專(zhuān)利名稱(chēng)：抗凝血肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的抗凝血肽，這些抗凝血肽本身又是開(kāi)發(fā)抗凝劑有價(jià)值的試劑。
在例如急性深靜脈血栓形成、肺栓塞、四肢的急性動(dòng)脈栓塞形成、心肌梗塞、和散布性血管內(nèi)血凝固的藥物治療中，抗凝劑是有用的治療劑。據(jù)信抗凝劑的預(yù)防性給藥可預(yù)防患風(fēng)濕性或動(dòng)脈硬化性心臟病患者復(fù)發(fā)栓塞和預(yù)防某些外科血栓栓塞并發(fā)癥?？鼓齽┮部捎糜谥委煿跔顒?dòng)脈和腦血管疾病。動(dòng)脈栓塞形成，特別是發(fā)生在供養(yǎng)心肌和腦的動(dòng)脈中，是死亡的誘因。
水蛭素是一種分離自水蛭唾液腺的65個(gè)氨基酸殘基的多肽。它是一種抗凝血?jiǎng)?，即凝血酶特異性抑制劑。盡管分離自水蛭提取物的水蛭素相當(dāng)有效，但其臨床應(yīng)用似乎是不可能的，因?yàn)槠淞渴怯邢薜模嘿F，和通常在任何這一大小的外來(lái)蛋白給藥之后出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)。
申請(qǐng)人首先發(fā)現(xiàn)了一個(gè)至少可部分擔(dān)負(fù)其抗凝血活性的水蛭素的特定區(qū)域。用化學(xué)方法合成了該肽區(qū)域(水蛭素的55～65個(gè)氨基酸)，該區(qū)域可與凝血酶的識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合;該識(shí)別位點(diǎn)與酶的切割位點(diǎn)在空間上是截然不同的。合成肽的結(jié)合還表明可競(jìng)爭(zhēng)性防止血纖維蛋白原與凝血酶識(shí)別位點(diǎn)的結(jié)合，這是血纖維蛋白產(chǎn)生和凝塊形成的重要的先決條件，因而其作為抗凝劑具有潛在的醫(yī)學(xué)價(jià)值。
申請(qǐng)人已進(jìn)一步制備了在其基本序列中含有單個(gè)氨基酸缺失的這種肽的衍生物。具體講，這一系列氨基酸缺失總地看來(lái)可在位置和組成上限定肽的序列依賴(lài)性程度，并可為藥物的持久合理設(shè)計(jì)提供基礎(chǔ)。許多這種類(lèi)型的肽類(lèi)似物具有母體肽的屬性，因此也可作為對(duì)抗凝血治療有科學(xué)價(jià)值和明顯療效的輔助劑。而且，氨基酸類(lèi)似物本身可具有增強(qiáng)的效力和持久的作用期。
下式的肽衍生物是有用的抗凝血?jiǎng)?，X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-Y其中X是氨基末端殘基，選自氫、一個(gè)或兩個(gè)具有1～10個(gè)碳原子的烷基，一個(gè)或兩個(gè)具有2～10個(gè)碳原子的?；S氧羰基或叔丁氧羰基;
A1是水蛭素或其天然變體的序列或該序列的一部分，一個(gè)鍵，或含有1～11個(gè)任何氨基酸殘基的肽;
A2是Phe，SubPhe，PClPhe，Pgl，Tha，His，Nap，β-(2-和3-噻吩基)丙氨酸，β-(2-和3-呋喃基)丙氨酸，β-(2-，3-，和4-吡啶基)丙氨酸，β-(苯并噻吩-2-和-3-基)丙氨酸，β-(1-和2-萘基)丙氨酸，Tyr，I-Tyr，或Trp;
A3是一個(gè)鍵，或是Glu，Asp，或Ala;
A4是一個(gè)鍵，或是任何氨基酸;
A5是一個(gè)鍵，或是Ile，Val，Leu，Nle，Phe，Ala;
A6是一個(gè)鍵，或是Pro，Hyp，3，4-dihydroPro，噻唑烷-4-羧酸酯，Sar，NMePgl，Azt，Pip，或D-Ala;
A7是一個(gè)鍵，或是任何L-氨基酸;
A8是一個(gè)鍵，或是任何L-氨基酸;
A9是Tyr，I-Tyr，D-Tyr，His，Ala，Met，Trp，Phe，Leu，Nle，Ile，Val，Cha和Pro或是至少含有這些氨基酸或親脂性氨基酸之一的二肽;
A10是水蛭素或其天然變體的序列或該序列的一部分，一個(gè)鍵或含有1～11個(gè)任何氨基酸殘基的肽;
Y是羧基末端殘基，選自O(shè)H，(C1-C8)烷氧基，氨基，或單或雙(C1-C4)烷基取代的氨基酸;
其中在A3至A8中的至少一個(gè)位置是一個(gè)鍵。
本說(shuō)明書(shū)中所用的(1)氨基酸及其三字母代碼，(2)修飾的和異常的氨基酸，和(3)末端氨基和羧基取代基的常用縮寫(xiě)如下(1)氨基酸及其三字母代碼L-氨基酸 D-氨基酸Ala(或A)-丙氨酸 D-Ala(或a)-D-丙氨酸Arg(或R)-精氨酸 D-Arg(或r)-D-精氨酸Asn(或N)-天冬酰胺 D-Asn(或n)-D-天冬酰胺Asp(或D)-天冬氨酸 D-Asp(或d)-D-天冬氨酸Cys(或C)-半胱氨酸 D-Cys(或c)-D-半胱氨酸Gly(或G)-甘氨酸Glu(或E)-谷氨酸 D-Glu(或e)-D-谷氨酸Val(或V)-纈氨酸 D-Val(或v)-D-纈氨酸Gln(或Q)-谷氨酰胺 D-Gln(或q)-D-谷氨酰胺
His(或H)-組氨酸 D-His(或h)-D-組氨酸Ile(或I)-異亮氨酸 D-Ile(或i)-D-異亮氨酸Leu(或L)-亮氨酸 D-Leu(或l)-D-亮氨酸Lys(或K)-賴(lài)氨酸 D-Lys(或k)-D-賴(lài)氨酸Phe(或F)-苯丙氨酸 D-Phe(或f)-D-苯丙氨酸Met(或M)-蛋氨酸 D-Met(或m)-D-蛋氨酸Pro(或P)-脯氨酸 D-Pro(或p)-D-脯氨酸Ser(或S)-絲氨酸 D-Ser(或s)-D-絲氨酸Thr(或T)-蘇氨酸 D-Thr(或t)-D-蘇氨酸Trp(或W)-色氨酸 D-Trp(或w)-D-色氨酸Tyr(或Y)-酪氨酸 D-Tyr(或y)-D-酪氨酸(2)修飾的和異常的氨基酸Aba-α-氨基-正丁酸pClPhe-對(duì)氯苯丙氨酸Cha-環(huán)己基丙氨酸Chg-環(huán)己基甘氨酸Hyp-羥脯氨酸I-Tyr-3-碘代酪氨酸，5-碘代酪氨酸，3，5-二碘代酪氨酸YMeGlu-D-谷氨酸γ甲酯NMePhe-N-甲基苯丙氨酸NMePgl-N-甲基苯基甘氨酸
Npa-β-(萘基)丙氨酸3，4-dihydroPro-3，4-二羥脯氨酸PNO2Phe-對(duì)硝基苯丙氨酸Nle-正亮氨酸Orn-鳥(niǎo)氨酸Pip-2-哌啶酸酯Pba-對(duì)氨基苯基丁酸pSubPhe-對(duì)位取代的苯丙氨酸Pgl-苯基甘氨酸Sar-肌氨酸(N-甲基甘氨酸)SubPhe-鄰，間，或?qū)?，單或雙取代的苯丙氨酸Tha-β-(2-噻吩基)丙氨酸Tiq-四氫異喹啉3-羧酸酯(3)氨基和羧基末端酸性取代基Ac-?；鵄zt-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸酯Cin-肉桂酰3，4-dihydroCin-3，4-二氫肉桂酰Glt-戊二酰Mal-馬來(lái)酰Oac-8-氨基辛酸Oct-正辛基Suc-琥珀酰
Tfa-三氟乙酰＃-C-末端酰胺以下標(biāo)明了水蛭素已知天然存在的氨基酸序列的變異水蛭素的氨基酸序列的變異12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu CysIle Thr
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys CysLys29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr GlyAsn Lys GlyGln Asp
43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56Glu Gly Thr Pro Lys Pro Glx Ser His Asn Asp Gly Asp PheAsn Glu
57 58 59 60 61 62 63 64 65Glu Glu ILe Pro Glu Glu Tyr Leu GlnPro Asp Asp Glu(Ala63Tyr64Leu/Asp64Glu65)
除甘氨酸外，天然存在的氨基酸都含有手性碳原子。除特別指出者外，本文涉及的光學(xué)活性氨基酸都具有L-構(gòu)型。例如，任何A1或A10組的氨基酸可具有D-或L-構(gòu)型。按照習(xí)慣，本文所書(shū)寫(xiě)的肽的結(jié)構(gòu)是使氨基末端位于鏈的左側(cè)，羧基末端位于鏈的右側(cè)。
烷基和烷氧基的烷基部分應(yīng)被看作包括直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基，例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、仲戊基、環(huán)戊基、己基、異己基、環(huán)己基和環(huán)戊基甲基、庚基、辛基(Ot)、8-氨基辛酸(Oac)。具有2～10個(gè)碳原子的?；鶓?yīng)被看作包括直鏈、支鏈、環(huán)狀、飽和和不飽和酰基，每個(gè)基團(tuán)上帶有1或2個(gè)羰基，例如，乙酰(Ac)、氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸酯(Azt)、苯甲酰琥珀酰、肉桂酰(Cin)、3，4-二氫肉桂酰(3，4-dihydrocin)、馬來(lái)酰(Mal)、和戊二酰(Glt)。烷基和?；〈急豢醋靼切в宣u素取代基的基團(tuán)，其中鹵素基團(tuán)是氟、氯、溴或碘，例如，三氟乙酰(Tfa)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“任何氨基酸”不意欲包括任何有氨基取代基的羧酸，而是多肽衍生物領(lǐng)域的技術(shù)人員常用的，其包括天然存在的氨基酸以及在制備天然存在肽的合成類(lèi)似物時(shí)肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員常用的其它“非蛋白質(zhì)”α-氨基酸。天然存在的氨基酸都是“L-氨基酸'，有甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、組氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、和賴(lài)氨酸。作為“任何氨基酸”還應(yīng)包括天然存在的L-氨基酸的D-異構(gòu)體(“D-氨基酸”);即D-丙氨酸、D-纈氨酸、D-亮氨酸、D-異亮氨酸、D-絲氨酸、D-蛋氨酸、D-蘇氨酸、D-苯丙氨酸、D-酪氨酸、D-色氨酸、D-半胱氨酸、D-脯氨酸、D-組氨酸、D-天冬氨酸、D-天冬酰胺、D-谷氨酸、D-精氨酸。還包括“非蛋白質(zhì)”α-氨基酸，例如正亮氨酸、正纈氨酸、別異亮氨酸、高精氨酸、硫代脯氨酸、二氫脯氨酸、羥脯氨酸(Hyp)、高絲氨酸、環(huán)己基甘氨酸(Chg)、α-氨基-正丁酸(Aba)、環(huán)己基丙氨酸(Cha)、氨基苯基丁酸(Pba)、在鄰位間位或?qū)ξ簧媳?C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、鹵素或硝基中的一個(gè)或兩個(gè)基團(tuán)單取代或雙取代的或被亞甲二氧基取代的苯丙氨酸，例如對(duì)位取代的苯丙氨酸(PSubPhe)和對(duì)氯苯丙氨酸，和對(duì)硝基苯丙氨酸(PNO2Phe)、β-2-和3-噻吩基-丙氨酸、β-2-和3-呋喃基丙氨酸、β-2-，3-，和4-吡啶基丙氨酸、β-(苯并噻吩-2-和3-基)丙氨酸、β-(1-和2-萘基)丙氨酸(NPa)，絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸的O-烷基化衍生物、谷氨酸和天冬氨酸的甲基酯、S-烷基化半胱氨酸、酪氨酸的O-硫酸酯和鹵化酪氨酸，例如3-碘代酪氨酸、5-碘代酪氨酸、3，5-二碘代酪氨酸。
關(guān)于“水蛭素或其天然變體的序列”，申請(qǐng)人意指見(jiàn)于水蛭素的氨基酸序列性質(zhì)上適用。
術(shù)語(yǔ)“該序列的一部分”是指包括衍生于水蛭素或其變體序列的4個(gè)氨基酸的連續(xù)區(qū)域。
術(shù)語(yǔ)“親脂性氨基酸”包括Tyr，Phe，Leu，Met，Nle Ile，Val，和Pro。此外，術(shù)語(yǔ)“亞氨基酸”是指包括所有N-烷基氨基酸。亞氨基酸的實(shí)例為N-甲基苯丙氨酸(NMePhe)、N-甲基苯基甘氨酸(NMePgl)、3，4-二氫脯氨酸(3，4-dihydroPro)、對(duì)氨基苯基丁酸(Pba)、肌氨酸(Sar)、和脯氨酸(Pro)、2-哌啶酸酯(Pip)。
“含有1-11個(gè)任何氨基酸殘基的肽”是指反映出氨基酸加到核心氨基酸(A2-A9)的氨基或羧基未端可構(gòu)成具有其固有活性的核心結(jié)構(gòu)。
式1的多肽可與任何無(wú)毒的有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸形成藥物上可接受的鹽。可形成適宜鹽的無(wú)機(jī)酸實(shí)例包括鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸及酸性金屬鹽，例如磷酸氫二鈉和硫酸氫鈉?？尚纬蛇m宜鹽的有機(jī)酸實(shí)例包括一元、二元和三元羧酸。例如這類(lèi)酸有乙酸、乙醇酸、乳酸、三聚氰酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、蘋(píng)果酸、馬來(lái)酸、灑石酸、檸檬酸、抗壞血酸、富馬酸、羥基富馬酸、苯甲酸、羥苯甲酸、苯基乙酸、肉桂酸、水楊酸、2-苯氧苯甲酸和磺酸如甲磺酸和2-羥基乙磺酸。羧基末端氨基酸部分的鹽包括與任何適宜的無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿形成的無(wú)毒羧酸鹽。作為例證，這些鹽包括堿金屬鹽，例如鈉鹽和鉀鹽;堿土金屬鹽，例如鈣鹽和鎂鹽;ⅢA族的輕金屬鹽，包括鋁鹽;和有機(jī)伯、仲和叔胺，例如，三烷基胺，包括三乙胺、普魯卡因、二芐胺、1-乙胺、N，N′-二芐基亞乙基二胺、二氫松香胺、N-(低級(jí))烷基哌啶，和任何其它適宜胺的鹽。
對(duì)于化合物的一般基團(tuán)來(lái)說(shuō)，某些基團(tuán)是優(yōu)選的。申請(qǐng)人優(yōu)選其中各基團(tuán)定義如下的式1所示的肽衍生物X為氫、乙酰、或琥珀酰;
A1為一個(gè)鍵或?yàn)榘?-54氨基酸水蛭素或其天然變體序列或其區(qū)域;
A2為一個(gè)鍵或?yàn)門(mén)yr，Trp，Glu，His，Leu，Phe，D-Phe，SubPhe，PclPhe，NMePhe，Tha，3，4-dihydrocin，Cin，Nap，β-(2-和3-噻吩)丙氨酸，β-(2-和3-呋喃基)丙氨酸，β-(2-，3-，和4-吡啶基)丙氨酸，或β-(1-和2-萘基)丙氨酸;
A3是一個(gè)鍵，或Glu，Ala;
A4是一個(gè)鍵，或Glu，Asp，Pro，Ala，Azt，Pip、亞氨基酸或D-氨基酸;
A5是一個(gè)鍵，或Ile，Leu;
A6是一個(gè)鍵，或Pro，Sar，D-Ala，Hyp或NMepgl;
A7是一個(gè)鍵，或Glu，Gln，Asp或Ala;
A8是一個(gè)鍵，或Glu，Asp或Ala;
A9是一個(gè)鍵，或Ala，Pro，Cha，或二肽Ala-Tyr，Tyr-Leu，Ala-Phe，Tyr-Tyr，Ala-Leu，Tyr-Ala，Glu-Leu，D-Tyr-Leu，Leu-Phe，Sar-Cha，Pro-Cha，Cha-Leu，Ala-Cha，Tyr-Cha;
A10是一個(gè)鍵，或YMeGlu，Glu，D-Glu，Asn，D-Asn，Asn-Ol，Pro，Gln，Ala，Lys，D-Lys，Asp，Orn，Asp，或?yàn)锳la;和Y是選自O(shè)H，(C1-C8)烷氧基，氨基，單或雙(C1-C4)烷基取代的氨基酸的羧基末端殘基，或是醇末端殘基;
其中A3至A9中至少一個(gè)位置是一個(gè)鍵。
其中各基團(tuán)定義如下的式1所示的肽衍生物是特別優(yōu)選的X是Suc，Mal;
A1是一個(gè)鍵;
A2是Tyr，Phe，Nap;
A3是Glu，或是一個(gè)鍵;
A4是Glu，Pro，Tiq，或是一個(gè)鍵;
A5是Ile，或是一個(gè)鍵;
A6是Pro，或是一個(gè)鍵;
A7是Glu，或是一個(gè)鍵;
A8是Glu，或是一個(gè)鍵;
A9是Ala-Cha，Tyr-Leu，Ala，Cha;
A10是Gln，D-Glu，Asn;和Y是OH，NH2。
其中A3至A8中至少一個(gè)位置是一個(gè)鍵。
合成本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員易于得知的方法來(lái)制備。這類(lèi)方法包括液相肽合成，固相連續(xù)和嵌段合成，基因克隆和這些技術(shù)的結(jié)合。固相連續(xù)法可使用所建立的自動(dòng)化方法采用自動(dòng)肽合成儀進(jìn)行。在該程序中，肽在樹(shù)脂上構(gòu)建，從C-末端被保護(hù)的氨基酸開(kāi)始。所用的樹(shù)脂載體可以是任何本領(lǐng)域內(nèi)常用的適于多肽固相制備的樹(shù)脂，最好是已與0.5至約3%二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯，已使之氯甲基化或羥甲基化以為與最初引入的α-氨基被保護(hù)的氨基酸形成酯提供位點(diǎn)。對(duì)于C-末端酰胺，可使用甲基二苯甲基胺樹(shù)脂。在在序列的偶聯(lián)完成之后，除去或適當(dāng)保留BOC保護(hù)基或?qū)⑵涿摮⑹筃-末端氨基?；?。用適當(dāng)?shù)陌被紡臉?shù)脂上置換出被保護(hù)的片段。
Bodanszhy等人述及了一例羥甲基樹(shù)脂〔Chem.Ind.(London)38，1597-98(1966)〕。氯甲基化樹(shù)脂可購(gòu)自Bio Rad Laboratories，Richmond，California，Stewart等人在“固相肽合成”第一章第1-6頁(yè)述及了這種樹(shù)脂的制備(Freeman & CO，San Francisco 1969)。許多與樹(shù)脂結(jié)合的保護(hù)的氨基酸是商業(yè)上可得到的。作為一例，為了制備其中羧基末端是D-Glu殘基的本發(fā)明的多肽，可使用與芐基化，羥甲基化苯乙酰氨基甲基(PAM)樹(shù)脂結(jié)合的叔丁氧羰基(BOC)保護(hù)的D-Glu。
在α-氨基被保護(hù)的氨基酸與樹(shù)脂載體偶聯(lián)之后，用任何適宜的方法，例如用溶于二氯甲烷的三氟乙酸，單獨(dú)用三氟乙酸，或用溶于二噁烷的HCl脫除保護(hù)基。去保護(hù)可在0℃至室溫的某一溫度下進(jìn)行。也可使用其它標(biāo)準(zhǔn)解離試劑和條件脫除特定的α-氨基保護(hù)基。在脫除α-氨基保護(hù)基之后，按所需順序?qū)⑵渌被槐Ｗo(hù)的氨基酸逐步偶聯(lián)。另外，多種氨基酸基團(tuán)在與載有氨基酸序列的樹(shù)脂偶聯(lián)之前可用溶液法偶聯(lián)。
用于引入到多肽序列中的各個(gè)氨基酸的α-氨基保護(hù)基可以是任何本領(lǐng)域已知的這種保護(hù)基。在各類(lèi)α-氨基保護(hù)基中，可考慮(1)酰基型保護(hù)基，例如甲?；?、三氟乙?；?、鄰苯二甲?；?、甲苯磺?；?、鄰硝基苯氧乙?；挺?氯丁酰;(2)芳族氨基甲酸乙酯型保護(hù)基，例如芐氧羰基和取代的芐氧羰基，如對(duì)氯芐氧羰基、對(duì)硝基芐基羰基、對(duì)溴芐氧羰基、對(duì)甲氧芐氧羰基、1-(對(duì)聯(lián)苯基)-1-甲基乙氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧芐氧羰基和二苯甲氧羰基;(3)脂族氨基甲酸乙酯保護(hù)基，例如叔丁氧羰基(Boc)、二異丙基甲氧羰基、異丙氧羰基、乙氧羰基和烯丙氧羰基;(4)環(huán)烷基氨基甲酸乙酯型保護(hù)基，例如環(huán)戊氧羰基、金剛烷氧羰基和環(huán)己氧羰基;(5)硫代氨基甲酸乙酯型保護(hù)基，例如苯基硫代羰基;和(6)烷基型保護(hù)基，例如三苯甲基和芐基。優(yōu)選的α-氨基保護(hù)基是叔丁氧羰基。
如固相肽合成領(lǐng)域所知，許多氨基酸都具有在鏈制備過(guò)程中需要保護(hù)的官能度。使用和選擇適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基屬本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)有的能力，并應(yīng)取決于欲保護(hù)的氨基酸和肽上其它被保護(hù)的氨基酸殘基的存在。這種側(cè)鏈保護(hù)基的選擇是關(guān)鍵的，其中它必須是不會(huì)在α-氨基部分保護(hù)基解離過(guò)程中被解離而除去的基團(tuán)。例如，適于賴(lài)氨酸的側(cè)鏈保護(hù)基是芐氧羰基和取代的芐氧羰基，所述的取代基應(yīng)選自鹵素(例如氯、溴、氟)和硝基(例如，2-氯芐氧羰基、對(duì)硝基芐氧羰基、3，4-二氯芐氧羰基)、甲苯磺?；⑹逦煅豸驶?、叔丁氧羰基和二異丙氧羰基。蘇氨酸和絲氨酸的醇羥基可用乙?；?、苯甲?；⑹宥』?、三苯甲基、芐基、2，6-二氯芐基或芐氧羰基保護(hù)。優(yōu)選的保護(hù)基是芐基。
選擇適當(dāng)?shù)呐悸?lián)試劑屬于本領(lǐng)域的技能。欲加入的氨基酸是Gln，Asn或Arg的特別適宜的偶聯(lián)試劑是N，N′-二異丙基碳化二亞胺和1-羥基苯并三唑。這些試劑的使用可防止腈和內(nèi)酰胺的形成。其它偶聯(lián)劑是(1)碳化二亞胺(例如，N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺和N-乙基-N′-(Y-二甲基氨基丙基碳化二亞胺);(2)氨基腈(例如，N，N-二芐基氨基氰);(3)乙烯酮亞胺;(4)異噁唑鎓鹽(例如，N-乙基-5-苯基-異噁唑鎓-3-磺酸鹽);(5)環(huán)中含有1-4個(gè)氮原子的具有芳族特性的單環(huán)含氮的雜環(huán)酰胺，例如咪唑酰胺、吡唑酰胺、和1，2，4-三唑酰胺。具體適用的雜環(huán)酰胺包括N，N′-羰基二咪唑和N，N-羰基-二-1，2，4-三唑;(6)烷氧基化乙炔(例如，乙氧乙炔);(7)可與氨基酸的羧基部分形成混合酐的試劑(例如，氯甲酸乙酯和氯甲酸異丁酯)或欲偶聯(lián)氨基酸的對(duì)稱(chēng)酐(例如，Boc-Ala-O-Ala-Boc);(8)在一個(gè)環(huán)氮原子上帶有羥基的含氮雜環(huán)化合物(例如，N-羥基鄰苯二甲酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和1-羥基苯并三唑)和(9)Castro氏試劑(BOP)。其它活化試劑及其在肽偶聯(lián)中的應(yīng)用詳見(jiàn)Kepoor，J.Pharm，SCi，59，PP，1-27(1970)，申請(qǐng)人優(yōu)先使用對(duì)稱(chēng)酐作為除Arg、ASn和Gln之外的所有氨基酸的偶聯(lián)試劑。
將各被保護(hù)的氨基酸或氨基酸序列以大約過(guò)量4倍的量引入到固相反應(yīng)器中并在二甲基甲酰胺∶二氯甲烷(1∶1)的介質(zhì)中或單獨(dú)在二甲基甲酰胺中或最好單獨(dú)在二氯甲烷中進(jìn)行偶聯(lián)。在未完全偶聯(lián)的情況下，可在脫除α-氨基保護(hù)基之前重復(fù)偶聯(lián)步驟，然后在固相反應(yīng)器中進(jìn)行下一個(gè)氨基酸的偶聯(lián)。在合成各階段偶聯(lián)反應(yīng)是否成功由E.Kaise等人所述的茚三酮反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Analyt.Biochem.34，595(1970))。
在α-氨基被保護(hù)的氨基酸與樹(shù)脂載體偶聯(lián)之后，用任何適宜的方法，例如用溶于二氯甲烷的三氟乙酸，單獨(dú)用三氟乙酸，或用溶于二噁烷的HCl脫除保護(hù)基。去保護(hù)可在0℃至室溫的某一溫度下進(jìn)行。也可使用其它標(biāo)準(zhǔn)解離試劑和條件脫除特定的α-氨基保護(hù)基。在脫除α-氨基保護(hù)基之后，按所需順序?qū)⑵渌被槐Ｗo(hù)的氨基酸逐步偶聯(lián)。另外，多種氨基酸基團(tuán)在與載有氨基酸序列的樹(shù)脂偶聯(lián)之前可用溶液法偶聯(lián)。
在獲得所需氨基酸序列之后，從樹(shù)脂上移出肽并去保護(hù)?？赏ㄟ^(guò)水解，例如通過(guò)在消除劑(例如茴香醚)存在下用無(wú)水液態(tài)HF處理與樹(shù)脂結(jié)合的多肽完成上述過(guò)程。一般在肽鏈合成完全后脫除保護(hù)基，但也可在任何其它適當(dāng)?shù)臅r(shí)間脫除保護(hù)基。
去保護(hù)肽的純化和分析可通過(guò)多種標(biāo)準(zhǔn)方法完成。適當(dāng)純化和分析方法的選擇屬于本領(lǐng)域的技能。適宜的純化方法是制備HPLC。純化肽的分析可通過(guò)分析HPLC、氨基酸分析、快原子轟擊質(zhì)譜分析、和任何其它適宜的分析手段來(lái)進(jìn)行。
治療應(yīng)用本發(fā)明的肽衍生物的抗凝血?jiǎng)┝渴敲刻烀縦g患者體重0.2mg至250mg，取決于待治療患者血栓形成癥狀的嚴(yán)重程度和所選的肽衍生物。適于某一患者的劑量可容易地確定。最好每天分1-4劑給藥，一般每劑含5mg至100mg活性化合物。在體外介質(zhì)如貯存的全血中抑制或防止血液凝結(jié)所需本發(fā)明肽的量可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。
抗凝血療法可用于治療和預(yù)防各種血栓形成癥狀，特別是冠狀動(dòng)脈和腦血管疾病。在這一領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的人員都易于掌握需要抗凝血治療的情況。本文所用的術(shù)語(yǔ)“患者”應(yīng)看作是指哺乳動(dòng)物如靈長(zhǎng)類(lèi)，包括人、羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠和小鼠。血液凝結(jié)的抑制不但適用于患有血栓形成病癥個(gè)體的抗凝血治療，而且適用于任何需要抑制血液凝結(jié)的時(shí)候，例如可防止貯存全血的凝結(jié)和防止用于試驗(yàn)或貯存的其它生物樣品的凝結(jié)。
盡管某些肽衍生物在口服并通過(guò)腸道后仍然存在，但申請(qǐng)人優(yōu)選非口服給藥，例如皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮內(nèi)給藥。給藥方式有儲(chǔ)存注射;植入制劑;或例如在含有本發(fā)明肽衍生物的噴灑煙霧劑的容器中以噴霧或干粉形式施用于粘膜，如鼻、咽喉和支氣管粘膜。
對(duì)于非腸道使用，化合物可以可注射劑量給藥，該化合物可用藥理上可接受的稀釋劑配成溶液或懸浮液，藥物載體可為一種無(wú)菌液體如水和油類(lèi)，加有或不加有表面活性劑和其它可藥用試劑。可用于這些制劑的油類(lèi)實(shí)例有石油、動(dòng)物、植物、或合成來(lái)源的油類(lèi)，例如，花生油，豆油、和礦物油，水，鹽水、含水右施糖和相關(guān)的糖溶液、乙醇和二醇類(lèi)如丙二醇或乙二醇是優(yōu)選的液體載體，特別適用于可注射溶液。
化合物可以?xún)?chǔ)存注射或植入制劑形式給藥，植入制劑可以使有效成分持續(xù)釋放的方式配制。可將有效成分壓成丸?；蛐A柱體并以?xún)?chǔ)存注射或植入方式徑皮下或肌內(nèi)植入。植入物可使用惰性材料，例如可生物降解的聚合物或合成硅氧烷，例如Silastic，它是Dow-Corning Corg生產(chǎn)的硅氧烷橡膠。
實(shí)施例本發(fā)明可用下列非限制性實(shí)例加以說(shuō)明。
實(shí)施例1抗凝血肽的制備在Vega半自動(dòng)肽合成儀上，用8.3mmol的0.56mmol/g Bod D-Glu(Bzl)Merrifield樹(shù)脂，通過(guò)固相法合成肽，用18.3mmol Nα-Boc-氨基酸(Peptides International)進(jìn)行單對(duì)稱(chēng)酐偶聯(lián)，但對(duì)于Boc-Cha，需要兩次偶聯(lián)反應(yīng)才能作出陰性Kaiser試驗(yàn)。將部分肽樹(shù)脂(0.7～1.5g)在3～8個(gè)周期之后取出并放在一邊;對(duì)于des-Glu57，在8個(gè)周期之后保留1.36g(0.50mmol)Boc-Pro-Ile-Pro-Glu(Bzl)-Glu(Bzl)-Ala-Cha-D-Glu(Bzl)Merrifielcl樹(shù)脂。將被保護(hù)肽片段樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到應(yīng)用生物系統(tǒng)反應(yīng)容器中，其中加入與2.0mmol氨基酸進(jìn)行雙對(duì)稱(chēng)酐偶聯(lián)的Boc-Tyr(2-BrZ)，用溶于二氯甲烷的50%三氟乙酸脫除Nα-Boc保護(hù)，用溶于二氯甲烷的10%二異丙基乙胺沖洗三次進(jìn)行中和，用二氯甲烷洗三次，并在氮?dú)饬飨赂稍?。?jīng)在二甲基甲酰胺中進(jìn)行雙對(duì)稱(chēng)酐偶聯(lián)使肽Nα琥珀酰化，用二甲基甲酰胺沖洗三次，用溶于二氯甲烷的10%二異丙基乙胺洗兩次進(jìn)行中和，用二氯甲烷洗三次并真空干燥。將肽去保護(hù)并用含有5%茴香醚的無(wú)水HF在0℃解離60分鐘。在0℃下真空除去HF;用25%含水乙腈從樹(shù)脂中取出肽，冷凍并凍干。
在0.1%含水三氟乙酸中以29.6-31.6%乙腈線性梯度，以80ml/分的速率，歷時(shí)15分鐘，在C18Beckman50.8×150mm柱上進(jìn)行制備HPLC。收集并凍干主峰(在280nm處監(jiān)測(cè))，得到281mg所需產(chǎn)物。用HPLC測(cè)定均勻性Vydac 218 TP54(4.6×250mm)C18柱，2.0ml/分，t0＝1.5分，以15-40%乙腈線性梯度經(jīng)25分鐘洗脫至0.1%三氟乙酸的時(shí)間是17.1分鐘。
純化的標(biāo)記肽的分析給出了所需的分子離子峰(FAB-MS)并根據(jù)所需肽進(jìn)行了氨基酸分析。用這種方法，下列肽具有如下所示的固定的物理特性。
在凝血酶誘導(dǎo)的血纖維蛋白凝血塊抑制測(cè)定中試驗(yàn)了樣品。所有測(cè)定溶液都是用含有0.12M氯化鈉，0.01M磷酸鈉，0.01%疊氮化鈉和0.1%牛血清白蛋白的測(cè)定緩沖液(pH7.4)配制的。將牛凝血酶滴定至適當(dāng)?shù)臐舛纫员隳軌蛲ㄟ^(guò)微滴板讀數(shù)器(Bio-Tek EL309)在405nm處60分鐘內(nèi)監(jiān)測(cè)血纖維蛋白凝塊的形成。將這種凝血酶溶液(50μl;0.2Pmol)加到含有50μl待試合成肽溶液的微滴板孔中。攪拌1分鐘并在20℃再保溫10分鐘后，加入100μl于0.1%EDTA中的稀血漿(1∶10)并渦旋20秒鐘。用自動(dòng)讀數(shù)器，以5分鐘的間隔監(jiān)測(cè)溶液的濁度。根據(jù)結(jié)果計(jì)算IC50，IC50被定義為相對(duì)于不含抑制劑的對(duì)照可導(dǎo)致觀察到的混濁度之半的肽濃度。這相當(dāng)于血纖維蛋白凝塊形成時(shí)間增加兩倍。對(duì)于用人凝血酶進(jìn)行的測(cè)定來(lái)說(shuō)，在30分鐘內(nèi)將人和牛凝血酶以同樣速率滴定到可產(chǎn)生血纖維蛋白凝塊的濃度。這樣，下列肽具有固定的生物學(xué)特性，在下示實(shí)例中，+表示IC50＞25μM和＜200μM，++表示IC50＜25μM。
1)Suc-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu OHMW 1200 FAB-MS(MH)+1201Z(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)3.08 1.97 0.96 0.99 0.99體外效價(jià)+2)H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OHMW 1370 FAB-MS(MH)+1371Z(5) Ile(1) Tyr(1) Gly(1) B(1) Phe(1) Leu(1)4.93 0.85 0.95 1.09 1.10 1.08 0.99體外效價(jià)+
3)Suc-Tyr-Glu-Pro-Tiq-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1278 FAB-MS(MH)+1279Z(4) Pro(1) Ile(1) Tyr(1) Ala(1) Cha(1)4.05 0.93 0.96 0.95 1.03 1.03體外效價(jià)++4)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Gln-NH2MW 1158 FAB-MS(MH)+1175Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.15 1.94 0.96 1.01 0.95體外效價(jià)++5)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Cha-Gln-NH2MW 1256 FAB-MS(MH)+1257Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.15 1.98 0.91 0.97 1.05體外效價(jià)++6)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Ala-Cha-Asn-OHMW 1184 FAB-MS(MH)+1185B(1) Z(2) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)1.02 2.09 1.98 0.93 1.01 0.97體外效價(jià)++7)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Asn-OHMW 1161 FAB-MS(MH)+1162Z(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1) B(1)3.14 1.95 0.95 1.00 0.96 1.01體外效價(jià)++8)Mal-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1198 FAB-MS(MH)+1198Z(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)3.06 2.01 0.95 0.99 1.01體外效價(jià)+9)Suc-Nap-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1234 FAB-MS(MH)+1234
Z(3) Pro(2) Ile(1) Ala(1)3.08 2.00 0.94 0.97體外效價(jià)++10)Suc-Tyr-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1232 FAB-MS(MH)+1233Z(4) Pro(1) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.07 0.99 0.96 0.98 0.99體外效價(jià)+11)Suc-Tyr-Glu-Pro-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1216 FAB-MS(MH)+1217Z(4) Pro(2) Tyr(1) Ala(1)4.05 1.97 0.98 1.00體外效價(jià)+12)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1232 FAB-MS(MH)+1233Z(4) Pro(1) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.10 1.01 0.94 0.96 0.99體外效價(jià)++13)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1200 FAB-MS(MH)+1201Z(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)3.16 1.97 0.93 0.96 0.98體外效價(jià)++14)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-D-Glu-OHMW 1176 FAB-MS(MH)+1177Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.08 1.97 0.96 0.99 1.00體外效價(jià)++
15)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Cha-D-Glu-OHMW 1258 FAB-MS(MH)+1259Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1)4.10 2.01 0.91 0.98體外效價(jià)++16)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Gln-OHMW 1175 FAB-MS(MH)+1175Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.11 1.98 0.93 1.01 0.97體外效價(jià)++17)Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Gln-NH2MW 1158 FAB-MS(MH)+1159Z(4) Pro(2) Ile(1) Ala(1) Phe(1)4.10 2.05 0.93 0.96 0.97體外效價(jià)+18)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-OHMW 1200 FAB-MS(MH)+1201Glx(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)3.10 1.94 0.98 0.99 0.99體外效價(jià)++19)Suc-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1166 FAB-MS(MH)+1167Glx(4) Pro(2) Ile(1) Ala(1)4.12 1.95 0.96 0.98體外效價(jià)+
權(quán)利要求
1.下式的肽衍生物及其可作藥用的鹽的制備方法X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-Y其中X是氨基末端殘基，選自氫、1或2個(gè)具有1-10個(gè)碳原子的烷基、1或2個(gè)具有2-10個(gè)碳原子的?；?、芐氧羰基或叔丁氧羰基；A1是水蛭素或其天然變體的序列或該序列的一部分、一個(gè)鍵、或是含有1-11個(gè)任何氨基酸殘基的肽；A2是一個(gè)鍵或是Phe，Subphe，Pclphe，D-phe，NMephe，pgl，Tha，His，Cin，Nap，Leu，Gln，3，4-dihydroCin，β-(2-和3-噻吩基)丙氨酸，β-(2-和3-呋喃基)丙氨酸，β-(2-，3-，和4-吡啶基)丙氨酸，β-(苯并噻吩-2-和-3-基)丙氨酸，β-(1-和2-苯基)丙氨酸，TYr或Trp；A3是一個(gè)鍵，或是Glu，Asp，或Ala；A4是一個(gè)鍵，或是任何氨基酸；A5是一個(gè)鍵，或是Ile，Val，Leu，Nle，Phe，Ala，或D-Leu；A6是一個(gè)鍵，或是Pro，Hyp，3，4-dihydropro，噻唑烷-4-羧酸酯，Sar，NMepgl，Azt，Pip，Ala或D-Ala；A7是一個(gè)鍵，或是任何氨基酸；A8是一個(gè)鍵，或是任何氨基酸；A9是一個(gè)鍵，或是Tyr，I-Tyr，D-Tyr，His，Ala，Met，Trp，Phe，Leu，Nle，Ile，Val，Cha和Pro或是至少含有這些氨基酸或親脂性氨基酸之一的二肽；A10是水蛭素或其天然變體的序列或該序列的一部分，一個(gè)鍵，或是含有1-11個(gè)任何氨基酸殘基的肽；Y是羧基末端殘基，選自O(shè)H，(C1-C8)烷氧基、氨基、單或雙(C1-C4)烷基取代的氨基酸，或是醇末端殘基；其中A3至A9中至少一個(gè)位置是一個(gè)鍵；該方法包括以下步驟a)使用一個(gè)適當(dāng)結(jié)合有其C-末端被保護(hù)的A10組氨基酸的樹(shù)脂；b)依次偶聯(lián)A9至A1組α-氨基被保護(hù)的氨基酸，以達(dá)到被保護(hù)的所要求的氨基酸序列；c)除去所說(shuō)保護(hù)基并純化所需肽。
2.權(quán)利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A2是Tyr，Nap，phe。
3.權(quán)利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A3是一個(gè)鍵，或Glu。
4.權(quán)利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A4是一個(gè)鍵，pro，Tiq，亞氨基酸，或D-氨基酸。
5.權(quán)利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A5是一個(gè)鍵，Ile。
6.權(quán)利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A6是一個(gè)鍵，pro。
7.權(quán)利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A7是一個(gè)鍵，Glu或Ala。
8.權(quán)利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A8是一個(gè)鍵，Glu或Asp。
9.權(quán)利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A9是Ala，Cha，Ala-Cha，Tyr-Leu。
10.權(quán)利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A10是Gln，Asn，或D-Glu。
11.權(quán)利要求1的肽衍生物的制備方法，其中X是H，或NH2。
12.一種減少需治療患者中血液凝結(jié)的方法，該方法包括施用有效抗凝血量的權(quán)利要求1-11之一的肽衍生物和藥物上可接受的載體。
13.一種減少某一介質(zhì)中血液凝結(jié)的方法，該方法包括使該介質(zhì)與抗凝血有效量的權(quán)利要求1-11之一的肽接觸。
14.一種為權(quán)利要求1-11的天然存在的水蛭素類(lèi)似物的肽，其含有負(fù)責(zé)與凝血酶結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)，因此能作為凝血酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及作為有用的抗凝血?jiǎng)┑碾难苌铩?br> 文檔編號(hào)C07K14/815GK1050720SQ90108049
公開(kāi)日1991年4月17日 申請(qǐng)日期1990年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1989年10月3日
發(fā)明者約翰·L·卡斯特南凱 申請(qǐng)人:默里爾多藥物公司