專利名稱：：丹參注射液中的化合物及其在心血管疾病治療中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種從丹參或丹參注射液中提取的新的酚酸類化合物，本發(fā)明還涉及這一新化合物的制備方法及其在制備治療心血管疾病藥物和丹參注射液質量控制中的用途。
背景技術：
：丹參注射液是中藥材丹參經過現(xiàn)代工藝提取加工而成，用于心腦血管疾病預防和治療，主要應用于活血化瘀，通脈養(yǎng)心，冠心病胸悶和心絞痛，臨床應用已有20余年，其中的活性成分主要為以丹參素、丹酚酸B為主的酚酸類化合物，目前尚有大量有效成分未被發(fā)現(xiàn)。國內已有66個廠家擁有丹參注射液的藥品批準文號，制備方法均參照部頒標準WS3-B-3766-98-2004，其含測指標和鑒別指標均只有原兒茶醛一種有效成分，顯然不能滿足提高中藥注射液治療標準的要求。
發(fā)明內容為了全面提高丹參注射劑的安全性、有效性和質量可控性，深入研究其活性物質基礎，經過大量的實驗研究，利用現(xiàn)代分離提取技術和結構確定手段，在丹參制劑中發(fā)現(xiàn)了一種新的丹酚酸類化合物，藥理研究表明化合物有很好的心肌保護活性和明顯的抗氧化活性。由于該新化合物與已發(fā)現(xiàn)的丹酚酸A、丹酚酸B等酚酸類結構相近，故將該化合物命名為丹酚酸M，其結構式為式A所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式A丹酚酸M化學名稱為3_(3，4_dihydroxyphenyl)_2_(3_(3_(3，4_dihydroxyphenyl)_2，7_dihydroxy_2，3_dihydrobenzofu:ran_4_yl)acryloyloxy)propanoicacid5(3-(3，4-二羥基苯基)-2-(3-(3_(3，4_二羥基苯基(-2，7_二羥基_2，3_二氫苯并呋喃-4_)丙烯酰氧基)_丙酸。丹酚酸M:淡黃色粉末，高分辨質譜HR-ESI-MS給出分子量為510.1053，分子式為C^H^OllUV吸收光譜Amax(MeOH)nm(loge):324(3.2)，290(3.16)，旋光[a]25D=8(MeOH，lmg/ml);紅外光譜IR(KBr)，Vmax/cm—1:3387，1696，1612，1518，1448，1265，1172，1072。ESI-MS顯示準分子離子峰為m/z509[M-H]—，表明該化合物分子量為510，多級質譜碎片離子峰主要有m/z311[M-H-198]—，表明該化合物含有(3，4_二羥基)乳酸(丹參素)結構片段；核磁共振氫譜顯示共有10個不飽和質子信號和5個飽和質子信號，其中S7.53和S6.20(J=16.OHz)為一對雙鍵質子信號。三個芳香質子S6.45(bs)、S6.87(d，J=8.OHz)、S6.50(m，J=8.OHz)和另三個芳香質子S6.70(bs)、S6.73(d，J=8.OHz)以及S6.49(dd，J=8.0，1.5Hz)分別屬于兩個ABX耦合系統(tǒng)，兩個芳香質子信號S7.15和S6.82(J=8.OHz)屬于AB偶合系統(tǒng)。信號S3.05(dd，J=14.5，4.OHz)、S2.94(dd，J=14.5，4.OHz)以及S5.09(dd，J=4.OHz)構成OCHCH2片段。信號S4.38(bs)禾PS5.65(bs)構成OCHCH片段，其中，信號S5.65對應的碳信號為S108.3，推測該碳信號為半縮醛或縮醛。利用DMSO-de作為核磁共振溶劑，觀察到羥基質子信號S7.47(bs)與該碳上質子信號S5.65的力」HCOSY相關，證實了為半縮醛結構。利用2D-NMRCHJHCOSY、HMQC、HMBC)，鑒定了該化合物的平面結構，并歸屬了所有碳氫信號。查閱了國內外相關文獻后確定該化合物為未見文獻報道的新骨架化合物。氫譜和碳譜數(shù)據(jù)歸屬如下丹酚酸M氫譜和碳譜數(shù)據(jù)(CD3OD)，單位S:ppm<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明提供的該化合物的制備方法為丹參藥材加水煎煮，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮。乙醇沉淀，濾過，濾液回收乙醇，蒸餾水稀釋，過制備液相分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即為該化合物。制備液相分離條件流動相由0.05%甲酸-水(A)和乙腈(B)組成，梯度洗脫程序為028min，A-B(82:18，v/v);2860min，A-B(82:1865:35，v/v)，流速4mL/min，分離用半制備色譜柱為ZorbaxSB_C18(9.4mmX25cm，5ym)，保留時間tR=22.lmin。丹酚酸M也可以直接在根據(jù)部頒標準制備的丹參注射液中分離得到，分離條件可參考上述條件。ZORBAXStableBond(SB)反相HPLC系列色譜柱在低pH下具有超常穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。其獨特的單官能團硅烷空間保護鍵合相在低pH下不被水解，還可以耐受很高的溫度，最高900C。其中的SB-Cw半制備柱(9.4mmX25cm)適用于低毫克級物質的制備，根據(jù)待分離物質的量，可是選擇合適的C18半制備型和制備型色譜柱。發(fā)明效果本發(fā)明提供了一種新的酚酸類化合物丹酚酸M，由于其化學結構是新的且具有心肌保護和抗氧化活性，因而具有進一步研制開發(fā)成有效的治療心血管疾病藥物的前景，且可以用于丹參注射液質量控制標準中。說明書附圖丹參注射液的LC-MS指紋圖譜具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但不以此限制本發(fā)明。實施例1.丹酚酸M的制備方法以丹參藥材為原料取丹參1500g，加水8倍量煎煮三次，第一次2小時，第二、三次各1.5小時，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至750m1。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量為75%，第二次使含醇量為85%，每次均冷藏放置后濾過，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml，加蒸餾水至400ml，混勻，靜置，濾過。使用半制備色譜柱為ZorbaxSB-C^(9.4mmX25cm，5i!m)分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即獲得該化合物50.lmg。流動相由0.05%甲酸-水(A)和乙腈(B)組成，梯度洗脫程序為028min，A-B(82:18，v/v);2860min，A-B(82:1865:35，v/v)，流速4ml/min，分離用，保留時間tK=22.lmin。實施例2.丹酚酸M的制備方法以丹參藥材為原料取丹參1500g，加6倍量水煎煮三次，每次1.5小時，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至750ml。加乙醇沉淀二次，各使含醇量為75%，靜置后濾過，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml浸膏。浸膏蒸餾水稀釋，靜置，濾過。使用半制備色譜柱分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即獲得該化合物48.Omg。半制備色譜柱分離、純化同實施例1。實施例3.丹酚酸M的制備方法以丹參藥材為原料取丹參1500g，加10倍量水煎煮三次，每次2.0小時，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至750ml。加乙醇沉淀二次，各使含醇量為85%，靜置后濾過，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml浸膏。浸膏蒸餾水稀釋，靜置，濾過。使用半制備色譜柱分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即獲得該化合物44.lmg。半制備色譜柱分離、純化同實施例1。實施例4.丹酚酸M的制備方法以丹參藥材為原料取丹參1500g，加12倍量水煎煮二次，每次2.0小時，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至700ml。加乙醇沉淀二次，各使含醇量為85%，靜置后濾過，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml浸膏。浸膏蒸餾水稀釋，靜置，濾過。使用半制備色譜柱分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即獲得該化合物37.Omg。半制備色譜柱分離、純化同實施例1。實施例5.丹酚酸M的制備方法以1200ml丹參注射液制劑為原料通過半制備ODS-HPLC分離、純化，獲得該化合物。分離條件同實施例1，即獲得該化合物50.lmg實施例6.丹酚酸M的制備方法以1200ml丹參注射液制劑為原料通過半制備ODS-HPLC分離、純化，獲得該化合物。使用半制備色譜柱為ZorbaxSB-C18(9.4mmX15cm，5ym)，流速2ml/min，其他分離條件同實施例l，僅獲得該化合物15.3mg。實施例7.丹酚酸M的制備方法以1200ml丹參注射液制劑為原料通過半制備ODS-HPLC分離、純化，獲得該化合物。使用半制備色譜柱為SB-C18(21.2mmX250mm，10iim)，流速10ml/min，流動相為0.1%甲酸-水(A)和甲醇(B)，洗脫程序為0，55XB;45min，65XB;tK二24.lmin，僅獲得該化合物6.3mg。實施例5至7的丹參注射液由正大青春寶制藥有限公司提供，屬于按照部頒標準WS3-B-3766-98-2004制備的上市產品。實施例8.活性測定MTT法體外培養(yǎng)H9C2心肌細胞種于96孔板上。種板24h后，加入該化合物，給藥濃度為100、40、16、6.4、2.56、1.28uM。每個濃度設定三復孔，平行兩板，陽性藥為100uM的維生素C。加藥12h后，洗去培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入600uM雙氧水損傷3h。損傷結束后，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入MTT試劑，孵育4小時，吸去上清，加入匿SO溶解，分光光度法(550nm)測定細胞存活率。根據(jù)模型組計算藥物的保護率，采用SPSS軟件計算得到該化合物保護雙氧水損傷心肌細胞的半數(shù)有效劑量(EC50)為23uM。另外DPK1法(l，l-二苯基苦基苯肼法)測試該化合物的抗氧化作用，結果顯示其EC50為52uM。實施例9丹參注射液的指紋圖譜構建方法儀器與試劑AgilentllOO型高效液相色譜儀(德國Agilent公司)，配四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、ChemStation工作站控制系統(tǒng)；AgilentllOO型質譜檢測器與HPLC聯(lián)用。分離用色譜柱為AgilentZorbaxSB-C18(4.6mmX250mm，5iim)。流動相為乙月青(德國Meek公司，色譜純)和Milli-Q超純水(Millipore公司，美國)；甲酸(色譜純，美國TEDIA公司)。各批次丹參注射液由正大青春寶制藥有限公司提供，均為市售產品。樣品預處理。丹參注射液50iiL，重蒸水稀釋至200iU，HPLC進樣量20iU。色譜條件。色譜柱AgilentZorbaxSB-C18(4.6mmX250mm，5iim)，流速0.5mL/min，柱溫3(TC;流動相為0.05%甲酸水(A相)和0.05%甲酸乙腈(B相)，采用梯度洗脫010min，10%B20%B，10min30min，20%B47%B，30min50min，47%B100%B，即0—10min—30min—50min，B:10%—20%—47%—100%;DAD檢測器(190400nm)。質譜檢測器，ESI電離源，負離子，采用全掃描模式(TICmode)，掃描范圍m/z1001000，電力電壓150V，干燥氮氣流速9.5L/min，干燥氣體溫度350°C，毛細管電壓3000V。根據(jù)上述條件獲得丹參注射液的LC-MS指紋圖譜，其特征峰包括了目前已發(fā)現(xiàn)的丹參注射液中的大部分有效成分，包括丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B等，還包括了本發(fā)明中在丹參注射液中新發(fā)現(xiàn)的丹酚酸M，使丹參注射液質量控制技術有上了一個新的臺階。該指紋圖譜中各特征峰表示如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權利要求一種酚酸類化合物丹酚酸M，其結構式為F2009101548417C0000011.tif2.—種制備丹酚酸M的方法，其特征在于取丹參注射液，過半制備色譜柱分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即獲得該化合物。流動相由0.05%甲酸-水和乙腈組成，梯度洗脫程序為0—28min—60min:乙腈18%—18%—35X，流速4ml/min，分離用半制備色譜柱為ZorbaxSB_C18(9.4mmX25cm)，保留時間tK=22.lmin。3.—種制備丹酚酸M的方法，其特征在于丹參藥材加6-8倍量水煎煮二三次，每次1.52小時，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮。乙醇沉淀二次，是每次含醇量在75%85%，濾過，濾液回收乙醇，蒸餾水稀釋，靜置過濾，過制備液相分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即為該化合物；制備液相分離條件為流動相由0.05%甲酸-水和乙腈組成，梯度洗脫程序為0—28min—60min，乙腈18%—18%—35%，流速4ml/min，分離用半制備色譜柱為SB-C18，9.4mmX25cm，5iim，保留時間tK=22.lmin。4.權利要求2所述的一種制備丹酚酸M的方法，其特征在于取丹參1500g，加水8倍量煎煮三次，第一次2小時，第二、三次各1.5小時，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至750ml;加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量為75%，第二次使含醇量為85%，每次均冷藏放置后濾過，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml，加蒸餾水稀釋至400ml，混勻，靜置，濾過。使用半制備色譜柱分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即獲得該化合物；流動相由0.05%甲酸-水和乙腈組成，梯度洗脫程序為0—28min—60min:乙腈18%—18%—35X，流速4mL/min，分離用半制備色譜柱為ZorbaxSB_C18(9.4mmX25cm)，保留時間tK=22.lmin。5.丹酚酸M在制備治療心血管疾病藥物中的應用。6.—種丹參注射液指紋圖譜構建方法，其特征是指紋圖譜中包含丹酚酸M的特征峰，丹酚酸M的保留時間為17.Omin;丹參注射液50iiL，重蒸水稀釋至200iiL，HPLC進樣量20yL;色i普條^(牛色i普柱AgilentZorbaxSB_C18(4.6mmX250mm，5um)，、流速0.5ml/min，柱溫30。C;流動相為0.05%甲酸-水和0.05%甲酸_乙腈，采用梯度洗脫0—10min—30min—50min，0.05%甲酸-乙腈10%—20%—47%—100%;DAD檢測器，檢測波長190400nm;質譜檢測器，ESI電離源，負離子，采用全掃描模式，掃描范圍m/z1001000，電力電壓150V，干燥氮氣流速9.5L/min，干燥氣體溫度35(TC，毛細管電壓3000V。全文摘要本發(fā)明公開了一種從丹參中提取的新的酚酸類化合物丹酚酸M，該新化合物也可以從丹參注射液中提取，發(fā)明同時公開了分別從丹參和丹參注射液中該新化合物的提取方法。藥理研究表明丹酚酸M具有心肌保護和抗氧化活性，因而具有進一步研制開發(fā)成有效的治療心血管疾病藥物的前景，且可以用于丹參注射液質量控制標準中。文檔編號A61P39/00GK101717384SQ20091015484公開日2010年6月2日申請日期2009年11月24日優(yōu)先權日2009年11月24日發(fā)明者周天芳,張曉麗,徐金鐘,王木蘭,王治,瞿海斌,程翼宇,聶晶,范驍輝,莫必琪申請人:正大青春寶藥業(yè)有限公司