼聚糖/肝素溶液。取40mL步驟2制備的肝素溶液，溶解1.2g的殼聚糖，得到乳白色的粘稠液體。 4.制備絲素蛋白溶液。使溶液中絲素蛋白的濃度為4%。 5.制備絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液。將步驟3制備的40ml殼聚糖/肝素 溶液加入步驟4制備的80mL絲素蛋白溶液中，則絲素蛋白與殼聚糖的質量比例為3 : l，總 濃度為3. 3%，攪拌15min，混合均勻。 6.模具成型。將步驟5所制的絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液倒入聚四氟乙烯 模具中，樣品在_201:冷凍24h后，再于冷凍干燥機里冷凍干燥48h (-54°C ， 80Pa)。
7.甲醇處理。將冷凍干燥后的樣品從模具中取出，甲醇浸泡6h后，倒去甲醇，并 繼續(xù)冷凍干燥48h除去剩余的甲醇。最后得到膜狀的絲素蛋白/殼聚糖/肝素共混支架材 料，其中，絲素蛋白和殼聚糖的比例為3 : 1，含肝素0.04%。 所制人工真皮支架的孔隙率為90. 4%，壓縮模量為2. 83MPa，壓縮強度為185kPa。 該支架溶脹率為67%，吸水率為254%，具有良好的親水性。該支架凝血酶原時間、部 分凝血活酶時間和凝血酶時間分別大于60s、50s和150s，比未加肝素的支架(分別為 17. 8±1. 8s、12. 3±1. ls和35. 0±1. Os)相比，均有顯著的提高，說明所制人工真皮支架具 有良好的抗凝血性。
實施例3 絲素蛋白和殼聚糖比例為l : l，含肝素O. 1%的絲素蛋白/殼聚糖/肝素人工真 皮支架制備如下 1.制備0.2M的醋酸溶液。將1.2g醋酸于去離子水中溶解，滴定至100mL，得到 0. 2M的醋酸溶液。 2.制備肝素溶液。在在40mL步驟1制備的醋酸溶液中溶解2. 4mg的肝素，再用醋 酸滴定至肝素加入之前溶液的pH值。 3.制備3%殼聚糖/肝素溶液。取40mL步驟2制備的肝素溶液，溶解1.2g的殼 聚糖，得到乳白色的粘稠液體。 4.制備絲素蛋白溶液。使溶液中絲素蛋白的濃度為4%。 5.制備絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液。將步驟3制備的殼聚糖/肝素溶液加 入30mL步驟4制備的絲素蛋白溶液中，則絲素蛋白與殼聚糖的質量比例為l : l，總濃度為 3. 4% ，攪拌15min，混合均勻。 6.模具成型。將步驟5所制的絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液倒入的聚四氟乙 烯模具中，樣品在_201:冷凍24h后，再于冷凍干燥機里冷凍干燥48h (-54°C ， 80Pa)。
7.甲醇處理。將冷凍干燥后的樣品從模具中取出，甲醇浸泡6h后，倒去甲醇，并 繼續(xù)冷凍干燥48h除去剩余的甲醇。最后得到膜狀的絲素蛋白/殼聚糖/肝素共混支架材 料，其中，絲素蛋白和殼聚糖的比例為1 : l，含肝素O. 1%。 所制人工真皮支架的孔隙率為92%、壓縮模量為3. 12MPa，壓縮強度為348kPa。 該支架溶脹率為50.3%，吸水率為236%，具有良好的親水性。凝血酶原時間、部分凝血 活酶時間和凝血酶時間分別大于60s、大于50s和大于150s，比未加肝素的支架(分別為 17. 8± 1. 8s、 12. 3± 1. ls和35. 0± 1. Os)相比，均有較大的提高，說明所制人工真皮支架具 有良好的抗凝血性。
實施例4
絲素蛋白和殼聚糖的比例為3 : 1，含肝素0.04%的絲素蛋白/殼聚糖/肝素人 工真皮支架制備如下 1.制備0.2M的醋酸溶液。將1.2g醋酸于去離子水中溶解，滴定至100mL，得到 0. 2M的醋酸溶液。 2.制備肝素溶液。在40mL步驟1制備的醋酸溶液中溶解2mg的肝素，再用醋酸滴 定至肝素加入之前溶液的pH值。 3.制備5%殼聚糖/肝素溶液。取40mL步驟2制備的肝素溶液，溶解2g的殼聚 糖，得到乳白色的粘稠液體。 4.制備絲素蛋白溶液。使溶液中絲素蛋白的濃度為5%。 5.制備絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液。將步驟3制備的40ml殼聚糖/肝素 溶液加入步驟4制備的120mL絲素蛋白溶液中，則絲素蛋白與殼聚糖的質量比例為3 : 1， 總濃度為5%，攪拌15min，混合均勻。 6.模具成型。將步驟5所制的絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液倒入聚四氟乙烯 模具中，樣品在_201:冷凍24h后，再于冷凍干燥機里冷凍干燥48h (-54°C ， 80Pa)。
7.甲醇處理。將冷凍干燥后的樣品從模具中取出，甲醇浸泡6h后，倒去甲醇，并 繼續(xù)冷凍干燥48h除去剩余的甲醇。最后得到膜狀的絲素蛋白/殼聚糖/肝素共混支架材 料，其中，絲素蛋白和殼聚糖的比例為3 : 1，含肝素0.04%。 所制人工真皮支架的孔隙率為85. 1%，壓縮模量為3. 84MPa，壓縮強度為475kPa。 該支架溶脹率為45%，吸水率為220%，具有良好的親水性。該支架凝血酶原時間、部 分凝血活酶時間和凝血酶時間分別大于60s、50s和150s，比未加肝素的支架(分別為 17. 8±1. 8s、12. 3±1. ls和35. 0±1. Os)相比，均有顯著的提高，說明所制人工真皮支架具 有良好的抗凝血性。
權利要求
一種人工真皮支架，其特征在于，由絲素蛋白、殼聚糖和肝素加工制成。
2. 根據權利要求l所述的人工真皮支架，其特征在于，絲素蛋白與殼聚糖質量比為i : 3 3 : i。
3. 根據權利要求i所述的人工真皮支架，其特征在于，人工真皮支架中的肝素的含量為0. 01% 0. 1%。
4. 根據權利要求1所述的人工真皮支架，其特征在于，人工真皮支架具有三維多孔結 構，孔隙率為85 98%，孔徑在100 250iim之間；該支架壓縮模量為2. 5 3. 8MPa，壓 縮強度為150 480kPa，顯示出好的力學性能；該支架具有45 70%的溶脹率和220 360%吸水率，表現出良好的親水性。
5. 根據權利要求1所述的人工真皮支架，其特征在于，該支架的凝血酶原時間、部分凝 血活酶時間和凝血酶時間分別^ 42. 2±2. 8s、》32. 5±4. ls和^ 119. 1±6. 7s。
6. 權利要求1所述的人工真皮支架具有修復皮膚損傷的作用。
7. 權利要求l所述的人工真皮支架具有抗凝血的作用。
8. 權利要求l所述的人工真皮支架具有三維多孔結構。
9. 權利要求1所述的人工真皮支架的制備方法，其特征在于，制備步驟如下1) 制備0. 2M的醋酸溶液；2) 制備肝素溶液；3) 制備殼聚糖/肝素溶液；4) 制備絲素蛋白溶液；5) 制備絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液；6) 模具成型；7) 甲醇處理，即得。
10. 根據權利要求9所述的人工真皮支架的制備方法，其特征在于，制備步驟如下1. )制備0. 2M的醋酸溶液將1. 2g醋酸于用去離子水中溶解，滴定至100mL，得到0. 2M 的醋酸溶液；2. )制備肝素溶液在醋酸溶液中溶解一定質量的肝素，再用醋酸滴定至肝素加入之 前溶液的pH值；3. )制備殼聚糖/肝素溶液取40mL步驟2制備的肝素溶液，溶解一定量的殼聚糖，使 其濃度為3 5%，得到乳白色的粘稠液體；4. )制備絲素蛋白溶液使溶液中絲素蛋白的濃度為4% ;5. )制備絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液將步驟3制備的殼聚糖/肝素溶液加入步驟4制備的絲素蛋白溶液中，使絲素蛋白與殼聚糖的質量比例為i : 3 3 : i，總濃度為3 5%，攪拌15min，混合均勻；6. )模具成型將步驟5所制的絲素蛋白/殼聚糖/肝素混合溶液倒入的聚四氟乙烯 模具中，樣品在_201:冷凍24h后，再于冷凍干燥機里冷凍干燥48h ;7. )甲醇處理將冷凍干燥后的樣品從模具中取出，甲醇浸泡6h后，倒去甲醇，并繼續(xù) 冷凍干燥48h除去剩余的甲醇，最后得到膜狀的絲素蛋白/殼聚糖/肝素共混支架材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于皮膚損傷修復、具有良好三維多孔結構和抗凝血真皮支架的制備，該支架制備所用原料為三種天然生物材料再生絲素蛋白、殼聚糖和肝素，其中，肝素具有優(yōu)異的抗凝血性能，該真皮支架具有高的孔隙率和適宜真皮細胞長入的孔徑尺寸，該支架有較好的力學性能和良好的親水性，該人工真皮支架具有肝素緩釋功能，使得其凝血酶原時間、部分凝血活酶時間和凝血酶時間都顯著延長，證明其具有優(yōu)良的抗凝血性。
文檔編號A61L27/40GK101703799SQ20091022320
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月20日 優(yōu)先權日2009年11月20日
發(fā)明者佘振定, 王明波, 譚榮偉 申請人:佘振定