專利名稱：抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體制備方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，在疾病診斷、治療方面，弄清生物體防御機能、尤其是其核心免疫機能， 正逐漸成為重要課題。例如，在診斷除癌癥、糖尿病等生活習慣病以外的其他各種疾病時使 用的各種方法中，提出了能像可目視檢測與疾病密切相關(guān)的標記物的濃度、量的免疫膠體 層析法一樣可更簡便診斷的方法，研究用試劑、診斷用試劑、各種物質(zhì)監(jiān)測用試劑、免疫學 診斷、治療領(lǐng)域被進一步擴大，但所述方法中抗體的穩(wěn)定確保將在今后變得越來越重要。另 夕卜，開發(fā)出了利用噬菌體展示系統(tǒng)的抗體庫制備技術(shù)，分離人抗體也成為可能。另外，制備免疫學測定中必要的單克隆抗體時，首先要向小鼠中注射抗原(免 疫)，此步驟需要約3個月。之后提取產(chǎn)生抗體的B細胞群，與骨髓瘤細胞進行細胞融合。 通過此步驟構(gòu)建出可無限增殖的抗體產(chǎn)生細胞(雜交瘤)群。最后從該雜交瘤細胞群中篩 選能產(chǎn)生目的抗體的細胞(克隆)，用該細胞進行抗體的大量制備。此克隆步驟中，需要稀 釋雜交瘤細胞群，使1孔只含1個細胞的狀態(tài)，從1細胞開始進行培養(yǎng)。使其增殖到可進行 抗體性質(zhì)研究的細胞濃度，再對所得單克隆抗體的性質(zhì)進行檢查。對呈陽性的孔再次進行 稀釋，進行與上述相同的檢查。重復實施該操作幾次，便分離得到耐用的雜交瘤細胞。此步 驟1個周期需要約2周，也有整體需要3個月以上的情況。上述制備單克隆抗體的方法費 時費力，且需要依賴專業(yè)人員，制備抗體成本高昂。這里例舉公知文獻對抗體制備方法進行具體說明，特開平10-282097號公報中記 載了對以佐劑物質(zhì)、細胞因子的組合為特征的抗原的特異性免疫方法。特開2004-121237 號公報中記載了如下制備特異性抗體的方法，其特征是，按照誘導抗體產(chǎn)生應(yīng)答的方法，將 誘導出抗原特異性抗體的產(chǎn)生應(yīng)答的末梢血淋巴細胞通過EB病毒永生化，分離抗原特異 性B細胞，制備產(chǎn)生抗原特異性抗體的B細胞，及進一步培養(yǎng)上述B細胞。特開2006-180708 號公報中記載了如下抗體制備方法，其包括將經(jīng)標記抗原與靶細胞結(jié)合的步驟、分離 經(jīng)標記靶細胞的步驟、制備抗體基因步驟、用表達載體表達抗體基因的步驟。此外，特表 2006-516408號公報中記載了經(jīng)過一系列步驟，由目的抗體制備人源化高親和力抗體的方 法。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種新的抗體制備方法，其比以往費時費力的抗體制 備方法用時更短，制備更容易。本發(fā)明基于這些新抗體制備方法，以實現(xiàn)在作為腎癌標記物而被廣泛關(guān)注的 S100A10蛋白免疫學測定、治療中有效的抗體制備方法為目的。S100A10蛋白如高山達也 等，腎癌細胞中S100A10蛋白的特異性表達，腎癌研究會會報，28 9-10,2005中所述，可作 為腎癌標記物使用，由于該標記物也可從尿成分中獲得，因此在簡便診斷腎癌中應(yīng)用價值很
為達成這些目的，本發(fā)明提供一種抗體制備方法，包括將含免疫用細胞的組織在 含抗原和刺激物的培養(yǎng)液中體外免疫的步驟；篩選所述經(jīng)免疫的細胞的步驟；及從篩選出 的免疫細胞獲得抗體的步驟。即本發(fā)明使用所謂體外免疫法，在添加了特定刺激物的培養(yǎng)液中得到由抗原所致 的致敏免疫細胞，能夠?qū)崿F(xiàn)用通常所需時間的幾十分之一的時間來制備抗體。更詳細而言，首先，如果異物(抗原)進入體內(nèi)，則巨噬細胞、樹突狀細胞將其攝入 細胞中。異物在細胞內(nèi)分解，將分解產(chǎn)物呈遞到細胞膜表面。接著幼稚T細胞靠近分解產(chǎn) 物，通過幼稚T細胞表面的T細胞受體(TCR)識別抗原，經(jīng)此過程活化T細胞，成為輔助T 細胞(Th2)。另一方面，B細胞也是通過將侵入體內(nèi)的異物(抗原)用細胞表面上的B細胞受 體(BCR)識別而攝入細胞內(nèi)。被攝入的抗原被快速分解，分解產(chǎn)物被呈遞到II類MHC分子 上。此時，被稱為CD40的分子也同時在細胞膜表面表達。 通過上述方法可使Th2和抗原呈遞B細胞靠近，相互識別，開始活化B細胞及抗體 的類別轉(zhuǎn)換。此時，未發(fā)現(xiàn)不是用相同抗原活化的分子則發(fā)生的現(xiàn)象。其中，上述情況中的免疫反應(yīng)雖然在體內(nèi)實施，但使所述免疫反應(yīng)在體外發(fā)生的 方法是所謂的體外免疫法。本發(fā)明為了在體外得到期望的抗體產(chǎn)生細胞而添加刺激物，而將B細胞分化誘導 成抗體產(chǎn)生細胞(漿細胞)或記憶B細胞。這里的所謂刺激物只要可與在免疫活性細胞 (如B細胞、樹突狀細胞、T細胞等)的膜表面表達的受體分子相互作用，則無特定限制。在 本發(fā)明的實施中，尤其作為針對細胞因子受體的刺激物，可舉例IL_1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-21 ；作為針對表面抗原的刺激物可舉例TGF_i3 (轉(zhuǎn)化生長因 子- β ) ,BAFF (B細胞活化因子)、APRIL(A增值-誘導配體)、⑶40配體、⑶38配體、B⑶F (B 細胞分化因子)、BCAF(B細胞活化因子)；作為針對信號轉(zhuǎn)導相關(guān)受體的刺激物，可舉例 LPS (脂多糖)等。刺激物的使用濃度，雖然隨著所免疫細胞的濃度而變化，但是LPS優(yōu)選 10ng/mL 500 μ g/mL的濃度，特別推薦20 80 μ g/mL的濃度。另外，LPS以外的物質(zhì)，一 般優(yōu)選為Ing/mL 50 μ g/mL的濃度，特別推薦為lOng/mL 40ng/mL的濃度。另外，可為 代替這些物質(zhì)的功能的激動劑抗體。在該誘導分化過程中，特別通過IL-4、IL-5、抗-⑶38 抗體、抗-CD40抗體刺激來誘導抗體的親和力成熟及類別轉(zhuǎn)換，成為親和力更高的抗體。另外通過利用使用像FACScan這樣的基于流式細胞術(shù)等的細胞分離裝置來對目 的細胞染色篩選的方法進行致敏免疫細胞的檢測及分離。作為本發(fā)明中使用的篩選及檢測免疫細胞用染色劑，并沒有特定限制。例如作為 染色劑可使用臺盼藍來檢測增殖、生存中的B細胞，而其他的，在流式細胞術(shù)中使用的用 FITC或PE等熒光物質(zhì)標記的抗原或抗體，特別是檢測細胞內(nèi)鈣濃度的Fura-2這樣的熒光 探針或給細胞內(nèi)DNA染色的溴化乙錠為代表的DNA染色劑等，只要能夠給目的免疫細胞染 色，都可適當使用。而篩選發(fā)生類別轉(zhuǎn)換或親和力成熟的細胞時，可適當使用與上述染色劑同樣的染 色劑。檢測、篩選被染色細胞的方法，除例如流式細胞儀等細胞分離裝置以外，還可適當利用例如血細胞計數(shù)器等血細胞計數(shù)板、電泳裝置、離心裝置、磁珠裝置、微型電路裝置等。
另外，將分離出的細胞與骨髓瘤細胞融合而得到雜交瘤也可，但也不一定非要得 到雜交瘤。此外，本發(fā)明構(gòu)成如下需從組織上篩選用于得到抗體基因的細胞，并通過體外免 疫步驟來篩選免疫細胞，并由這些免疫細胞通過PCR方法形成抗體基因，再將其導入宿主 細胞培養(yǎng)表達，進而大量制備抗體，通過該方法，可從組織片得到免疫后的細胞，從而可謀 求作業(yè)效率的提高。從該細胞中得到的抗體基因通過PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))法擴增，再由大腸桿菌等 宿主細胞，優(yōu)選與經(jīng)克隆化而獲得抗體的步驟組合，可在短時間內(nèi)制備大量抗體。作為宿主 細胞，除大腸桿菌外，可舉例鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、CHO細胞、COS細胞、HEK293細 胞等。另外，作為表達載體，只要是能在宿主細胞中表達的載體，就沒有特定限制。作為 表達載體，可舉例源于細菌質(zhì)粒、源于酵母質(zhì)粒、染色體、游離基因、源于病毒、源于逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 病毒的載體等。如上所述課題以外，本發(fā)明人還研究了“即便在體外篩選得到免疫細胞，難道就不 能無需作為至篩選的準備的雜交瘤形成步驟而可分離抗體基因”這樣的課題。本發(fā)明人得出，在采用體外免疫方法時，可通過添加一定的刺激物來實現(xiàn)向記憶B 細胞或漿細胞的分化誘導，及被人為在這個過程中發(fā)生的抗體親和力成熟、類別轉(zhuǎn)換，從而 完成本發(fā)明。以前，制備高親和力抗體主要是，在體內(nèi)，通過抗原反復免疫，進行向記憶B細胞 或漿細胞的分化誘導，并利用被人為在此過程中發(fā)生的抗體親和力成熟、類別轉(zhuǎn)換。從分化 誘導出的免疫細胞形成雜交瘤，通過進行篩選來獲得高親和力抗體。另一方面，在體外，構(gòu) 建利用PCR的隨機突變導入法等向從雜交瘤或市售的庫(library)中得到的抗體基因中導 入各種突變的庫，再插入嗜菌粒載體，通過淘選法，篩選強抗體。但是，本發(fā)明人認為，即便在特定環(huán)境下體外供給特定的刺激物，向記憶B細胞或 漿細胞的分化誘導及被人為在此過程中可發(fā)生的抗體親和力成熟、類別轉(zhuǎn)換也可能。而且， 由于導入刺激物可使B細胞向記憶B細胞、漿細胞分化誘導，因此體外免疫中的該方法一改 以往只有通過脾細胞本身或B細胞和T細胞共培養(yǎng)狀態(tài)下才能免疫的方法，使得用僅B細 胞也能進行免疫，抗原也與以往的體外免疫法一樣，與體內(nèi)免疫相比約1/1000 1/10000 少量也可能。而本發(fā)明中使用的刺激物可誘導與親和力成熟或抗體類別轉(zhuǎn)換相關(guān)的蛋白表達， 其結(jié)果實現(xiàn)了從抗體的IgM向IgG的迅速且確定的類別轉(zhuǎn)換。重點是，本發(fā)明所謂體外免疫法為以下方法，通過在向研磨組織片得到的細胞添 加了特定刺激物的培養(yǎng)液中得到進行抗原致敏的免疫細胞，從而可在通常對免疫動物進行 免疫所需時間的幾十分之一的時間內(nèi)實現(xiàn)。在上述本發(fā)明的抗體制備方法的實施中，可按已經(jīng)說明的方法有利實施在體內(nèi)及 體外發(fā)生免疫反應(yīng)的方法。以下對本發(fā)明的體外免疫方法中各種刺激物和各種分化、誘導等的關(guān)系進行說明。
本發(fā)明中所示抗原可在制備免疫用組織片后立即的一次而充分，也可設(shè)置2 3 日的間隔而進行多次，沒有限制。另外，此時的抗原濃度優(yōu)選Ipmol lmmol，例如可例示 Inmol ο可為達到輔助抗原刺激的目的而添加以LPS為代表的刺激TLR(Toll樣受體)的 物質(zhì)。該刺激物添加優(yōu)選在抗原刺激時進行，添加量優(yōu)選為lOng/mL 500 μ g/mL較優(yōu)，尤 其優(yōu)選20 80 μ g/mL。此外，本發(fā)明所示作為向記憶B細胞或漿細胞分化誘導及被人為在此過程中發(fā)生 的抗體親和力成熟、類別轉(zhuǎn)換的誘導用刺激物只要是上述刺激物則沒有特定限制，但特別 優(yōu)選IL-4、IL-5、抗-CD38抗體、抗-CD40抗體。添加濃度為，IL-4、IL-5優(yōu)選Ing/mL 50 μ g/mL的濃度，特別優(yōu)選10ng/mL 40ng/mL ；抗-CD38抗體、抗-CD40抗體優(yōu)選Ing/ mL 50 μ g/mL的濃度，特別優(yōu)選lOOng/mL 10 μ g/mL。該刺激物的添加優(yōu)選在抗原刺激 時進行。作為構(gòu)成本發(fā)明中體外進行的免疫用組織片的細胞，除例如上述細胞以外，還可 例示例如源于小鼠、大鼠、豚鼠、兔等免疫動物的器官、組織中得到的細胞，分化調(diào)節(jié)iPS 細胞、ES細胞的免疫活性細胞，分化調(diào)節(jié)培養(yǎng)細胞株的免疫活性細胞等。本發(fā)明中所用抗原可舉例h (人)S100A10、he (雞)EL、h (人)Ras、h (人)rap74、 h(人)T0P02B、b(牛)SA、b(牛)酪蛋白等源于小鼠以外的蛋白；源于小鼠的m(小鼠) S100A10、mSA、mMapkl等蛋白；肽(四種7聚體、10聚體、16聚體、20聚體)等。另外，在 本發(fā)明的實施中，可使用以前得到抗體時不能使用的小分子化合物(若丹明等熒光物質(zhì)、 FITC)。本發(fā)明根據(jù)目的體外導入刺激物，不以T細胞為必要，通過將B細胞向抗體產(chǎn)生細 胞分化誘導的步驟，除可利用小分子抗原以外，可得到可獲得類別轉(zhuǎn)換所致的優(yōu)選抗體，親 和力成熟所致的抗體的免疫細胞。此外，如上所述，用FACScan這樣的基于流式細胞術(shù)等的細胞分離裝置，利用染色 篩選目的細胞的方法檢測和分離致敏免疫細胞。此外，得到的免疫細胞的大小與其他細胞相比要大，當進一步時親和度成熟的情 況下，細胞的大小會變得更大，因此，也可根據(jù)細胞的大小來進行篩選。另外，作為根據(jù)所述 細胞大小進行篩選的方法，可適當使用例如特開2007-175684號公報等中記載的方法。對在本發(fā)明中篩選、檢測免疫細胞時使用的染色劑已進行說明。而在篩選發(fā)生類 別轉(zhuǎn)換、親和力成熟的細胞時，如上所述，也可適當使用相同的染色劑。此外，如上所述，本發(fā)明構(gòu)成如下通過體外免疫步驟將用于得到抗體基因的細胞 從組織上篩選免疫細胞，由所述免疫細胞通過PCR法形成抗體基因，將其導入宿主細胞培 養(yǎng)表達，從而大量制備抗體，通過該方法可從組織片上獲得免疫后的細胞，從而可謀求作業(yè) 效率的提高。在這里，即使不篩選免疫細胞而分離組織片細胞的基因，也由于用于PCR的引 物是抗體基因特異性引物，因此也可獲得僅目的基因，和篩選免疫細胞的情況一樣，也可采 用提取抗體基因的方法。如上所述，從該 細胞得到的抗體基因通過PCR法增幅，并通過大腸桿菌等宿主細 胞，優(yōu)選與經(jīng)克隆化而得到抗體步驟組合，從而可在短時間內(nèi)制備大量抗體。能夠使用的宿 主細胞及表達載體如前所述。
作為在本發(fā)明中的抗體篩選方法，可舉例在噬菌體或大腸桿菌、酵母、動物細胞 等的表面表達抗體的方法；如使用酵母、大腸桿菌等雙雜交法、IVV法、核糖體展示法的呈 遞DNA或mRNA的方法；利用表面等離子體共振的BIAC0RE法、ELISA法、蛋白印跡法、通過 在磁球上固定抗體或抗原，再通過磁力進行篩選(MACS)的方法等。所述篩選方法只要能夠 研究蛋白質(zhì)間相互作用，就沒有特定限制。根據(jù)本發(fā)明，如可從以下詳細說明知道，可在短時間內(nèi)分離、獲得目的免疫細胞， 并且，能夠根據(jù)基因組學等方法制備抗體，從而迅速生產(chǎn)及獲得抗體。該免疫細胞特別適合 于篩選等。附圖簡述圖IA為示制備出的總RNA電泳照片、圖IB為其說明圖。
圖2A為示制備出的cDNA電泳照片、圖2B為其說明圖。圖3A為示制備出的scFv PCR產(chǎn)物的電泳照片、圖3B為其說明圖。圖4A為示制備出的大腸桿菌克隆的電泳照片、圖4B為其說明圖。圖5A為示通過SDS-PAGE法分析純化的MBP-scFv蛋白質(zhì)的圖、圖5B為其說明圖。圖6為示抗原與IgGl陽性率的關(guān)系的坐標圖。圖7為示標記物基因與mRNA表達量的關(guān)系的坐標圖。圖8為將細胞因子的細胞毒性實驗結(jié)果作為刺激物與比增殖率的關(guān)系的顯示的 坐標圖。圖9A及圖9B為分別示刺激物與比增殖率的關(guān)系的坐標圖。

圖10A，圖10B，圖IOC和圖IOD分別為示測定單獨刺激時的Blimp-I表達量、Xbp-I 表達量、Bcl-6表達量及AID表達量的結(jié)果的坐標圖。圖IlA及圖IlB分別為示測定復合刺激、漿細胞分化時的Blimp-I表達量及Xbp-I 表達量的結(jié)果的坐標圖。圖12A及圖12B分別為示測定復合刺激、體細胞變異時的Bcl_6表達量及AID表 達量的結(jié)果的坐標圖。圖13為示測定復合刺激、漿細胞分化時的Blimp-I表達量的結(jié)果的坐標圖。圖14為示測定復合刺激、漿細胞分化時的Xbp-I表達量的結(jié)果的坐標圖。圖15為示測定復合刺激、體細胞變異時的Bcl-6表達量的結(jié)果的坐標圖。圖16為示測定復合刺激、體細胞變異時的AID表達量的結(jié)果的坐標圖。圖17A及圖17B分別為示用Inmol抗原及0. Inmol抗原進行免疫時細胞因子濃度 的上限及下限的標記物表達量的坐標圖。圖18A及圖18B分別為將B細胞分化的研究結(jié)果以脾細胞中B細胞的比例及脾細 胞中漿細胞的比例顯示的坐標圖。圖19A，圖19B，圖19C及圖19D分別為將B細胞分化的研究結(jié)果以B細胞中Tl-B 細胞的比例、B細胞中T2-B細胞的比例、B細胞中B2細胞的比例及B細胞中活化的B細胞 的比例顯示的坐標圖。圖20A，圖20B，圖20C及圖20D分別為示研究B細胞分化時測定Blimp-I表達量、 Xbp-I表達量、Bcl-6表達量及AID表達量的結(jié)果的坐標圖。圖21示對脾細胞進行免疫操作獲得的抗_雞卵溶菌酶/MBP-scFv的ELISA結(jié)果，為檢測抗原特異性，使用分別用β -酪蛋白、S100A2、S100A14、雞卵溶菌酶包被的ELISA板進行比較的坐標圖。圖22示對B細胞進行免疫操作獲得的抗_雞卵溶菌酶/MBP-scFv的ELISA結(jié)果， 為檢測抗原特異性，使用分別用β _酪蛋白、S100A2、S100A14、雞卵溶菌酶包被的ELISA板 進行比較的坐標圖。圖23示抗-雞卵溶菌酶/MBP-scFv/EGFP的ELISA結(jié)果，EGFP通過Gl-接頭及 G5-接頭與scFv融合，并且為檢測抗原特異性，使用分別用β-酪蛋白、S100A2、S100A14、 雞卵溶菌酶包被的ELISA板進行比較的坐標圖。圖24示抗- β _酪朊嗎啡肽7/MBP-scFv、抗-血管緊張素I/MBP-scFv、抗-PTH/ MBP-scFv的ELISA結(jié)果，并且為檢測抗原特異性，使用分別用β -Cas7 β -酪朊嗎啡肽 7 (b-Cas7)，血管緊張素I (Ang I)，PTH包被的ELISA板進行比較的坐標圖。圖25為示評價抗小鼠蛋白抗體的取得結(jié)果的吸光度(mAlbuminELISA)的結(jié)果的 坐標圖。圖26為示評價抗小鼠蛋白抗體的取得結(jié)果的陽性克隆出現(xiàn)率(mAlbumin陽性率) 的結(jié)果的坐標圖。圖27為示評價抗小鼠蛋白抗體的取得結(jié)果的吸光度(mS100A10ELISA Inmol抗 原)的結(jié)果的坐標圖。圖28為示評價抗小鼠蛋白抗體的取得結(jié)果的吸光度(mS100A10ELISA Inmol抗 原)的結(jié)果的坐標圖。圖29為示評價抗小鼠蛋白抗體的取得結(jié)果的陽性克隆出現(xiàn)率(mSlOOAlO陽性率) 的結(jié)果的坐標圖。圖30為示抗小分子化合物抗體的取得的電泳照片。實施方式下面對本發(fā)明優(yōu)選的實施方式進行說明。但值得注意的是，本發(fā)明并不限于下述 特定的實施方式。本發(fā)明從小鼠、大鼠等免疫用動物摘出器官，并從該器官中分離含有免疫細胞的 細胞群，將其在含有刺激物的培養(yǎng)液中用抗原致敏，以得到免疫細胞。該免疫細胞，采用FACScan等細胞分離裝置、或其他根據(jù)細胞染色的篩選方法，從 淋巴細胞中篩選如產(chǎn)生目的抗體的B細胞?？赏ㄟ^將篩選出的B細胞與骨髓瘤細胞融合 使其永生化，形成雜交瘤，經(jīng)克隆后得到抗體或抗體基因，但形成雜交瘤的步驟并不是必需 的。從篩選出的細胞或雜交瘤細胞中提取基因，通過PCR法獲得H鏈、L鏈的基因，為 了能在大腸桿菌中表達，而將其改變成單鏈抗體scFv，并使其質(zhì)?；?，再在大腸桿菌內(nèi)表 達來獲得抗體；關(guān)于抗原，并不是特定的，但其中例如S100A10蛋白可用作可在以尿為檢體 使用的腎癌標記物，因此本發(fā)明適于作為制備免疫學診斷腎癌用抗體的方法。有關(guān)小鼠源人抗體的制備本發(fā)明中，可對小鼠源人抗體制備步驟進行進一步整合。以下示獲得人抗體的步 驟例。1.使用免疫人源化小鼠源脾細胞的方法
有報導將小鼠脾細胞內(nèi)的抗體基因全部置換為人源基因的免疫人源化小鼠。因為 除抗體基因以外全部是小鼠源細胞，因此此次可直接使用體外免疫法進行免疫。通過該方 法獲得的抗體全部是人抗體。2.講行抗體人源化的方法
由獲得的基因確定抗體的氨基酸序列。將該氨基酸序列與人抗體氨基酸序列庫進 行比對。尤其要比較高變區(qū)(互補決定區(qū))以外的抗體構(gòu)架部分，從人抗體氨基酸序列庫 中篩選同源性(同一性)高的序列。向篩選出的構(gòu)架序列中并入所得抗體基因的高變區(qū)， 進行人源化。此階段中抗體為人源化小鼠抗體。對于全長人抗體，由獲得的基因確定抗體的氨基酸序列。將該氨基酸序列與人抗 體氨基酸序列庫進行比對。比較包含高變區(qū)的抗體的全長，從人抗體氨基酸序列庫中篩選 同源性高的序列。將篩選出的序列在細胞中表達，則得到全長人抗體。將篩選出的序列的 高變區(qū)通過基因工程學方法進行改變，即使與原序列完全相同，也可作為全長人抗體。在此，如將本發(fā)明略示，則如下各項所述。(1)抗體制備方法，包括 將含免疫用細胞的組織在含抗原和刺激物的培養(yǎng)液中體外免疫的步驟； 篩選所述經(jīng)免疫的細胞的步驟；及 從篩選出的免疫細胞獲得抗體的步驟。(2) (1)的抗體制備方法，還包括以下步驟 通過PCR擴增方法，從所述免疫細胞得到擴增抗體基因后，由宿主細胞表達制 備抗體或類抗體蛋白。(3) (1)的抗體制備方法，其中所述組織是免疫用動物。(4) (1)的抗體制備方法，其中所述篩選出的細胞是發(fā)生類別轉(zhuǎn)換或親和力成熟的 細胞。(5) (1)的抗體制備方法，其中所述經(jīng)免疫細胞的篩選通過流式細胞術(shù)或染色進 行。(6) (1)的抗體制備方法，其中所述刺激物是刺激在免疫活性細胞上表達的細胞因 子受體、表面抗原或信號轉(zhuǎn)導相關(guān)受體的物質(zhì)。(7)⑴的抗體制備方法，其中所述抗原是肽。(8) (1)的抗體制備方法，其中所述抗原是屬于SlOO家族的蛋白，取得單鏈抗體 scFv(單鏈可變片段)或抗體IgGl (免疫球蛋白Gl)。(9)⑴的抗體制備方法，其中所述抗原是S100A10蛋白，取得單鏈抗體scFv(單鏈 可變片段)或抗體IgGl (免疫球蛋白Gl)。(10) (6)的抗體制備方法，其中所述刺激物是下列中的至少一種 針對細胞因子受體的刺激物IL_4或IL-5 ； 針對表面抗原的刺激物抗-⑶38抗體或抗-⑶40抗體；及 針對信號轉(zhuǎn)導相關(guān)受體的刺激物LPS(脂多糖)。(11) (1)的抗體制備方法，其將含免疫用細胞的組織在含刺激物的培養(yǎng)液中體外 免疫來制備抗體，所述刺激物是選自下列中1種以上的刺激物IL-4、IL-5、抗-CD38抗體、 抗-CD40抗體及LPS。
(12) (1)的抗體制備方法，其還包括 確定篩選出的所述抗體基因氨基酸序列的步驟；及 將所述氨基酸序列與人抗體氨基酸序列庫進行比對，并從所述人抗體氨基酸序 列庫選出同源性(同一性)高的序列，或經(jīng)改變調(diào)整形成人源化抗體基因的步驟。
實施例以下通過下述實施例來對本發(fā)明進行 更具體說明。但這些實施例不旨在限定本發(fā) 明。實施例1 本實施例中，以S100A10蛋白作為抗原例使用，說明了抗體IgGl的制備方法。提取脾細胞(SDlenocyte)肉眼識別小鼠脾臟后，取出，洗凈。將兩只的脾臟置于網(wǎng)格(mesh)上，用細胞刮刀 破碎之后，通過離心分離(1300rpmX3分鐘，4°C )回收細胞。接著，將細胞懸浮于3mL ACK 裂解緩沖液中后，加入IOmLPBS (-)。通過離心分離(1300rpmX3分鐘，4°C )回收細胞，懸浮 于6mL RPMI1640 (-)中。使通過細胞過濾網(wǎng)來去除不溶性脂肪等。體外免疫S100A10蛋白抗原用檢測試劑盒(Dc蛋白測定試劑盒、BioRad公司制)測定濃 度。此時作為標準物使用BSA(Sigma公司制)。已知濃度的S100A10蛋白抗原按規(guī)定的量 (5 μ g或20 μ g)分注，向其中添加100 μ L lmg/mL的佐劑N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異 谷酰胺(每只小鼠50yL)，室溫下靜置15分鐘。向脾細胞中添加配制好的抗原溶液，室溫 下靜置15分鐘。再各添加6mL RPMI1640 (40% FBS)。并添加刺激物(IL_4(終濃度IOng/ mL)、IL-5 (終濃度lOng/mL)、抗-CD38抗體(終濃度1 μ g/mL)、抗-CD40抗體(終濃度 1 μ g/mL)、LPS (終濃度40 μ g/mL))。將全量鋪于IOcm皿中。在37°C、CO2、培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (4天)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離(2000rpm、5分鐘、4°C)回收細胞，用0. 4%臺盼藍染料 (GIBC0公司制)染色細胞，用血細胞計數(shù)板(AS ONE公司制)統(tǒng)計免疫后的脾細胞數(shù)。當 用5μ gS100A10抗原免疫時的細胞數(shù)為1. 33 X IO7細胞，用20 μ g S100A10抗原免疫時的細 胞數(shù)為0. 71 X IO7細胞。該細胞用培養(yǎng)基B (Clona細胞HY試劑盒、StemCell Technology 公司制)洗滌(10mLX3次)，配制成1.00X IO8細胞/mL。黑餼素瘤細胞的制備PAI細胞(小鼠源骨髓瘤細胞)用培養(yǎng)基A(Clona細胞HY試劑盒、StemCell Technology公司制)繼代培養(yǎng)。用培養(yǎng)基B洗滌細胞(IOmLX 3次)，用與上述同樣的裝置 進行計數(shù)。在細胞融合時，該細胞數(shù)優(yōu)選5 X IO7細胞。細胞融合按脾細胞Splenocyte 黑色素瘤細胞Myeloma = 2 1混合細胞，通過離心回 收。放液(tapping)后，用 66. 5yL(免疫 5yg S100A10 抗原時)或 35. 5 μ L (免疫 20 μ g S100A10抗原時)PEG (聚乙二醇)溶液(對于IX IO8細胞的脾細胞為500 μ L)混合。離心分離回收后，以665yL(免疫5yg S100A10抗原時)或355 μ L(免疫20 μ g S100A10抗原時)(對于1 X IO8細胞的脾細胞為5mL)各添加一滴培養(yǎng)基B。以665yL(免疫 5yg S100A10 抗原時)或 355 μ L(免疫 20 μ gS100A10 抗原時)(對于1 X IO8細胞的脾細胞為5mL)向其中各添加一滴培養(yǎng)基C(Clona細胞HY試劑 盒、StemCell Technology公司制)。取該溶液5. 32mL(免疫5 μ g S100A10抗原時)或 2. 84mL (免疫20 μ gS100A10抗原時)(對于1 X IO8細胞的脾細胞為40mL)緩慢添加到培養(yǎng) 基C中，于37°C，CO2下用培養(yǎng)箱培養(yǎng)(1天)(于15mL離心管中)。細胞融合當天將培養(yǎng)基0((10皿細胞附試劑盒、5切111(^111^(^1101呢7公司制)移 到4°C培養(yǎng)箱中進行溶解。確認溶解后，混合好后，回到室溫。艦 細胞離心回收后，懸浮于1.33mL(免疫5yg S100A10抗原時)或0. 71mL(免疫 20 yg S100A10抗原時)(對于IX IO8細胞的脾細胞為IOmL)培養(yǎng)基C中，之后將其懸浮 于lL97mL(免疫5yg S100A10抗原時)或6. 39mL (免疫20 μ g S100A10抗原時)(對于 IX IO8細胞的脾細胞為90mL)培養(yǎng)基D中。于37°C下溫育15分鐘后，將其鋪于IOcm皿中。 再于37°C、CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(10 14天)。iBr^t目視下對細胞集落計數(shù)，將其全部移96孔板(well plate)上，加200 μ L培養(yǎng)基 E (Clona細胞HY試劑盒、StemCell Technology公司制)。接著于37°C、C02的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)(4天)?；厥丈锨?50yL，通過S100A10ELISA進行確認。S100A10ELISA 板的制備S100A10 抗原用 PBS(-)稀釋到 5 μ g/mL，各取 100 μ L加入到 96 孔板(Nunc-Immuno module F8 maxisoap，Nunc公司制)上。將其于4°C下靜置1天后，棄去上清，各加入200 μ L 0. l%BSA/PBS(-)0于室溫下靜置1個小時后，用PBS(-)洗3次，從而制備S100A10 ELISA 板。S100A10 ELISA取從上述“收獲”中得到的培養(yǎng)上清150 μ L加入到S100A10ELISA板中，于37°C培 養(yǎng)箱中靜置1個小時。棄去上清，用PBS (-)清洗3次，加入用PBS (-)稀釋5000倍的50 μ L 第二抗體(抗_小鼠IgGl-HRP，F(xiàn)unakoshi公司制)，于37°C培養(yǎng)箱中靜置1個小時。棄去 上清，用PBS㈠洗3次，加入100 μ L的TMB溶液，于37°C培養(yǎng)箱中靜置10分鐘。之后立 刻添加IOOyL IN HCl(和光純藥公司制)來終止反應(yīng)。此后，再用酶標儀(550型，BioRad 公司制)測定各孔的在450nm下的吸光度。得到結(jié)果如表1所示。表 1
Λ ^ β 免疫后脾細 ▲ ^ > b 克隆后的 IgGl ^rc 免疫量^aji , 7 雜交瘤數(shù) Mi ζ χ 抗原胞數(shù)(XlO7 —_____增殖 表達
(up )II :
__5細胞)大集落小集落合計 +++ 林數(shù)
51.33273259 1514 4
S100A10
_ 100.7110835143 | 51| 40 [ 20接著，將雜交瘤集落化，其集落大小用肉眼確認。這些集落通過上述方法克隆后， 確認此后的增殖。增殖的克隆的培養(yǎng)上清通過S100A10 ELISA確認產(chǎn)生抗S100A10 IgGl抗體的克隆數(shù)。根據(jù)上述表1中的記錄，通過體外免疫法確認能夠制備IgGl。此免疫步驟 需要約5天，與一般情況(2 3個月)相比，可更快制備出針對S100A10蛋白的IgGl。實施例2 本例中，對抗S100A10抗體基因的提取及通過大腸桿菌表達抗體的步驟進行說明。DNA提取、單鏈抗體scFv質(zhì)粒的制備 用Isogen(Nippongene公司制)從1.5X106細胞(cells)免疫后的B細胞或雜 交瘤中得到總RNA。其中，也可將通過上述實施例1中說明的體外免疫步驟得到的免疫細胞 用于所述步驟。接著，通過1. 2%瓊脂糖凝膠(Agarose Gel)電泳進行確認得到。得到的結(jié)果如圖 IA及圖IB所示。以得到的總RNA為模板，以小鼠(mouse) VH基因特異性引物或小鼠VL基因特異性 引物，用ReverTra Ace (Τ0Υ0Β0公司制)試劑合成了單鏈cDNA。再以制備出的cDNA為模 板，用引物-VH正向引物混合物/VH反向引物混合物或VL正向引物混合物/VL反向引物 混合物，通過PrimeSTAR HS聚合酶(TaKaRa公司制)進行第一 PCR。所用引物序列利用了 Antibody Engineering a practicalapproach(pp. 210-211)中介紹的弓I物序列。之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行確認得到。得到的結(jié)果如圖2A及圖2B所示。從電泳后的瓊脂糖凝膠上切下目的條帶，用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN公 司制)提取、純化VH基因及VL基因。接著用該VH基因及VL基因各10ng，通過PrimeSTAR HS聚合酶(TaKaRa公司制)，在不添加引物的情況下，進行連接PCR反應(yīng)。之后向連接PCR 的樣品中加入引物-第二 PCR預混物而直接進行PCR擴增。之后，通過2 %瓊脂糖凝膠電泳 進行確認得到。得到的結(jié)果如圖3A及圖3B所示。由這些結(jié)果可確認能夠得到目的scFv PCR產(chǎn)物。接著，用限制酶EcoRI及HindIII在37°C下對scFv PCR產(chǎn)物反應(yīng)1小時而進行分 解，從電泳后的瓊脂糖凝膠上切下目的條帶，用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司制) 提取、純化scFv基因。同樣，用限制酶EcoRI及HindIII在37°C下對質(zhì)粒載體pMAL_p2X反 應(yīng)1小時而進行分裂，從電泳后的瓊脂糖凝膠上切下目的條帶，用QIAquick凝膠提取試劑 盒(QIAGEN公司制)提取、純化質(zhì)粒載體基因。這些純化產(chǎn)物按Imol質(zhì)粒載體基因?qū)?mol scFv基因的比例混合，通過DNA連接試劑盒〈Mighty Mix> (TaKaRa公司制)進行連接。取 連接溶液20 μ L與大腸桿菌JM109株的感受態(tài)細胞混合來轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。將該轉(zhuǎn) 化體涂布到含有50 μ g/mL的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)18小時。為了篩選攜帶連接了 scFv基因的質(zhì)粒的大腸桿菌克隆，將通過上述步驟形成的 集落通過集落PCR及2 %瓊脂糖凝膠電泳進行確認得到。得到的結(jié)果如圖4A及圖4B所示。將按上述方法得到的克隆接種到含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中， 于37°C培養(yǎng)18小時，用QIApr印Miniprep試劑盒(QIAGEN公司制)提取質(zhì)粒DNA。提取 出的質(zhì)粒的DNA序列用DNA測序儀MegaBASElOOO (GE Healthcare公司制)進行確定。此 獲得抗體基因的步驟耗時3天。由大腸桿菌表達單鏈抗體scFv用序列經(jīng)確定的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)株。將該轉(zhuǎn)化體涂布到含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)18小時。接著，將按上述方式得到集落接種到5mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的LBG液體培養(yǎng)基中，于30°C培養(yǎng)18小時。之后取該培養(yǎng)液ImL接種到IOOmL含50 μ g/mL氨芐青霉 素的LBG液體培養(yǎng)基中，于30°C培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每隔1小時在660nm下用分光光度計 UV-1200 (島津制作所公司制)測定吸光度。當吸光度達到0. 5時，添加IPTG至終濃度達到 0. 5mM，于23°C下培養(yǎng)20個小時。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離(6000rpm，20分鐘，4°C )回收 大腸桿菌。將其用 5mL 溶液 A (20%蔗糖、ImM EDTA、30mM Tris-HCl pH8. 0、0. 5mM APMSF) 溶解，室溫下靜置10分鐘。通過離心分離(6000rpm，20分鐘，4°C )回收大腸桿菌，將其用 5mL冰冷的溶液B(5mM MgSO4)溶解，并在冰上靜置10分鐘。之后通過離心分離(6000rpm， 20分鐘，4 °C )回收上清。此后，使如上所述回收的上清通過直鏈淀粉樹脂柱(10mL，Φ2. 5cmX3. 3cm)。上 清全部通過柱后，用洗滌緩沖液(200mM NaCl, 20mM Tris-HCl pH8. 0) 40mL清洗柱。清洗兩 次后，用40mL洗脫緩沖液(5mM麥芽糖，200mM NaCl, 20mM Tris-HCl pH8. 0)將吸附在柱上 的MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)-scFv蛋白洗脫，純化。將純化的MBP-scFv蛋白用SDS-PAGE法 分析。得到的結(jié)果如圖5A及圖5B所示。接著用測定試劑盒(Dc蛋白測定試劑盒、BioRad公司制)測定經(jīng)純化的MBP-scFv 蛋白的濃度。結(jié)果，從50mL培養(yǎng)液中可得到0. 345mg的MBP-scFv蛋白。上述純化步驟需要3天。本方法從獲得抗體基因步驟算起，需要6天，比起一般方 法(2 3個月)可更快的制備針對S100A10蛋白的scFv。其中需知，本發(fā)明作為實施例例示了可大量制備抗S100A10抗體的可能性，但并 不限于抗S100A10抗體，其他各種抗體也適用。實施例3 重復了實施例1中記載的方法。但本實施例中使用SlOOAl蛋白及S100A10蛋白 作為抗原，采用與上述實施例1相同的方法實施體外免疫法，計算了 IgGl陽性率。圖6示 如此得到的結(jié)果。從圖6可看到，雖然可根據(jù)抗原而不同，但均以60%以上的高概率發(fā)生向 IgGl的類別轉(zhuǎn)換。本發(fā)明在體外(in vitro)免疫過程中，在抗原免疫后添加一次LPS (40 μ g/mL)、 IL-4、IL-5 (lOng/mL)、抗-⑶38抗體、抗-⑶40抗體(1 μ g/mL)等刺激物，在刺激物存在下 培養(yǎng)4天，則可實現(xiàn)實現(xiàn)有效的類別轉(zhuǎn)換。實施例4 重復了實施例1中記載的方法。但本實施例是以S100A10蛋白為抗原以與實施 例1相同的方法實施體外免疫法，在進行培養(yǎng)的第4天和第7天回收全細胞，并由此提取總 RNA。以600ng的總RNA為模板，使用ReverTra Ace (Τ0Υ0Β0公司)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 反應(yīng)組成隨廠商說明，體積為20yL，使用01igo(dT)20(T0Y0B0公司)作為引物。反應(yīng)條 件42°C 20分鐘、99°C 5分鐘、4°C 5分鐘。以該產(chǎn)物1 μ L為模板，使用PowerSYBR Green PCR MasterMix(Applied Biosystems公司)進行實時PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件95°C 10分鐘 —(950C 15秒、60°C 1分鐘)進行40個循環(huán)。此外，本實施例所用設(shè)備為7500Fast (Applied Biosystems公司)。得到的結(jié)果采用內(nèi)標β激動蛋白進行標準化，繪制成圖。結(jié)果如圖7所示。從圖7可看到所有的標記物 基因(Bcl6、AID、Xbpl、Blimpl)均可使表達量上升，抗體的親和力、抗體產(chǎn)生細胞的分化、 誘導也變更高。這里的Bcl6或AID主要是涉及抗體親和力成熟或類別轉(zhuǎn)換的基因；Xbpl是 多功能轉(zhuǎn)錄因子，與抗體產(chǎn)生細胞的分化也有關(guān)；Blimpl也與Xbpl —樣，是B細胞向抗體 產(chǎn)生細胞(漿細胞)分化時起作用的因子。實施例5 本實施例就細胞因子的細胞毒性試驗的實驗方法進行說明。將BALB/c小鼠(4周齡、早、SPF/VAF)頸椎脫臼處死，肉眼識別小鼠脾臟后，摘出， 用70%乙醇洗凈。之后再用PBS洗凈后，將2只的脾臟置于細胞過濾網(wǎng)上，用細胞刮刀破 碎。用4mL PBS(-)清洗3次細胞過濾網(wǎng)，將脾細胞從細胞過濾網(wǎng)上洗脫。通過離心分離 (1300rpmX3分鐘，4°C )回收細胞。將細胞懸浮于3mL ACK裂解緩沖液中后，加入IOmL PBS(-)去除紅細胞，通過離心 分離(1300rpmX3分鐘，4°C )回收脾細胞。將該脾細胞懸浮于IOmL RPMI1640培養(yǎng)基中， 使通過細胞過濾網(wǎng)來去除不溶性脂肪。細胞數(shù)用血細胞計數(shù)板計數(shù)，并濃縮至IX IO7細胞 /mL0將刺激物(IL-4 (標準終濃度lOng/mL)、IL-5 (標準終濃度lOng/mL)、抗-CD38抗 體(標準終濃度1 μ g/mL)、抗-⑶40抗體(標準終濃度1 μ g/mL)、LPS (標準終濃度40 μ g/ mL))配成達標準終濃度的10000倍。將其用PBS (-)進行10倍梯度稀釋。由此配置至10_6 IO4倍的刺激物稀釋系列。取該刺激物1.5yL(l/1000體積)與300 μ L脾細胞混合，用含 40% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將細胞濃度配至2 X IO6細胞/mL，用37°C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 天。培養(yǎng)后，將100 μ L細胞溶液分注到96孔板上，用37°C的CO2培養(yǎng)箱溫育2小時。 之后向其中添加IOmL細胞計數(shù)試劑盒-S(Dojindc)公司制)，再溫浴1小時。用酶標儀測 定450nm下的吸光度，作為空白，對照測定了 650nm下的吸光度。以450nm下的測定值減去 650nm下的測定值，即得測定值。用各測定值比上未添加刺激物時的測定值，就得到比增殖 率。得到的結(jié)果如圖8的坐標圖所示。作圖時由于10_5以下的結(jié)果與10_4的結(jié)果顯示同一 值，因此省略。另外，各刺激物在各稀釋倍數(shù)下的終濃度如表2所示。表2 綜上所述，細胞因子細胞毒性試驗的結(jié)果如圖8所示。該圖以比增殖率為縱坐標， 刺激物的稀釋倍數(shù)為橫坐標。圖中箭頭所示濃度為通常使用的濃度。進行3次獨立實驗， 取平均值作圖。在標準終濃度下并沒有觀察到細胞毒性。有過LPS，如果使用現(xiàn)在的10倍濃度，就 有觀察到細胞死亡的情況。但由于也只能下降到與未添加任何刺激物的情況相同的程度， 因此得知該濃度也可使用。另外，標準終濃度下，添加任何刺激物都能觀察到細胞的增殖， 因此認為被最優(yōu)效免疫。實施例6 本實施例中，就研究刺激物組合的實驗方法進行說明。將BALB/c小鼠(4周齡、早、SPF/VAF)頸椎脫臼處死，肉眼識別小鼠脾臟后，摘出， 用70%乙醇洗凈。之后再用PBS洗凈后，將2只的脾臟置于細胞過濾網(wǎng)上，用細胞刮刀破 碎。用4mL PBS(-)清洗3次細胞過濾網(wǎng)，將脾細胞從細胞過濾網(wǎng)上洗脫。通過離心分離 (1300rpmX3分鐘，4°C )回收細胞。將細胞懸浮于3mL ACK裂解緩沖液中后，加入IOmL PBS(-)去除紅細胞，通過離心 分離(1300rpmX3分鐘，4°C )回收脾細胞。將該脾細胞懸浮于IOmL RPMI1640培養(yǎng)基中， 使通過細胞過濾網(wǎng)來去除不溶性脂肪。細胞數(shù)用血細胞計數(shù)板計數(shù)，并濃縮至IX IO7細胞 /mL0將刺激物(IL-4 (標準終濃度lOng/mL)、IL-5 (標準終濃度lOng/mL)、抗-CD38抗 體(標準終濃度1 μ g/mL)、抗-⑶40抗體(標準終濃度1 μ g/mL)、LPS (標準終濃度40 μ g/ mL))配成達標準終濃度的1000倍。取該刺激物1. 5 μ L (1/1000體積)與300 μ L脾細胞混 合，用含40% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將細胞濃度配至2 X IO6細胞/mL，用37°C的CO2培養(yǎng) 箱培養(yǎng)4天。培養(yǎng)后，將100 μ L細胞溶液分注到96孔板上，用37°C的CO2培養(yǎng)箱溫育2小時。 之后向其中添加IOmL細胞計數(shù)試劑盒-S(Dojindc)公司制)，再溫育1小時。用酶標儀測定450nm下的吸光度，作為空白對照，測定了 650nm下的吸光度。以450nm下的測定值減去650nm下的測定值，即得測定值。用各測定值比上未添加刺激物時的測定值，就得到比增殖 率。得到的結(jié)果如圖9A及圖9B所示，其中縱坐標為比增殖率，橫坐標為添加的刺激物種類?；厥张囵B(yǎng)后殘留的細胞，用ISOGEN(Nippongene公司制)回收總RNA。用600ng 的上述總RNA為模板，使用ReverTra Ace (Τ0Υ0Β0公司)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)組成隨廠 商說明，體積為20 μ L，使用Oligo (dT) 20 (Τ0Υ0Β0公司)作為引物。反應(yīng)條件42°C 20分 鐘、99°C 5分鐘、4°C 5分鐘。以該產(chǎn)物1 μ L為模板，使用PowerSYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems公司)進行實時PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件％°C 10分鐘一(95°C 15 秒、60°C 1分鐘)進行40個循環(huán)。此外，本實施例所用設(shè)備為7500Fast (AppliedBiosystems 公司)。得到的結(jié)果采用內(nèi)標β激動蛋白進行標準化。將此數(shù)值再用未添加時的值標準 化而繪制成圖，結(jié)果如圖IOA 圖10D、圖IlA及圖11Β、圖12Α及圖12Β、圖13、圖14、圖15 及圖16所示。從顯示研究刺激物組合的結(jié)果的一系列圖可知，對于細胞增殖而言，抗⑶40刺激 及LPS刺激有效。但是當LPS與抗CD40共存時卻抑制增殖。因此推測是由于進入細胞的 刺激過強，誘導細胞凋亡的結(jié)果。另一方面，添加LPS、抗⑶38、IL_5中的任一種均能增加漿細胞分化標記物的表達 量，說明這些刺激可促進分化。另外，復合添加這些刺激物時，可發(fā)現(xiàn)表達量增加了。但由 于LPS存在增殖細胞的作用，因此使共存時全體細胞數(shù)增加，而作為結(jié)果，表達量減少了。 此外，添加任意兩種時，分化標記物的表達量就會達到幾乎飽和，因此得出在現(xiàn)在的濃度下 就可充分達到分化刺激的目的。而添加IL4和抗CD40可提高全體細胞數(shù)，由此雖然表達量 下降了，但是確認可能是添加IL5或抗⑶38、LPS而提高了分化標記物的表達量。再者，添加LPS、抗⑶38、IL5中的任一種都可增加體細胞變異標記物的表達量。在 細胞基本不增殖的條件(不存在IL4、抗CD40、LPS的條件)下，由于IL5及抗CD38的刺激 而體細胞變異標記物的表達量升高，而在細胞增殖的條件下，確認了 LPS刺激所致的標記 物表達量升高。這提示由LPS可促進抗原非依賴性B細胞的活化、分化。LPS是構(gòu)成大腸桿 菌肽聚糖的脂多糖，其存在的狀態(tài)意味著生物體處于被微生物感染的狀態(tài)。從生物體防御 觀點來看，由于LPS刺激，誘導了 B細胞的體細胞變異、活化，使免疫活性細胞具備了制備更 適于產(chǎn)生抗體的細胞的功能。這里所述體外免疫方法是指，首先在原本脾細胞中存在的B細胞中，通過IL4、抗 CD40的作用，使產(chǎn)生目的抗體的細胞增殖，通過IL5、抗CD38作用使體細胞變異，成為具有 親和力不同的細胞群。并通過LPS刺激，使不與抗原反應(yīng)的細胞增殖、產(chǎn)生體細胞變異，成 為積累能與抗原反應(yīng)的變異的系統(tǒng)。實施例7 本實施例對細胞因子濃度上限和下限的標記物表達量的實驗方法進行說明。將BALB/c小鼠(4周齡、早、SPF/VAF)頸椎脫臼處死，肉眼識別小鼠脾臟后，摘 出，用70%乙醇洗凈。再用PBS洗凈后，將2只的脾臟置于細胞過濾網(wǎng)上，用細胞刮刀破 碎。用4mL PBS(-)清洗3次細胞過濾網(wǎng)，將脾細胞從細胞過濾網(wǎng)上洗脫。通過離心分離 (1300rpmX3分鐘，4°C )回收細胞。將細胞懸浮于3mL ACK裂解緩沖液中后，加入IOmL PBS(-)去除紅細胞，通過離心分離(1300rpmX3分鐘，4°C )回收脾細胞。將該脾細胞懸浮于IOmL RPMI1640培養(yǎng)基中， 使通過細胞過濾網(wǎng)來去除不溶性脂肪。細胞數(shù)用血細胞計數(shù)板計數(shù)，并濃縮至IX IO7細胞 /mL0用純化的hSIOOAlO蛋白作為抗原，取0. Inmol或Inmol免疫IX IO7細胞的脾細 胞。此時，作為佐劑添加50 μ g的胞壁酰二肽(SIGMA公司)。室溫下靜置15分鐘進行免疫 反應(yīng)。刺激物(IL-4、IL-5、抗⑶38抗體、抗⑶40抗體、LPS)配置成至下述表3的終濃度。 將所述刺激物與經(jīng)免疫的脾細胞混合，用含40% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將細胞濃度配至 2 X IO6細胞/mL，用37°C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4天。培養(yǎng)后，回收全部細胞，用ISOGEN(Nippongene公司制)回收總RNA。用600ng的上 述總RNA為模板，使用ReverTra Ace (Τ0Υ0Β0公司)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)組成隨廠商說明， 體積為20 μ L，使用Oligo (dT) 20 (Τ0Υ0Β0公司)作為引物。反應(yīng)條件:42°C 20分鐘、99°C 5 分鐘、4°C5 分鐘。以該產(chǎn)物 1 μ L為模板，使用 PowerSYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems公司)進行實時PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件95°C 10分鐘一(95°C 15秒、60°C 1分 鐘)進行40個循環(huán)。此外，本實施例所用設(shè)備為7500Fast(AppliedBiOSyStemS公司)。得 到的結(jié)果采用內(nèi)標β激動蛋白進行標準化。將此數(shù)值再用未添加時的值標準化而繪制成 圖，結(jié)果如圖17Α及圖17Β所示。表3 顯示細胞因子濃度上限、下限的標記物表達量的結(jié)果的圖17A及圖17B中，坐標圖 的橫坐標示所研究標記物基因名，縱坐標示mRNA的表達量。坐標圖的縱坐標中的數(shù)值減少 0. 05時，可換算成mRNA表達量成為約2倍。從圖可看到，無論抗原濃度為0. Inmol還是lnmol，用上限及下限的刺激物濃度可 得到與未添加時相同或以上的標記物表達量。由此提示，通過在該范圍內(nèi)添加刺激物，經(jīng)抗 原免疫的細胞分化成漿細胞、并在該過程中發(fā)生抗體的親和力成熟及類別轉(zhuǎn)換。實施例8
本實施例就B細胞分化研究的實驗方法進行說明。將BALB/c小鼠(4周齡、早、SPF/VAF)頸椎脫臼處死，肉眼識別小鼠脾臟后，摘 出，用70%乙醇洗凈。再用PBS洗凈后，將2只的脾臟置于細胞過濾網(wǎng)上，用細胞刮刀破 碎。用4mL PBS(-)清洗3次細胞過濾網(wǎng)，將脾細胞從細胞過濾網(wǎng)上洗脫。通過離心分離 (1300rpmX3分鐘，4°C )回收細胞。將細胞懸浮于3mL ACK裂解緩沖液中后，加入IOmL PBS(-)去除紅細胞，通過離心 分離(1300rpmX3分鐘，4°C )回收脾細胞。將該脾細胞懸浮于IOmL RPMI1640培養(yǎng)基中， 使通過細胞過濾網(wǎng)來去除不溶性脂肪。細胞數(shù)用血細胞計數(shù)板計數(shù)，并濃縮至IX IO7細胞 /mL0 用Inmol純化的hSIOOAlO蛋白作為抗原，免疫2X107細胞的脾細胞。此時，作為 佐劑添加100 μ g的胞壁酰二肽(SIGMA公司)。室溫下靜置15分鐘進行免疫反應(yīng)。將刺激 物(IL-4、IL-5、抗CD38抗體、抗CD40抗體、LPS)配成達標準終濃度的1000倍。取上述刺 激物10 μ L與經(jīng)免疫的脾細胞(2mL)混合，用含40% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將細胞濃度配 至2X106細胞/mL，用37°C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4天。將只添加抗原的和只添加刺激物的、未 添加的同時用作對照。培養(yǎng)后回收全部細胞，為了使其達到1 X IO8細胞/mL，并懸浮于染色緩沖液(含 0. 5% BSA, 2mM EDTA的PBS (-)緩沖液)中。取20 μ L該細胞用抗體染色。染色方法如下 表4所示。表 4 將經(jīng)染色的細胞懸浮于500mL的染色緩沖液中，用FACSCaliber分析。測定各細 胞的陽性率，作圖。得到的結(jié)果如圖18A、圖18B、圖19A 圖19D所示。圖中以各細胞的陽 性率為縱坐標，抗原·有無刺激作為橫坐標。從顯示研究B細胞分化的結(jié)果的一系列圖中證實，通過在體外免疫脾細胞，可活 化、增殖B細胞并向漿細胞分化。并且可知道，B細胞的活化、成熟由不是抗原的刺激物引 起。在只有抗原的情況下，雖然能證實向漿細胞分化，但并沒有證實B細胞的成熟，因此提 示，向漿細胞的分化主要由抗原刺激引起。而只添加抗原和只添加刺激物的情況下，都可觀 察到B細胞的增殖，因此提示是佐劑引起的B細胞的增殖。這也可由佐劑的結(jié)構(gòu)與LPS的 末端結(jié)構(gòu)相同且可由LPS觀察到細胞增殖中得到提示。即使在只添加刺激物的情況下，得到的漿細胞比例也上升，因此提示可不依賴抗 原地分化。另外，脾細胞中的B細胞，通過抗原、刺激物的作用，依Tl-B細胞一T2-B細胞一B2細胞一活化的B細胞成熟，進而分化成漿細胞。事實上，通過本方法，可使B細胞更成熟，特別是比起B(yǎng)2細胞沒有免疫的情況，成熟度大幅提高。而活化的B細胞的比例幾乎不依免疫與否而變化，因此提示從活化的B細胞向漿 細胞分化非常迅速地發(fā)生。當同時添加抗原和刺激物時，與只添加刺激物的情況相比，B2細 胞的比例上升。因此同時添加抗原時會優(yōu)先活化抗原依賴型B細胞，而抗原非依賴型B細 胞的活化減少。也就是說，通過本體外免疫法，可優(yōu)先分化產(chǎn)生目的抗體的細胞。實施例9 本實施例，對研究分化B細胞的標記物表達量的實驗方法進行說明。將BALB/c小鼠(4周齡、早、SPF/VAF)頸椎脫臼處死，肉眼識別小鼠脾臟后，摘 出，用70%乙醇洗凈。再用PBS洗凈后，將2只的脾臟置于細胞過濾網(wǎng)上，用細胞刮刀破 碎。用4mL PBS(-)清洗3次細胞過濾網(wǎng)，將脾細胞從細胞過濾網(wǎng)上洗脫。通過離心分離 (1300rpmX3分鐘，4°C )回收細胞。將細胞懸浮于3mL ACK裂解緩沖液中后，加入IOmL PBS (-)去除紅細胞，通過離心 分離(1300rpmX3分鐘，4°C )回收脾細胞。將該脾細胞懸浮于IOmL RPMI1640培養(yǎng)基中， 使通過細胞過濾網(wǎng)來去除不溶性脂肪。細胞數(shù)用血細胞計數(shù)板計數(shù)，并濃縮至IX IO7細胞 /mL0用Inmol純化的hSIOOAlO蛋白作為抗原，免疫2X107細胞的脾細胞。此時，作為 佐劑添加100 μ g的胞壁酰二肽(SIGMA公司)。室溫下靜置15分鐘進行免疫反應(yīng)。將刺激 物(IL-4、IL-5、抗CD38抗體、抗CD40抗體、LPS)配成達標準終濃度的1000倍。取上述刺 激物10 μ L與經(jīng)免疫的脾細胞(2mL)混合，用含40% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將細胞濃度配 至2X106細胞/mL，用37°C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4天。將只添加抗原的和只添加刺激物的、未 添加的同時用作對照。培養(yǎng)后，回收全部細胞，用ISOGEN(Nippongene公司制)回收總RNA。用600ng的上 述總RNA為模板，使用ReverTra Ace (Τ0Υ0Β0公司)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)組成隨廠商說明， 體積為20 μ L，使用Oligo (dT) 20 (Τ0Υ0Β0公司)作為引物。反應(yīng)條件:42°C 20分鐘、99°C 5 分鐘、4°C5 分鐘。以該產(chǎn)物 1 μ L為模板，使用 PowerSYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems公司)進行實時PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件95°C 10分鐘一(95°C 15秒、60°C 1分鐘) 進行40個循環(huán)。此外，本實施例所用設(shè)備為7500Fast(AppliedBiOSyStemS公司)。得到的 結(jié)果，用內(nèi)標β激動蛋白的數(shù)值乘以同時測定的漿細胞或活化的B細胞的比例，就得到由 源于各細胞的β激動蛋白的表達量。用源于漿細胞的β激動蛋白表達量標準化Blimp-I 及Xbp-I表達量，用源于活化的B細胞的β激動蛋白表達量標準化Bcl-6及AID的表達量。 將該值再用未添加的值標準化，繪制成圖。所得結(jié)果如圖20A 圖20D所示。從顯示B細胞分化的研究標記物表達量的結(jié)果的一系列圖可知，與抗體染色結(jié)果 相同，添加抗原的情況下，向漿細胞分化的標記物Blimp-I或Xbp-I的表達量上升。另外，通 過添加刺激物，可使體細胞變異的標記物Bcl-6或AID高表達。因此得知，不僅添加抗原， 同時添加刺激物，可容易得到更高親和力的抗體。另外，同時添加抗原和刺激物時，比只添加刺激物的情況，體細胞變異標記物的表 達量降低，因此提示，共存特定抗原時，可在一定程度上抑制體細胞變異，并有防止由于過 度變異弓I起的活性下降的系統(tǒng)。
而免疫前的脾細胞，分化標記物幾乎沒有表達，而高表達體細胞變異標記物。這可能是由于常發(fā)生通過體細胞變異增加抗體集合(repertoire)反應(yīng)的原因。實施例10 本實施例對ELISA實驗方法進行說明。5mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)收集菌后，懸浮于ImL PBS中進行超聲波破碎，取含有可溶性 MBP-scFv的破碎上清級分。該上清級分用3% BSA/PBS稀釋50倍，取50 μ L進行ELISA分析，得到的結(jié)果如圖 21 圖24所示。圖21所示的ELISA法，是依據(jù)本體外免疫法，通過ELISA測定免疫模型抗原雞卵 溶菌酶(HEL)構(gòu)建起來的抗-HEL/MBP-scFv的活性。為了研究抗原特異性，用分別包被 β -酪蛋白，S100A2，S100A14、雞卵溶菌酶的ELISA板進行測定。結(jié)果采用本法可得到對雞 卵溶菌酶具有明顯特異性的scFv。圖22所示的ELISA法是本體外免疫的改良方法，以MACS替代脾細胞進行分離，對 于B細胞免疫了雞卵溶菌酶。與圖21 —樣，確認構(gòu)建好的抗-HEL/MBP-scFv的特異性，證 實可得到具有明顯特異性的scFv。因此，本法可對分離得到的B細胞直接進行有效的免疫 操作。圖23所示的ELISA法中根據(jù)本體外免疫法能夠得到目的scFv的基因序列。用 此，可對scFv進一步附加功能。作為一例，制備了在抗-HEL/MBP-scFv的C端融合了作為 熒光蛋白之一的EGFP的抗-HEL/MBP-scFv-EGFP。制備scFv與EGFP間通過長度不同的接 頭(Gly及Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)連接的2種。與圖21相同，確認構(gòu)建的MBP-scFv-EGFP 的特異性，證實可制備對雞卵溶菌酶具有特異性，且有熒光的scFv。作為蛋白以外的模型抗原，按本方法免疫肽。一般的免疫方法中，用像肽這樣的小 分子量物質(zhì)綴合到KLH或BSA等蛋白上作為抗原使用，但本方法中，以B細胞為直接目標在 體外直接用肽也可進行免疫反應(yīng)。因此用4種長度不同的肽為模型抗原，直接免疫肽。所 用肽如下所示β -酪朊嗎啡肽-7 (牛；YPFPGPI，7a. a.)，血管緊張素I (人；DRVYIHPFHL, 10a. a.)，甲狀旁腺激素；PTH(人；EADKADVNVLYKAKSQ，16a. a.)。用 PBS 溶解各肽，取 10 μ g 免疫。圖24所示的ELISA法，是用ELISA法測定根據(jù)本方法構(gòu)建起的抗-β -酪朊嗎啡 肽7/MBP-scFv，抗-血管緊張素I/MBP-scFv，抗-PTH/MBP-scFv的活性。為了研究特異性， 使用分別包被酪朊嗎啡肽_7，血管緊張素I、PTH的ELISA板進行測定。結(jié)果可證明得 到了對各肽有顯著特異性的scFv。由于本方法中將肽本身作為抗原添加，說明即使對于短 鏈肽也可得到scFv。實施例11 本實施例對抗小鼠(mouse)蛋白抗體的獲得實驗方法進行說明。將BALB/c小鼠(4周齡、早、SPF/VAF)頸椎脫臼處死，肉眼識別小鼠脾臟后，摘 出，用70%乙醇洗凈。再用PBS洗凈后，將2只的脾臟置于細胞過濾網(wǎng)上，用細胞刮刀破 碎。用4mL PBS(-)清洗3次細胞過濾網(wǎng)，將脾細胞從細胞過濾網(wǎng)上洗脫。通過離心分離 (1300rpmX3分鐘，4°C )回收細胞。將細胞懸浮于3mL ACK裂解緩沖液中后，加入IOmL PBS (-)去除紅細胞，通過離心分離(1300rpmX3分鐘，4°C )回收脾細胞。將該脾細胞懸浮于IOmL RPMI1640培養(yǎng)基中， 使通過細胞過濾網(wǎng)來去除不溶性脂肪。細胞數(shù)用血細胞計數(shù)板計數(shù)，并濃縮至IX IO7細胞 /mL0
以純化的hSIOOAlO蛋白及購買的mAlbumin(SIGMA公司)用作抗原。分別用 Inmol、IOnmol免疫2 X IO7細胞的脾細胞。此時，作為佐劑添加100 μ g的胞壁酰二肽(SIGMA 公司)。室溫下靜置15分鐘進行免疫反應(yīng)。將刺激物(IL-4、IL-5、抗⑶38抗體、抗⑶40 抗體、LPS)配成達標準終濃度的1000倍。取上述刺激物10 μ L與經(jīng)免疫的脾細胞(2mL)混 合，用含40% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將細胞濃度配至2 X IO6細胞/mL，用37°C的CO2培養(yǎng) 箱培養(yǎng)4天。培養(yǎng)后，回收全部細胞，用ISOGEN(Nippongene公司制)回收總RNA。用600ng的上 述總RNA為模板，使用ReverTra Ace (Τ0Υ0Β0公司)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)組成隨廠商說明， 體積為20 μ L，使用Oligo (dT) 20 (Τ0Υ0Β0公司)作為引物。反應(yīng)條件:42°C 20分鐘、99°C 5 分鐘、4°C5分鐘。以IOyL該產(chǎn)物為模板，通過PCR擴增抗體的H鏈及L鏈的高變區(qū)。PCR 中采用PrimeSTAR HS (TaKaRa公司)，反應(yīng)組成、反應(yīng)條件隨廠商說明。得到的400bp片段通 過瓊脂糖凝膠電泳(2. 0% Seakem GTG瓊脂糖(TaKaRa公司)/TAE緩沖液，150V，30分鐘) 分離，用QIAEX II凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司)提取純化。實驗方法隨廠商說明。以提 取的片段各50ng為模板，通過PCR制備800bp的scFv片段。PCR采用PrimeSTARHS (TaKaRa 公司)，反應(yīng)組成、反應(yīng)條件隨廠商說明。得到的SOObp片段用限制酶KpnI及HindIII (均 為Τ0Υ0Β0公司制)剪切，亞克隆到pMal-c2E載體(NEB公司)中。用亞克隆的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，得到的克隆在5mL添加了過夜快速自動 誘導系統(tǒng)(Novagen公司)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。27°C下培養(yǎng)一整晚，之后從1. 5mL培養(yǎng)液 中回收菌體，用300 μ L含ImM AEBSF(SIGMA公司)的BugBuster蛋白提取試劑回收可溶性 蛋白。取5μ L回收的可溶性蛋白通過SDS-PAGE法(10 %聚丙烯酰胺凝膠，25mA，60分 鐘)證實MBP-scFv的表達。此外，通過ELISA驗證抗體親和力。作為ELISA用板，制備了固定了 mSlOOAlO或 mAlbumin的板。每孔添加1 μ g蛋白，于4°C下固定一晚。用PBS(-)清洗后，mSlOOAlO板 用3 % BSA (牛血清白蛋白(和光純藥公司))/PBS (-)，mAlbumin板用1 % HEL (雞蛋白溶菌 酶(生化學工業(yè)公司))/PBS(_)分別進行封閉。在室溫下進行1小時封閉后，用PBS清洗。 向如上所述制備的板中添加MBP-scFv抗體樣品。添加到mSlOOAlO板的抗體用3% BSA/ PBS㈠，添加到mAlbumin板的抗體用1 % HEL/PBS㈠分別稀釋50倍，室溫下靜置30分鐘。 向制備好的板中添加50yL該樣品，于37°C下反應(yīng)1小時。用PBS(-)洗凈后，添加50yL 用PBS(-)稀釋了 2000倍的第二抗體(抗-MBP，HRP綴合物(NEB公司))的溶液，于37°C 下反應(yīng)1小時。用PBS (-)洗凈后，添加100 μ L SureBlue Reserve (KPL公司)進行顯色。 在室溫下進行顯色反應(yīng)3分鐘，添加IOOyL IN HCl (和光純藥公司)以終止顯色反應(yīng)。之 后用680型酶標儀(BioRad公司)測定450nm/655nm的吸光度。用測定值減去空白值，繪制成坐標圖。以吸光度為縱坐標，樣品編號為橫坐標繪 圖。免疫mAlbumin的克隆將在mAlbumin板上的值為陽性值，在mSlOOAlO板上的值為陰性 值。出現(xiàn)差異的克隆特別用星號標出。
此外，陽性值比上陰性值，如果比值為負，且陽性值為正值的克隆記為++、比值示 2以上的值的克隆記為+，比值示1 2的值的克隆記為士，示1以下的值的克隆記為_，將 各自的陽性率繪圖。所得結(jié)果如圖25 圖29所示。從顯示抗小鼠蛋白抗體的取得結(jié)果的一系列圖可知道，mSlOOAlO能夠得到多數(shù)抗 體。從抗體親和力分布結(jié)果來看，免疫高濃度抗原，得到多數(shù)無親和力的克隆。但高親和力 抗體的陽性率與用低濃度抗原免疫的情況沒有大差別，由于體細胞變異的頻率上升，因此 認為不與抗原反應(yīng)的克隆增加了。因此使用抗原性低的抗原，盡可能用高濃度的，這樣可能 得到更符合目的的抗體。另一方面，得到針對mAlbumin的抗體非常困難。原因為由于小鼠血液中大量存 在，如果比較容易制備出相對應(yīng)的抗體那么患自身免疫疾病的幾率迅速上升。因此，認為應(yīng) 該在從骨髓向脾臟運送免疫活性細胞之前，經(jīng)篩選排除有可能性的克隆。因此制備針對這 些的抗體時，從骨髓得到免疫活性細胞而免疫的方法有可能高效獲取抗體。并且，從得到 mSlOOAlO抗體的結(jié)果來看，通過用比IOnmol更高濃度免疫可更高效獲取抗體。雖然較差， 但也能獲得與mAlbumin反應(yīng)的抗體，因此，也可采用向基因中人為導入突變來獲得目的抗 體的方法。
兩個實施例12 本實施例對抗小分子化合物抗體的獲得及實驗方法進行說明。將BALB/c小鼠(4周齡、早、SPF/VAF)頸椎脫臼處死，肉眼識別小鼠脾臟后，摘 出，用70%乙醇洗凈。再用PBS洗凈后，將2只的脾臟置于細胞過濾網(wǎng)上，用細胞刮刀破 碎。用4mL PBS(-)清洗3次細胞過濾網(wǎng)，將脾細胞從細胞過濾網(wǎng)上洗脫。通過離心分離 (1300rpmX3分鐘，4°C )回收細胞。將細胞懸浮于3mL ACK裂解緩沖液中后，加入IOmL PBS (-)去除紅細胞，通過離心 分離(1300rpmX3分鐘，4°C )回收脾細胞。將該脾細胞懸浮于IOmL RPMI1640培養(yǎng)基中， 使通過細胞過濾網(wǎng)來去除不溶性脂肪。細胞數(shù)用血細胞計數(shù)板計數(shù)，并濃縮至IX IO7細胞 /mL0以HEL_Cy3蛋白及HEL-ITC用作抗原。分別用Cy3單次反應(yīng)性染料包(GE Healthcare公司)、FITC (Funakoshi公司)標記HEL (生化學工業(yè)公司)。測定標記率，用相 當于Inmol小分子化合物，免疫2 X IO7細胞的脾細胞。此時，作為佐劑添加100 μ g的胞壁 酰二肽(SIGMA公司)。室溫下靜置15分鐘進行免疫反應(yīng)。將刺激物(IL-4、IL-5、抗⑶38 抗體、抗⑶40抗體、LPS)配成達標準終濃度的1000倍。取上述刺激物10 μ L與經(jīng)免疫的 脾細胞(2mL)混合，用含40% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將細胞濃度配至2 X IO6細胞/mL，用 37°C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4天。培養(yǎng)后，回收全部細胞，用ISOGEN(Nippongene公司制)回收總RNA。用600ng的 上述總RNA為模板，使用ReverTra Ace (Τ0Υ0Β0公司)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)組成隨廠商 說明，體積為20 μ L，使用Oligo (dT) 20 (Τ0Υ0Β0公司)作為引物。反應(yīng)條件42°C 20分鐘、 99°C 5分鐘、4°C 5分鐘。以10 μ L該產(chǎn)物為模板，通過PCR擴增抗體的H鏈及L鏈的高 變區(qū)。PCR中采用PrimeSTAR HS (TaKaRa公司)，反應(yīng)組成、反應(yīng)條件隨廠商說明。得到的 400bp片段通過瓊脂糖凝膠電泳(2.0% Seakem GTG Agarose (TaKaRa公司)/TAE緩沖液，150V, 30分鐘)分離，用QIAEX II凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司)提取純化。實驗方法隨 廠商說明。以提取的片段各50ng為模板，通過PCR制備SOObp的scFv片段。PCR中采用 PrimeSTAR HS(TaKaRa公司)，反應(yīng)組成、反應(yīng)條件隨廠商說明。得到的800bp片段用限制 酶KpnI及HindIII (均為TOYOBO公司制)剪切，亞克隆到pMal_c2E載體(NEB公司)中。用亞克隆的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，得到的克隆在5mL添加了過夜快速自動誘導系統(tǒng)(Novagen公司)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。27°C下培養(yǎng)一整晚，之后從1. 5mL培養(yǎng)液 中回收菌體，用300 μ L含ImM AEBSF(SIGMA公司)的BugBuster蛋白提取試劑回收可溶性 蛋白。取5μ L回收的可溶性蛋白通過SDS-PAGE法(10 %聚丙烯酰胺凝膠，25mA，60分 鐘)證實MBP-scFv的表達。圖30所示為得到的抗小分子化合物抗體的電泳照片。由Cy3-HEL、FITC_HEL都能 夠確認目的蛋白(圖中箭頭部分)的高表達，由此提示能夠獲得目的抗體。工業(yè)實用件通過上述說明，根據(jù)本發(fā)明，可在短時間內(nèi)大量制備抗體應(yīng)用于以抗原抗體反應(yīng) 為基礎(chǔ)的疾病診斷方法中。不限于疾病診斷，更可擴大到免疫學標記物檢測領(lǐng)域。此外，還 可在短時間內(nèi)制備多種抗體應(yīng)用到以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的疾病治療中，因此也促進擴大 了抗體醫(yī)藥的領(lǐng)域。另外，由于可在短時間內(nèi)大量制備抗體用于檢測作為腎癌標記物之一的S100A10 蛋白，因此，可降低抗體制造成本，及低成本頻繁進行以檢測癌癥為目的的尿檢。
權(quán)利要求
抗體制備方法，包括●將含免疫用細胞的組織在含抗原和刺激物的培養(yǎng)液中體外免疫的步驟；●篩選所述經(jīng)免疫的細胞的步驟；及●從篩選出的免疫細胞獲得抗體的步驟。
2.權(quán)利要求1的抗體制備方法，還包括以下步驟 通過PCR擴增，從所述免疫細胞得到擴增抗體基因后，由宿主細胞表達制備抗體或 類抗體蛋白。
3.權(quán)利要求1的抗體制備方法，其中所述組織是免疫用動物。
4.權(quán)利要求1的抗體制備方法，其中所述篩選出的細胞是發(fā)生類別轉(zhuǎn)換或親和力成熟 的細胞。
5.權(quán)利要求1的抗體制備方法，其中所述經(jīng)免疫細胞的篩選通過流式細胞術(shù)或染色進行。
6.權(quán)利要求1的抗體制備方法，其中所述刺激物是刺激在免疫活性細胞上表達的細胞 因子受體、表面抗原或信號轉(zhuǎn)導相關(guān)受體的物質(zhì)。
7.權(quán)利要求1的抗體制備方法，其中所述抗原是肽。
8.權(quán)利要求1的抗體制備方法，其中所述抗原是屬于SlOO家族的蛋白，取得單鏈抗體 scFv(單鏈可變片段)或抗體IgGl (免疫球蛋白Gl)。
9.權(quán)利要求1的抗體制備方法，其中所述抗原是S100A10蛋白，取得單鏈抗體scFv(單 鏈可變片段)或抗體IgGl (免疫球蛋白Gl)。
10.權(quán)利要求6的抗體制備方法，其中所述刺激物是下列中的至少一種 針對細胞因子受體的刺激物IL_4或IL-5 ； 針對表面抗原的刺激物抗-CD38抗體或抗-CD40抗體 ’及 眷針對信號轉(zhuǎn)導相關(guān)受體的刺激物LPS(脂多糖)。
11.權(quán)利要求1的抗體制備方法，其將含免疫用細胞的組織在含刺激物的培養(yǎng)液中體 外免疫來制備抗體，所述刺激物是選自下列中1種以上的刺激物IL_4、IL-5、抗-CD38抗 體、抗-CD40抗體及LPS。
12.權(quán)利要求1的抗體制備方法，其還包括 確定篩選出的所述抗體基因氨基酸序列的步驟；及 將所述氨基酸序列與人抗體氨基酸序列庫進行比對，并從所述人抗體氨基酸序列庫 選出同源性(同一性)高的序列，或經(jīng)改變調(diào)整形成人源化抗體基因的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗體制備方法，包括將含免疫用細胞的組織在含抗原和刺激物的培養(yǎng)液中體外免疫的步驟；篩選所述經(jīng)免疫的細胞的步驟；及從篩選出的免疫細胞獲得抗體的步驟。按照這種抗體制備方法可在短時間內(nèi)大量制備抗體，繼而能夠為免疫學檢查的普及做貢獻。
文檔編號A61K39/395GK101883862SQ20088011906
公開日2010年11月10日 申請日期2008年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月3日
發(fā)明者吉見達成, 稻垣貴之 申請人:愛德芳世株式會社