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銀杏葉提取物在制備治療脂肪肝藥物中的應(yīng)用及組合物的制作方法

文檔序號(hào):1149024閱讀:514來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:銀杏葉提取物在制備治療脂肪肝藥物中的應(yīng)用及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種銀杏葉提取物的應(yīng)用及組合物,尤其是涉及銀杏葉提取物在制備 脂肪肝防治藥物中的應(yīng)用及組合物分。本發(fā)明的銀杏葉提取物(GBE,Ginkgo biloba leaf Extract)能夠引起的肝臟中脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化,對(duì)體內(nèi)與脂類代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶 基因——肉毒堿棕櫚?;D(zhuǎn)移酶基因(Cptla)、乙?;o酶A氧化酶(Acoxl)、乙酰輔酶A ?;D(zhuǎn)移酶基因(Acaal)、過氧化物酶體增殖物活化受體基因(Ppara)的表達(dá)有上調(diào)作用。
背景技術(shù)
銀杏葉為銀杏科植物銀杏的干燥葉,性甘、味苦、澀、平,歸心、肺經(jīng)。有斂肺、平喘、 活血化淤、止痛之功。銀杏葉制劑是目前世界最暢銷的食用增補(bǔ)劑和藥品之一。60年代中 期德國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物對(duì)心腦血管病和外周循環(huán)障礙疾病,有較好的防治作用。 近些年來(lái)德、法、美、日、韓等國(guó)均把銀杏葉制劑廣泛用于治療腦血管病,如對(duì)老年性癡呆的 防治和對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用日益受到重視。到目前為止已知化學(xué)成分的銀杏葉提取物多達(dá)百余種,但對(duì)其進(jìn)行分離提取研 究表明,其主要有效成分為銀杏黃酮苷類(ginkgo flavone glycosides)和銀杏內(nèi)酯類 (terpene lactate),銀杏黃酮苷類可分為槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、異鼠 李素(isorhamnetin)等,內(nèi)酯類包括銀杏內(nèi)酯A,B,C,J,M及白果內(nèi)酯等,其主要成分可以 進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控,其藥效是相對(duì)比較穩(wěn)定的。由于銀杏葉提取物是多組分復(fù)合體,因此藥物 對(duì)機(jī)體作用比較廣泛,可引起全身多種組織器官的分子水平的改變。銀杏葉提取物作為治療血液循環(huán)系統(tǒng)疾病包括治療冠心病、腦供血不足和周圍血 管疾病的藥物,其作用機(jī)制包括1)擴(kuò)張正常或缺血狀態(tài)下的冠狀動(dòng)脈;2)降低心肌耗氧 量并與劑量相關(guān);3)抑制鈣離子內(nèi)流;4)降低血粘度;5)抑制血小板聚集。銀杏葉提取物 具有強(qiáng)烈的抗氧自由基,保護(hù)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞,改善肝臟微循環(huán)紊亂。有文獻(xiàn)曾報(bào)道銀杏葉提 取物能明顯降低血清膽固醇、甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶,表明其具有保護(hù)肝細(xì)胞 功能,促進(jìn)肝細(xì)胞功能恢復(fù)的作用。脂肪肝是臨床上常見的疾病,近年來(lái)在我國(guó)的發(fā)病率逐年增加,脂肪肝的發(fā)生原 因有很多,包括高脂飲食、酒精、糖尿病及藥物等,脂肪肝本身是一可逆性疾病,通過飲食調(diào) 整、運(yùn)動(dòng)等方法,可以得到有效的改善。但部分患者往往伴有肥胖、糖尿病、高脂血癥等其他 疾病,脂肪肝亦可發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的嚴(yán)重病變,如脂肪性肝炎、脂肪性肝硬化,甚至誘發(fā)肝 細(xì)胞癌變。目前治療脂肪肝的藥物有多種,主要分為降脂性藥物、護(hù)肝去脂藥和中醫(yī)中藥。 降脂性藥物主要有氯貝特類、膽堿、蛋氨酸、煙酸類及他汀類藥物,這些藥物偏向于對(duì)血脂 有較好的效果,但從目前所知道的機(jī)理分析,可能趨使血脂更集中于肝臟進(jìn)行代謝,反而促 進(jìn)脂質(zhì)在肝內(nèi)的蓄積,并繼發(fā)損害肝功能。因此,在無(wú)明顯高脂血癥的脂肪肝患者中,不應(yīng) 長(zhǎng)期盲目服用降脂藥物。護(hù)肝去脂藥主要有不飽和脂肪酸及磷脂類、S-腺苷甲硫氨酸及保 肝降酶藥,這類藥物的療效有限。中醫(yī)中藥,許多中草藥具有降血脂的作用,如何首烏、丹
4參、澤瀉、川芎等;一些中藥方劑,如小柴胡湯、四逆散、六味地黃丸對(duì)治療脂肪肝和高血脂 癥均有一定的療效,但藥物的療效有待提高,其有效成分和作用機(jī)理尚不明確。有研究表明GBE可能對(duì)調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠的肝臟和血液膽固醇的水平有一定的 作用,但是對(duì)脂肪肝的重要因素甘油三酯的影響鮮見報(bào)道。在我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),銀杏 葉提取物可以抑制高脂飲食大鼠的肝臟脂肪沉積,這對(duì)將來(lái)銀杏葉提取物在臨床上應(yīng)用于 脂肪肝的防治有重要的提示作用,但是其藥理機(jī)制及其活性成分并不清楚。銀杏葉提取物的主要成分為黃酮和內(nèi)酯類,主要化合物都已有成熟的分離提取方 法,可供深入的實(shí)驗(yàn)研究。藥理機(jī)制的闡明及活性成分的識(shí)別,將有助于銀杏葉提取物的進(jìn) 一步開發(fā),同時(shí)為防治脂肪肝的藥物提供新的藥物靶點(diǎn)及先導(dǎo)化合物。鑒于以上的技術(shù)背 景,提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供銀杏葉提取物的新用途,即在制藥中的新應(yīng)用。本發(fā)明的目的之二在于提供含有銀杏葉提取物組分的組合物。實(shí)際上,本發(fā)明涉及銀杏葉提取物作為制備治療或預(yù)防脂肪肝藥物中的應(yīng)用。上述銀杏葉提取物中至少含有5_50襯%的銀杏葉黃酮類物質(zhì)和l_10wt%銀杏葉 內(nèi)酯類物質(zhì)。所述的銀杏葉提取物具有以下指紋圖譜的特征峰黃酮醇苷、蘆丁、莽草酸、花青 素類、」L茶酚類、黃烷類化合物。所述的銀杏葉提取物為銀杏酮酯、銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取物或其組合。在該銀杏葉提取 物中含有如下通式(I)的化合物構(gòu)成的活性成分當(dāng)R1為-0H,R2為H,通式(I)的化合物為槲皮素;當(dāng)R1為H,R2為H,通式(I)的 化合物為山奈酚;當(dāng)R1為-OCH3, R2為H,通式(I)的化合物為異鼠李素。本發(fā)明所說的應(yīng)用是通過如下單一基因表達(dá)或其組合變化來(lái)影響肝臟甘油三酯 的水平(a)肉毒堿棕櫚?;D(zhuǎn)移酶基因(Cptla)表達(dá)的增加;(b)乙酰化輔酶A氧化酶(Acoxl)表達(dá)的增加;(c)過氧化物酶體增殖物活化受體A基因(Ppara)的表達(dá)的增加;(d)乙酰輔酶A?;D(zhuǎn)移酶基因(Acaal)表達(dá)的增加。所說的單一基因表達(dá)或其組合變化作為對(duì)甘油三酯水平調(diào)節(jié)的指示指標(biāo)。本發(fā)明所說的應(yīng)用,其藥物的施用量總的銀杏葉提取物計(jì)算,通常為每天約 0. 01-500mg/kg體重,較佳的約為0. l-100mg/kg體重?;蜷纹に亍⑸侥畏踊虍愂罄钏?. 001-50mg/kg 體重本發(fā)明所說的應(yīng)用可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥,其中包括但并不限于口服、肌 注、皮下注射給藥方式。優(yōu)選口服給藥方式。作為本發(fā)明第二方面的含有銀杏葉提取物的組合物,包含銀杏葉提取物和藥學(xué)上 可接受的載體。所述藥學(xué)上可接受的載體包括但并不限于鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇 中的一種及其組合。所述組合物可以制備成如下劑型片劑、膠囊、液體膠囊、顆粒劑、滴丸、口服液、粉 針劑、凍干粉或注射液。本發(fā)明所說的組合物還可以是藥物組合物或保健品組合物。本發(fā)明的主要產(chǎn)生的有益效果是1.提供一種源自天然物質(zhì)的、可有效降低肝臟脂質(zhì)沉積的銀杏葉提取物的組合 物,且明確GBE通過調(diào)節(jié)與甘油三酯代謝相關(guān)的基因表達(dá)而降低甘油三酯,明確GBE用于降 低甘油三酯的有效性和配伍原則。2.可以用來(lái)提示體內(nèi)甘油三酯的代謝水平,這些基因的表達(dá)變化水平,可以用來(lái) 但不限于進(jìn)行相關(guān)藥物功效的鑒定與篩選,食品添加劑保健功能的檢測(cè)。下面就本發(fā)明在治療脂肪肝方面用途的具體實(shí)驗(yàn)做詳細(xì)說明。應(yīng)注意的是,這些 實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不限于本發(fā)明的范圍。


圖1為大鼠肝臟病理切片圖。圖2為GBE50對(duì)H印G2細(xì)胞甘油三酯含量的影響。圖3為GBE50的成分對(duì)H印G2細(xì)胞甘油三酯含量的影響。圖4為大鼠肝臟脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)。圖5為GBE50對(duì)H印G2細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。圖6為GBE50的各成分對(duì)CPTlA與ACOXl基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。圖7為GBE50、槲皮素、山奈酚及異鼠李素對(duì)H印G2細(xì)胞CPTlA蛋白表達(dá)的影響。圖8為GBE50、槲皮素、山奈酚及異鼠李素對(duì)H印G2細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1GBE50的制備GBE50購(gòu)自上海杏靈科技藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)20030608),其制備 方法參照中國(guó)專利ZL99803683.8進(jìn)行,符合國(guó)家藥品監(jiān)督管理局《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS3-227(Z-028)-2002(Z)》。經(jīng)測(cè)定,GBE50成分組成和比例如下銀杏黃酮醇甙> 24%,銀杏總黃酮> 44%,銀杏總內(nèi)酯> 6%,明確有效成份達(dá) 50%,銀杏酸;^ 5PPM。實(shí)施例2GBE50作用對(duì)大鼠脂肪肝的影響1.動(dòng)物來(lái)源
Wister大鼠,雄性,8周齡,體重250g,購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2.飼料配方基礎(chǔ)飼料為購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的實(shí)驗(yàn)大鼠顆粒飼料,高脂 飼料和高脂飼料+GBE50的飼料由中科院上海生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼料加工廠負(fù)責(zé)加工。表1各組飼料組成和比例
飼料種類配比基礎(chǔ)飼料 ‘蛋白質(zhì) 22. 08%,脂肪 5. 3%,纖維素 4. 24%,灰份 5. 98%,鈣 1. 21%,磷 0. 75%. ’水 8. 8%高脂飼料基礎(chǔ)飼料83%,膽固醇2%,豬油10%,蛋黃粉5%。高脂飼料+GBE50高脂飼料99. 8%, 2. 5g GBE50/kg高脂飼料3.動(dòng)物分組和處理20只8周齡體重約250克的Wistar大鼠,經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為4組,即 普通飼料組(C組)、普通飼料伴藥組(CG組,GBE50劑量約為150mg/kg/day)、高脂飼料組 (H組)、高脂飼料伴藥組(HG組,GBE50劑量約為150mg/kg/day),每組各5只大鼠。普通飼料的配方見表1,高脂飼料的培養(yǎng)中添加10%豬油、5%蛋黃粉、2%膽固醇 及83%的普通飼料。動(dòng)物飼養(yǎng)條件溫度在23-24°C,每天12小時(shí)光照,自由進(jìn)食和進(jìn)水,記錄進(jìn)食 量及動(dòng)物每周體重的變化。飼養(yǎng)12周后,大鼠禁食過夜,用戊巴比妥鈉(100mg/kg)麻醉 后斷頭處死;大鼠腹主動(dòng)脈采血,用肝素抗凝后,4°C離心IOOOg 10分鐘收集血漿,儲(chǔ)存 于-80°C,用于血生化分析。收集肝臟、睪丸周圍及腹內(nèi)脂肪等組織器官,稱重。肝臟先用液 氮快速冰凍,儲(chǔ)存于-80°C,作為后續(xù)的mRNA分析及病理學(xué)檢測(cè)。以上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的所有操作 都是符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南,并經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)道德委員會(huì)批準(zhǔn)。4.肝臟病理學(xué)分析及脂質(zhì)測(cè)定油紅‘0’染色的結(jié)果顯示,高脂喂飼引起大鼠肝臟大量的脂質(zhì)沉積,而在HG組中, 大鼠肝臟的脂肪沉積顯著減輕(圖1A)。肝臟樣本進(jìn)行脂質(zhì)的抽提,然后測(cè)定其甘油三酯的 含量,結(jié)果顯示高脂喂飼引起大鼠肝臟中的甘油三酯含量顯著增加,而在HG組,肝臟的甘 油三酯含量顯著減輕(圖1B)。在普通飼料組中添加GBE50后,對(duì)肝臟脂質(zhì)的含量無(wú)顯著的影響。A,大鼠肝臟的油紅‘0’染色。高脂喂飼后,大鼠肝臟脂質(zhì)沉積顯著增加,高脂添加 GBE50后,肝臟脂質(zhì)沉積顯著減輕,普通飼料加藥組的肝臟脂質(zhì)無(wú)顯著影響;C指普通飼料 組,CG指普通飼料加GBE50組,H指高脂飼料組,HG指高脂飼料加GBE50組,圖片放大倍數(shù) 為100倍。
B,大鼠肝臟甘油三酯的測(cè)定,普通飼料加藥后,肝臟甘油三酯含量無(wú)顯著改變;高 脂喂飼后,大鼠肝臟的甘油三酯含量顯著增加,而高脂添加GBE50后,肝臟甘油三酯的含量 顯著減少;數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差作圖,每組的動(dòng)物數(shù)量為5只。**P < 0. 01,與C組相 比;#P < 0.05,HG 組 vs H 組。實(shí)施例3GBE50及其成分對(duì)H印G2細(xì)胞甘油三酯含量的影響1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組加藥處理HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于直徑10厘米的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)基量約10ml,含10%胎牛血清的 MEM培養(yǎng)基,37°C,5% CO20培養(yǎng)皿中的細(xì)胞約三天一次換液,待細(xì)胞鋪滿底80 90%時(shí), 胰酶消化傳代,將消化下的細(xì)胞約1/4接種于新的直徑10厘米的培養(yǎng)皿中。用于加藥實(shí)驗(yàn)的H印G2細(xì)胞用胰酶消化后接種于24孔板,每孔加入細(xì)胞懸液2ml, 密度為105個(gè)/ml,待細(xì)胞充分貼壁后進(jìn)行處理。為減少血清中脂類及其它未知成分對(duì)實(shí)驗(yàn) 的干擾,又保證細(xì)胞有良好的生長(zhǎng)狀態(tài),在進(jìn)行細(xì)胞處理時(shí)均換用含2%胎牛血清的相應(yīng)培 養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至約占培養(yǎng)孔底面面積為60-70%時(shí),可進(jìn)行下面的加藥實(shí)驗(yàn)。1)觀察GBE50劑量-效應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)組各種濃度GBE50 (50、100、200、400 μ g/ml) 處理細(xì)胞24小時(shí),對(duì)照組含等量的溶媒即0. 1 %的DMS0。每種處理3個(gè)重復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。用于檢測(cè)細(xì)胞的甘油三酯含量,及收集RNA用于定量PCR實(shí)驗(yàn)。2)觀察GBE50時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)組200 μ g/ml GBE50處理細(xì)胞2、6、12、24小 時(shí);陰性對(duì)照組含等量的溶媒即0. 的DMSO ;每種處理3個(gè)重復(fù)孔,用于定量PCR實(shí)驗(yàn)。3)培養(yǎng)基中添加高脂試劑后,觀察GBE50對(duì)細(xì)胞甘油三酯含量的影響,加藥分為 四組,分別為普通培養(yǎng)基組(C組),添加高脂試劑組(H組),高脂試劑加GBE50組(HG組), 高月旨試劑力口 Lovastatin 組(HL 組)。高月旨試劑為 250X cholesterol lipid concentrate 試劑,內(nèi)含膽固醇及甘油三酯。加藥處理時(shí),添加到培養(yǎng)基內(nèi)以1 500的比例稀釋,GBE50 的加藥濃度為200 μ g/ml,Lovastatin的加藥濃度為0. 5 μ M。加藥時(shí)間為24小時(shí),加藥時(shí) 培養(yǎng)基濃度為2%FBS-MEM。用于檢測(cè)細(xì)胞甘油三酯。4)觀察GBE50各成分對(duì)細(xì)胞甘油三酯含量的影響,各成分的加藥濃度根據(jù)它們 各自在GBE中的比例進(jìn)行換算,濃度分別如下=Quercetin % 20 μ g/ml, Kaempferol為 20 μ g/ml,Isorhamnetin 為 8 μ g/ml,Ginkgolide A 為 2 μ g/ml,Ginkgolide B 為 1 μ g/ml, Ginkgolide C為3μ g/ml,Bilobalide為6μ g/ml。加藥處理的時(shí)間為24小時(shí),加藥時(shí)培 養(yǎng)基濃度為2% FBS-MEM。Quercetin、Kaempfero丄及Isorhamnetin的劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法 同上,即加藥處理24小時(shí),加藥時(shí)培養(yǎng)基濃度為2% FBS-MEM。用于檢測(cè)細(xì)胞甘油三酯,及 收集RNA用于定量PCR實(shí)驗(yàn)。2. GBE50降低H印G2細(xì)胞的甘油三酯含量在培養(yǎng)的肝細(xì)胞株HepG2細(xì)胞中,觀察GBE50對(duì)細(xì)胞甘油三酯含量的影響。培養(yǎng)基 中添加GBE5024小時(shí)處理時(shí)間后,細(xì)胞甘油三酯含量顯著減少,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴效 應(yīng),在50 μ g/ml時(shí),細(xì)胞甘油三酯的含量無(wú)顯著改變,在100 μ g/ml時(shí),細(xì)胞甘油三酯的含 量有所減少,在200 μ g/ml時(shí)降低幅度最大,而400 μ g/ml時(shí),細(xì)胞甘油三酯的含量有所恢 復(fù)。此外,在細(xì)胞加藥處理的過程中添加含有膽固醇和脂肪酸的高脂試劑,可以發(fā)現(xiàn)添加高 脂試劑后,細(xì)胞甘油三酯含量的顯著增加,而在加入GBE50后,抑制了細(xì)胞甘油三酯含量的 增加,選用的降膽固醇類的對(duì)照藥Lovastatin對(duì)細(xì)胞甘油三酯含量無(wú)顯著的影響(圖2)。
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圖 2 中,A,C 指對(duì)照組,G50、G100、G200、G400 指 GBE50 的濃度分別為 50,100,200,
400 μ g/ml。數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示,*P < 0. 01,與C組相比。
B, C指對(duì)照組,H指添加高脂試劑組,HG指添加高脂試劑及GBE50組(200 μ g/ml), HL指添加高脂試劑及Lovastatin組(0. 5 μ M)。數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示,*Ρ < 0. 01, 與C組相比;#Ρ < 0. 01,與H組相比。結(jié)果來(lái)自3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn),每次實(shí)驗(yàn)3個(gè)重復(fù)孔。3. GBE50的成分對(duì)!fepG2細(xì)胞甘油三酯含量的影響為了識(shí)別GBE50中降低細(xì)胞甘油三酯的成分,選取了已經(jīng)明確的幾種成分,在細(xì) 胞水平測(cè)試其對(duì)細(xì)胞甘油三酯含量的影響。各成分在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)的初始工作濃度根據(jù)其在 GBE50中的比例而定。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,黃酮類的三種成分,即槲皮素、山奈酚及異素李 素都有降低細(xì)胞甘油三酯含量的效應(yīng),以槲皮素及山奈酚較為顯著,而銀杏內(nèi)酯中的幾種 成分對(duì)細(xì)胞甘油三酯的含量無(wú)顯著影響(圖3A)。在此基礎(chǔ)上,觀察了三種黃酮成分的劑量 依賴關(guān)系,發(fā)現(xiàn)槲皮素及山奈酚的劑量依賴效應(yīng)較為顯著,而異素李素的劑量依賴關(guān)系不 顯著(圖3B)。A,槲皮素(Q)、山奈酚(K)及異鼠李素(I)可顯著降低IfepG2細(xì)胞甘油三酯的含 量,而銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B (GB)、銀杏內(nèi)酯C(GC)及白果內(nèi)酯(BB)對(duì)甘油三酯含量 無(wú)顯著影響,各成分的劑量濃度如方法中所述;B,槲皮素及山奈酚可顯著降低細(xì)胞甘油三酯含量,呈一定的劑量依賴效應(yīng),而異 鼠李素有降低細(xì)胞甘油三酯的效應(yīng),但劑量依賴效應(yīng)不明顯;C為對(duì)照組,Q5、Q10、Q20指 quercetin的加藥濃度分別為5、10、20 μ g/ml,K5、K10、K20指Kaempferol的加藥濃度分別 為 5,10,20 μ g/ml, 12、14、18 指 Kaempferol 的加藥濃度分別為 2,4,8 μ g/ml數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示,*P < 0. 05,#P < 0. 01,與C組相比;結(jié)果來(lái)自3次 獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差,每次實(shí)驗(yàn)3個(gè)重復(fù)孔。實(shí)施例4GBE50對(duì)脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)1.引物設(shè)計(jì)大鼠肝臟及細(xì)胞的PCR的引物名稱及序列分別見表2,表3。表2大鼠肝臟的PCR引物名稱及序列Table 2Name and sequence of PCR primers for rat liver 表3!fepG2細(xì)胞的PCR引物名稱及序列Table 3Name and sequence of PCR primers for HepG2cells 2.總RNA的提取及cDNA合成大鼠肝臟的RNA提取凍存的大鼠肝臟樣本各取約200mg,加入5ml Trizol后用 勻漿器進(jìn)行勻漿,室溫靜置5分鐘,加入Iml氯仿,劇烈振蕩后再靜置5分鐘,4°C 7500g離 心15分鐘,上清轉(zhuǎn)移至另一無(wú)RNA酶離心管,加入等體積的異丙醇顛倒混勻,室溫靜置5分 鐘,4°C 7500g離心15分鐘,棄上清,沉淀加入Iml 75%的乙醇,4°C 12000g離心5分鐘,棄 去乙醇,空氣晾干,用200 μ 1的DEPC水充分溶解沉淀。細(xì)胞的RNA提取細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后,棄培養(yǎng)基,每孔加入Iml TRIZOL裂解細(xì)胞 后收集至1. 5ml無(wú)RNA酶離心管,室溫靜置5分鐘,加入200 μ 1氯仿,劇烈振蕩后再靜置5 分鐘,4°C 16000g離心10分鐘,上清轉(zhuǎn)移至另一 1. 5ml無(wú)RNA酶離心管,加入500 μ 1異丙 醇顛倒混勻,室溫靜置5分鐘,4°C 16000g離心10分鐘,棄上清,沉淀加入lml75%的乙醇, 40C 12000g離心5分鐘,棄去乙醇,空氣晾干,用20 μ 1的DEPC水充分溶解沉淀cDNA 合成取 2 μ g 總 RNA,力口入 1 μ 1 的 Oligo (dT) 18(500 μ g/ml),1 μ 1 的 dNTP (IOmM),用DEPC水補(bǔ)足至IJ 12μ 1,65°C加熱5分鐘后立即置冰上,加入5X酶緩沖液 4 μ 1,DTT (0. lmmol/l)2y 1, RNA 酶抑制劑(40U/μ 1) 1 μ 1,混勻,42°C溫育 2 分鐘,再加入 200U的逆轉(zhuǎn)錄酶,42°C溫育50分鐘,最后70°C加熱10分鐘完成逆轉(zhuǎn)錄過程,收集逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物 cDNA。3.定量 RT-PCRPCR反應(yīng)體系模板cDNA1 μ 1上游引物(5 μ Μ)1μ 1下游引物(5 μ Μ)1μ 1SYBR Green Real-time PCR Master Mix12. 5μ 1用無(wú)菌去離子水補(bǔ)足體積至25 μ 1反應(yīng)條件95°C 10分鐘95°C 15 秒,60°C 1 分鐘,40 個(gè)循環(huán)95°C 15 秒,60°C 1 分鐘,95°C 15 秒,1 個(gè)循環(huán)數(shù)據(jù)分析CT值每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),實(shí)時(shí)測(cè)定每 個(gè)孔的熒光數(shù)值。以Gapdh為管家基因,校正每個(gè)樣品的CT值,每組樣本為3個(gè)重復(fù)。4. GBE50對(duì)大鼠肝臟脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)為了研究GBE50減輕大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的機(jī)理,采用定量PCR的方法對(duì)脂代謝相 關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。涉及的基因主要參與脂肪酸β氧化通路、脂肪酸的合成通路、 脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)通路及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,基因名稱及定量PCR的結(jié)果見圖4。脂肪酸β氧化通 路中挑選的基因包括 Acsl、Cptla, Slc25a20、Cpt2、Acadl、Acoxl、Echsl、Hadh 及 Acaal。 在高脂誘導(dǎo)后,Hadh與Acaal的表達(dá)發(fā)生下調(diào),而在添加GBE50的HG組,Acaal基因的表達(dá) 恢復(fù)到正常水平。尤其重要的是,HG組中的脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶即肉毒堿棕櫚?;D(zhuǎn) 移酶(Cptla)的表達(dá)增加,在CG中,Cptla的表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì),但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。此外, 其它參與脂肪酸β氧化通路的基因表達(dá)無(wú)顯著改變。參與脂肪酸合成的基因包括Srebfl、Acaca, Acacb及Fasn,此外還有酮體生成相 關(guān)基因Hmgcsl、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Fabpl及脂肪酶Lipe與Lpl。在高脂誘導(dǎo)后,Lpl的表達(dá)顯
11著增加,HmgcsLSrebfl有增加趨勢(shì),但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而Fabpl的表達(dá)顯著減少。Acaca, Acacb及Fasn的表達(dá)在各組之間無(wú)顯著差別。過氧化物酶體增殖激活受體(Ppara、Ppard、Pparg)與視黃醇類X受體(Rxra、 Rxrb, Rxrg)形成的異二聚體是參與脂肪酸代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子,在高脂誘導(dǎo)后,Ppara的 表達(dá)有所減少,而Pparg的表達(dá)有所增加。在高脂飼料中添加GBE50后,GBE50可以增加 Ppara的表達(dá),而對(duì)Pparg無(wú)顯著影響,但在普通飼料加GBE50后,Pparg的表達(dá)有顯著增 加。以Gapdh為內(nèi)參,基因的相對(duì)表達(dá)量以Δ ACT值進(jìn)行計(jì)算,對(duì)照組的基因表達(dá) 都調(diào)整為1,數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示,每組為5個(gè)樣本。*P < 0. 05,與C組相比;#P < 0. 05,與H組相比。5. GBE50對(duì)細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)在前面的研究中,發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟的一些脂代謝相關(guān)基因表達(dá)受到GBE50的調(diào)節(jié), 為此在細(xì)胞水平開展相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在培養(yǎng)的H印G2細(xì)胞中,添加6ΒΕ50(200μβ/πι1)分 別處理2、6、12及24小時(shí)后,觀察脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)改變情況,主要包括CPT1A、AC0X1、 PPARA、PPARD、FABPl、FASN、SREBFl、ACACA 及 ACACB 的表達(dá)(圖 5),結(jié)果顯示 GBE50 ±曾力口 CPTlA基因的表達(dá),加藥處理12小時(shí)后,有顯著地增加;ACOXl基因在2小時(shí)增加最為顯著, 但之后逐漸恢復(fù),24小時(shí)恢復(fù)至正常水平;FABPl基因在6小時(shí)有瞬時(shí)的增加,隨后恢復(fù)至 正常水平。FASN基因在24小時(shí)后表達(dá)有所減少,ACACA在6小時(shí)有表達(dá)增加,而在24小時(shí) 減少;ACACB在6小時(shí)表達(dá)有瞬時(shí)的減少。以GAPDH內(nèi)參,基因的相對(duì)表達(dá)量以Δ Δ CT值進(jìn)行計(jì)算,對(duì)照組的基因表達(dá)都調(diào) 整為1,數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示,每組為3個(gè)重復(fù)。*Ρ < 0. 05,與C組相比。實(shí)施例5GBE50的成分對(duì)細(xì)胞CPTlA及ACOXl基因表達(dá)的影響1.細(xì)胞加藥處理,RNA抽提,cDNA合成,蛋白提取及濃度測(cè)定IfepG2細(xì)胞加藥處理如上所述。RNA抽提及cDNA合成及基因表達(dá)檢測(cè)的方法同實(shí) 施例4。細(xì)胞在相應(yīng)的加藥處理后,棄培養(yǎng)基,每孔加入250 μ 1的蛋白裂解液RIPA收集蛋 白,采用Lowry方法測(cè)定蛋白的濃度,測(cè)定按照操作說明進(jìn)行。2. Western blot 操作步驟1)電泳每孔加入的總蛋白量為50yg,并加入IX蛋白緩沖液?;靹?,將樣品管 100°C水浴5分鐘,13200g離心10分鐘后上樣,預(yù)染Marker 5μ 1加至邊上空白孔,濃縮膠 5%,分離膠10%。2)電泳條件恒壓80V,20分鐘,恒壓120V, 1. 5小時(shí)。電泳時(shí),準(zhǔn)備好電轉(zhuǎn)液,4°C預(yù)冷。3)轉(zhuǎn)PVDF膜采用電轉(zhuǎn)槽進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,即將PVDF膜在甲醇中浸泡10秒鐘左右,隨后 放入電轉(zhuǎn)液中平衡;取6層相應(yīng)大小的濾紙浸沒到電轉(zhuǎn)液中平衡備用;電泳結(jié)束后小心取 下膠,電轉(zhuǎn)液中平衡;按如下順序在電轉(zhuǎn)夾上(負(fù)極至正極)鋪放3層濾紙-電泳膠-PVDF 膜_3層濾紙,壓緊除去氣泡;電轉(zhuǎn)槽中加入約IOOOml的預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液,同時(shí)放置預(yù)制的冰 盒,將裝好的電轉(zhuǎn)夾放入電轉(zhuǎn)槽,注意正負(fù)極;200mA恒流2小時(shí)。4)封閉取膜,做好標(biāo)記后,PBS略洗,浸入5%脫脂奶粉封閉液,4°C緩慢搖晃,封 閉過夜。
5)加一抗封閉后的膜剪成小快,加相應(yīng)一抗(i3-aCtin,l 5000 ;CPT1A, 1 1000)。室溫輕搖,孵育2小時(shí)。6)洗膜PBST輕搖,洗3次,每次lOmin。7)加二抗加相應(yīng)的HRP偶聯(lián)的二抗(羊抗鼠二抗,1 4000;兔抗羊,1 4000)。 室溫,輕搖,孵育2小時(shí)。8)洗膜同上。9)發(fā)光、顯影利用ECL發(fā)光試劑盒及X射線膠片顯影、定影,按常規(guī)及試劑說明 操作。3.槲皮素、山奈酚及異鼠李素增加細(xì)胞內(nèi)的CPTlA及ACOXl基因的表達(dá)在前面動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)GBE50對(duì)脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶-肉毒堿棕櫚 ?;D(zhuǎn)移酶(CPTlA)有顯著的上調(diào)作用,提示GBE50可能增加肉毒堿棕櫚?;D(zhuǎn)移酶來(lái)促 進(jìn)脂肪酸的β氧化從而減輕肝臟的脂質(zhì)沉積。在前面的實(shí)驗(yàn)中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)槲皮素、山奈酚 及異鼠李素有降低細(xì)胞甘油三酯的效應(yīng),所以來(lái)觀察這些成分是否也影響CPTlA的表達(dá)。 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示三種降細(xì)胞甘油三酯的成分都可以顯著地增加CPTlA的基因水平表 達(dá)(圖6Α),以槲皮素和山奈酚較為顯著,而異鼠李素的增加幅度相對(duì)較少,這與細(xì)胞甘油 三酯降低的幅度呈一定的相關(guān)性,而銀杏內(nèi)酯類的幾種成分對(duì)CPTlA基因的表達(dá)無(wú)顯著影 響,相應(yīng)地它們對(duì)細(xì)胞甘油三酯的含量無(wú)影響,這些結(jié)果提示GBE50及其三種成分槲皮素、 山奈酚及異鼠李素可能主要通過增加CPTlA的表達(dá)而發(fā)揮作用的。此外,發(fā)現(xiàn)槲皮素、山 奈酚及異鼠李素也可增加ACOXl基因的表達(dá),幾種內(nèi)酯成分對(duì)其無(wú)顯著調(diào)節(jié)(圖6Β),提示 GBE50及其三種成分槲皮素、山奈酚及異鼠李素也通過增加ACOXl的表達(dá)起作用的。在細(xì)胞水平,進(jìn)一步觀察GBE50及槲皮素、山奈酚及異鼠李素對(duì)CPTlA蛋白表達(dá)的 影響。通過Western blot的檢測(cè)顯示,GBE50顯著增加CPTlA的蛋白表達(dá),在GBE50加藥 處理12小時(shí)后,CPTlA增加顯著,24小時(shí)后最為顯著。三種黃酮成分即槲皮素、山奈酚及異 鼠李素也可顯著增加CPTlA蛋白的表達(dá)(圖7)。以GAPDH內(nèi)參,基因的相對(duì)表達(dá)量以Δ Δ CT值進(jìn)行計(jì)算,對(duì)照組的基因表達(dá)都調(diào) 整為1,數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示,每組為3個(gè)重復(fù)。*Ρ < 0. 05,與C組相比。A,GBE50 (200 μ g/ml)加藥處理H印G2細(xì)胞2,6,12,24小時(shí),在加藥12小時(shí)后增 加較為顯著,24小時(shí)最為明顯;B,槲皮素(Q,20 μ g/ml)、山奈酚(K,20 μ g/ml)及異鼠李素(I,8 μ g/ml)顯著增加 CPTlA蛋白的表達(dá),加藥處理的時(shí)間為24小時(shí);右側(cè)的柱狀圖為其左側(cè)蛋白條達(dá)的灰度值,縱坐標(biāo)為CPTlA與beta-actin蛋白的 相對(duì)比值,對(duì)照組調(diào)整為1。實(shí)施例6GBE50及其成分對(duì)細(xì)胞攝取外源膽固醇的影響1.實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞對(duì)膽固醇攝取的實(shí)驗(yàn)測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[12]。膽固醇攝取的測(cè)定 方法如下24孔細(xì)胞培養(yǎng)板鋪上2X105個(gè)/孔的!fepG2細(xì)胞,培養(yǎng)基為0. 5ml的含 10 % FBS的MEM。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到75-80 %的底板面積時(shí),培養(yǎng)基更換為0. 5ml含2 % FBS 的MEM,并在各孔中添加0.2 μ Ci Ια ,2α (η)-3H-膽固醇及各種濃度的GBE50 (200 μ g/ ml)或其成分 Quercetin(20 μ g/ml), Kaempferol(20 μ g/ml), Isorhamnetin(8 μ g/ml) , GinkgolideA (2 μ g/ml), Ginkgolide Β(1μ g/ml), Ginkgolide C (3 μ g/ml), Bilobalide (6μ g/ml),或 0. 5μ M 的 Lovastatin。加藥處理 24 小時(shí)后,細(xì)胞用 IXPBS 洗滌 兩次,然后細(xì)胞溶解于200 μ 1的0. ImM的氫氧化鈉。取190 μ 1的細(xì)胞裂解液加入2ml的 乙二醇甲醚及3ml的含0. 8% PBD (2-苯基-5- (4-聯(lián)苯基)_1,3,4-噁二唑)的二甲苯,混 勻后,采用液體閃爍儀Beckman LS 6500測(cè)定3H的放射性活性cpm值。取10 μ 1的細(xì)胞裂 解液,采用Bradford方法測(cè)定其蛋白含量。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果由于細(xì)胞對(duì)外源脂質(zhì)的攝取對(duì)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量也有一定的影響,所以來(lái)進(jìn)一步 觀察藥物對(duì)細(xì)胞攝取外源脂質(zhì)的影響。在實(shí)驗(yàn)中,觀察GBE50及其成分對(duì)H印G2細(xì)胞攝取培 養(yǎng)基中同位素標(biāo)記的膽固醇的影響,來(lái)反映細(xì)胞對(duì)外源脂質(zhì)的攝取能力。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示, GBE50及其成分異鼠李素(I)可顯著降低細(xì)胞對(duì)外源膽固醇的攝取,而對(duì)照藥Lovastatin 增加HepG2細(xì)胞對(duì)外源膽固醇的攝取(與文獻(xiàn)報(bào)道一致),這結(jié)果提示GBE50及其成分異鼠 李素(I)還可以通過抑制脂質(zhì)攝取的方式來(lái)降低細(xì)胞的甘油三酯含量。GBE50及其成分異鼠李素(I)可顯著減少H印G2細(xì)胞對(duì)外源膽固醇的攝取,而槲皮 素(Q)、山奈酚(K)、銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B(GB)、銀杏內(nèi)酯C(GC)及白果內(nèi)酯(BB)對(duì) 細(xì)胞攝取外源膽固醇無(wú)顯著影響;數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示,卞< 0. 05,與Con組相比; 結(jié)果來(lái)自3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差,每次實(shí)驗(yàn)4個(gè)重復(fù)孔。
1權(quán)利要求
銀杏葉提取物作為制備治療或預(yù)防脂肪肝藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中所述的銀杏葉提取物中含有5-50wt%的銀杏葉黃酮 類物質(zhì)、l_10wt%銀杏葉內(nèi)酯類物質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中所述的銀杏葉提取物具有以下指紋圖譜的特征峰 黃酮醇苷、蘆丁、莽草酸、花青素類、兒茶酚類、黃烷類化合物。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中所述的銀杏葉提取物為銀杏酮酯、銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取 物或其組合。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中在該銀杏葉提取物中含有如下通式(I)的化合物構(gòu) 成的活性成分
6.如權(quán)利要求5所說的應(yīng)用,其中當(dāng)R1為-0H,R2為H,通式⑴的化合物為槲皮素。
7.如權(quán)利要求5所說的應(yīng)用,其中當(dāng)隊(duì)為禮1 2為H,通式⑴的化合物為山奈酚。
8.如權(quán)利要求5所說的應(yīng)用,其中當(dāng)R1為-OCH3,R2為H,通式⑴的化合物為異鼠李
9.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中所說的應(yīng)用是通過如下單一基因表達(dá)或其組合變化 來(lái)影響肝臟甘油三酯的水平(a)肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶基因(Cptla)表達(dá)的增加;(b)乙?;o酶A氧化酶(Acoxl)表達(dá)的增加;(c)過氧化物酶體增殖物活化受體A基因(Ppara)的表達(dá)的增加;(d)乙酰輔酶A?;D(zhuǎn)移酶基因(Acaal)表達(dá)的增加。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用,其中所說的單一基因表達(dá)或其組合變化作為對(duì)甘油三 酯水平調(diào)節(jié)的指示指標(biāo)。
11.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中藥物的施用量以總的銀杏葉提取物計(jì),通常為每天 約 0. 01-500mg/kg 體重。
12.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中藥物的施用量以總的銀杏葉提取物計(jì),通常為每天 約 0. Ι-lOOmg/kg 體重。
13.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中藥物的施用量以槲皮素計(jì),通常為每天約 0. 001-50mg/kg 體重。
14.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中藥物的施用量以山奈酚計(jì),通常為每天約 0. 001-50mg/kg 體重。
15.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中藥物的施用量以異鼠李素計(jì),通常為每天約 0. 001-50mg/kg 體重。
16.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥,其中包括但并不限于口 服、肌注、皮下注射給藥方式。2
17.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中采用口服給藥方式。
18.含有銀杏葉提取物的組合物,其中包含銀杏葉提取物和藥學(xué)上可接受的載體。
19.如權(quán)利要求18所述組合物,其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括但并不限于鹽水、 緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇中的一種及其組合。
20.如權(quán)利要求18所述組合物,其中所述組合物可以制備成如下劑型片劑、膠囊、液 體膠囊、顆粒劑、滴丸、口服液、粉針劑、凍干粉或注射液。
21.如權(quán)利要求18所述組合物,其中是藥物組合物或保健品組合物。
22.如權(quán)利要求18所述組合物,其中銀杏葉提取物中含有5-50wt%的銀杏葉黃酮類物 質(zhì)和I-IOwt%銀杏葉內(nèi)酯類物質(zhì)。
23.如權(quán)利要求18所述組合物,其中所述的銀杏葉提取物具有以下指紋圖譜的特征 峰黃酮醇苷、蘆丁、莽草酸、花青素類、兒茶酚類、黃烷類化合物。
24.如權(quán)利要求18所述組合物,其中所述的銀杏葉提取物為銀杏酮酯、銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提 取物或其組合。
25.如權(quán)利要求18所述組合物,其中在該銀杏葉提取物中含有如下通式的化合物構(gòu)成 的活性成分
26.如權(quán)利要求25所說的組合物,其中當(dāng)R1為-0H,R2為H,通式(I)的化合物為槲皮ο
27.如權(quán)利要求25所說的組合物,其中當(dāng)R1為H,R2為H,通式(I)的化合物為山奈酚。
28.如權(quán)利要求25所說的組合物,其中當(dāng)R1為-OCH3,R2為H,通式(I)的化合物為異鼠李素
全文摘要
本發(fā)明涉及銀杏葉提取物(GBE,Ginkgo biloba leaf Extract)在制備治療或預(yù)防脂肪肝藥物中的新應(yīng)用以及可有效降低肝臟脂肪沉積的銀杏葉提取物的組合物,本發(fā)明且明確GBE通過調(diào)節(jié)與甘油三酯代謝相關(guān)的基因表達(dá)而降低甘油三酯,明確GBE用于降低甘油三酯的有效性和配伍原則。這些基因的表達(dá)變化,可以用來(lái)提示體內(nèi)甘油三酯的代謝水平,可以用來(lái)但不限于進(jìn)行相關(guān)藥物功效的鑒定與篩選,食品添加劑保健功能的檢測(cè)。
文檔編號(hào)A61P1/16GK101919884SQ20091005274
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2009年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月9日
發(fā)明者張慶華, 謝作權(quán), 陳佳 申請(qǐng)人:上海生物芯片有限公司
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