專(zhuān)利名稱(chēng)：含有甜菊提取物或甜菊提取物組分的新穎的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含甜菊(Stevia)提取物或其組分例如甜菊醇(steviol)和甜菊苷 (stevioside)作為活性成分的新穎的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物或食物添加劑，它們用于改善認(rèn)知功 能例如學(xué)習(xí)、記憶和警覺(jué)，以及釋放社會(huì)心理(psychosocial)壓力。
背景技術(shù)：
記憶、學(xué)習(xí)和警覺(jué)依賴(lài)于中腦、特別是海馬中的神經(jīng)元回路，在那里信息被加工并 且記憶被鞏固。精神表現(xiàn)和學(xué)習(xí)依賴(lài)于突觸可塑性；即通過(guò)募集新受體、形成新突觸和最終 產(chǎn)生新神經(jīng)元聯(lián)結(jié)來(lái)強(qiáng)化神經(jīng)元聯(lián)結(jié)。(長(zhǎng)期)記憶的形成和腦的有效功能依賴(lài)于用于強(qiáng)化神經(jīng)元之間通信強(qiáng)度的新蛋 白質(zhì)的合成。用于突觸強(qiáng)化的新蛋白質(zhì)的生產(chǎn)由神經(jīng)元內(nèi)的化學(xué)信號(hào)和電信號(hào)引發(fā)。長(zhǎng)期增強(qiáng)(LTP)是用于描述突觸傳遞的長(zhǎng)效增強(qiáng)(體外數(shù)小時(shí)，體內(nèi)數(shù)天或數(shù)周) 的術(shù)語(yǔ)，所述增強(qiáng)在短的、有條件的突觸前電刺激猝發(fā)(約IOOHz持續(xù)1秒)之后在中樞神 經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中具體的突觸中發(fā)生。該現(xiàn)象被廣泛認(rèn)為是記憶形成并儲(chǔ)存于腦中的主要機(jī) 制之一。在體外和活動(dòng)物中均觀察到LTP。在實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)突觸應(yīng)用一系列短的、高頻電 刺激能夠?qū)⒒瘜W(xué)突觸的強(qiáng)度強(qiáng)化至數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)。最重要的是，LTP有助于活動(dòng)物中的 突觸可塑性，為高度適應(yīng)性神經(jīng)系統(tǒng)提供基礎(chǔ)。LTP過(guò)程主要涉及兩種不同的受體類(lèi)型，即N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體復(fù) 合物和α -氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(AMPA)受體。在LTP期間，主要的興 奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸從突觸前神經(jīng)元釋放，結(jié)合并活化突觸后膜上的AMPA受體，導(dǎo)致其 去極化。在靜息膜電勢(shì)下，NMDA受體通道被鎂離子阻斷，但是突觸后膜的去極化去除該阻 斷，使NMDA受體活化并隨后使鈣進(jìn)入細(xì)胞。相信細(xì)胞內(nèi)鈣的這一提高能活化蛋白質(zhì)激酶， 導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄和強(qiáng)化蛋白質(zhì)的構(gòu)建(Niehoff (2005)，The Language ofLife =How Cells Communicate in Health and Disease，210-223)，并導(dǎo)致增強(qiáng)的 AMPA 受體敏感度，因此進(jìn) 一步促進(jìn)LTP的神經(jīng)傳遞和維持。NMDA受體由NRl-和NR2-亞基組成；谷氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域在這些亞基的接點(diǎn)處形 成。除谷氨酸之外，NMDA受體還需要共激動(dòng)劑甘氨酸，從而調(diào)控受體功能。甘氨酸結(jié)合位 點(diǎn)存在于NRl亞基中，而NR2亞基具有多胺結(jié)合位點(diǎn)，所述多胺是調(diào)控NMDA受體功能化的 調(diào)節(jié)分子。因此，已知甘氨酸在NMDA受體復(fù)合物上與谷氨酸一起發(fā)揮陽(yáng)性變構(gòu)調(diào)控 ^lJ (positive allosteric modulator)禾口 # # 云力齊[J 的 乍用(Danysz andParsons 1998Pharmacol. Rev. ,50(4) =597-664) 0甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GlyT)通過(guò)將甘氨酸重?cái)z取進(jìn) 入突觸前神經(jīng)末端或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，而在突觸后甘氨酸能作用的終止和低細(xì)胞外甘氨酸 濃度的維持中起重要作用。因此，甘氨酸作用的終止在很大程度上由快速重?cái)z取介導(dǎo)。兩 種甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GlyTl和GlyT2是已知的，并由12個(gè)推定的跨膜區(qū)域表征，同時(shí)鑒定了 由相同基因編碼的三種 GlyTl 變體(GlyTla、b 和 c) (Borowsky andHoffman 1998J. Biol.Chem. ，273(44) :29077_29085)。GlyTl是前腦中唯一的氯化鈉依賴(lài)型甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其與NMDA受體一起共表 達(dá)。人們認(rèn)為在該位點(diǎn)中，GlyTl負(fù)責(zé)控制突觸處的細(xì)胞外甘氨酸水平(I^pez-Corcuera et al 2001Mol. Membr. Biol.，18(1) 13-20)，導(dǎo)致對(duì) NMDA 受體功能的調(diào)控。事實(shí)上，在存在選擇性GlyTl拮抗劑N-[3-(4 ‘-氟苯基)_3_(4'-苯基苯氧 基)]丙基肌氨酸(NFPS)時(shí)，在小鼠和大鼠海馬切片中Schaffer側(cè)支刺激(Schaffer collateral stimulation)后觀察到CAl錐體細(xì)胞中增強(qiáng)的NMDA受體應(yīng)答(Bergeron, et al 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (26) 15730-15734)。成年小鼠中體內(nèi)全身性施用 NFPS提高了齒狀腦回中的LTP并增強(qiáng)了對(duì)聽(tīng)覺(jué)驚嚇應(yīng)答(acoustic startle response) 的前脈沖抑制，表明GlyTl的抑制以行為相關(guān)的方式影響NMDA受體功能(Kirmey，et al 2003，J. Neurosci.，23(20) 7586-7591)。這類(lèi)數(shù)據(jù)突出了下述化合物用于在正常個(gè)體中預(yù)防神經(jīng)病綜合征和用于維持或 加強(qiáng)生理學(xué)認(rèn)知功能(例如記憶和學(xué)習(xí))的有用性，所述化合物能夠通過(guò)提高突觸NMDA受 體局部微環(huán)境中的細(xì)胞外甘氨酸水平來(lái)增強(qiáng)NMDA受體的突觸功能。人們對(duì)開(kāi)發(fā)下述化合物以及營(yíng)養(yǎng)藥物組合物的興趣越來(lái)越高，所述化合物以及營(yíng) 養(yǎng)藥物組合物可在老人和年輕人中，日常工作需要特別高記憶和注意力的個(gè)體(包括學(xué) 生、建筑工人、司機(jī)、飛行員、醫(yī)師、售貨員、行政人員、家庭主婦、“高效率專(zhuān)業(yè)人士”)中，和 處于精神或日常壓力下的人中，以及傾向于神經(jīng)不穩(wěn)定(例如精神分裂癥)的人中改善學(xué) 習(xí)、記憶和警覺(jué)。因此，增強(qiáng)NMDA受體功能并使得能夠改善學(xué)習(xí)、記憶和警覺(jué)的化合物或營(yíng)養(yǎng)藥物 組合物會(huì)是高度期望的。過(guò)去曾向飲料/食物組合物中添加甜菊提取物(例如見(jiàn)Nippon PaperChemical Co.，Ltd的Japanese Kokai 2005-278467)，但是甜菊提取物發(fā)揮的是甜味劑的作用。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，下式I和II的化合物通過(guò)其誘導(dǎo)LTP的能力成為海馬功能活化 劑，并且可用作增強(qiáng)認(rèn)知功能的營(yíng)養(yǎng)藥物和/或藥物。這些化合物可通過(guò)抑制甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白GlyTl從而抑制甘氨酸重?cái)z取，或者通過(guò)活化導(dǎo)向LTP誘導(dǎo)的另一通路，或者通過(guò)這兩 種機(jī)制發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明涉及通過(guò)向動(dòng)物(包括人)施用認(rèn)知功能增強(qiáng)量的式I、II 化合物或其混合物來(lái)增強(qiáng)認(rèn)知功能的方法。根據(jù)本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)甜菊提取物能夠通過(guò)抑制甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GlyTl而抑制甘氨 酸重?cái)z取。得到的細(xì)胞外甘氨酸水平的提高導(dǎo)致增強(qiáng)的NMDA受體活化，這是誘導(dǎo)大量基因 轉(zhuǎn)錄活化并隨后誘導(dǎo)LTP的第一步，所述LTP是涉及記憶形成和記憶鞏固的主要細(xì)胞機(jī)制。另外，根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)能夠在甜菊提取物中發(fā)現(xiàn)的化合物——甜菊醇、異甜菊醇 (isosteviol)和甜菊苷通過(guò)不同的機(jī)制誘導(dǎo)LTP。因?yàn)閮煞N過(guò)程具有相同的生物學(xué)益處， 即它們均促進(jìn)海馬功能，所以本發(fā)明的另一方面是一種或多種這些活性成分增強(qiáng)認(rèn)知功能 的用途。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是用于增強(qiáng)認(rèn)知功能的新穎的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物，其包含 甜菊提取物或一種或多種式I或II的化合物。除異甜菊醇以外，尤其優(yōu)選的表1化合物是 甜菊醇和甜菊苷。
式I :R基團(tuán)的細(xì)節(jié)見(jiàn)表1。 表1 甜菊醇和相關(guān)糖苷的結(jié)構(gòu)(式I)。Glc、Xyl和Rha分別代表葡萄糖、木糖和 鼠李糖片段(Kuznesof (2007) Steviol glycosides-chemicaland technical assessment, 68th JECFA meeting)。
式II 異甜菊醇(CAS 編號(hào) 27975-19-5)是甜菊醇糖苷(steviolglycoside)的一
種分解產(chǎn)物。 式I和II的化合物可以使用已知方法合成生產(chǎn)，可使用已知的提取流程從天然來(lái) 源例如植物中提取，或者它們可作為植物提取物的組分使用，優(yōu)選地作為甜菊提取物的組 分使用，所述甜菊提取物含有足量的甜菊醇和/或甜菊苷，從而是海馬功能的有效增強(qiáng)劑。附圖概述

圖1展示了 GlyTl抑制測(cè)定中甜菊提取物的劑量-應(yīng)答曲線。測(cè)定結(jié)果表示為放 射性甘氨酸內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞的％抑制。圖1清楚地證明了在細(xì)胞測(cè)定中，甜菊提取物能夠特 異性抑制GlyTl的作用。圖2a展示下臺(tái)(st印-down)測(cè)試中結(jié)果的錯(cuò)誤率；a 訓(xùn)練周期期間與載劑處理 的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同。b 測(cè)試周期期間與載劑處理的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著 不同。c 清除周期期間與載劑處理的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同。d 清除周期期間與銀 杏(Ginkgo biloba)處理的小鼠顯著不同。在所有情況下，顯著性被標(biāo)注為ρ < 0. 05。這 些數(shù)據(jù)顯示甜菊處理的小鼠不僅比其他組學(xué)習(xí)得更好，而且將其記憶保留更長(zhǎng)的時(shí)間段。圖2b展示潛伏期(逃離電擊的)下臺(tái)行為測(cè)試的持續(xù)時(shí)間。b 測(cè)試周期期間與 載劑處理的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同。c 清除周期期間與載劑處理的年齡匹配的同窩 動(dòng)物顯著不同。d:清除周期期間與銀杏處理的小鼠顯著不同。在所有情況下，顯著性被標(biāo) 注為ρ < 0. 05。因此，用150mg/kg甜菊提取物處理的小鼠顯示比它們年齡匹配的對(duì)照顯著
6更好的學(xué)習(xí)和記憶表現(xiàn)，同時(shí)在最高劑量下，甜菊處理的小鼠顯示比年齡匹配的對(duì)照小鼠 以及銀杏處理的陽(yáng)性對(duì)照二者都表現(xiàn)得更好。圖3a展示了訓(xùn)練日期間定位Morris水迷宮中隱藏平臺(tái)先前位置的潛伏期。a: 第一天期間與載劑處理的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同，強(qiáng)調(diào)用低劑量甜菊提取物(50mg/ kg)處理顯著改善了動(dòng)物的學(xué)習(xí)表現(xiàn)。顯著性被標(biāo)注為ρ <0.05。圖3b 測(cè)試日(第4天)時(shí)定位Morris水迷宮中隱藏平臺(tái)先前位置的潛伏期。a 與載劑處理的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同，顯示用中(150mg/kg)和高(450mg/kg)劑量 甜菊提取物處理顯著改善了動(dòng)物的記憶表現(xiàn)，其程度與施用參照物質(zhì)銀杏的小鼠中所觀察 到的相同，比咯利普蘭(rolipram)處理的動(dòng)物更好。顯著性被標(biāo)注為ρ < 0. 05。圖4a展示穿梭箱(shuttle box)測(cè)試中的錯(cuò)誤率a.測(cè)試周期期間與載劑處理 的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同。b 衰竭周期(extinction period)期間與載劑處理的年 齡匹配的同窩仔顯著不同。顯著性被標(biāo)注為P <0.05。因此，在測(cè)試周期中檢查的最高劑 量下，甜菊處理的動(dòng)物顯示比載劑處理的同窩動(dòng)物顯著更好的記憶表現(xiàn)，和與施用陽(yáng)性對(duì) 照化合物咯利普蘭的小鼠等同的表現(xiàn)。圖4b展示穿梭箱測(cè)試中的逃離時(shí)間a 測(cè)試周期期間與載體處理的年齡匹配的 同窩動(dòng)物顯著不同。b 測(cè)試周期期間與銀杏處理的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同。顯著性 被標(biāo)注為P < 0. 05。這些結(jié)果顯示甜菊處理的小鼠(劑量為150和450mg/kg)學(xué)會(huì)了逃 離足部電擊，它們的表現(xiàn)比載劑處理的對(duì)照小鼠和施用參照物質(zhì)咯利普蘭的小鼠二者均更好。圖5展示物品出現(xiàn)之前3小時(shí)和之后3小時(shí)每個(gè)角落中的訪問(wèn)持續(xù)時(shí)間。箭頭表 示放置物品。與載劑處理的對(duì)照小鼠相比，銀杏和甜菊提取物顯著地提高了訪問(wèn)含有新穎 物品的角落的持續(xù)時(shí)間(分別P = 0. 004和P = 0. 005)。因此兩種處理均提高了物品識(shí)別 測(cè)試中小鼠的探索活動(dòng)。圖6展示地點(diǎn)錯(cuò)誤率(訪問(wèn)不正確角落的百分比)。甜菊提取物處理導(dǎo)致與載劑 處理的對(duì)照小鼠和施用銀杏的小鼠二者相比均顯著更低的百分比錯(cuò)誤率(分別P = 0. 012 和ρ = 0. 017)。從模塊開(kāi)始時(shí)觀察到該效果并保持最初12小時(shí)(活性期)，證明用甜菊處 理導(dǎo)致更高的注意力水平和改善的記憶表現(xiàn)。圖7展示側(cè)面錯(cuò)誤率(side error rate)(用鼻子觸碰正確角落的不正確側(cè)面的 百分比)。甜菊提取物再次誘導(dǎo)與載劑處理對(duì)照和銀杏處理的小鼠相比顯著更低的百分比 錯(cuò)誤率(分別P = 0. 002和P = 0. 035)。從模塊開(kāi)始時(shí)觀察到該效果并保持最初12小時(shí) (活性期)，表明甜菊處理的小鼠中改善的注意力和記憶。甜菊提取物甜菊提取物可以用甜菊屬的任何物種例如Stevia rebaudiana, Steviaeupatoria、 Stevia ovata、 Stevia plummerae、 Stevia salicifolia 禾口 Steviaserrata.制造。通常甜菊提取物應(yīng)當(dāng)含有至少約10_95%、優(yōu)選約40_85%的甜菊苷 和甜菊醇。在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)通篇中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“甜菊提取物”旨在被廣義使用，并可 包括通過(guò)常規(guī)手段制造的植物提取物，所述常規(guī)手段例如蒸汽蒸餾、基于水的萃取、基于醇 的萃取，或基于有機(jī)溶劑例如乙酸乙酯的萃取和離子交換色譜。
關(guān)于甜菊提取物的僅有的關(guān)鍵性參數(shù)為1)其在用于動(dòng)物或人消耗的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物中使用應(yīng)當(dāng)是可接受的。因此要用于 其制備的溶劑應(yīng)當(dāng)是多個(gè)管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于期望用途的。因此，優(yōu)選的提取用品為熱水、蒸 汽、醇和乙酸乙酯。2)其應(yīng)當(dāng)含有使其有效的足量的甜菊苷、異甜菊醇和/或甜菊醇。另外，發(fā)現(xiàn)干燥的植物部分(例如葉)含有足量的活性成分。因此，干燥形式的甜 菊也意欲應(yīng)當(dāng)包含在本發(fā)明中，作為甜菊提取物及其組分的有價(jià)值的來(lái)源。甜菊提取物典 型地含有其他化合物，所述其他化合物也可以是生物活性的，和/或提高甜菊的活性成分 的生物利用率。它們?cè)谔鹁仗崛∥镏械拇嬖诹靠梢曰诖罅恳蛩囟兓?，所述因素包括?用的甜菊物種，植物的生長(zhǎng)條件，和(當(dāng)然)用于制備甜菊提取物的方法。使用水性提取方 法制備的典型的甜菊提取物會(huì)含有甜菊醇、異甜菊醇、甜菊苷和萊鮑迪苷。甜菊提取物及其組分有益于精神狀杰如前文所述，記憶、學(xué)習(xí)和精神穩(wěn)定性的基礎(chǔ)是LTP或神經(jīng)元聯(lián)結(jié)的強(qiáng)化，這通過(guò) 腦中、尤其是海馬中AMPA和NMDA受體的活化發(fā)生。作為甘氨酸重?cái)z取抑制劑，甜菊提取物 通過(guò)它們對(duì)GlyTl的活性而允許甘氨酸在NMDA受體附近聚集，進(jìn)而使所述受體活化并最終 導(dǎo)致LTP (涉及記憶形成和記憶鞏固的主要細(xì)胞機(jī)制)的誘導(dǎo)。另外，甜菊醇、異甜菊醇和甜菊苷也誘導(dǎo)相同的生物化學(xué)通路的活化(雖然在與 甜菊提取物不同的步驟中)，導(dǎo)致LTP誘導(dǎo)，并且類(lèi)似地有益于改善記憶功能。因此，甜菊提取物及其組分能夠活化海馬功能并改善記憶形成和鞏固，以及改善 精神健康。因此，在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)通篇中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“認(rèn)知功能增強(qiáng)量”表示劑量 足以活化海馬功能，并且能夠?qū)е赂纳频恼J(rèn)知功能，這在下文中進(jìn)一步解釋。本發(fā)明改善的狀況在本發(fā)明的上下文中，“治療”也包括共同治療以及預(yù)防，削弱與具體狀況相關(guān)的 癥狀，減少具體狀況的發(fā)作時(shí)間，減小狀況的嚴(yán)重性和減小無(wú)癥狀個(gè)體在未來(lái)顯示狀況的 可能性。在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)通篇中，術(shù)語(yǔ)“改善的認(rèn)知功能”表示支持和維持認(rèn)知健 康和平衡的狀況，例如 增強(qiáng)的學(xué)習(xí)，包括ο語(yǔ)言處理ο解決問(wèn)題ο智力功能·應(yīng)付社會(huì)心理負(fù)擔(dān)的能力·增強(qiáng)的注意力和精神集中·增強(qiáng)的記憶和記憶能力，特別是短期記憶·增強(qiáng)的精神警覺(jué)和精神警戒，精神疲勞的減少 精神狀態(tài)的穩(wěn)定，包括ο減輕產(chǎn)后狀況ο減輕由于與配偶、孩子分離、心愛(ài)的人死亡或婚姻問(wèn)題導(dǎo)致的心理負(fù)擔(dān)ο減輕與住所、工作改變或類(lèi)似事件相關(guān)的問(wèn)題
ο減輕交通意外或其他消極社會(huì)壓力之后的應(yīng)激狀況 減輕壓力，包括ο治療、預(yù)防和改善與超負(fù)荷工作、衰竭和/或“精疲力盡”相關(guān)的癥狀ο對(duì)壓力的提高的抗性或耐性ο在正常健康個(gè)體中有利于和促進(jìn)放松 “狀況改善”包括ο減少的應(yīng)激性和疲勞ο應(yīng)付新情況的能力ο減少、預(yù)防或減輕身體和精神疲勞ο在患病或健康的個(gè)體中促進(jìn)品質(zhì)良好的睡眠，也就是說(shuō)對(duì)抗失眠和睡眠病癥， 并且更概括來(lái)說(shuō)提高能量。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面中，組合物可被用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，尤其是用于感受到 需要增強(qiáng)的認(rèn)知功能和/或社會(huì)心理支持的人。會(huì)受益于增強(qiáng)的認(rèn)知功能的人的非詳盡列 表包括老人，學(xué)生或準(zhǔn)備考試的人，忙于大量學(xué)習(xí)的兒童，即嬰兒、學(xué)步兒童、學(xué)前兒童和上學(xué)兒童，建筑工人，或者可能有危險(xiǎn)的機(jī)械的操作者，卡車(chē)司機(jī)、飛行員、火車(chē)司機(jī)或其它運(yùn)輸專(zhuān)業(yè)人士，空運(yùn)管理者，銷(xiāo)售員、行政人員和其它“高效率專(zhuān)業(yè)人士”警官和軍隊(duì)職員，家庭主婦，或在其日常工作中接觸大量壓力的任何人，或其日常工作中需要特別高注意力/ 精神集中/高精神和心理性能的個(gè)體，例如運(yùn)動(dòng)員、國(guó)際象棋手、高爾夫球員、職業(yè)表演者 (演員、樂(lè)師等等)。為了實(shí)現(xiàn)這些改善，在若干天(例如至少6天或10天)中施用是推薦的，并且通 常優(yōu)選每天施用，持續(xù)若干周。除了應(yīng)用于人以外，本發(fā)明的組合物還在獸醫(yī)領(lǐng)域中具有額外的用途?？墒芤嬗?增強(qiáng)的認(rèn)知功能的動(dòng)物包括承受應(yīng)激狀況的這些動(dòng)物。這類(lèi)狀況例如發(fā)生在捕獲或運(yùn)輸之 后，或者可能歸因于居住條件(例如住所或主人的改變)，當(dāng)動(dòng)物發(fā)生類(lèi)似的病癥或者痛苦 或有攻擊性時(shí)，或顯示亥丨J板(stereotypic)行為、或焦慮禾口強(qiáng)迫(obsessive-compulsive) 行為時(shí)。承受壓力的動(dòng)物還應(yīng)當(dāng)包括競(jìng)賽動(dòng)物(例如狗、馬、駱駝)、或用于多種運(yùn)動(dòng)中的動(dòng) 物、表演動(dòng)物(例如馬戲團(tuán)動(dòng)物和出現(xiàn)在舞臺(tái)、電視或電影中的動(dòng)物)和表演馴馬術(shù)和其它 高度紀(jì)律性日常工作的馬。優(yōu)選的“動(dòng)物”是寵物或伴侶動(dòng)物和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物。寵物的例子是狗、貓、鳥(niǎo)、觀賞魚(yú)、 荷蘭豬、(北美野)兔、野兔和白鼬。農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物的例子是水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)、豬、馬、反芻動(dòng)物(牛、 綿羊和山羊)和家禽。營(yíng)養(yǎng)藥物用涂/配制物/劑量
在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)藥物”表示同時(shí)在營(yíng)養(yǎng)學(xué)和藥物學(xué)兩個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域中的 有用性。因此，可以使用新穎的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物作為食物和飲料的補(bǔ)充劑和作為用于腸內(nèi) 和腸胃外應(yīng)用的藥物配制物，其可以是固體配制物例如膠囊或片劑，或液體配制物例如溶 液或懸浮液。根據(jù)本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物可進(jìn)一步含有保護(hù)性水膠體(例如樹(shù)膠、蛋白質(zhì)、 改性淀粉)、黏合劑、成膜劑、包封劑/材料、壁/孔材料、基質(zhì)化合物、涂層、乳化劑、表面活 性劑、增溶劑(油、脂肪、蠟、卵磷脂等等)、吸附劑、運(yùn)載體、填充劑、共同化合物、分散劑、濕 潤(rùn)劑、加工助劑(溶劑)、流動(dòng)劑、口味掩蔽劑、增重劑、膠凍劑(jellyfyingagent)、凝膠形 成劑、抗氧化劑和抗微生物劑。另外，可以向本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物中添加多維生素和礦物質(zhì)補(bǔ)充劑，以獲得 足量的必需營(yíng)養(yǎng)物，所述必需營(yíng)養(yǎng)物在一些膳食中缺失。多維生素和礦物質(zhì)補(bǔ)充劑也可以 用于疾病預(yù)防和防止由生活方式導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)物損失和缺乏。根據(jù)本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物可以是適合施用至體內(nèi)的任何蓋侖制劑形式，特別 是便于口施用的任何形式，例如固體形式如強(qiáng)化的食物或飼料、食物或飼料預(yù)混物、食物或 飼料(的添加劑/補(bǔ)充劑)、片劑、丸劑、顆粒劑、錠劑、膠囊和刨騰配制物，例如粉末和片劑， 或者是液體形式，例如溶液、乳劑或懸浮液，例如飲料、糊劑和油性懸浮液。糊劑可以被摻入 硬殼或軟殼膠囊中，其中膠囊具有例如(魚(yú)、豬、家禽、牛)明膠、植物蛋白質(zhì)或磺酸木質(zhì)素 的基質(zhì)。其它應(yīng)用形式的例子是經(jīng)皮、腸胃外或可注射的施用。膳食和藥物組合物可以是 受控(延時(shí))釋放的配制物形式。食物的例子是乳制品，包括例如人造黃油、涂抹物、黃油、奶酪、軟奶或乳飲品。強(qiáng)化的食物的例子是甜玉米、面包、谷物棒，烘焙物品例如蛋糕和曲奇，和馬鈴薯 片或炸土豆條。飲料包括無(wú)醇飲品和含酒精的飲品，以及要添加進(jìn)飲用水和液體食物中的液體 制劑。無(wú)醇飲品為例如軟飲、運(yùn)動(dòng)飲品、果汁、檸檬水、茶和基于乳的飲品。液體食物為例 如湯和乳制品?？梢韵蜍涳?、能量棒或糖果中添加含有甜菊提取物、其組分或富集的甜菊 提取物的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物，使得成年個(gè)體消耗每份1到lOOOmg、更優(yōu)選50-750mg、最優(yōu)選 100-500mg的甜菊提取物、其組分或富集的甜菊提取物。如果營(yíng)養(yǎng)藥物組合物是藥物配制物，則組合物還含有可藥用的賦形劑、稀釋劑或 佐劑。它們的配制可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如Remington' sPharmaceutical Sciences，第20 版，Williams&Wilkins，PA, USA。對(duì)口施用而言，優(yōu)選地使用下述片劑和膠囊，其含有合適 的粘合劑例如明膠或聚乙烯吡咯烷酮，合適的填充劑例如乳糖或淀粉，合適的潤(rùn)滑劑例如 硬脂酸鎂，和任選地含有其他添加劑。優(yōu)選的是每個(gè)施用單位(例如每個(gè)片劑或膠囊)含 有10到750mg、更優(yōu)選50到500mg甜菊提取物或其組分的配制物。就本發(fā)明的目的而言，對(duì)包括人的動(dòng)物而言，甜菊提取物或其組分的合適的每日 劑量可在每天從每kg體重0. 15mg到每kg體重約IOmg的范圍內(nèi)。更優(yōu)選的是優(yōu)選地以下 述量含有甜菊提取物或其組分的本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物，所述量足以施用給成人(體重 約70kg)從約IOmg/天到約750mg/天、優(yōu)選從約50mg/天到約500mg/天的劑量。提供以下的非限制性例子來(lái)更好地闡述本發(fā)明。實(shí)施例1
甜菊提取物的組成和制備本發(fā)明公開(kāi)的典型的甜菊水性提取物含有甜菊苷約70%萊鮑迪苷(Rebaudiosides)約 20%甜菊醇、異甜菊醇約10%將研碎的Stevia rebaudiana葉與熱水混合20_30分鐘。隨后通過(guò)排水取出水性 提取物，使用壓力從而實(shí)現(xiàn)最大量的提取。可以使用若干類(lèi)型的浸出(infusion)/排水過(guò) 程。允許提取物冷卻至室溫。為了去除顆粒，可以使提取物靜置同時(shí)使顆粒狀的物質(zhì)沉降， 或者可以將提取物離心。隨后通過(guò)噴霧干燥或冷凍干燥來(lái)干燥提取物。該提取物含有增甜 劑成分、植物色素和其他水溶性組分。以下實(shí)施例中使用的甜菊提取物(“甜菊葉提取物，85%粉末”；產(chǎn)品目錄號(hào)S1964) 購(gòu)自 Spectrum Laboratory Products Inc. , Gardena, CA, USA。實(shí)施例2細(xì)胞測(cè)定中，甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的抑制穩(wěn)定表達(dá)人甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lb cDNA(GlyTl)的CH0細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于Dulbecco，s 改良的Eagle's培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，USA)中，所述培養(yǎng)基含有10%經(jīng)透析的胎 牛血清、青霉素、鏈霉素、脯氨酸和抗生素G418。在測(cè)定前一天通過(guò)胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞， 并接種于上述培養(yǎng)基中。測(cè)定前即刻用攝取緩沖液替換培養(yǎng)基，所述緩沖液含150mM NaCl、 ImM CaCl2、2. 5mM KC1、2. 5mM MgCl2、lOmM 葡萄糖和 lOmM N_2_ 羥乙基哌嗪-N，-2-乙磺酸 (HEPES緩沖液)。通過(guò)添加 60nM經(jīng)放射標(biāo)記的[3H]甘氨酸(Amersham Biosciences GEHealthcare, Slough, UK)并在室溫下孵育30分鐘，來(lái)測(cè)定進(jìn)入細(xì)胞的甘氨酸攝取。通過(guò)用上述緩沖液 柔和洗滌三次去除未摻入的標(biāo)簽后，通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)來(lái)量化摻入的甘氨酸。甜菊提取物的添加以劑量依賴(lài)型方式抑制通過(guò)GlyTl轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的甘氨酸攝取。使 用肌氨酸、0RG24598和ALX5407(均來(lái)自Sigma, St. Louis, USA)作為已知的GlyTl抑制 劑。測(cè)量的抑制甘氨酸攝取的IC5(I值(甜菊提取物、提取物組分和參照化合物)和代表性 劑量-應(yīng)答曲線(甜菊提取物)分別顯示于表2和圖1中。Ml 除參照化合物肌氨酸、0RG24598和ALX5407以外，甜菊提取物及其主要組分、 甜菊醇、異甜菊醇和甜菊苷對(duì)進(jìn)入CH0細(xì)胞的甘氨酸攝取的抑制測(cè)量的IC5(I值。數(shù)據(jù)表示 為均值士標(biāo)準(zhǔn)差(其中進(jìn)行多于一次實(shí)驗(yàn))；其中純化合物的IC50以PM表示，提取物的 IC50 以 li g/ml 表示。
物質(zhì)氚標(biāo)記的甘氨酸攝 取的IC5Q甜菊提取物(根據(jù)實(shí)施例1的組合物)45 + 6. 9 u g/ml 實(shí)施例3海馬切片培養(yǎng)物使用環(huán)狀刀對(duì)七天齡的Wistar大鼠斷頭。在少于1分鐘內(nèi)打開(kāi)頭骨，將大腦 半球分離并轉(zhuǎn)移，將每個(gè)海馬切下并轉(zhuǎn)移進(jìn)冰冷的下述緩沖液中，所述緩沖液含有137mM NaCl、5mM KCl、0.85mM Na2HPO4U. 5mMCaCl2,0. 66mM ΚΗ2Ρ04、0· 28mM MgSO4UmM MgCl2, 2. 7mMNaHC03、lmM 犬尿喹啉酸(Kynurenic acid)和 0. 6% D-葡萄糖。在相同緩沖液中使用振動(dòng)刀片切片機(jī)(vibrating blade microtome) (VT1200S ； Leica Microsystems (Schweiz) AG, Heerbrugg，瑞士)制備橫向海馬切片(400 μ m)。將海 馬切片各自置于膜插入物(Millicell Culture PlateInserts, 0. 4 μ m)上，并于 35°C、5% C02、95%濕度下在含BME和MEM(均來(lái)自Invitrogen) 1 1混合物的下述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所 述培養(yǎng)基含有25%熱失活的馬血清、Ix GlutaMAX、lx青霉素/鏈霉素、0.6%葡萄糖和ImM 犬尿喹啉酸(Stoppini 1991 J. Neurosci. Methods 37(2) 173-82)。培養(yǎng)48 小時(shí)后，在 140mM NaCl、5mM KCl U. 3mM CaCl2,25mM HEPES (pH 7.3)、33mM D-葡萄糖和0. 02mM牡丹荷包堿甲碘化物(bicuculline methiodide)中，通過(guò)添加甜菊提 取物、其主要組分或?qū)φ瘴镔|(zhì)15分鐘，來(lái)活化突觸NMDA受體。常規(guī)地使用肌氨酸(100 μ Μ) 和ALX5407 (20ηΜ)作為陽(yáng)性對(duì)照。額外的陽(yáng)性對(duì)照包括向姐妹培養(yǎng)基中添加200 μ M甘氨 酸。處理后將切片洗滌并固定，用于免疫組織化學(xué)分析。對(duì)增強(qiáng)的突觸活性的標(biāo)記物定量 (見(jiàn)下表3)，所述增強(qiáng)的突觸活性通常伴隨著長(zhǎng)期增強(qiáng)，代表了學(xué)習(xí)和記憶的離體模型。表3.與用緩沖液處理的姐妹培養(yǎng)物相比，用甜菊提取物或其一些組分化合物(甜菊醇、異甜菊醇、甜菊苷和萊鮑迪苷A)處理后突觸標(biāo)記物的相對(duì)活化。在經(jīng)典的LTP試驗(yàn) 中觀察任何這些標(biāo)記物(或其組合)的活化。
++++顯示定量的最大活化，++和+分別表示最大活化的一半和中度活化，而士說(shuō) 明免疫反應(yīng)性無(wú)改變；對(duì)GluRl而言，數(shù)值顯示為對(duì)照值的百分比提高。用甜菊提取物、甜菊醇、異甜菊醇和甜菊苷處理海馬培養(yǎng)物誘導(dǎo)了 LTP典型的一 種或多種生物化學(xué)標(biāo)記物(PCREB 活化形式的cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白；pMAPK 活化形式 的促細(xì)胞分裂原活化的蛋白質(zhì)激酶；GluRl =AMPA受體1的細(xì)胞表面存在)。實(shí)施例4ι-下臺(tái)測(cè)試對(duì)小鼠進(jìn)行聯(lián)合的學(xué)習(xí)和記憶范例——下臺(tái)測(cè)試。將小鼠分別地置于反應(yīng)箱中， 所述反應(yīng)箱的地板裝有36V電網(wǎng)。當(dāng)動(dòng)物接受電擊時(shí)，它們正常的反應(yīng)是跳到絕緣的平臺(tái) 上以避免疼痛刺激。因此，下臺(tái)到網(wǎng)上的大部分動(dòng)物會(huì)在接受電擊后迅速跳回平臺(tái)上。在 第0天將動(dòng)物培訓(xùn)5分鐘，并記錄每只小鼠被電擊(即犯錯(cuò))的次數(shù)。所述數(shù)據(jù)組成學(xué)習(xí) 數(shù)據(jù)。在24小時(shí)(第2天，訓(xùn)練日)和48小時(shí)(第2天，測(cè)試日)后對(duì)小鼠進(jìn)行再測(cè)試， 這些試驗(yàn)發(fā)揮記憶測(cè)試的作用。記錄每組中被電擊的動(dòng)物數(shù)量、第一次從平臺(tái)上跳下之前 的時(shí)間(潛伏期)，和最初3分鐘內(nèi)的錯(cuò)誤數(shù)量。在結(jié)束訓(xùn)練后6天，在第8天測(cè)試記憶衰 退(清除測(cè)試)。該研究包含6個(gè)測(cè)試組(每組η = 12)。在訓(xùn)練動(dòng)物之前，通過(guò)每日口強(qiáng)飼法 (lOml/kg)施用30天測(cè)試物質(zhì)或載劑。以3種劑量50(低)、150(中)和450 (高)mg/kg 測(cè)試甜菊提取物，而參照物質(zhì)銀杏以100mg/kg的劑量施用。通過(guò)在測(cè)試前30分鐘的腹膜 內(nèi)注射，施用藥理學(xué)陽(yáng)性對(duì)照咯利普蘭(roliprams lmg/kg)。與用載劑處理的同窩動(dòng)物(陰性對(duì)照)相比，用甜菊處理的所有動(dòng)物組在訓(xùn)練和 記憶期期間和清除周期之后顯示顯著更好的學(xué)習(xí)和記憶表現(xiàn)，如錯(cuò)誤率的降低所示(圖 2a)。另外，在訓(xùn)練期期間，甜菊處理的小鼠(50mg/kg)與施用對(duì)照化合物銀杏的小鼠表現(xiàn)得同樣好，并且比咯利普蘭處理的小鼠表現(xiàn)得更好；在測(cè)試期期間，所有三種劑量的甜菊提 取物導(dǎo)致與在銀杏和咯利普蘭處理的小鼠中所觀察到的相似的表現(xiàn)；在清除周期期間，施 用低劑量和中劑量甜菊提取物的小鼠也與用參照物質(zhì)和陽(yáng)性對(duì)照處理的小鼠表現(xiàn)得同樣 好，而最高劑量的甜菊誘導(dǎo)了比銀杏處理的小鼠中所觀察到的顯著更好的表現(xiàn)。在測(cè)試期期間，在施用中劑量甜菊提取物的小鼠中，潛伏期與載劑處理的對(duì)照小 鼠相比被顯著提高。另外，該作用與在咯利普蘭處理的小鼠中所觀察到的等同。在清除期 期間，與載劑處理的對(duì)照小鼠和施用銀杏提取物的小鼠相比，最高劑量的甜菊提取物誘導(dǎo) 了潛伏期的顯著提高(圖2b)。因此，總而言之，甜菊提取物能夠?qū)W(xué)習(xí)和記憶表現(xiàn)改善至與天然參照物質(zhì)銀杏 和藥物陽(yáng)性對(duì)照化合物咯利普蘭相似或更好的程度。圖2a 下臺(tái)測(cè)試中結(jié)果的錯(cuò)誤率；a 訓(xùn)練周期期間與載劑處理的年齡匹配的同窩 動(dòng)物顯著不同。b 測(cè)試周期期間與載劑處理的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同。c 清除周期 期間與載劑處理的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同。d 清除周期期間與銀杏處理的小鼠顯著 不同。在所有情況下，顯著性被標(biāo)注為P <0.05。這些數(shù)據(jù)顯示甜菊處理的小鼠不僅比其 他組學(xué)習(xí)得更好，而且將其記憶保留更長(zhǎng)的時(shí)間段。圖2b展示下臺(tái)行為測(cè)試的的結(jié)果；逃離電擊的潛伏期持續(xù)時(shí)間。b 測(cè)試周期期間 與載劑處理的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同。c 清除周期期間與載劑處理的年齡匹配的同 窩動(dòng)物顯著不同。d:清除周期期間與銀杏處理的小鼠顯著不同。在所有情況下，顯著性被 標(biāo)注為P <0.05。因此，用150mg/kg甜菊提取物處理的小鼠顯示比它們年齡匹配的對(duì)照顯 著更好的學(xué)習(xí)和記憶表現(xiàn)，同時(shí)在最高劑量下，甜菊處理的小鼠顯示比年齡匹配的對(duì)照小 鼠和銀杏處理的陽(yáng)性對(duì)照表現(xiàn)得更好。實(shí)施例5
wise] mmmm^mmm^m^^mimmm^mm 2-Morris 水迷宮Morris水迷宮是測(cè)試嚙齒動(dòng)物中空間記憶(spatial memory)的被最好接受的范 例之一。小鼠必須借助于實(shí)驗(yàn)室中視覺(jué)提示的使用，在圓形池中游泳并尋找隱藏的平臺(tái)。此處使用與下臺(tái)測(cè)試范例中相同的劑量和處理時(shí)間。該研究中使用的Morris水迷宮(直徑=1. 5m)包含位于西北象限(10點(diǎn)鐘處) 距池邊緣IOcm的隱藏平臺(tái)(10cm χ 10cm)。第0天時(shí)，使小鼠習(xí)慣測(cè)試場(chǎng)地并接受兩次訓(xùn) 練試驗(yàn)，期間訓(xùn)練它們游向平臺(tái)。在第1到3天，從水迷宮中去除平臺(tái)，每天使小鼠接受兩次訓(xùn)練試驗(yàn)。每次訓(xùn)練 (90秒)后，將平臺(tái)放回相同位置處，允許小鼠找到并爬上所述平臺(tái)。該流程確保小鼠在每 個(gè)訓(xùn)練日中有效地學(xué)習(xí)平臺(tái)的位置，并在隨后的試驗(yàn)中回憶起平臺(tái)的位置。記錄定位平臺(tái) 放置區(qū)域的初始時(shí)間(第一跨越平臺(tái)時(shí)間；FCPT)和小鼠游經(jīng)平臺(tái)放置區(qū)域的次數(shù)(跨越 次數(shù))，并提供每個(gè)訓(xùn)練日的平均得分(第1天到體3天訓(xùn)練得分)。第4天時(shí)，小鼠再接 受兩次試驗(yàn)，其結(jié)果為測(cè)試得分。訓(xùn)練區(qū)間(session)的第1天，施用最低劑量甜菊的小鼠比載劑處理的對(duì)照小鼠 和施用陽(yáng)性對(duì)照化合物咯利普蘭的小鼠表現(xiàn)得顯著更好(圖3a)。第4天在測(cè)試試驗(yàn)期間， 用中劑量和高劑量甜菊處理的小鼠顯示與年齡匹配的對(duì)照動(dòng)物相比顯著更短的潛伏期時(shí)間(圖3b)。因此，這些數(shù)據(jù)表明用甜菊提取物處理影響小鼠的學(xué)習(xí)以及記憶表現(xiàn)，并且該 影響依賴(lài)于使用的劑量。圖3a展示訓(xùn)練日期間，定位Morris水迷宮中隱藏平臺(tái)先前位置的潛伏期。a:第一 天期間與載劑處理的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同，強(qiáng)調(diào)用低劑量甜菊提取物(50mg/kg) 處理顯著改善了動(dòng)物的學(xué)習(xí)表現(xiàn)。顯著性被標(biāo)注為P < 0. 05。圖3b展示測(cè)試日(第4天)時(shí)定位Morris水迷宮中隱藏平臺(tái)先前位置的潛伏期。 a:與載劑處理的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同，顯示用中(150mg/kg)和高(450mg/kg)劑 量甜菊提取物處理顯著改善了動(dòng)物的記憶表現(xiàn)，其程度與施用參照物質(zhì)銀杏的小鼠中所觀 察到的相同，比咯利普蘭(rolipram)處理的動(dòng)物更好。顯著性被標(biāo)注為ρ < 0. 05。實(shí)施例6舌甘Hf帛耳對(duì)勿會(huì)充白如忠力云M勿-a禾口記^草白射乍ffl3-穿梭箱測(cè)試作為該動(dòng)物測(cè)試基礎(chǔ)的范例是積極避免不良刺激。穿梭箱的一部分裝有釋放電擊 的網(wǎng)格。電擊之前有聽(tīng)覺(jué)信號(hào)(“嘟嘟”的噪音，持續(xù)7秒)。動(dòng)物必須學(xué)習(xí)逃離至穿梭箱 的另一側(cè)，從而跨越紅外光束。此處使用與下臺(tái)測(cè)試范例相同的劑量和處理時(shí)間。將小鼠每天訓(xùn)練一次，持續(xù)5天。訓(xùn)練程序由15個(gè)區(qū)間組成；每個(gè)區(qū)間包括(1)15 秒的暫停，(2)7秒的聽(tīng)覺(jué)信號(hào)(“響?hù)[周期(be印ingperiod) ”)和(3)8秒的電擊(“刺激 周期”)。如果小鼠在響?hù)[周期或刺激周期期間跨越穿梭箱任一端的兩個(gè)紅外光束之一，則 進(jìn)行下一區(qū)間。記錄積極逃離次數(shù)(響?hù)[周期)和消極逃離次數(shù)(刺激周期)，并計(jì)算總逃 離次數(shù)。如果小鼠在響?hù)[周期期間未跨越紅外光束，則記錄為錯(cuò)誤。采用第4天記錄的錯(cuò) 誤和逃離次數(shù)作為訓(xùn)練得分，第5天的作為測(cè)試得分，第8天的作為衰竭得分。在測(cè)試期(第5天)期間，最高劑量的甜菊提取物誘導(dǎo)與載劑處理的對(duì)照小鼠相 比顯著更少的錯(cuò)誤；對(duì)錯(cuò)誤率的影響與在咯利普蘭處理的陽(yáng)性對(duì)照小鼠中所觀察到的等 同。另外，與載劑處理和銀杏處理的小鼠相比，中劑量和高劑量甜菊提取物顯著降低逃離時(shí) 間。因此，這些數(shù)據(jù)也表明，用甜菊提取物處理影響小鼠的學(xué)習(xí)性能，但是該影響取決于使 用的劑量。圖4a展示穿梭箱(shuttle box)測(cè)試中的錯(cuò)誤率a.測(cè)試周期期間與載劑處理 的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同。b 衰竭周期(extinction period)期間與載劑處理的年 齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同。顯著性被標(biāo)注為P <0.05。因此，在測(cè)試周期中檢查的最高 劑量下，甜菊處理的動(dòng)物顯示比載劑處理的同窩動(dòng)物顯著更好的記憶表現(xiàn)，和與施用陽(yáng)性 對(duì)照化合物咯利普蘭的小鼠等同的表現(xiàn)。圖4b展示穿梭箱測(cè)試中的逃離時(shí)間a 測(cè)試周期期間與載體處理的年齡匹配的 同窩動(dòng)物顯著不同。b 測(cè)試周期期間與銀杏處理的年齡匹配的同窩動(dòng)物顯著不同。顯著性 被標(biāo)注為P < 0. 05。這些結(jié)果顯示甜菊處理的小鼠(劑量為150和450mg/kg)學(xué)習(xí)逃離足 部電擊，它們的表現(xiàn)比載劑處理的對(duì)照小鼠和施用參照物質(zhì)咯利普蘭的小鼠二者均更好。實(shí)施例7在IntelliCage 中比較用甜菊提取物或銀杏處理的小鼠的認(rèn)知表現(xiàn)，所述IntelliCage 系統(tǒng)允許在居住籠樣環(huán)境(homecage-like environment)中自動(dòng)監(jiān)測(cè)小鼠 的自發(fā)行為禾口學(xué)習(xí)行為(NewBehavior AG, Ziirich, Switzerland, www.newbehavior.com; Galsworthy et al. 2005, Behav Brain Res 157 211~217 ；Onishchenko et al. 2007, Toxicol Sci 97 :428-437)。個(gè)體小鼠被IntelliCage角落中讀取應(yīng)答器(參照識(shí)別標(biāo)簽) 的傳感器識(shí)別，所述應(yīng)答器植入小鼠的頸背中。每個(gè)IntelliCage 實(shí)際上是一個(gè)大的籠子 (37. 5x 55x20. 5cm)，向其中放置包含四個(gè)記錄(工作)室的金屬框架。記錄室安置在籠的 角落，各自覆蓋地板空間的15x 15x 21cm直角三角型區(qū)域?；\內(nèi)天線允許自動(dòng)化監(jiān)測(cè)每只 個(gè)體小鼠的角落訪問(wèn)；每個(gè)角落內(nèi)的光束允許自動(dòng)化記錄個(gè)體的鼻子觸碰(nosepoke)和 舔水瓶口(licks of the water bottlespout)行為。將四個(gè)三角型小鼠掩蔽體置于籠中 心，在上面放置食物漏斗，使得能夠隨意取用食物。每個(gè)記錄室含有(1)塑料環(huán)(內(nèi)徑30mm)，其發(fā)揮進(jìn)入室內(nèi)的入口作用并且覆蓋 記錄角落訪問(wèn)的環(huán)狀天線；(2)網(wǎng)格地板，小鼠一進(jìn)入室內(nèi)就坐在所述地板上；(3)兩個(gè)環(huán) 狀開(kāi)口(13mm直徑)，其使得能夠達(dá)到水瓶口 ；每個(gè)開(kāi)口被記錄鼻子觸碰的光束穿過(guò)；(4) 兩個(gè)機(jī)動(dòng)門(mén)，其允許(門(mén)開(kāi)放)或阻止(門(mén)關(guān)閉)到達(dá)水瓶口 ；(5)兩個(gè)水瓶；(6)管道，可 以通過(guò)所述管道遞送空氣噴氣作為令鼠不悅的刺激；(7)不同顏色的發(fā)光二極管，其可以 被用于調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)階段研究包含三個(gè)測(cè)試組(每組η = 12-14)載劑(對(duì)照)、銀杏(100mg/kg)和甜菊 提取物(450mg/kg)。在8周的整個(gè)研究期間，通過(guò)每日口強(qiáng)飼法(10ml/kg)對(duì)所有小鼠施 用測(cè)試物質(zhì)或載劑。在處事適應(yīng)周期(4-5天)期間，小鼠可以自由到達(dá)所有角落、水和飼料，并可自由 探索籠子。隨后，小鼠必須學(xué)習(xí)應(yīng)用鼻子觸碰(鼻子觸碰適應(yīng)模塊，3天)；所有的門(mén)最初是 關(guān)閉的(禁止接觸水)，并且小鼠必須進(jìn)行鼻子觸碰從而打開(kāi)門(mén)并達(dá)到水瓶口。收集到的數(shù) 據(jù)包含若干參數(shù)，例如每只個(gè)體小鼠最不優(yōu)選的角落，所述數(shù)據(jù)被記錄用于程序設(shè)計(jì)下一 模塊。物品識(shí)別為了測(cè)試小鼠的內(nèi)在探索活動(dòng)，將兩個(gè)相同的物品分別置于角落1和2中或角落 3和4中，各自包括每組最不優(yōu)選的角落。動(dòng)物具有自由探索籠子的機(jī)會(huì)，并能完全獲得水 和飼料。物品出現(xiàn)之前3小時(shí)和之后3小時(shí)記錄訪問(wèn)。角落1和2中物品出現(xiàn)之后對(duì)照組 的訪問(wèn)模式未改變，而銀杏和甜菊處理二者均導(dǎo)致對(duì)含新穎物品的角落(分別為角落4和 2)的訪問(wèn)持續(xù)時(shí)間顯著提高(圖5)。因此，甜菊提取物的慢性施用顯著地提高了小鼠的探 索活動(dòng)，與銀杏的程度相同。圖5展示物品出現(xiàn)之前3小時(shí)和之后3小時(shí)每個(gè)角落中的訪問(wèn)持續(xù)時(shí)間。箭頭表 示放置物品。與載劑處理的對(duì)照小鼠相比，銀杏和甜菊提取物顯著地提高了對(duì)含有新穎物 品的角落的訪問(wèn)持續(xù)時(shí)間(分別P = 0. 004和P = 0. 005)。因此兩種處理均提高了物品識(shí) 別測(cè)試中小鼠的探索活動(dòng)。側(cè)面辨別設(shè)計(jì)該模塊用來(lái)測(cè)試注意力和聯(lián)想式記憶(associative memory)。對(duì)每只小鼠指 定一個(gè)正確的角落。在這個(gè)角落中僅指定(兩個(gè)中)一個(gè)側(cè)面是正確的，并通過(guò)綠色LED對(duì)動(dòng)物指明。動(dòng)物能夠在正確的一個(gè)側(cè)面進(jìn)行鼻子觸碰隨后從水瓶中飲用。在該模塊期間 記錄地點(diǎn)錯(cuò)誤(即訪問(wèn)不正確角落的百分比)和側(cè)面錯(cuò)誤(即在正確角落的不正確側(cè)面上 鼻子觸碰的百分比)。這些數(shù)據(jù)表明在用甜菊提取物慢性處理后改善的注意力，因?yàn)樵跍y(cè)試的最初12 個(gè)小時(shí)(活性期)中與載劑和銀杏處理的小鼠相比地點(diǎn)錯(cuò)誤率(圖6)和側(cè)面錯(cuò)誤率(圖 7)均顯著更低。圖6展示地點(diǎn)錯(cuò)誤率(訪問(wèn)不正確角落的百分比)。甜菊提取物處理導(dǎo)致與載劑 處理的對(duì)照小鼠和施用銀杏的小鼠二者相比均顯著更低的百分比錯(cuò)誤率(分別P = 0. 012 和p = 0. 017)。從模塊開(kāi)始時(shí)觀察到該效果并保持最初12小時(shí)(活性期)，證明用甜菊處 理導(dǎo)致更高的注意力水平和改善的記憶表現(xiàn)。圖7展示側(cè)面錯(cuò)誤率(用鼻子觸碰正確角落不正確側(cè)面的百分比)。甜菊提取物再 次誘導(dǎo)與載劑處理對(duì)照和銀杏處理的小鼠相比顯著更低的百分比錯(cuò)誤率(分別P = 0. 002 和P = 0. 035)。從模塊開(kāi)始時(shí)觀察到該效果并保持最初12小時(shí)(活性期)，表明甜菊處理 的小鼠中改善的注意力和記憶?？偠灾瑏?lái)自自動(dòng)化IntelliCage 研究的結(jié)果驗(yàn)證了來(lái)自經(jīng)典測(cè)試(實(shí)施例4、 5和6)的行為結(jié)果用甜菊提取物處理8周導(dǎo)致與載劑處理的同窩動(dòng)物相比小鼠學(xué)習(xí)和記 憶的顯著改善。在一些情況下，在甜菊處理的小鼠中觀察到的表現(xiàn)改善甚至比施用天然參 照物質(zhì)銀杏或藥物陽(yáng)性對(duì)照化合物咯利普蘭任一的小鼠中所觀察到的更大。實(shí)施例8制備軟明膠膠囊制備包含以下成分的軟明膠膠囊 可以向成年人每天施用兩粒膠囊，持續(xù)3個(gè)月。觀察到認(rèn)知功能、警覺(jué)和專(zhuān)注于工 作的能力都有所改善。實(shí)施例9制備即食的調(diào)味軟飲 將所有成分混合并篩過(guò)500 u m的篩網(wǎng)。將得到的粉末置于適宜的容器中，并在管 狀攪拌機(jī)中至少混合20分鐘。為了制備飲品，將獲得的105g混合的粉末與足量水混合，制
備一升飲料。即飲型軟飲每份(250ml)含有約15mg富集的甜菊提取物。作為增強(qiáng)劑 (strengthener)或?qū)σ话憬】刀?，每天可飲?份(500ml)。觀察到認(rèn)知功能、警覺(jué)和專(zhuān) 注于工作的能力都有所改善。實(shí)施例10制備強(qiáng)化的非烘焙的谷物棒 將迷迭香提取物與脫脂乳粉預(yù)混合，并置于行星式碗狀攪拌機(jī)(planetary bowl mixer)中。添加玉米脆和脆米酥，將整體輕柔混合。然后添加干燥并切開(kāi)的蘋(píng)果。在第一 烹調(diào)罐中，以上文給定的量混合水和鹽(溶液1)。在第二烹調(diào)罐中，以上文給定的量混合葡 萄糖漿、轉(zhuǎn)化糖漿和山梨醇糖漿(溶液2)。油脂相由烘焙油脂、棕櫚仁油脂、卵磷脂和乳化 劑的混合物組成。將溶液1加熱至110°C。將溶液2加熱至113°C，然后在冷水浴中冷卻。 之后將溶液1和溶液2合并。在水浴中于75°C下熔化油脂相，然后添加至溶液1和2的合 并混合物中。向液體的糖/油脂混合物中添加蘋(píng)果味香料和檸檬酸。將液體物料添加至干 燥成分中，并在行星式碗狀攪拌機(jī)中充分混合。將物料置于大理石板上，并滾碾至期望的厚 度。將物料冷卻至室溫，并切件。非烘焙的谷物棒每份(30g)含有約10mg的甜菊提取物。 對(duì)于一般健康和供能而言，每天可食用1-2只谷物棒。觀察到認(rèn)知功能、警覺(jué)和專(zhuān)注于工作 的能力均有所改善。實(shí)施例11含甜菊提取物的干燥狗飼料
以足夠施用給狗每kg體重4mg甜菊提取物的每日劑量的量，用甜菊提取物在水中 的溶液與抗氧化劑例如維生素C(例如來(lái)自DSM NutritionalProducts Ltd,Kaiseraugst, 瑞士的ROVIMIX C-EC)及其衍生物，即抗壞血酸單磷酸鈉(例如來(lái)自DSM Nutritional Products Ltd,Kaiseraugst,瑞士的STAY-C 50)或L_抗壞血酸鈉/鈣的三磷酸酯、二磷 酸酯和單磷酸酯的混合物(例如來(lái)自DSM Nutritional Products Ltd，Kaiseraugst，瑞士 的ROVIMIX STAY-C 35) —起，對(duì)狗用商業(yè)基礎(chǔ)膳食(例如Mera Dog"Brocken", MERA-Tiernahrung GmbH，Marienstra旦 e 80—84，D-47625Kevelaer_Wetten，德國(guó))進(jìn)對(duì)亍噴 霧。將食物組合物干燥至含有按重量計(jì)約90%的干物質(zhì)。對(duì)于每天消耗約200g干飼料的 10kg體重的平均狗而言，狗食物含有每kg食物約200mg甜菊提取物。對(duì)更重的狗而言，相 應(yīng)地制備飼料混合物。為了在狗中減少壓力、恐懼和攻擊性，可以在動(dòng)物掩蔽所(animal shelter farm)中有規(guī)律地給予所述食物。在看獸醫(yī)之前或在獸醫(yī)診所停留或假期分離時(shí)， 在應(yīng)激事件之前至少一周、事件期間和之后一周給予所述食物。實(shí)施例12含甜菊提取物的濕潤(rùn)貓食物以足夠施用給貓每kg體重4mg甜菊提取物的每日劑量的量，用甜菊提取物在水中 的溶液與抗氧化劑例如維生素C(例如來(lái)自DSM NutritionalProducts Ltd,Kaiseraugst, 瑞士的ROVIMIX C-EC)及其衍生物，即抗壞血酸單磷酸鈉(例如來(lái)自DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst，瑞士的STAY-C 50)或L_抗壞血酸鈉/鈣的三磷酸酯、二 磷酸酯和單磷酸酯的混合物(例如來(lái)自DSM Nutritional Products Ltd，Kaiseraugst，瑞 士的ROVIMIX STAY-C 35) —起，與貓用商業(yè)基礎(chǔ)膳食(例如Happy Cat"Adult", Tierfeinnahrung, Sudliche Hauptstra 旦 e 38，D_86517Wehringen，德國(guó))t昆合。對(duì)于f肖耗 約400g濕潤(rùn)食物的5kg體重的平均貓而言，貓食物含有每kg食物50mg甜菊提取物。將食 物組合物干燥至含有按重量計(jì)約90 %的干物質(zhì)。為了在貓中減少壓力、恐懼和攻擊性，可以 在動(dòng)物掩蔽所中有規(guī)律地給予所述食物。在看獸醫(yī)之前或在獸醫(yī)診所停留時(shí)，在應(yīng)激事件 之前至少一周、事件期間和之后一周給予所述食物。實(shí)施例13含甜菊提取物的狗零食以足夠施用給調(diào)劑者每g零食0. 5-5mg甜菊提取物的量，用甜菊提取物在水中的 溶液與抗氧化劑例如維生素C(例如來(lái)自DSM NutritionalProducts Ltd，Kaiseraugst，瑞 士的ROVIMIX C-EC)及其衍生物，即抗壞血酸單磷酸鈉(例如來(lái)自DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst，瑞士的STAY-C 50)或L_抗壞血酸鈉/鈣的三磷酸酯、二 磷酸酯和單磷酸酯的混合物(例如來(lái)自DSM Nutritional Products Ltd，Kaiseraugst，瑞 士的ROVIMIX STAY-C 35) —起，對(duì)商業(yè)狗零食(例如由MeraTiernahrung GmbH, Marienstrasse 80-84，47625Kevelaer_Wetten，德國(guó)提供的狗用 Mera Dog “Biscuit，，)進(jìn) 行噴霧。將食物組合物干燥至含有按重量計(jì)約90%的干物質(zhì)。為了減少恐懼和緊張，可以 在一天中除食物之外給予零食，或者在不保證飼喂時(shí)(即旅行期間)每天至多5次給予零 合民。實(shí)施例14含甜菊提取物的貓零食
以足夠施用給調(diào)劑者每g零食0. 5-5mg甜菊提取物的量，用甜菊提取物在水中的 溶液與抗氧化劑例如維生素C(例如來(lái)自DSM NutritionalProducts Ltd，Kaiseraugst，瑞 士的ROVIMIX C-EC)及其衍生物，即抗壞血酸單磷酸鈉(例如來(lái)自DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst，瑞士的STAY-C 50)或L_抗壞血酸鈉/鈣的三磷酸酯、二 磷酸酯和單磷酸酯的混合物(例如來(lái)自DSM Nutritional Products Ltd，Kaiseraugst，瑞 士的ROVIMIX STAY-C 35) —起，對(duì)商業(yè)貓零食(例如由 Whiskas，Masterfoods GmbH, Eitzer Str. 215，27283Verden/Aller，德國(guó)提供的貓用 Whiskas Dentabits)進(jìn)行噴 霧。將食物組合物干燥至含有按重量計(jì)約90%的干物質(zhì)。為了減少恐懼和緊張，可以在一 天中除食物之外給予零食，或者在不保證飼喂時(shí)(即旅行期間)每天至多5次給予零食。
權(quán)利要求
在動(dòng)物或人中改善認(rèn)知功能和/或心理狀態(tài)的方法，包括施用認(rèn)知功能改善量的選自以下的化合物甜菊醇、甜菊雙糖苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C(杜爾可苷B)、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F、甜茶苷、杜爾可苷A、異甜菊醇及其混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物存在于甜菊提取物中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述甜菊提取物含有至少約10-90%的甜菊苷、甜菊醇 和/或異甜菊醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述認(rèn)知功能和/或心理狀態(tài)選自保持認(rèn)知良好和 平衡、學(xué)習(xí)、語(yǔ)言處理、解決問(wèn)題、智力功能、應(yīng)付社會(huì)心理負(fù)擔(dān)的能力、注意力和精神集中、 記憶、記憶能力、精神警覺(jué)、精神警戒、精神疲勞、精神狀態(tài)的穩(wěn)定、減輕壓力、超負(fù)荷工作的 壓力、壓力相關(guān)的衰竭和/或精疲力盡，和促進(jìn)放松。
5.用于制造在動(dòng)物或人中改善認(rèn)知功能的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物或藥物組合物，所述組合物 包含認(rèn)知功能改善量的選自以下的化合物甜菊醇、甜菊雙糖苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C(杜爾可苷B)、萊鮑迪 苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F、甜茶苷、杜爾可苷A、異甜菊醇及其混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述化合物存在于甜菊提取物中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中所述甜菊提取物含有至少約10-90%的甜菊苷、甜菊 醇和/或異甜菊醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述認(rèn)知功能選自保持認(rèn)知良好和平衡、學(xué)習(xí)、語(yǔ) 言處理、解決問(wèn)題、智力功能、應(yīng)付社會(huì)心理負(fù)擔(dān)的能力、注意力和精神集中、記憶、記憶能 力、精神警覺(jué)、精神警戒、精神疲勞、精神狀態(tài)的穩(wěn)定、減輕壓力、超負(fù)荷工作的壓力、壓力相 關(guān)的衰竭和/或精疲力盡，和促進(jìn)放松。
9.包含認(rèn)知功能改善量的選自以下的化合物的營(yíng)養(yǎng)藥物甜菊醇、甜菊雙糖苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C(杜爾可苷B)、萊鮑迪 苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F、甜茶苷、杜爾可苷A、異甜菊醇及其混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的營(yíng)養(yǎng)藥物，其用于獸醫(yī)用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的營(yíng)養(yǎng)藥物，其中所述認(rèn)知功能選自保持認(rèn)知良好和平衡、學(xué)習(xí)、 語(yǔ)言處理、解決問(wèn)題、智力功能、應(yīng)付社會(huì)心理負(fù)擔(dān)的能力、注意力和精神集中、記憶、記憶 能力、精神警覺(jué)、精神警戒、精神疲勞、精神狀態(tài)的穩(wěn)定、減輕壓力、超負(fù)荷工作的壓力、壓力 相關(guān)的衰竭和/或精疲力盡，和促進(jìn)放松。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含甜菊提取物或其組分例如甜菊醇和甜菊苷作為活性成分的新穎的營(yíng)養(yǎng)藥物組合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)藥物組合物”表示在營(yíng)養(yǎng)、藥物和獸醫(yī)應(yīng)用領(lǐng)域中的有用性。所述組合物可用于改善認(rèn)知功能例如學(xué)習(xí)、記憶和警覺(jué)，和改善精神穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)A61K31/704GK101883568SQ200880119091
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2008年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月3日
發(fā)明者伯恩德·穆斯勒, 克勞斯·吉爾伯特, 哈?！つ苋? 安·福勒, 安尼斯·奧利維亞·麥尼-莫肯, 瑞吉納·古拉爾奇克, 艾德里安·維斯 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司