專利名稱：自身免疫性疾病聯(lián)合診斷的蛋白質(zhì)芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明自身免疫病聯(lián)合診斷的蛋白質(zhì)芯片屬于生命科學領(lǐng)域。涉及一種蛋白質(zhì)芯片、制備方法及檢測方法，蛋白質(zhì)芯片是在固態(tài)基底上有序排布的蛋白質(zhì)或多肽陣列，以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)進行并行檢測、識別、鑒定和診斷的器件?？蓮V泛應(yīng)用于生物學、醫(yī)學及其相關(guān)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病(autoimmune diseases)是指機體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導致自身組織損害所引起的疾病。常見的自身免疫性疾病可分為非器官特異性和器官特異性兩類，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)等屬于前者，重癥肌無力、自身免疫性溶血性貧血等屬于后者。自身免疫性疾病的起始原因和確切發(fā)病機制都不明確，病程一般較長，多呈反復發(fā)作和慢行性遷延的過程，任何年齡、性別均可發(fā)病，女性多見且有遺傳傾向，易伴發(fā)于免疫缺陷病或惡性腫瘤。特別是非器官特異性自身免疫性疾病會導致全身多器官病變、損害，由此導致患者死亡。自身免疫性疾病是危害人類健康的重要疾病，目前尚無法根治，因此盡早發(fā)現(xiàn)以便及時對癥治療尤為重要。多數(shù)自身免疫病患者血清中都會出現(xiàn)針對自身抗原的自身抗體，且其與疾病的相關(guān)性已得到認可，所以這些自身抗體在自身免疫病的診斷和療效評價方面都具有重要的意義。自身免疫病的常用檢測指標有檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡的抗核抗體(抗雙鏈DNA抗體，抗Sm抗體等)，檢測類風濕性關(guān)節(jié)炎的類風濕因子(RF)，檢測重癥肌無力的抗乙酰膽堿受體(AchR)抗體，檢測自身免疫性溶血性貧血的抗血細胞抗體，檢測喬本甲狀腺炎的抗甲狀腺球蛋白及微粒體抗體等。然而，上述指標尚有不足之處，因為在一些所謂的器官特異性自身免疫性疾病患者血清中也可檢測出非病變組織的特異性抗體，如在喬本甲狀腺炎患者血清中，可同時檢出抗甲狀腺球蛋白抗體、抗核抗體，甚至類風濕因子。在臨床實踐中也常見到二種以上的自身免疫病相重疊或混合出現(xiàn)的情況，如類風濕關(guān)節(jié)炎與系統(tǒng)性紅斑狼瘡并存，系統(tǒng)性硬化癥可合并肌炎等。按照傳統(tǒng)的方法，容易出現(xiàn)誤診或漏診。
目前臨床上用免疫細胞化學技術(shù)檢查相應(yīng)抗體作為自身免疫病診斷的重要依據(jù)之一。具體地說，該方法分為直接法和間接法。直接法首先要將待檢測組織進行組織切片、固定后，將適當稀釋的針對自身抗體的熒光抗原滴加到標本上，洗滌后用熒光顯微鏡觀察；間接法是預先制備好抗原切片，加待測病人血清雜交，反應(yīng)后再加熒光二抗，洗滌后用熒光顯微鏡觀察。
免疫細胞化學技術(shù)診斷自身免疫疾病的常用方法存在一定的缺陷第一，組織切片操作煩瑣，費時費力，尤其是直接法，需要對病人進行組織活檢，傷害較大；第二，直接法敏感性較差，且一種熒光抗原只能檢查一種抗體，尤其是非器官特異性自身免疫性疾病，需要多項指標綜合判斷；而間接法雖然敏感性略有提高，但操作繁瑣，且特異性不高。第三，由于這兩種方法依賴于檢測人員對顯微鏡下組織的觀察，因此對技術(shù)要求極高，增加了結(jié)果的風險性。第四，采用傳統(tǒng)技術(shù)，一張載玻片上只能對一個病人進行檢測，且檢測指標有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可多指標同時檢測的蛋白質(zhì)芯片，以及芯片的制備方法和檢測方法，把多種自身免疫病指標的抗原同時點陣于蛋白質(zhì)芯片上，僅僅通過一次反應(yīng)即可得到多種指標的逐項反應(yīng)結(jié)果，從而大大提高檢測的速度和效率。
本發(fā)明的目的可通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)采用多樣品微陣列生物芯片技術(shù)，可以同時檢測多個人份的多種自身免疫性疾病，自身免疫性疾病聯(lián)合診斷的蛋白質(zhì)芯片，是把蛋白質(zhì)樣品點陣于固相載體上，蛋白質(zhì)樣品的點樣陣列設(shè)計成多樣品微陣列生物芯片，所述蛋白質(zhì)樣品是指自身免疫病各項指標的抗原以及陽性對照、陰性對照，將其點陣于多樣品微陣列生物芯片的同一個腔室內(nèi)，使多樣品微陣列生物芯片的每一個腔室均點陣了上述多項指標的抗原。
其中，自身免疫病的檢測指標為所有已知的自身抗體，主要有抗核抗體(抗雙鏈DNA抗體，抗Sm抗體等)，類風濕因子(RF)，抗乙酰膽堿受體(AchR)抗體，抗血細胞抗體，抗甲狀腺球蛋及微粒體抗體等。在固相載體上點陣的抗原為純化的、能與上述抗體特異性結(jié)合的特征性抗原。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，可以采用抗原—抗體—熒光二抗方法(間接法)檢測病人血清中的自身抗體，具體的說，是將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待測抗體分別與固定在芯片上的相對應(yīng)的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標記的二抗，洗去未結(jié)合的二抗，樣品點的熒光強度與血清中抗體濃度大小成正比。用這種蛋白質(zhì)芯片可以分別檢測到血清中針對自身免疫病的多項指標。原理如圖1所示。
也可以采用雙抗原夾心法檢測病人血清中的自身抗體，具體的說，是將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待測抗體分別與固定在芯片上的相對應(yīng)的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標記的另一種抗原，可以用多種熒光染料標記多種抗原，洗去未結(jié)合的抗原，樣品點的熒光強度與血清中抗體濃度大小成正比。原理見圖2所示。
本發(fā)明具有下述優(yōu)越性1，多指標可同時檢測。本發(fā)明把多種自身免疫病指標的抗原同時點陣于一張載玻片上，僅僅通過一次反應(yīng)即可得到多種指標的逐項反應(yīng)結(jié)果，因而大大提高了檢測的速度和效率。同時，多指標同時用于結(jié)果判斷，可以為醫(yī)生提供更多的線索，因而可以更早、更準確地判斷病情。2，由于采用了多樣品微陣列生物芯片技術(shù)，可以同時檢測多個人份的多種自身免疫病指標。3，靈敏度高，特異性高，利于及早診斷，檢測結(jié)果穩(wěn)定，可靠性高。4，工藝簡單，操作安全，對病人傷害小。5，不僅效率高而且降低了成本，從而使診斷費用降低，實用性強。


附圖1，間接法原理圖。
附圖2，雙抗原夾心法原理圖。
附圖3，列舉幾種抗原的點樣陣列。
附圖4，該病人抗雙鏈DNA抗體，抗Sm抗體陽性，表明感染系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
附圖5，該病人抗甲狀腺球蛋白及微粒體抗體陽性，表明感染喬本甲狀腺炎。
附圖6，該病人抗乙酰膽堿受體抗體陽性，表明感染重癥肌無力。
附圖7，該病人類風濕因子陽性，表明感染類風濕性關(guān)節(jié)炎。
附圖8，該病人抗血細胞抗體陽性，表明感染自身免疫性溶血性貧血。
具體實施例方式
本發(fā)明自身免疫性疾病聯(lián)合診斷的蛋白質(zhì)芯片是把自身免疫病的檢測指標包括所有已知的自身抗體，主要有抗核抗體，類風濕因子(RF)，抗乙酰膽堿受體(AchR)抗體，抗血細胞抗體，抗甲狀腺球蛋白及微粒體抗體等，在固相載體上點陣的抗原為能與上述抗體特異性結(jié)合的特征性抗原。蛋白質(zhì)樣品點陣于固相載體上，蛋白質(zhì)樣品的點樣陣列設(shè)計在多樣品微陣列生物芯片上，蛋白質(zhì)樣品是指自身免疫病各項指標的抗原以及陽性對照、陰性對照，將其點陣于多樣品微陣列生物芯片的同一個腔室內(nèi)，使多樣品微陣列生物芯片的每一個腔室均點陣了上述多項指標的抗原。將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待測抗體分別與固定在芯片上的相對應(yīng)的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標記的另一種抗原，用多種熒光染料標記多種抗原，洗去未結(jié)合的抗原，樣品點的熒光強度與血清中抗體濃度大小成正比。本實施例點陣法采用如圖3幾種抗原的點樣陣列，檢測病人血清，檢測結(jié)果如圖4～8所示。
其中，點樣、制作技術(shù)(1)根據(jù)樣品數(shù)目選擇合適的多樣品微陣列生物芯片，確定點陣的排列方式和點樣位置。(2)點樣針從多孔板取出蛋白質(zhì)樣品(自身免疫性疾病各項指標的相應(yīng)抗原)后直接高密度點印于固相載體上，例如醛基化的玻璃片上。(3)室溫過夜或37℃溫育1小時，使蛋白質(zhì)的氨基和玻璃片上的醛基發(fā)生縮合反應(yīng)，以固定樣品。(4)利用制作蛋白質(zhì)芯片的常規(guī)方法封閉、洗滌、干燥、包裝、保存。
雜交反應(yīng)(1)在點好樣的芯片上滴加病人血清樣品，37℃溫育1小時，使抗原抗體充分反應(yīng)。(2)用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，室溫晾干。(3)加封阻液封阻并再次洗凈晾干。(4)滴加以封阻液稀釋過的熒光標記二抗或熒光標記抗原。(5)在37℃避光溫育30分鐘。洗凈并室溫晾干。
結(jié)果的檢測反應(yīng)結(jié)束后，利用專業(yè)的芯片掃描分析儀進行結(jié)果的判讀和分析。
結(jié)果如圖4，該病人抗雙鏈DNA抗體，抗Sm抗體陽性，表明感染系統(tǒng)性紅斑狼瘡。圖5，該病人抗甲狀腺球蛋白及微粒體抗體陽性，表明感染喬本甲狀腺炎。圖6，該病人抗乙酰膽堿受體抗體陽性，表明感染重癥肌無力。圖7，該病人類風濕因子陽性，表明感染類風濕性關(guān)節(jié)炎。圖8，該病人抗血細胞抗體陽性，表明感染自身免疫性溶血性貧血。
權(quán)利要求
1，自身免疫性疾病聯(lián)合診斷的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，將自身免疫病各項指標相應(yīng)的抗原以及陽性對照、陰性對照同時高密度點陣于固相載體上，蛋白質(zhì)通過化學鍵連接于固相載體上而被固定，將所述蛋白質(zhì)樣品點陣于多樣品微陣列生物芯片的同一個腔室內(nèi)，使多樣品微陣列生物芯片的每一個腔室均點陣了上述多項指標的抗原。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的自身免疫性疾病聯(lián)合診斷的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，自身免疫病的檢測指標為已知的自身抗體，包括抗核抗體，類風濕因子(RF)，抗乙酰膽堿受體(AchR)抗體，抗血細胞抗體，抗甲狀腺球蛋白及微粒體抗體，在固相載體上點陣的抗原為能與上述抗體特異性結(jié)合的特征性抗原。
3，根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的自身免疫性疾病聯(lián)合診斷的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，采用抗原—抗體—熒光二抗方法檢測病人血清中的自身抗體，即是將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待測抗體分別與固定在芯片上的相對應(yīng)的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標記的二抗，洗去未結(jié)合的二抗，樣品點的熒光強度與血清中抗體濃度大小成正比。
4，根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的自身免疫性疾病聯(lián)合診斷的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，采用雙抗原夾心法檢測病人血清中的自身抗體，即是將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待測抗體分別與固定在芯片上的相對應(yīng)的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標記的另一種抗原，洗去未結(jié)合的抗原，樣品點的熒光強度與血清中抗體濃度大小成正比。
5，自身免疫性疾病聯(lián)合診斷的蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征在于，第一步，根據(jù)樣品數(shù)目選擇合適的多樣品微陣列生物芯片，確定點陣的排列方式和點樣位置；第二步，點樣針從多孔板取出自身免疫性疾病各項指標的相應(yīng)抗原后，直接高密度點印于固相載體上；第三步，室溫過夜或37℃溫育1小時，以固定樣品；第四步，利用制作蛋白質(zhì)芯片的常規(guī)方法封閉、洗滌、干燥、包裝、保存。
6，自身免疫性疾病聯(lián)合診斷的蛋白質(zhì)芯片的檢測方法，其特征在于，進行雜交反應(yīng)第一，在點好樣的芯片上滴加病人血清樣品，37℃溫育1小時，使抗原抗體充分反應(yīng)；第二，用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，室溫晾干；第三，加封阻液封阻并再次洗凈晾干；第四，滴加以封阻液稀釋過的熒光標記二抗或熒光標記抗原；第五，37℃避光溫育30分鐘，洗凈并室溫晾干；第六，反應(yīng)結(jié)束后，利用專業(yè)的芯片掃描分析儀進行結(jié)果的判讀和分析。
全文摘要
本發(fā)明自身免疫病聯(lián)合診斷的蛋白質(zhì)芯片涉及一種蛋白質(zhì)芯片、制備方法及檢測方法,是將自身免疫病各項指標相應(yīng)的抗原以及陽性對照、陰性對照同時高密度點陣于固相載體上,蛋白質(zhì)通過化學鍵連接于固相載體上而被固定,將所述蛋白質(zhì)樣品點陣于多樣品微陣列生物芯片的同一個腔室內(nèi),使多樣品微陣列生物芯片的每一個腔室均點陣了上述多項指標的抗原。具有僅僅通過一次反應(yīng)即可得到多種指標的逐項反應(yīng)結(jié)果,可以同時檢測多個人份的多種自身免疫病指標,靈敏度高,特異性高,利于及早診斷,檢測結(jié)果穩(wěn)定,可靠性高,工藝簡單,操作安全,對病人傷害小。不僅效率高而且降低了成本,從而使診斷費用降低,實用性強。
文檔編號G01N33/96GK1338633SQ01126929
公開日2002年3月6日 申請日期2001年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月29日
發(fā)明者張濤, 李賓, 彭永濟, 陳瑩, 任一萍 申請人:上海晶泰生物技術(shù)有限公司