專利名稱：防治自身免疫性疾病的化合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及防治自身免疫性疾病的化合物及其 用途。
背景技術(shù)：
糖尿病通常分I型糖尿病(Type I Diabetes)和II型糖尿病(Type II Diabetes) 和妊娠期糖尿病(Gestational Diabetes)。I型糖尿病與II型糖尿病的發(fā)病機制完全不 同。其中I型糖尿病多發(fā)生于青少年，其胰島素分泌缺乏，必須依賴胰島素治療維持生命。 II型糖尿病多見于30歲以后中、老年人，其胰島素的分泌量并不低甚至還偏高，病因主要 是機體對胰島素不敏感(即胰島素抵抗)。目前認為，I型糖尿病是一種自身免疫性疾病，在多種因素共同作用下，機體對胰 島素多種抗原成分免疫欠耐受，最終導致了胰島素的絕對缺乏。目前I型糖尿病的主要治 療手段是終生注射胰島素或胰島素類似物來控制血糖水平。近幾年對I型糖尿病的治療手 段也取得了一定的突破，如異種移植、新型胰島素及藥物治療、I型糖尿病疫苗、基因免疫治 療以及致病基因的破譯等方面的研究為I型糖尿病提供了新的思路和方法。一旦患上“糖尿病”，將減少壽命十年之多，且可能發(fā)生的并發(fā)癥遍及全身。近年 來，中國糖尿病患病率顯著增加。目前糖尿病患者人數(shù)已超過6000萬，占世界糖尿病人群 總數(shù)的五分之一，患病率居世界第二位，并且以每天至少3000人的速度增加。因此，開發(fā)有效的藥物以控制糖尿病已經(jīng)成為本領(lǐng)域迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供防治自身免疫性疾病的化合物及其用途。在本發(fā)明的第一方面，提供黃連素、其藥學上可接受的鹽或其衍生物的用途，用于 制備預防、治療或改善自身免疫性疾病的組合物。在一個優(yōu)選例中，所述的黃連素的藥學上可接受的鹽是黃連素的鹽酸鹽。在另一優(yōu)選例中，所述的自身免疫性疾病是Thl或Thl7細胞相關(guān)的自身免疫性疾病。在另一優(yōu)選例中，所述的自身免疫性疾病是I型糖尿病。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于預防或治療胰島炎。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于抑制炎癥因子的產(chǎn)生；或促進抗炎因子 的產(chǎn)生。在另一優(yōu)選例中，所述的炎癥因子選自IL-17、IL_6、IFNy或TNF α。在另一優(yōu)選例中，所述的抗炎因子選自IL_4或IL-10。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于抑制T細胞的Thl7分化，即抑制T細胞向 Th 17細胞分化。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于激活Erk。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物通過激活Erk抑制T細胞的Thl7分化。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于抑制T細胞的Thl分化，即抑制T細胞向 Thl細胞分化。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于下調(diào)p38或JNK的活性。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物通過抑制p38或JNK的活性來抑制T細胞的Thl7 分化。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于降低STAT4的蛋白表達水平；或增多 STAT4的泛素化。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物通過泛素_蛋白酶體途徑來降低STAT4的蛋白表 達水平。另一方面，提供一種預防、治療或改善自身免疫性疾病的方法，所述方法包括，給 予需要預防、治療或改善自身免疫性疾病的對象有效量的黃連素、其藥學上可接受的鹽或 其衍生物。在另一優(yōu)選例中，所述的對象是哺乳動物。更特別的，所述的哺乳動物是人。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1、黃連素降低了糖尿病小鼠的發(fā)病率。11周的雌性NOD小鼠灌胃給黃連素鹽酸鹽共14天。A 每周測量隨機血糖，血糖 高于250mg/dL時算作糖尿病。B 14天灌胃結(jié)束后，取胰腺做H&E染色，圖示為胰島炎評分 標準(0分到4分)。C 黃連素鹽酸鹽或者溶劑給藥后小鼠胰腺的胰島炎評分情況。圖2、黃連素處理的NOD小鼠的細胞因子表達譜。11周的雌性NOD小鼠灌胃給予黃連素鹽酸鹽共14天，取出脾臟細胞。用不同濃 度的α -⑶3抗體刺激48個小時。收上清用ELISA方法測量細胞因子IL_17 (A)、IL_6 (B)、 IFN y (C)、IL-4 (D)、IL-IO (E)、TNF α (F)。圖3、黃連素抑制了體外Thl7的分化。A 用從NOD小鼠中純化出來的⑶4+T細胞在Thl7分化條件下培養(yǎng)4天，分別加入 不同濃度的黃連素鹽酸鹽，然后細胞內(nèi)染色觀察IL-17和IFNy的表達情況。B 上述CD4+T細胞培養(yǎng)2天后，檢查IL-17，IL-17F和ROR γ t的mRNA表達。C:上述CD4+T細胞在上述培養(yǎng)條件下分別加入圖示的各種藥物(濃度分 另Ij 是 SB-202190 (0. 5 μ g/ml)，PD98059 (10 μ Μ)，SP600125 (1 μ Μ)，BADGE (1 μ Μ)， rosiglitazone (1 μ Μ), wortmannin (1 μ Μ))培養(yǎng) 4 天，然后細胞內(nèi)染色觀察 IL-17 和 IFNy 的表達情況。D 上述⑶4+Τ細胞在上述培養(yǎng)條件下分別加入圖示的各種藥物(其中黃連素鹽酸 鹽濃度是10 μ Μ)培養(yǎng)4天，然后細胞內(nèi)染色觀察IL-17和IFNy的表達情況。E ⑶4+Τ細胞分別在下列培養(yǎng)條件下培養(yǎng)α -⑶3/28的抗體(購自 BDPharmingenM用數(shù)字“1”表示)，Thl7培養(yǎng)條件(用數(shù)字“2”表示)或者Thl7培養(yǎng)條 件加上黃連素鹽酸鹽(用數(shù)字“3”表示)。然后用免疫印跡檢查Erk的本底(Erkl/2)和磷酸化(p-Erkl/2)的表達情況。條帶的光密度表示在右邊的插圖里。F :11周的雌性NOD小鼠灌胃給黃連素鹽酸鹽(用量是200mg/Kg體重)共14天， 取出脾臟細胞，用免疫印跡檢查Erk的本底和磷酸化的表達情況。條帶的光密度表示在右 邊的插圖里(η = 4，**，ρ < 0. 01)。圖4、Erk是人和小鼠的Thl7的分化負調(diào)控因子。A 用從NOD小鼠中純化出來的⑶4+T細胞在Thl7分化條件下培養(yǎng)4天，分別加入 不同濃度的PD98059，然后細胞內(nèi)染色觀察IL-17和IFNy的表達情況。B、C 用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染了野生型(B)或者突變(C)的Erk的⑶4+細胞在Thl7分 化條件下培養(yǎng)，胞內(nèi)染色觀察IL-17和IFNy的表達情況。D =NOD小鼠連續(xù)三天腹腔注射PD98059，純化出來的⑶4+T細胞在Thl7分化條件 下培養(yǎng)4天，然后細胞內(nèi)染色觀察IL-17和IFNy的表達情況。E 分離人的⑶4+T細胞在Thl7分化條件下培養(yǎng)3天，分別加入圖中所示的藥物， 用ELISA檢測IL-17的分泌。圖5、黃連素抑制了體外Thl的分化。A 用從NOD小鼠中純化出來的⑶4+T細胞在Thl分化條件下培養(yǎng)4天，分別加入 不同濃度的黃連素鹽酸鹽，然后細胞內(nèi)染色觀察IL-17和IFNy的表達情況。B 上述CD4+細胞培養(yǎng)2天后，檢查IFN γ和Τ-bet的mRNA表達。C:上述⑶4+細胞在上述培養(yǎng)條件下分別加入圖示的各種藥物(濃度分 另Ij 是 SB-202190 (0. 5 μ g/ml)，PD98059 (10 μ Μ)，SP600125 (1 μ Μ)，BADGE (1 μ Μ)， Rosiglitazone (1 μ Μ), Wortmannin (1 μ Μ))培養(yǎng) 4 天，然后細胞內(nèi)染色觀察 IL-17 和 IFNy 的表達情況。D ⑶4+Τ細胞分別在下列培養(yǎng)條件下培養(yǎng)⑶3/28的抗體(用數(shù)字“ 1”表示)，Thl 培養(yǎng)條件(用數(shù)字“2”表示)或者Thl培養(yǎng)條件加上黃連素鹽酸鹽(用數(shù)字“3”表示)。 然后用免疫印跡檢查Ρ38ΜΑΡΚ和JNK的本底(ρ38)和磷酸化(ρ-ρ38)的表達情況。條帶的 光密度表示在右邊的插圖里。E 11周的雌性NOD小鼠灌胃給黃連素鹽酸鹽共14天，取出脾臟細胞，用免疫印跡 檢查ρ38ΜΑΡΚ和JNK的本底和磷酸化的表達情況。條帶的光密度表示在右邊的插圖里(η =4，**，ρ < 0. 01)。圖6、黃連素通過泛素化-蛋白酶體通路降解STAT4。A 用從NOD小鼠中純化出來的⑶4+Τ細胞在Thl分化條件下培養(yǎng)，分別加入圖中 所示的藥物，免疫印跡檢測相關(guān)蛋白(STAT1/4本底及磷酸化和actin)表達。B:用從NOD 小鼠中純化出來的CD4+T細胞在Thl分化條件下培養(yǎng)，分別加入圖中所示的藥物，免疫印跡 檢測相關(guān)蛋白(STAT4和Actin)表達。C 用從NOD小鼠中純化出來的⑶4+T細胞在Thl分 化條件下培養(yǎng)，分別加入圖中所示的藥物，免疫印跡檢測相關(guān)蛋白(STAT1/4本底及磷酸化 和Actin)表達。D 用從NOD小鼠中純化出來的⑶4+T細胞在Thl分化條件下培養(yǎng)，分別加 入圖中所示的藥物，然后用STAT4的抗體(購自Cell signalling)沉降細胞裂解液，免疫 印跡檢測相關(guān)蛋白(STAT4，Ubiquitin，Actin)表達。圖7、黃連素抑制I型糖尿病中Thl7和Thl分化的機制的示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期而廣泛的研究，首次揭示黃連素對于改善或治療I型糖尿病、 胰島炎等自身免疫性疾病具有極其優(yōu)異的效果。所述的黃連素可抑制炎癥因子的產(chǎn)生、促 進抗炎因子的產(chǎn)生；所述的黃連素還可抑制τ細胞的Thl7分化以及Thl分化；所述的黃連 素還可降低STAT4的蛋白表達水平或增多STAT4的泛素化，從而實現(xiàn)防治自身免疫性疾病 的效果。黃連素黃連素(Berberine)是一種來源于天然的草本植物的有效藥用成分，為一種生物 堿?，F(xiàn)有技術(shù)中，黃連素一直用于治療腹瀉，并且現(xiàn)代藥理學研究證實黃連素具有顯著的抗 心力衰竭、抗心律失常、降低膽固醇、抗血管平滑肌增殖、抗血小板等作用，因而在心血管系 統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面也可能有效果。黃連素的結(jié)構(gòu)式為 在本發(fā)明中，所述的“黃連素”可以是純凈形式存在的式(I)所示的化合物，或純 度大于85%的式(I)所示的化合物，也可以是含有1_90襯％的黃連素或其藥學上可接受的 鹽的提取物。黃連素的制備方法可采用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)人員所了解的方法。所述的黃連素可提 取自任何含有黃連素或其衍生物(如鹽或酯)的植物中，所述的植物包括但不限于黃連、 黃柏、三顆針?？蓪ⅫS連素的植物提取物直接給藥；或者可將黃連素的植物提取物進行提純 和加工，制成純凈形式的黃連素、或各種形式的黃連素的制劑后，用于給藥。此外，所述的黃連素也可通過化學合成的方式獲得，這是目前本領(lǐng)域完全可以實 現(xiàn)的。在本發(fā)明中，還包括黃連素的藥學上可接受的鹽。所述的“藥學上可接受的鹽”是 指黃連素與無機酸或有機酸反應生成的鹽。優(yōu)選地，所述的黃連素的藥學上可接受的鹽是 黃連素的鹽酸鹽(又稱為鹽酸小檗堿)，其具有式(II)所示的結(jié)構(gòu)式 黃連素的異構(gòu)體、外消旋體、水合物或前體也被包括在本發(fā)明中，只要它們具有與 黃連素相同或接近的防治自身免疫性疾病的功能。所述的“前體”指當用適當?shù)姆椒ǚ?后，該化合物的前體在哺乳動物體內(nèi)進行代謝或化學反應而轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)式(I)或(II)的一 種化合物或其類似物。[ 0061]所述的黃連素或其異構(gòu)體、外消旋體、藥學上可接受的鹽、水合物或前體可通過化 學合成的方式獲得。用途本發(fā)明提供了黃連素、其藥學上可接受的鹽或衍生物的用途，用于制備預防或治 療哺乳動物自身免疫性疾病的組合物。所述的自身免疫性疾病優(yōu)選的是指Thl或Thl7細胞相關(guān)的一類疾病；更優(yōu)選地， 所述的自身免疫性疾病是I型糖尿病。為了論證黃連素的上述用途，本發(fā)明人采用了經(jīng)典的I型糖尿病模型(NOD小鼠) 為研究對象，用灌胃的方式給黃連素，然后觀察I型糖尿病的發(fā)病情況。本發(fā)明人的研究結(jié) 果發(fā)現(xiàn)，黃連素可以顯著的降低I型糖尿病的發(fā)病率，降低IL-17和IFNy等炎癥因子的分 泌，同時明顯改善了胰島炎癥狀。因為Thl7和Thl是導致胰島炎和I型糖尿病的兩群T細 胞，所以本發(fā)明人研究了黃連素對于這兩群T細胞的分化的影響。體外的T細胞分化實驗 顯示，黃連素可以抑制Thl7和Thl的分化。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，黃連素是分別通過激活Erk 和抑制P38MAPK和JNK來抑制Thl7和Thl的分化的。本發(fā)明人的實驗結(jié)果還提示，Erk是 人和小鼠的Thl7分化的一個負調(diào)控因子。另一方面，黃連素通過P38/MAPK和JNK來抑制 STATl和STAT4的活性，并且通過了泛素化蛋白酶體來降解STAT4，進而調(diào)控Thl的分化?？?之，黃連素通過調(diào)控MAPK的活性進而調(diào)控Thl和Thl7的分化，從而降低了 I型糖尿病的發(fā) 病率并改善了胰島炎癥。所以黃連素也可以用于其它與Thl和Thl7細胞有關(guān)的自身免疫 性疾病的改善和治療。黃連素抑制I型糖尿病中Thl7和Thl分化的機制參見圖7的示意圖。組合物如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明的組合物”包括藥物組合物和飲食補充劑(如保健品組 合物)，只要它們含有黃連素或其藥學上可接受的鹽或衍生物作為預防或治療哺乳動物自 身免疫性疾病的活性成分。本發(fā)明提供了一種藥物組合物，含有(a)有效量的黃連素或其藥學上可接受的 鹽或其衍生物；以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明中，術(shù)語“含有，，表示各種成分可一起應用于本發(fā)明的混合物或組合物中。 因此，術(shù)語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語“含有”中。本發(fā)明中，“藥學上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應 (如毒性、刺激和變態(tài)反應)即有合理的效益/風險比的物質(zhì)。本發(fā)明中，“藥學上可接受的載體”是用于將本發(fā)明的黃連素或其生理上可接受的 鹽或其衍生物傳送給動物或人的藥學上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可 以是液體或固體。從易于制備和給藥的立場看，優(yōu)選的藥物組合物是固態(tài)組合物，尤其是片劑和固 體填充或液體填充的膠囊。藥物組合物的口服給藥是優(yōu)選的。本發(fā)明所述的藥物組合物的劑型可以是多種多樣的，只要是能夠使活性成分有效 地到達哺乳動物體內(nèi)的劑型都是可以的。比如可選自片劑、膠囊、粉末、顆粒、糖漿、溶液、 懸浮液、或氣霧劑。其中黃連素可以存在于適宜的固體或液體的載體或稀釋液中。本發(fā)明的黃連素及其組合物也可儲存在適宜于注射或滴注的消毒器具中。
通常，在本發(fā)明的藥物組合物中，黃連素作為活性成分占總重量的1-50% ；較佳地 2-40% ；更佳地3-30%，其余為藥學上可接受的載體以及其他添加劑等物質(zhì)。通常，所述的飲食補充劑含有0. 001_50襯％的黃連素或其藥學上可接受的鹽或其 衍生物；(b)食品上可接受的載體或賦形劑。給藥方式和劑型本發(fā)明的藥物組合物可以通過常規(guī)方法制成任何常規(guī)的制劑形式。所用的活性成分的有效劑量可隨所用的化合物、給藥的模式和待治療的疾病的嚴 重程度而變化。然而，通常當本發(fā)明的黃連素或其藥學上可接受的鹽或其衍生物每天以約 l-300mg/kg動物體重的劑量給予時，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以1-3次分開的 劑量給予，或以緩釋形式給藥。對大部分大型哺乳動物而言，每天的總劑量約為5-1000mg， 較佳地約為10-500mg。適用于內(nèi)服的劑量形式，包含與固態(tài)或液態(tài)藥學上可接受的載體密 切混合的約l_200mg的活性化合物。可調(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應答。例如，由治 療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。 所述化合物或其藥學上可接受的鹽及其組合物可通過口服以及靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮 下等途徑給藥；優(yōu)選的是口服給藥。固態(tài)載體包括淀粉、乳糖、磷酸二鈣、微晶纖維素、蔗 糖和白陶土，而液態(tài)載體包括無菌水、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米 油、花生油和芝麻油)，只要適合活性成分的特性和所需的特定給藥方式。在制備藥物組合 物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，例如調(diào)味劑、色素、防腐劑和抗氧化劑如維生素E、 維生素C、BHT和BHA。適應于注射的藥物形式包括無菌水溶液或分散液和無菌粉(用于臨時制備無菌 注射溶液或分散液)。在所有情況中，這些形式必須是無菌的且必須是流體以易于注射器 排出流體。在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，且必須能防止微生物(如細菌和真菌)的 污染影響。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二 醇)、它們的適當混合物和植物油。黃連素或其藥學上可接受的鹽及其組合物還可與其它活性成分或藥物聯(lián)合給藥。當兩種或兩種以上的藥物聯(lián)合給藥時，一般具有優(yōu)于兩種藥物分別單獨給藥的效^ ο本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)首次發(fā)現(xiàn)了黃連素在防治I型糖尿病等自身免疫性疾病中的新用途，其藥理 作用強，且沒有毒副作用，具有極好的藥用前景。(2)所述的黃連素可以直接提取自植物中，在毒性低，服用方便的同時，還具有來 源豐富，價格低廉，制備工藝簡單的優(yōu)點。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1、黃連素降低了糖尿病小鼠的糖尿病發(fā)病率將黃連素鹽酸鹽(結(jié)構(gòu)式如式(II)所示，購自Sigma)配制于溶劑PBS，形成均勻 的濁液，用于給藥I型糖尿病小鼠(NOD小鼠)。本發(fā)明人檢測了黃連素能否降低NOD小鼠(購自上海市斯萊克公司)的糖尿病發(fā) 病率。11周的雌性NOD小鼠灌胃給黃連素鹽酸鹽共14天(每天給予黃連素鹽酸鹽200mg/ Kg體重)。每周測量隨機血糖，血糖高于250mg/dL時算作糖尿病，觀察發(fā)生糖尿病的小鼠數(shù) 目。并且，在14天灌胃結(jié)束后，取胰腺做H&E染色，觀察染色情況以判斷胰島炎發(fā)生情況。 以溶劑給藥組NOD小鼠作為對照。結(jié)果，100%的對照組NOD小鼠發(fā)病了，但是黃連素鹽酸 鹽處理組只有50%的小鼠發(fā)病，見圖IA0黃連素鹽酸鹽處理組的小鼠的胰島炎也得到了緩解。胰島炎的評分標準在圖IB 中有所表示。本發(fā)明人的分析顯示，經(jīng)過黃連素鹽酸鹽給藥后，77. 0%的胰島沒有發(fā)生胰島 炎；這一數(shù)字在對照組是45.2%，見圖1C。此外，整體而言，黃連素鹽酸鹽處理組的小鼠的 胰島炎也得到了顯著的降低。上述結(jié)果表示，黃連素對于NOD小鼠的糖尿病的發(fā)生具有顯著的治療作用。實施例2、黃連素處理顯著的改變了 NOD小鼠的細胞因子表達譜接下來本發(fā)明人分析了黃連素有沒有改變小鼠的細胞因子的分泌情況。11周的雌性NOD小鼠灌胃給黃連素鹽酸鹽共14天(每天給予200mg/Kg體重量 的黃連素鹽酸鹽)，以溶劑給藥組NOD小鼠作為對照。常規(guī)方法分離小鼠的脾臟細胞，用抗 ⑶3 (α-⑶3)的抗體(購自BD Pharmingen)處理48個小時，收上清，用常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸 附實驗(ELISA)分別檢測IL-17、IL_6、IFNy, TNFa、IL-4和IL-10的濃度。以溶劑給藥 組NOD小鼠作為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-17、IL-6、IFNy和TNF α等炎癥因子下降，而抗炎因子IL-4和 IL-10則有不同程度的上升，見圖2。實施例3、黃連素通過激活Erk抑制了 Thl7的體外分化因為IL-17是Thl7的標記分子，所以本發(fā)明人推測黃連素可能對于Thl7的分化 有所影響。用從NOD小鼠中純化出來的CD4+T細胞在Thl7分化條件下(在IL_6[10ng/mL]， TGF β [2ng/mL], IL-I β [10ng/mL], IL-23 [10ng/mL]，a-IL-4 抗體[10μ g/mL], a -IFN y 抗體[10 μ g/mL]條件下孵育)培養(yǎng)4天，分別加入不同濃度(5 μ M，10 μ Μ)的黃連素鹽酸 鹽，然后細胞內(nèi)染色觀察IL-17和IFNy的表達情況。結(jié)果，不給予黃連素的情況下大約 20%的T細胞變成了分泌IL-17的細胞。但是給予黃連素鹽酸鹽可以濃度依賴的抑制IL-17 陽性細胞的百分比，見圖3A。除了使用FACS技術(shù)檢測IL-17的分泌以外，本發(fā)明人還采用常規(guī)的RealTime PCR 技術(shù)檢測了 Thl7分化的幾個重要標記分子，包括IL-17、IL-17F(IL-17F是和IL-17同一家 族的細胞因子，也是Thl7的標志性標記分子)和Ror Yt。⑶4+細胞培養(yǎng)2天后，檢查IL-17， IL-17F和RORYt的mRNA表達，結(jié)果見圖3B (其中a -⑶3/28表示a -⑶3/28抗體孵育細 胞，a -CD3/28 抗體是 T 細胞生長必須的；Cocktail 表示 IL-6 [10ng/mL]，TGF β [2ng/mL]， IL-I β [10ng/mL]，IL-23 [10ng/mL]，α -IL-4 抗體[10 μ g/mL]，α -IFN γ 抗體[10 μ g/mL]孵育細胞)。這些基因的表達都用肌動蛋白(actin)作內(nèi)參進行了標準化處理。為了弄清楚黃連素是通過什么機制來抑制Thl7的分化的，本發(fā)明人使用了 一系列信號通路的激動劑或者抑制劑。這些信號通路都是被其他實驗室證實是受黃 連素調(diào)控的。這些激動劑和抑制劑包括:SB-202190(p38MAPK的抑制劑，購自Sigma), PD98059 (MEKl/2-Erkl/2 的抑制劑，購自 Sigma), SP600125 (JNK/SAPK 的抑制劑，購自 Sigma), BADGE(PPARa 的抑制劑，購自 Sigma), Rosiglitazone (PPAR γ 的激動劑，購自 Sigma)和Wortmannin(PI3K/Akt的抑制劑，購自Sigma)。除此以外，本發(fā)明人還使用了 Compound C (AMPK的抑制劑，購自Sigma)，但是在實驗中，Compound C呈現(xiàn)了一種廣譜的抑 制和細胞毒性，所以本發(fā)明人就放棄了對Compound C的研究。非常幸運的是，本發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)了 PD98059可以上調(diào)Thl7的分化，見圖3C。此外，PD98059還可以逆轉(zhuǎn)黃連素鹽酸鹽對Thl7的分化的抑制，見圖3D。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)黃連素鹽酸鹽在體內(nèi)和體外均可以激活Erkl/2，見圖3E，F(xiàn)。上述數(shù)據(jù)提示，黃連素鹽酸鹽可能是通過激活Erk來抑制Thl7分化的。實施例4、Erk對Th 17分化的調(diào)控本發(fā)明人的上述結(jié)果提示Erk很有可能是Thl7分化中的一個負調(diào)節(jié)分子；為 了驗證這個假設，本發(fā)明人首先檢測PD98059在Thl7分化中的作用。用從NOD小鼠中純 化出來的⑶4+T細胞在Thl7分化條件下培養(yǎng)4天，分別加入不同濃度(10 μ M，20 μ M)的 PD98059，然后細胞內(nèi)染色觀察IL-17和IFNy的表達情況，以不加入PD98059的細胞作為 對照(Control)。結(jié)果如圖4A所示，PD98059可以濃度依賴的促進Thl7的分化。將野生型Erk 基因(Erkl :gene ID 5595 ;Erk2 :gene ID 26413)和突變型基因 (蛋白水平上將Erkl和Erk2的第71位和第52位的賴氨酸變成精氨酸后構(gòu)成的編碼基 因；獲自美國西南醫(yī)學中心)克隆入pM-IRES-GFP載體(購自美國CellBiolab公司)的 BamHI/XhoI酶切位點內(nèi)，構(gòu)成重組表達載體，利用專門用來包裝病毒的細胞Plat-E (美國 Cell Biolab公司)進行病毒包裝，獲得攜帶野生型或者突變的Erk的逆轉(zhuǎn)錄病毒。用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染了野生型或者突變型的Erk的CD4+細胞在Thl7分化條件下培 養(yǎng)，胞內(nèi)染色觀察IL-17和IFNy的表達情況。結(jié)果如圖4B和4C所示，突變形式的Erk可 以促進Thl7的分化。為了進一步檢測Erk在Thl7分化中的作用，本發(fā)明人給小鼠注射PD98059 (連續(xù)3 天，每天1次，劑量如圖所示)。3天以后，取出小鼠的T細胞做Thl7分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD98059 的處理可以提高T細胞向Thl7分化的能力，見圖4D。除此以外，本發(fā)明人還有一個更有意思的發(fā)現(xiàn)Erk對Thl7的分化的負調(diào)控作用 可以推廣到人的T細胞，見圖4E。實施例5、黃連素通過抑制p38MAPK和JNK來抑制Thl的分化眾所周知的，Thl是I型糖尿病發(fā)生的一個重要致病因子。因為本發(fā)明人的初步 數(shù)據(jù)顯示黃連素可以降低小鼠的IFNy的分泌，所以本發(fā)明人關(guān)心黃連素能否影響Thl的 分化。如圖5A所示，在Thl分化條件下培養(yǎng)4天，大約80 %的T細胞變成了分泌IFN γ 的細胞。但是黃連素鹽酸鹽可以濃度依賴的抑制IFNy陽性細胞的百分比。除了使用FACS技術(shù)檢測IFN γ的分泌以外，本發(fā)明人還用Real Time PCR技術(shù)檢測了 Thl分化的幾個重要標記分子，包括IFNy和T-bet，這些基因的表達都用actin做內(nèi) 參進行了標準化處理，結(jié)果見圖5B。為了弄清楚黃連素鹽酸鹽是通過什么機制來抑制Thl的分化的，本發(fā)明人繼續(xù) 使用上述信號通路的激動劑或者抑制劑。非常幸運的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 SB-202190和 SP600125下調(diào)Thl的分化，見圖5C。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)黃連素鹽酸鹽在體內(nèi)和體外均可以下調(diào)p38和JNK的活性 (即發(fā)生磷酸化的比例下降)，見圖5D，E0這些數(shù)據(jù)提示，黃連素鹽酸鹽是通過抑制P38和JNK的活性來抑制Thl的分化的。實施例6、黃連素通過泛素-蛋白酶體途徑來降低STAT4的蛋白表達水平因為STATl (IFNy的下游分子)和STAT4(IL_12的下游分子)在Thl的分化中扮 演重要的作用，所以本發(fā)明人也檢測了黃連素鹽酸鹽對STATl和STAT4的本底和磷酸化的 表達水平。如圖6A所示，黃連素鹽酸鹽顯著降低了 STATl和STAT4的磷酸化水平。非常有意思的是，本發(fā)明人還有一個意料之外的發(fā)現(xiàn)黃連素鹽酸鹽除了降低了 STAT4的磷酸化水平以外，還可以降低STAT4的穩(wěn)定性。如果加入MG132 (蛋白酶體抑制劑， 購自Cell signalling)，黃連素鹽酸鹽對STAT4本底的降低就被抑制了，見圖6B。因為本發(fā)明人在上面的試驗中發(fā)現(xiàn)，黃連素鹽酸鹽可以降低p38和JNK的活性，所 以本發(fā)明人想知道黃連素鹽酸鹽是不是通過P38和JNK來改變STAT4的表達的。結(jié)果顯示， P38和JNK的抑制劑并不能改變STATl和STAT4的本底表達；只能改變STATl和STAT4的 磷酸化，見圖6C。為了進一步驗證黃連素鹽酸鹽是通過泛素-蛋白酶體來降解STAT4的，本發(fā)明 人用STAT4的抗體和細胞裂解液孵育，然后用proteinA/G agarose beads沉降，最后用 Western blot檢測泛素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃連素鹽酸鹽可以顯著增多STAT4的泛素化，見圖6D。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
權(quán)利要求
黃連素、其藥學上可接受的鹽或其衍生物的用途，其特征在于，用于制備預防或治療自身免疫性疾病的組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的黃連素的藥學上可接受的鹽是黃連 素的鹽酸鹽。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的自身免疫性疾病是Thl或Thl7細胞 相關(guān)的自身免疫性疾病。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的自身免疫性疾病是I型糖尿病。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于預防或治療胰島炎。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于抑制炎癥因子的產(chǎn) 生；或促進抗炎因子的產(chǎn)生。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的炎癥因子選自IL-17、IL-6、IFNy或 TNFa ；或所述的抗炎因子選自IL-4或IL-10。
8.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于抑制T細胞的Thl7分化。
9.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于抑制T細胞的Thl分化。
10.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于降低STAT4的蛋白 表達水平；或增多STAT4的泛素化。
全文摘要
本發(fā)明涉及防治自身免疫性疾病的化合物及其用途，所述的化合物是黃連素、其藥學上可接受的鹽或其衍生物，所述的自身免疫性疾病是I型糖尿病或胰島炎等。本發(fā)明首次提出了黃連素的新用途，其藥理作用強，且沒有毒副作用，具有極好的藥用前景。
文檔編號A61P29/00GK101919844SQ200910053118
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月16日
發(fā)明者崔國梁, 秦瑩 申請人:中國科學院上海生命科學研究院