專利名稱：：遲緩愛德華菌弱毒菌株及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治技術(shù)，具體的說是防治遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda)感染的遲緩愛德華菌弱毒菌株及應用。
背景技術(shù)：
：遲緩愛德華菌是一種革蘭氏陰性致病菌，感染宿主范圍廣，可以感染多種低等和高等動物。在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中，該菌是魚類、兩棲類、爬行類的重要致病菌。由其引起的愛德華菌病是養(yǎng)殖魚類常見的傳染病，對養(yǎng)殖動物的健康和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害巨大。在我國，已經(jīng)從養(yǎng)殖的牛蛙、鱉、鰻鱺、牙鲆、大菱鲆、真鯛等多種動物中分離到致病性的愛德華菌。由于在生產(chǎn)過程中使用各種抗生素進行疾病的防治，已經(jīng)在世界各地分離到越來越多的愛德華菌抗藥性菌株，其中多數(shù)菌株呈多重抗藥性，不僅使治療效果下降，而且多種抗藥性菌株和抗藥質(zhì)粒的存在增加了環(huán)境的壓力，對環(huán)境造成嚴重的威脅。早在1981年，國際上就成立了世界《慎用抗生素聯(lián)盟》，其成員國已達到90多個國家。目前，不少國家已經(jīng)明令禁止在動物飼料中使用抗生素添加劑。我國加入WTO后，解決抗生素殘留等問題已經(jīng)刻不容緩。為了減少抗生素對環(huán)境的影響，通過免疫途徑防治愛德華氏菌病發(fā)生無疑是一種最佳的方式。人們對遲鈍愛德華氏菌的各種疫苗組成(包括滅活菌體細胞苗、脂多糖LPS、去類脂A的多糖、溶血素)和免疫途徑(包括注射、浸泡、口服)進行了大量的工作，但這些滅活疫苗或亞單位疫苗的保護效果都不理想，沒有達到疾病防控的要求。遲緩愛德華菌的毒力因子有溶血素、軟骨素酶、皮下壞死毒素、過氧化氫酶以及蛋白分泌系統(tǒng)，如三型(T3SS)和六型(T6SS)分泌系統(tǒng)，這些致病因子參與了細菌的黏附、定殖、侵襲和在動物宿主體內(nèi)的繁殖和擴散過程。由于遲緩愛德華菌可侵入宿主的上皮細胞和吞噬細胞，并在細胞內(nèi)生長和繁殖，因此作為一種有效的疫苗，只有系統(tǒng)地剌激動物體液和細胞的免疫應答反應才可能達到防治愛德華菌病的目的。由于滅活疫苗或亞單位疫苗存在保護抗原不完全、免疫應答反應不全面，尤其是它們主要引起動物的體液免疫應答而不能有效地剌激細胞免疫應答，是疾病防控效果不理想的根本原因；其次是滅活疫苗和亞單位疫苗主要通過注射方式進行魚類免疫，存在勞動力成本高、給藥不方便、容易引起動物應激等副作用。因此到目前為止，還沒有可用的遲緩愛德華菌疫苗進入市場。弱毒活疫苗對動物低毒活無毒，能夠有效地激發(fā)動物的體液和細胞免疫應答，為動物提供全面的免疫保護，是目前疫苗開發(fā)領(lǐng)域的主要發(fā)展方向之一；同時以弱毒活疫苗作為表達異源抗原的載體而進行多價疫苗的開發(fā)是國際的前沿和熱點。目前，美國專利有利用利福平(rifampicin)培養(yǎng)基對遲緩愛德華菌進行多次傳代的方法篩選弱毒株作為弱毒活疫苗(UnitedStatesPatent7067122)，該方法得到的弱毒株遺傳背景不清楚，細菌毒力減弱的機理不明確，在使用時容易造成毒力回復，同時難以對疫苗株進行環(huán)境監(jiān)控。利用轉(zhuǎn)座子或基因插入失活技術(shù)構(gòu)建的弱毒疫苗攜帶有抗生素和其他外源基因片斷，施用時容易將抗生素和外源基因片斷釋放到環(huán)境，存在有基因轉(zhuǎn)移或整合到其他病原體或其他生物的潛在危險。因此這些弱毒活疫苗難以通過各國的生物制品安全檢察管理機構(gòu)的審批法規(guī)，從而難以實現(xiàn)商品化。無標記基因突變技術(shù)可以對目的基因進行缺失突變。通過對多個目的基因的大片段缺失，大大降低了施用時由于毒力回復而帶來的環(huán)境傳播危險。另外，弱毒株不帶任何外源的抗生素篩選標記和外源基因片段，遺傳背景清晰、毒力減弱機理明確，易于區(qū)分疫苗株和野生型菌株，便于對疫苗株進行環(huán)境監(jiān)控，提高疫苗的安全性和可控性。同時，以無標記基因突變?nèi)醵就蛔冎曜鳛橐呙巛d體表達異源抗原制備多價疫苗具有防治多種傳染病的潛力，因而是目前國際的研究前沿和熱點領(lǐng)域。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新的遲緩愛德華菌弱毒活疫苗，以消除傳統(tǒng)弱毒疫苗存在的對環(huán)境和動物潛在的安全風險，為防治養(yǎng)殖魚類愛德華菌病提供一種安全、經(jīng)濟的遲緩愛德華菌弱毒菌株及應用。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為遲緩愛德華菌弱毒菌株，遲緩愛德華菌野生毒株MZLLSE40的aroA基因突變株，所述遲緩愛德華氏菌突變株為MZLLSE40aroA，其保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCCNo.2886，其突變株MZLLSE40aroA不含外源抗生素篩選標記和外源基因片段；遲緩愛德華菌野生毒株MZLLSE40的aroA基因和esrB基因的突變株，所述遲緩愛德華氏菌突變株為MZLLSE40aroAesrB，其保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCCNo.2887，其突變株MZLLSE40aroAesrB不含外源抗生素篩選標記和外源基因片段。所述突變株MZLLSE40aroA其于2009年1月19日，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，保藏編號為CGMCCNo.2886分類名稱為遲緩愛德華氏菌Edwardsiellatarda。所述突變株MZLLSE40aroB其于2009年1月19日，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，保藏編號為CGMCCNo.2887分類名稱為遲緩愛德華氏菌Edwardsiellatarda。所述菌株可采用胰大豆蛋白胨培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，同時每升培養(yǎng)基中補充苯丙氨酸20mg，酪氨酸20mg和色氨酸20mg。遲緩愛德華氏菌株MZLLSE40aroA或遲緩愛德華氏菌株MZLLSE40aroAesrB經(jīng)活化培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)后，將106-109cfu/mL的遲緩愛德華氏菌株MZLLSE40aroA或遲緩愛德華氏菌株MZLLSE40aroAesrB的細菌細胞與無菌磷酸緩沖鹽溶液混合，作為防治養(yǎng)殖魚類愛德華菌病的弱毒活疫苗。將上述弱毒活疫苗注射給藥濃度為106-108cfu/尾，浸泡給藥濃度為106-108cfu/mL，浸泡時間1030min。本發(fā)明所具有的優(yōu)點本發(fā)明由遲緩愛德華野生菌株MZLLSE40得到的二株無標記基因缺陷突變株MZLLSE40aroA和MZLLSE40aroAesrB，與野生菌株MZLLSE40相比毒力大大下降，用作疫苗可有效保護實驗用魚防御強致病性愛德華菌野生型毒株的感染。本發(fā)明弱毒活疫苗可根據(jù)4需要，以注射或浸泡方式給藥免疫而獲使免疫魚獲得高效的免疫保護。此外，本發(fā)明弱毒活疫苗可用于各種脊椎動物防治愛德華菌病，包括各種經(jīng)濟養(yǎng)殖魚和淡水養(yǎng)殖魚、觀享魚、鱉、蛙等。本發(fā)明提供的遲緩愛德華菌弱毒疫苗不含任何外源基因片段和外源抗生素篩選標記，對環(huán)境不存在外源基因轉(zhuǎn)移和抗生素基因傳播的危險。由于采用基因缺失突變手段進行毒力基因和必須氨基酸代謝途徑合成基因的大片段缺失、弱毒疫苗毒力不可回復、生長能力受限于必須氨基酸，極大地消除在環(huán)境和動物傳播大量病原體的危險；突變的遺傳背景清楚，減毒機理明確，易于區(qū)分疫苗株和野生型菌株，便于對疫苗株進行環(huán)境監(jiān)控，提高疫苗的安全性和可控性。具體實施例方式實施例1:弱毒活疫苗制備l)TSB培養(yǎng)基胰蛋白胨17.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L，NaC15.0g/L，K2HP042.5g/L，葡萄糖2.5g/L，苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，pH7.3。將上述成分溶解于1000ml蒸餾水中，用10X的NaOH調(diào)節(jié)pH，于121磅、125t:滅菌15分鐘，冷卻置室溫備用。2)TSA培養(yǎng)基胰蛋白胨17.Og/L，大豆蛋白胨3.0g/L，NaC15.0g/L，K2HP042.5g/L，葡萄糖2.5g/L，苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，瓊脂粉1.5g/L，pH7.3。將上述成分溶解于1000ml蒸餾水中，用10%的NaOH調(diào)節(jié)pH，于121磅、125t:滅菌15分鐘，冷卻至6(TC制成平板備用。3)PBS緩沖液Na2HP042H202.74g/L，NaH2P04H200.63g/L。將上述成分溶解于1000ml蒸餾水，于121磅、125t:滅菌15分鐘，冷卻置室溫備用。遲緩愛德華菌野生毒株MZLLSE40的aroA基因突變株，所述遲緩愛德華氏菌突變株為MZLLSE40aroA，MZLLSE40aroA缺失了野生型菌株MZLLSE40染色體上的芳香氨基酸合成代謝途徑的aroA基因，其保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCCNo.2886，其突變株MZLLSE40aroA不含外源抗生素篩選標記和外源基因片段；遲緩愛德華菌野生毒株MZLLSE40的aroA基因和esrB基因的突變株，所述遲緩愛德華氏菌突變株為MZLLSE40aroAesrB，MZLLSE40aroAesrB缺失了染色體上的aroA基因和三型分泌系統(tǒng)上的esrB基因，其保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCCNo.2887，其突變株MZLLSE40aroAesrB不含外源抗生素篩選標記和外源基因片段。本發(fā)明的遲緩愛德華菌株MZLLSE40菌株為野生型毒株，從我國北方沿海養(yǎng)海水養(yǎng)魚場爆發(fā)愛德華氏菌病的大菱鲆魚體內(nèi)分離，為致病性菌株。其生化鑒定特征符合伯杰氏細菌系統(tǒng)鑒定手冊(第九版)。疫苗制備取-S(TC保存的遲緩愛德華氏菌株MZLLSE40aroA或遲緩愛德華氏菌株MZLLSE40aroAesrB菌株劃線接種于TSA平板，在25-30。C培養(yǎng)48小時。挑取3-5個菌落，接種于lOOmL的TSB培養(yǎng)基，在25-30。C搖床(200轉(zhuǎn)/分鐘)培養(yǎng)12-18小時，取5-10%(V/V)的量接種500mL的TSB培養(yǎng)基，25-30。C搖床(200轉(zhuǎn)/分鐘)培養(yǎng)12-18小時。收活細菌菌液，用PBS洗滌三次，離心收集菌體(4000Xg，10分鐘，4t:)，而后混合于PBS緩沖液其中細菌濃度為10S-10、fu/mL，保存于fC備用。實施例2:以絲竹魚(TrichogastertrichopterusPallas)為試驗動物的半數(shù)致死量LD5。的測定體重為7-8g的健康試驗魚暫養(yǎng)于100L水族箱，配以流動循環(huán)水處理和凈化系統(tǒng)，養(yǎng)殖水溫維持20-22°C。暫養(yǎng)2周后，隨機分組至10L試驗水族箱，每個水族箱10尾魚，繼續(xù)暫養(yǎng)2周。試驗水族箱每天上午換水一次，換水量為1/2，維持水溫20-22t:。在人工感染試驗時，每組實驗魚分別注射不同稀釋濃度(105109cfU/mL)的弱毒疫苗株和野生型菌株，每尾魚腹部肌肉注射O.1M1，對照組注射PBS0.lml/尾。觀察14天，記錄每組每天的死亡魚數(shù)，計算累計死亡數(shù)和死亡率，計算LD5。值(見表1)。表1遲緩愛德華菌野生型和弱毒株對絲竹魚的致病力試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述結(jié)果表明，相對于野生型遲緩愛德華菌株MZLLSE40，弱毒株的毒力顯著降低，其中MZLLSE40aroA的毒力下降約41倍，MZLLSE40aroAesrB的毒力下降了1000倍以上。實施例3:以牙鲆(Paralichthysolivaceus)為試驗動物的半數(shù)致死量LD5。的測定體長為8-10cm的健康試驗魚暫養(yǎng)于的1000L水族箱，配以流動循環(huán)水處理和凈化系統(tǒng)，養(yǎng)殖水溫維持18-2(TC。暫養(yǎng)4周后，隨機分組至20L試驗水族箱，每個水族箱10尾魚，繼續(xù)暫養(yǎng)2周。試驗水族箱每天上下午各換水一次，換水量為1/2，維持水溫18-2(TC。在人工感染試驗時，每組實驗魚分別注射不同稀釋濃度(105-106cfu/mL)的弱毒疫苗株和野生型菌株，每尾魚腹部肌肉注射O.lmL，觀察14天，記錄每組每天的死亡魚數(shù)，計算累計死亡數(shù)和死亡率，計算LD5。值(見表2)。表2遲緩愛德華菌野生型和弱毒株對牙鉀的致病力試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述結(jié)果表明，相對于野生型遲緩愛德華菌株MZLLSE40，弱毒株的毒力顯著降低，其中MZLLSE40aroA的毒力下降了約31倍，MZLLSE40aroAesrB的毒力下降了1000倍以上。實施例4:遲緩愛德華菌在牙鉀體內(nèi)的存活實驗體長為8-10cm的健康試驗魚暫養(yǎng)4周后隨機分為4組，每組20尾。將制備的遲緩愛德華菌液采用腹部肌肉注射的方式感染實驗魚，野生菌株MZLLSE40的注射劑量為1.03X105cfu/尾，MZLLSE40aroA的注射劑量為5.4X105cfu/尾，MZLLSE40aroAesrB的注射劑量為7.8X106cfu/尾，對照組注射0.1ml/尾的PBS。養(yǎng)殖水溫18_20°C。每7天從每組分別取魚3尾，無菌取腎臟混合稱重后以PBS緩沖液勻漿、稀釋，在TSA平板涂布進行細菌計數(shù)，每稀釋度3個平板，記錄細菌數(shù)量并取平均值(表3)。表3遲緩愛德華菌在牙鲆體內(nèi)的存活實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*為第6天瀕死魚腎臟的細菌數(shù)量，到第6天時全部實驗魚死亡。上述結(jié)果顯示，野生菌株MZLLSE40注射后的第6天，實驗魚全部死亡，瀕死魚呈現(xiàn)典型的敗血癥狀，瀕死魚腎臟內(nèi)的細菌數(shù)量為7.97X109cfu/g;弱毒株在魚腎臟的細菌數(shù)量逐漸下降，其中MZLLSE40aroA株在第28天檢測不到細菌，MZLLSE40aroAesrB在第35天檢測不到細菌。這些結(jié)果表明，突變株細菌在魚體內(nèi)的生存能力極大地下降。實施例5:以牙鲆為實驗動物的注射免疫效力試驗取健康試驗魚隨機分為5組，每組30尾魚。將制備的遲緩愛德華菌液采用腹部肌肉注射的方式進行免疫，MZLLSE40aroA株的注射濃度為5.4X105cfu/尾、5.4X107cfu/尾，MZLLSE40aroAesrB株的注射濃度為8X106cfu/尾、8X108cfu/尾，對照組注射0.lml/尾的PBS。養(yǎng)殖水溫18-20免疫4周后將各種試驗組大菱鲆用野生型遲緩愛德華菌LSE40活菌以4.5X105cfu/尾的劑量進行攻毒。在7天內(nèi)統(tǒng)計免疫組和對照組死亡數(shù)，計算免疫保護率(見表4)免疫保護率計算公式為免疫保護率(RPS)%=(對照組死亡率_免疫組死亡率)/對照組死亡率X100%表4遲緩愛德華菌弱毒疫苗免疫牙鲆的免疫保護率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從上可以看出，隨著接種劑量增加，弱毒疫苗的免疫保護率也增加。在105cfu/尾107cfu/尾的接種劑量范圍顯示良好的防治愛德華菌感染的效果。實施例6:以牙鉀為試驗動物的浸泡免疫效力試驗取健康試驗魚隨機分5組，每試驗組30尾魚。將制備的遲緩愛德華菌分別以無特定病原體(SPF)海水配制成濃度為106Cfu/mL、108cfu/mL的疫苗溶液。每組魚在不同濃度的疫苗溶液中浸泡30分鐘，對照組以無菌PBS浸泡30分鐘，水溫保持18-2(TC。免疫30天后對各試驗組魚進行肌肉注射攻毒，攻毒濃度為4.5X105cfu/尾。在7天內(nèi)統(tǒng)計免疫組和對照組死亡數(shù)，計算免疫保護率(見表5)。表5遲緩愛德華菌弱毒疫苗免疫大菱鲆30天后的免疫保護效力<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從上可以看出，隨著浸泡接種劑濃度增加，弱毒疫苗的免疫保護率也增加，以108cfu/mL的浸泡接種濃度獲得的免疫保護效果最好。權(quán)利要求一種遲緩愛德華菌弱毒菌株，其特征在于遲緩愛德華菌野生毒株MZLLSE40的aroA基因突變株，所述遲緩愛德華氏菌突變株為MZLLSE40aroA，其保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCCNo.2886，其突變株MZLLSE40aroA不含外源抗生素篩選標記和外源基因片段；遲緩愛德華菌野生毒株MZLLSE40的aroA基因和esrB基因的突變株，所述遲緩愛德華氏菌突變株為MZLLSE40aroAesrB，其保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCCNo.2887，其突變株MZLLSE40aroAesrB不含外源抗生素篩選標記和外源基因片段。2.按權(quán)利要求1所述的遲緩愛德華菌弱毒菌株，其特征在于所述菌株可采用胰大豆蛋白胨培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，同時每升培養(yǎng)基中補充苯丙氨酸20mg，酪氨酸20mg和色氨酸20mg。3.按權(quán)利要求l所述的遲緩愛德華菌弱毒菌株的應用，其特征在于遲緩愛德華氏菌株MZLLSE40aroA或遲緩愛德華氏菌株MZLLSE40aroAesrB經(jīng)活化培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)后，將106-109cfu/mL的遲緩愛德華氏菌株MZLLSE40aroA或遲緩愛德華氏菌株MZLLSE40aroAesrB的細菌細胞與無菌磷酸緩沖鹽溶液混合，作為防治養(yǎng)殖魚類愛德華菌病的弱毒活疫苗。4.按權(quán)利要求3所述的遲緩愛德華菌弱毒菌株的應用，其特征在于將上述弱毒活疫苗注射給藥濃度為106-108(^11/尾，浸泡給藥濃度為1(f-108cfu/mL，浸泡時間1030min。全文摘要本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治技術(shù)，具體的說是防治遲緩愛德華菌感染的遲緩愛德華菌弱毒菌株及應用。遲緩愛德華氏菌突變株為MZLLSE40aroA，其保存于CGMCC，保藏編號為CGMCCNo.2886，遲緩愛德華氏菌突變株為MZLLSE40aroAesrB，其保存于CGMCC，保藏編號為CGMCCNo.2887。將106-109cfu/mL的遲緩愛德華氏菌株MZLLSE40aroA或遲緩愛德華氏菌株MZLLSE40aroAesrB的細菌細胞與無菌磷酸緩沖鹽溶液混合，作為防治養(yǎng)殖魚類愛德華菌病的弱毒活疫苗。本發(fā)明涉及菌株的毒力相關(guān)基因和營養(yǎng)代謝相關(guān)基因框內(nèi)大片段缺失、毒力不可回復，不含有外援基因片段和抗生素抗性標記，對環(huán)境和動物安全。文檔編號A61P31/04GK101705198SQ20091016459公開日2010年5月12日申請日期2009年7月17日優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日發(fā)明者李杰,楊佳銀,王波,肖鵬,茅云翔,莫照蘭申請人:中國科學院海洋研究所