專利名稱：一種菠蘿蛋白酶的制備方法
一種菠蘿蛋白酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菠蘿蛋白酶技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種菠蘿蛋白酶的制備方法。背景技術(shù)：
菠蘿蛋白酶(bromelain)是從菠蘿植株中提取的一類蛋白水解酶的總稱，主要存 在于菠蘿莖和果實中，根據(jù)提取部位的不同，分為莖菠蘿蛋白酶和果菠蘿蛋白酶。菠蘿蛋 白酶作為有活性的蛋白質(zhì)，易受到溫度、PH、金屬離子等的影響。菠蘿蛋白酶的最適反應(yīng)溫 度介于(55 60) °C，溫度再高，酶的熱失活增強(qiáng)，反應(yīng)速度下降；菠蘿蛋白酶的最適pH在 6. 5 7. 5，在7. 1附近達(dá)最大值，在酸性環(huán)境中，酶反應(yīng)速度下降快，在堿性下有個較寬的 應(yīng)用范圍，酶較穩(wěn)定的PH范圍在3. 5 4. 5。菠蘿蛋白酶的應(yīng)用已有很長的歷史，隨著提取純化技術(shù)的進(jìn)步，它將有更廣泛的 應(yīng)用。我國菠蘿資源豐富，年產(chǎn)菠蘿100萬噸以上，每年都有大量的菠蘿皮、莖被浪費(fèi)掉。同 時，我國對菠蘿蛋白酶的需求量逐年增多，特別是高活性的菠蘿蛋白酶。在醫(yī)藥領(lǐng)域，對菠 蘿蛋白酶的純度要求越來越高，甚至要明確起功能作用的具體成分，而目前工業(yè)化生產(chǎn)的 酶很難達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，就要求提取純化技術(shù)要不斷進(jìn)步，以滿足各領(lǐng)域的需求。菠蘿蛋白酶作 為生物活性物質(zhì)，決定了其易受到外部環(huán)境的影響而失活。因此，在生產(chǎn)、儲存、運(yùn)輸過程中 保持所需的酶活至關(guān)重要，這就要求酶的固定化技術(shù)等要有所突破。目前國內(nèi)菠蘿蛋白酶的現(xiàn)狀菠蘿蛋白酶的提取純化方法很多，用于工業(yè)化生產(chǎn) 的提取方法主要有3種高嶺土吸附法、單寧沉淀法、超濾濃縮法。以上方法中，高嶺土吸 附法所得產(chǎn)品酶活較高，但生產(chǎn)工藝和操作都比較復(fù)雜，所需設(shè)備多，原材料消耗也多，酶 活回收率低，污染環(huán)境，環(huán)保投資大；單寧沉淀法，生產(chǎn)工藝和操作比較簡單，但酶活回收率 低，所得酶的活性也不高，所加的單寧對環(huán)境造成一定污染。國內(nèi)工業(yè)上生產(chǎn)大多采用超濾 濃縮的方法。此法利用分子截留原理，把大于和小于蛋白酶分子的大部分物質(zhì)過濾除去，以 達(dá)到濃縮酶液的目的，菠蘿汁超濾濃縮后，再進(jìn)行干燥得到酶制品。這種方法較前兩種方法 操作步驟少，條件溫和，降低了酶活損失，生產(chǎn)和環(huán)保投入少，但所得酶制品中含有沒有酶 活性的雜蛋白較多，此類蛋白分子量和菠蘿蛋白酶近似，所以超濾過程無法除去。同時，我國對菠蘿蛋白酶的需求量逐年增多，特別是高活性的菠蘿蛋白酶。在醫(yī)藥 領(lǐng)域，對菠蘿蛋白酶的純度要求越來越高，目前工業(yè)化生產(chǎn)的酶很難到達(dá)此標(biāo)準(zhǔn)，這就要求 提取純化技術(shù)要不斷進(jìn)步，以滿足各領(lǐng)域的需求。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種菠蘿蛋白酶的制備方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其具體步驟為一、菠蘿蛋白酶的提取對超濾濃縮法進(jìn)行了改進(jìn)，把用PSA膜超濾后的菠蘿濃縮汁添加有機(jī)溶劑使酶沉淀，再經(jīng)減壓干燥等步驟得到高活性酶制品，酶活達(dá)到6. 01 X 106U/g ；二、菠蘿蛋白酶的純化(1)利用磁性氧化鐵微球固定聚丙烯酸吸附菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶的吸附率接 近100%，在pH值為6 8，以0. 01 0. 15mol/L的磷酸緩沖液和濃度為0. 6 2. Omol/L 的KCl作為洗脫液進(jìn)行洗脫，由于沒有內(nèi)擴(kuò)散阻力，吸附和解吸過程在0. 5 1. 5min內(nèi)就 能完成，此時的菠蘿蛋白酶的酶活回收率為7.4% ；所述的磷酸緩沖液的濃度優(yōu)選為0. lmol/L ；所述的洗脫液KCL的濃度優(yōu)選為1 1. 2mol/L ；所述的吸附和解吸過程時間優(yōu)選為Imin ；(2)用環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷共聚物的雙水相體系分離萃取高純度的菠蘿蛋白酶， 分離條件為共聚物中環(huán)氧乙烷質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為(含量)為5 15%，共聚物的分子量為 2000g/mol，共聚物質(zhì)量百分比為1 10%，溫度為20 30°C，pH值為5 7，鹽溶液濃度 在5 20mmol/L時，酶活回收率可達(dá)到94. 2%，酶活達(dá)到6. 55X106U/g ；所述的共聚物中環(huán)氧乙烷含量為10% ；所述的共聚物的分子量為2000g/mol，共聚物質(zhì)量百分比為5% ；所述的溫度為25°C，pH值為6. 0，鹽溶液濃度為15mmol/L。本發(fā)明制備的菠蘿蛋白酶的應(yīng)用本發(fā)明生產(chǎn)的菠蘿蛋白酶具有重要的藥用價值具有免疫刺激作用，研究表明，通 過對輔助細(xì)胞的刺激作用和對T細(xì)胞的直接抑制反應(yīng)，可以增強(qiáng)和抑制T細(xì)胞的免疫反應(yīng)； 能夠防治心血管疾病，它能加速纖維蛋白原的分解，緩解心絞痛和中風(fēng)；在各種組織中能有 效地治療水腫和炎癥，并能治療腹瀉；菠蘿蛋白酶用于燒傷脫痂，能選擇性地除去死皮，對 正常皮膚無不良影響，脫痂徹底，對治療燒傷有重要意義；菠蘿蛋白酶能夠抑制腫瘤細(xì)胞的 生長，降低毒素結(jié)合活性，并能抑制熱不穩(wěn)定毒素及霍亂毒素的分泌效應(yīng)；能增進(jìn)藥物的吸 收，與各種抗生素聯(lián)用能提高其療效，并能促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是(1)本發(fā)明的菠蘿蛋白酶生產(chǎn)簡單，可大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)；(2)本發(fā)明的菠蘿蛋白酶來源于天然植物，具有安全無毒、作用范圍廣等特；(3)本發(fā)明制備的菠蘿蛋白酶具有重要的藥用價值具有免疫刺激作用；應(yīng)用廣 泛。
具體實施方式以下提供本發(fā)明一種菠蘿蛋白酶的制備方法的具體實施方式
。實施例1一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其具體步驟為一、菠蘿蛋白酶的提取對超濾濃縮法進(jìn)行了改進(jìn)，把用PSA膜超濾后的菠蘿濃縮汁添加有機(jī)溶劑使酶沉 淀，再經(jīng)減壓干燥等步驟得到高活性酶制品，酶活達(dá)到6. 01 X 106U/g ；二、菠蘿蛋白酶的純化(1)利用磁性氧化鐵微球固定聚丙烯酸吸附菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶的吸附率接近100%，在PH值為6，以0. 01mol/L的磷酸緩沖液和濃度為0. 6mol/L的KCl作為洗脫液 進(jìn)行洗脫，由于沒有內(nèi)擴(kuò)散阻力，吸附和解吸過程在0. 5min內(nèi)就能完成，此時的菠蘿蛋白 酶的酶活回收率為7.4% ；(2)用環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷共聚物的雙水相體系分離萃取高純度的菠蘿蛋白酶， 分離條件為共聚物中環(huán)氧乙烷含量為5%，共聚物的分子量為2000為g/mol，共聚物質(zhì)量百 分比為1%，溫度為20°C，pH值為5，鹽溶液濃度在5mmol/L時，酶活回收率可達(dá)到94. 2%， 酶活達(dá)到6. 55X106U/g。實施例2一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其具體步驟為一、菠蘿蛋白酶的提取對超濾濃縮法進(jìn)行了改進(jìn)，把用PSA膜超濾后的菠蘿濃縮汁添加有機(jī)溶劑使酶沉 淀，再經(jīng)減壓干燥等步驟得到高活性酶制品，酶活達(dá)到6. 01 X 106U/g ；二、菠蘿蛋白酶的純化(1)利用磁性氧化鐵微球固定聚丙烯酸吸附菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶的吸附率接 近100%，在PH值為6. 5，以0. 05mol/L的磷酸緩沖液和濃度為0. 9mol/L的KCl作為洗脫 液進(jìn)行洗脫，由于沒有內(nèi)擴(kuò)散阻力，吸附和解吸過程在0. 7min內(nèi)就能完成，此時的菠蘿蛋 白酶的酶活回收率為7.4% ；(2)用環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷共聚物的雙水相體系分離萃取高純度的菠蘿蛋白酶， 分離條件為共聚物中環(huán)氧乙烷含量為8%，共聚物的分子量為2000為g/mol，共聚物質(zhì)量 百分比為3%，溫度為23°C，pH值為5. 5，鹽溶液濃度在8mmol/L時，酶活回收率可達(dá)到 94. 2%，酶活達(dá)到 6. 55X106U/g。實施例3一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其具體步驟為一、菠蘿蛋白酶的提取對超濾濃縮法進(jìn)行了改進(jìn)，把用PSA膜超濾后的菠蘿濃縮汁添加有機(jī)溶劑使酶沉 淀，再經(jīng)減壓干燥等步驟得到高活性酶制品，酶活達(dá)到6. 01 X 106U/g ；二、菠蘿蛋白酶的純化(1)利用磁性氧化鐵微球固定聚丙烯酸吸附菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶的吸附率接 近100%，在pH值為7，以0. lmol/L的磷酸緩沖液和濃度為lmol/L的KCl作為洗脫液進(jìn)行 洗脫，由于沒有內(nèi)擴(kuò)散阻力，吸附和解吸過程在Imin內(nèi)就能完成，此時的菠蘿蛋白酶的酶 活回收率為7.4% ；(2)用環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷共聚物的雙水相體系分離萃取高純度的菠蘿蛋白酶， 分離條件為共聚物中環(huán)氧乙烷含量10%，共聚物的分子量為2000g/mol，共聚物質(zhì)量百分 比為5%，溫度為25°C，pH值為6，鹽溶液濃度在15mmol/L時，酶活回收率可達(dá)到94. 2%， 酶活達(dá)至Ij 6. 55X106U/g。實施例4一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其具體步驟為一、菠蘿蛋白酶的提取對超濾濃縮法進(jìn)行了改進(jìn)，把用PSA膜超濾后的菠蘿濃縮汁添加有機(jī)溶劑使酶沉淀，再經(jīng)減壓干燥等步驟得到高活性酶制品，酶活達(dá)到6. 01 X 106U/g ；二、菠蘿蛋白酶的純化(1)利用磁性氧化鐵微球固定聚丙烯酸吸附菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶的吸附率接 近100%，在PH值為7. 8，以0. 12mol/L的磷酸緩沖液和濃度為1. 6mol/L的KCl作為洗脫 液進(jìn)行洗脫，由于沒有內(nèi)擴(kuò)散阻力，吸附和解吸過程在1. 2min內(nèi)就能完成，此時的菠蘿蛋 白酶的酶活回收率為7.4% ；(2)用環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷共聚物的雙水相體系分離萃取高純度的菠蘿蛋白酶， 分離條件為共聚物中環(huán)氧乙烷含量為12%，共聚物的分子量為2000g/mol，共聚物質(zhì)量 百分比為8 %，溫度為27 V，pH值為6. 6，鹽溶液濃度在17mmol/L時，酶活回收率可達(dá)到 94. 2%，酶活達(dá)到 6. 55X106U/g。實施例5一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其具體步驟為一、菠蘿蛋白酶的提取對超濾濃縮法進(jìn)行了改進(jìn)，把用PSA膜超濾后的菠蘿濃縮汁添加有機(jī)溶劑使酶沉 淀，再經(jīng)減壓干燥等步驟得到高活性酶制品，酶活達(dá)到6. 01 X 106U/g ；二、菠蘿蛋白酶的純化(1)利用磁性氧化鐵微球固定聚丙烯酸吸附菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶的吸附率接 近100%，在PH值為8，以0. 15mol/L的磷酸緩沖液和濃度為2. Omol/L的KCl作為洗脫液 進(jìn)行洗脫，由于沒有內(nèi)擴(kuò)散阻力，吸附和解吸過程在1.5min內(nèi)就能完成，此時的菠蘿蛋白 酶的酶活回收率為7.4% ；(2)用環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷共聚物的雙水相體系分離萃取高純度的菠蘿蛋白 酶，分離條件為共聚物中環(huán)氧乙烷含量為15%，共聚物的分子量為2000g/mol，共聚物質(zhì) 量百分比為10%，溫度為30°C，pH值為7，鹽溶液濃度在20mmol/L時，酶活回收率可達(dá)到 94. 2%，酶活達(dá)到 6. 55X106U/g。本發(fā)明的菠蘿蛋白酶生產(chǎn)簡單，可大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)；菠蘿蛋白酶來源于天然 植物，具有安全無毒、作用范圍廣等特；本發(fā)明制備的菠蘿蛋白酶具有重要的藥用價值具有 免疫刺激作用；應(yīng)用廣泛。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其特征在于，具體步驟為一、菠蘿蛋白酶的提取用PSA膜超濾后的菠蘿濃縮汁添加有機(jī)溶劑使酶沉淀，再經(jīng)減壓干燥等步驟得到高活 性酶制品；二、菠蘿蛋白酶的純化(1)利用磁性氧化鐵微球固定聚丙烯酸吸附菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶的吸附率接近 100%，在pH值為6 8，以0. 01 0. 15mol/L的磷酸緩沖液和濃度為0. 6 2. Omol/L的 KCl作為洗脫液進(jìn)行洗脫，吸附和解吸過程在0. 5 1. 5min內(nèi)完成；(2)用環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷共聚物的雙水相體系分離萃取高純度的菠蘿蛋白酶，分離 條件為共聚物中環(huán)氧乙烷質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5 15%，共聚物的分子量為2000g/mol，共聚物質(zhì) 量百分比為1 10%，溫度為20 30°C，pH值為5 7，鹽溶液濃度為5 20mmol/L。
2.如權(quán)利要求1所述的一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其特征在于，在所述的步驟(一) 中，所述的磷酸緩沖液的濃度為0. lmol/L。
3.如權(quán)利要求1所述的一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其特征在于，在所述的步驟(一) 中，所述的洗脫液KCL的濃度為1 1. 2mol/L。
4.如權(quán)利要求1所述的一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其特征在于，在所述的步驟(一) 中，所述的吸附和解吸過程時間為lmin。
5.如權(quán)利要求1所述的一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其特征在于，在所述的步驟(二) 中，所述的共聚物中環(huán)氧乙烷含量為10%。
6.如權(quán)利要求1所述的一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其特征在于，在所述的步驟(二) 中，所述的共聚物的分子量為2000g/mol，共聚物質(zhì)量百分比為5%。
7.如權(quán)利要求1所述的一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其特征在于，在所述的步驟(二) 中，所述的溫度為25°C，pH值為6. 0，鹽溶液濃度為15mmol/L。
8.如權(quán)利要求1所述的一種菠蘿蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述的菠蘿蛋白酶 在藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種菠蘿蛋白酶的制備方法，具體步驟為一、菠蘿蛋白酶的提取，用PSA膜超濾后的菠蘿濃縮汁添加有機(jī)溶劑使酶沉淀，再經(jīng)減壓干燥等步驟得到高活性酶制品；二、菠蘿蛋白酶的純化，(1)利用磁性氧化鐵微球固定聚丙烯酸吸附菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶的吸附率接近100％，在pH值為6～8，以0.01～0.15mol/L的磷酸緩沖液和濃度為0.6～2.0mol/L的KCl作為洗脫液進(jìn)行洗脫，吸附和解吸過程在0.5～1.5min內(nèi)完成；(2)用環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷共聚物的雙水相體系分離萃取高純度的菠蘿蛋白酶。本發(fā)明的優(yōu)點生產(chǎn)簡單，可大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)；來源于天然植物，具有安全無毒、作用范圍廣等特；應(yīng)用廣泛。
文檔編號A61P35/00GK102108350SQ20091020075
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者羌利民 申請人:南通遠(yuǎn)大生物科技發(fā)展有限公司