同時(shí)檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的熒光探針pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物的檢測方法和檢測試劑盒，具體涉及一種同時(shí)檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的熒光探針PCR檢測方法，所述的方法包括：利用特異性探針和引物對(duì)，以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，其特征在于:所述引物對(duì)分別為SeqIDNo.1、SeqIDNo.2、SeqIDNo.3和SeqIDNo.4所示的序列；SeqIDNo.1:5’-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’SeqIDNo.2:5’-CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’SeqIDNo.3:5’-TCCATTCGTCTGTGCGACAA-3’SeqIDNo.4:5’-AAAACACGTTCGGATGGATTG-3’所述探針為能與遲緩愛德華氏菌或鮰愛德華氏菌的基因組DNA位于所述引物對(duì)之間的序列相同或互補(bǔ)的核苷酸序列，并且所述探針的5’端和3’端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)；所述探針為SeqIDNo.5和SeqIDNo.6所示的序列,SeqIDNo.5：5’-ATCCTCAACGTCGAGAAGGCGCG-3’SeqIDNo.6：5’-CACTATGAGGGTGGGATCAAGGCGTTT-3’。
【專利說明】同時(shí)檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的熒光探針PCR方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物的檢測方法和檢測試劑盒，具體涉及用于同時(shí)檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的引物和探針序列，以及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]遲鈍愛德華氏菌(Mdwardsiella sp.)廣泛分布于海水和淡水中，感染各種養(yǎng)殖水生動(dòng)物,對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖危害極大。對(duì)鰻魚、鯰魚、鱔魚和其他多種動(dòng)物致病，可造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，引起魚類發(fā)病的病原菌主要為遲緩愛德華氏菌(疋和鮰愛德華氏菌{E.1ctaluri^0現(xiàn)已知遲緩愛德華氏菌是多種淡、海水養(yǎng)殖魚類的重要病原菌，引起魚類腎臟、肝臟膿瘍病灶的疾病，損失嚴(yán)重，是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害較大的病原菌。
[0003]目前國內(nèi)外建立的愛德華氏菌基因檢測技術(shù)有檢測遲緩愛德華氏菌的普通PCR檢測技術(shù)，以及檢測鮰愛德華氏菌的普通PCR檢測技術(shù)，這些方法需要多次才能把這兩種菌檢測出來，而且需要通過凝膠電泳才能觀察檢測結(jié)果，檢測方法較熒光PCR方法為繁瑣而費(fèi)時(shí)。
[0004]目前國內(nèi)外尚未開發(fā)建立同時(shí)檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的熒光探針PCR檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明為了快速檢測水生動(dòng)物中的遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌，開發(fā)建立了檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。
[0006]本發(fā)明一方面開發(fā)了一種同時(shí)檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的熒光探針PCR檢測方法。
[0007]本發(fā)明另一方面提供一種用于同時(shí)檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的試劑盒。
[0008]一種同時(shí)檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的熒光探針PCR檢測方法，所述的方法包括:利用特異性探針和引物對(duì)，以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，其特征在于:所述引物對(duì)分別為Seq ID N0.1、Seq IDN0.2、Seq IDN0.3和Seq IDN0.4所示的序列；
Seq ID N0.1: 5，-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’
Seq ID N0.2: 5’ -CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’
Seq ID N0.3: 5’ -TCCATTCGTCTGTGCGACAA-3’
Seq ID N0.4: 5’ -AAAACACGTTCGGATGGATTG-3’
其中:Seq ID N0.1為遲緩愛德華氏菌的上游引物，Seq ID N0.2為遲緩愛德華氏菌的下游引物，Seq ID N0.3為鮰愛德華氏菌的上游引物，Seq ID N0.3為鮰愛德華氏菌的下游引物；所述探針為能與遲緩愛德華氏菌或鮰愛德華氏菌的基因組DNA位于所述引物對(duì)之間的序列相同或互補(bǔ)的寡核苷酸序列，并且所述探針的5’端和3’端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)；
優(yōu)選的，所述探針為Seq ID N0.5和Seq ID N0.6所示的序列，
Seq ID N0.5:5’ -ATCCTCAACGTCGAGAAGGCGCG-3’ ；
Seq ID N0.6:5’ -CACTATGAGGGTGGGATCAAGGCGTTT-3’，
其中，Seq ID N0.5為能與遲緩愛德華氏菌的基因組DNA位于所述引物對(duì)之間的序列相同或互補(bǔ)的寡核苷酸序列；Seq ID N0.6為能與鮰愛德華氏菌的基因組DNA位于所述引物對(duì)之間的序列相同或互補(bǔ)的寡核苷酸序列。
[0009]所述Seq ID N0.5探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，Seq ID N0.6探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC，所述探針3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。
[0010]所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的引物終濃度為0.25μπιΟ1/ dm3，探針終濃度為
0.5 μ mol/ dm3。
[0011]所述實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件包括:先95 °C變性I min，然后95 V 10 S、550C 10 s、68 V 30 s循環(huán)40次，在68°C進(jìn)行FAM和VIC雙通道熒光采集。
[0012]本發(fā)明另一方面提供一種用于同時(shí)檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有能擴(kuò)增出遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的基因片段的引物對(duì)，所述引物對(duì)分別為Seq ID N0.1、Seq IDN0.2、Seq IDN0.3和Seq IDN0.4所示的序列；
Seq ID N0.1: 5，-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’
Seq ID N0.2: 5’ -CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’
Seq ID N0.3: 5’ -TCCATTCGTCTGTGCGACAA-3’
Seq ID N0.4: 5’ -AAAACACGTTCGGATGGATTG-3’
所述探針為能與遲緩愛德華氏菌或鮰愛德華氏菌的基因組DNA位于所述引物對(duì)之間的序列相同或互補(bǔ)的核苷酸序列，并且所述探針的5’端和3’端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)；
所述探針為Seq ID N0.5和Seq ID N0.6所示的序列，
5， -ATCCTCAACGTCGAGAAGGCGCG-3’
5’ -CACTATGAGGGTGGGATCAAGGCGTTT-3’。
[0013]所述Seq ID N0.5探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，Seq ID N0.6探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC，所述探針3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明開發(fā)建立同時(shí)檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的熒光探針PCR檢測方法，彌補(bǔ)了目前國內(nèi)外無同時(shí)檢測上述兩種愛德華氏菌的實(shí)時(shí)熒光PCR方法的空白。利用熒光探針與目的片段雜交，釋放檢測信號(hào)的熒光探針PCR檢測技術(shù)具有比普通PCR更高的檢測靈敏度和特異性，且操作步驟簡單，反應(yīng)結(jié)束后直接讀取檢測結(jié)果，無需打開反應(yīng)管進(jìn)行電泳檢測，減少了交叉污染，可以更有效的保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，亦有效提高檢測效率，縮短檢測時(shí)間。
[0015]【專利附圖】

【附圖說明】圖1示本發(fā)明實(shí)施例所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌陰性結(jié)果圖:其中，曲線I為遲緩愛德華氏菌陽性對(duì)照；曲線2為鮰愛得華氏菌陽性對(duì)照；曲線3為陰性對(duì)照；曲線4為受檢樣品。
[0016]圖2示本發(fā)明實(shí)施例所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測遲緩愛德華氏菌陽性結(jié)果圖:其中1.遲緩愛德華氏菌陽性對(duì)照；2.鮰愛得華氏菌陽性對(duì)照；3.受檢樣品；4.陰性對(duì)照。
[0017]圖3示本發(fā)明實(shí)施例所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測鮰愛德華氏菌陽性結(jié)果圖:其中，曲線I為遲緩愛德華氏菌陽性對(duì)照；曲線2為鮰愛得華氏菌陽性對(duì)照；曲線3和4為受檢樣品；曲線5為陰性對(duì)照。
[0018]

【具體實(shí)施方式】
為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面進(jìn)一步披露一些非限制實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0019]本發(fā)明所使用的物料和試劑均可以從市場上購得或者可以通過本發(fā)明所描述的方法制備而得。
[0020]實(shí)施例1
1、主要儀器和試劑
熒光定量PCR儀:美國ABI公司7300型。核酸純化系統(tǒng):美國Thermo公司KingFisherml型。核酸磁珠法提取試劑盒:美國Omega生物技術(shù)公司Mag-Si Tissue DNA kit。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液:北京天根生物工程有限公司的RealMasterMix (Probe)試劑盒。
[0021]2引物和探針
選擇GenBank所收錄的愛德華氏菌gyrb基因序列，在該基因序列保守區(qū)域用Primerexpress 3.0軟件設(shè)計(jì)引物,并在愛德華氏菌種特異區(qū)域設(shè)計(jì)TaqMan探針,經(jīng)NCBI Blast檢驗(yàn)其特異性。設(shè)計(jì)并篩選出2套特異性引物和TaqMan-MGB探針。遲緩愛德華氏菌檢測探針5’端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，鮰愛德華氏菌檢測探針5’端標(biāo)記VIC熒光報(bào)告基團(tuán)。引物和探針由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見表1。
[0022]表1遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌檢測引物和探針序列

【權(quán)利要求】
1.一種同時(shí)檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的熒光探針PCR檢測方法，所述的方法包括:利用特異性探針和引物對(duì)，以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，其特征在于:所述引物對(duì)分別為Seq ID N0.1、Seq IDN0.2、Seq IDN0.3和Seq IDN0.4所示的序列；
Seq ID N0.1: 5，-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’
Seq ID N0.2: 5’-CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’
Seq ID N0.3: 5’-TCCATTCGTCTGTGCGACAA-3’
Seq ID N0.4: 5’-AAAACACGTTCGGATGGATTG-3’ 所述探針為能與遲緩愛德華氏菌或鮰愛德華氏菌的基因組DNA位于所述引物對(duì)之間的序列相同或互補(bǔ)的核苷酸序列，并且所述探針的5’端和3’端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)； 所述探針為Seq ID N0.5和Seq ID N0.6所示的序列，
Seq ID N0.5:5’ -ATCCTCAACGTCGAGAAGGCGCG-3’
Seq ID N0.6:5’ -CACTATGAGGGTGGGATCAAGGCGTTT-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:所述SeqID N0.5探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，Se q ID N0.6探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC，所述探針3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于:所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的引物終濃度為0.25 μ mol/ dm3,探針終濃度為0.5 μ mol/ dm3。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于:所述實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件包括:先 95 °C變性 I min，然后 95 V 10 s、55°C 10 s、68 V 30 s 循環(huán) 40 次，在 68°C進(jìn)行 FAM和VIC雙通道熒光采集。
5.一種用于同時(shí)檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有能擴(kuò)增出遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的基因片段的引物對(duì)，所述引物對(duì)分別為 Seq ID N0.1、Seq IDN0.2、Seq IDN0.3 和 Seq IDN0.4 所示的序列；
Seq ID N0.1: 5，-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’
Seq ID N0.2: 5’-CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’
Seq ID N0.3: 5’-TCCATTCGTCTGTGCGACAA-3’
Seq ID N0.4: 5’-AAAACACGTTCGGATGGATTG-3’ 所述探針為能與遲緩愛德華氏菌或鮰愛德華氏菌的基因組DNA位于所述引物對(duì)之間的序列相同或互補(bǔ)的核苷酸序列，并且所述探針的5’端和3’端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)； 所述探針為Seq ID N0.5和Seq ID N0.6所示的序列，
5， -ATCCTCAACGTCGAGAAGGCGCG-3’
5’ -CACTATGAGGGTGGGATCAAGGCGTTT-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于:所述SeqID N0.5探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，Seq ID N0.6探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC，所述探針3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104164514SQ201410441438
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】郭書林, 陳信忠, 賈鵬, 龔艷清, 楊俊萍, 陳炳穎, 孔繁德 申請人:廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心