專利名稱：：用于診斷和治療癌癥的vhz的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學、細胞生物學、分子生物學和遺傳學領(lǐng)域。本發(fā)明涉及醫(yī)學領(lǐng)域。具體地，它涉及疾病(諸如乳腺癌)的治療和診斷，以及進行此類應(yīng)用的組合物。
背景技術(shù)：
：VHZ是與人PRL-PTP共享約28%的氨基酸序列同一性的磷酸酶。先前報告了，VHZ在許多組織中表達，并且位于胞質(zhì)溶膠和核仁中(Alonso等，2004a)。然而，VHZ的作用很大程度上是未知的；盡管它與蛙、魚、蒼蠅、和古細菌(Archaea)中的直向同系物(orthologue)在進化過程中是保守的。VHZ以及VHR屬于VH1樣PTP的不同亞組(Alonso等，2004b)。已經(jīng)報告了，VHR具有調(diào)控細胞周期行進的功能(Rahmouni等，2006)。在西方世界和亞洲的發(fā)達國家，乳腺癌是女性中癌癥相關(guān)死亡的第二位主要原因(Polyak，2001)。乳腺癌位于新加坡女性癌癥目錄的頂部，其中每年診斷700-800例新病例(SingaporeCancerRegistryReport,2000)在美國，每年180，000名女性被診斷為乳腺癌的新病例(Polyak，2001)。盡管有更好的診斷和例行的篩選，但1/4左右的病例仍會死于她們的疾病。因而，需要改良的乳腺癌檢測和治療。發(fā)明概述依照本發(fā)明的第一方面，我們提供了供在個體中治療、預(yù)防或減輕癌癥諸如乳腺癌的方法中使用的VHZ。依照本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于治療、預(yù)防或減輕癌癥的抗VHZ齊IJ。所述癌癥可以包括乳腺癌。所述癌癥可以包括侵入性或轉(zhuǎn)移性癌癥諸如侵入性導(dǎo)管癌(InvasiveDuctalCarcinoma,IDC)?？筕HZ劑可以能夠下調(diào)以GenBank登錄號NM_017823或NP_060293顯示的VHZ序列，或者與該序列具有至少90%序列同一性的序列的表達、量或活性的任意組合。所述抗VHZ劑可以包括抗VHZ抗體。所述抗VHZ抗體可以包括針對與人VHZ的氨基酸殘基(126-140)對應(yīng)的RRLRPGSIETYEQEK生成的抗肽抗體。所述抗VHZ抗體可以包括雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號LS-C32281，氨基酸35至90，LS-C42458，LS-A6806和LS-A6803，LS-C32281，LifeSpanInc,Seattle,Washington,USA)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號DS-PB-00676，RayBiotechInc,Norcross,Georgia,USA)、雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號XW-7857，ProSciIncorporated,Poway,California,USA)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號F4560和D9840-66A，UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)、雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號D9840-66，UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號AHP1142，AdBSerotec,Oxford,UnitedKingdom)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號NB110-40452，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)、雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號NB100-75328，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)。所述抗VHZ劑可以能夠通過RNA干擾來下調(diào)VHZ。它可以包含小干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)或嵌合RNAi諸如DUSP23預(yù)先設(shè)計嵌合RNAi(產(chǎn)品目錄編號H00054935-R01,NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)。依照本發(fā)明的第三方面，我們提供了一種用于檢測個體中的乳腺癌或個體對乳腺癌的易感性的試劑盒。所述試劑盒可以包含用于檢測所述個體或自他或她采集的樣品中的VHZ表達的手段。所述用于檢測的手段可以選自下組VHZ多核苷酸或其片段；VHZ核酸或其片段的互補核苷酸序列；VHZ多肽或其片段，或如上文所列的抗VHZ抗體或抗VHZ劑，和任選地，使用說明書。它可以進一步包含用于治療、預(yù)防或減輕乳腺癌的治療藥物，諸如包含他莫昔芬(Tamoxifen)或赫賽汀(Here印tin)。作為本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測癌細胞諸如乳腺癌細胞的方法。所述癌細胞可以包括侵入性或轉(zhuǎn)移性癌細胞諸如侵入性導(dǎo)管癌(IDC)。所述方法可以包括檢測所述細胞中VHZ的表達、量或活性的調(diào)控。所述調(diào)控可以包括上調(diào)?？梢员容^所述VHZ表達與已知為非癌性的對照細胞中的VHZ的表達、量或活性。所述方法可以包括檢測VHZ核酸。這可以是依靠包含如下核酸的至少一部分的探針，所述核酸具有以GenBank登錄號NM_017823或NP_060293顯示的序列或與此類序列具有至少90%序列同一性的序列，或者其中所述方法包括檢測VHZ多肽，諸如依靠權(quán)利要求2中所列的抗VHZ抗體。所述方法可以進一步包括組織學分級。所述組織學分級可以依靠Elston-Ellis改良的Scarff，Bloom,Richardson分級系統(tǒng)(Nottingham分級系統(tǒng)(NGS))。依照本發(fā)明的第五方面，我們提供了一種測定細胞的增殖狀態(tài)或者測定細胞會變?yōu)榍秩胄曰蚬粜缘目赡苄缘姆椒?。所述方法包括檢測所述細胞中的VHZ的表達、量或活性的調(diào)控。在第六方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)測患有癌癥的個體的存活率的方法。該方法包括檢測所述個體的細胞中的VHZ表達調(diào)控。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種為患有癌癥的個體選擇療法的方法，該方法包括檢測所述個體的細胞中的VHZ表達調(diào)控，基于所述癌癥的攻擊性來選擇合適的療法。所述療法可以包含如上文所描述的抗VHZ劑。依照本發(fā)明的第八方面，我們提供了一種測定特定療法在患有癌癥的個體中成功的可能性的方法。該方法包括比較所述療法與通過如上文所列的方法確定的療法。這些方法之每一種可以進一步包括本發(fā)明的上文第一至第三方面之任一項中所列的特征。依照本發(fā)明的第九方面，我們提供了一種操作癌細胞諸如乳腺癌細胞的方法。所述癌細胞可以包括侵入性或轉(zhuǎn)移性癌細胞諸如侵入性導(dǎo)管癌(IDC)。該方法可以包括調(diào)控所述細胞中的VHZ表達、量或活性。所述調(diào)控可以包括下調(diào)。所述方法可以包括將所述細胞暴露于能夠特異性結(jié)合VHZ的siRNA或shRNA。它可以包括將所述細胞暴露于抗VHZ抗體諸如上文所列的。由于所述操作，所述癌細胞可以變?yōu)榉前┬缘幕蛘咚銮秩胄曰蜣D(zhuǎn)移性癌細胞可以變?yōu)榉乔秩胄缘幕蚍寝D(zhuǎn)移性的。依照本發(fā)明的第十方面，提供了一種操作細胞的方法，該方法包括下列步驟(a)檢測細胞中VHZ表達、量或活性的升高；并(b)降低所述細胞中的VHZ水平。依照本發(fā)明的第十一方面，我們提供了一種鑒定能夠結(jié)合VHZ多肽的分子的方法，該方法包括使VHZ多肽或與其具有至少90%序列同一性的序列與候選分子接觸，并測定所述候選分子是否結(jié)合所述VHZ多肽或與其具有至少90%序列同一性的序列。依照本發(fā)明的第十二方面，我們提供了一種鑒定VHZ調(diào)控物的方法，該方法包括使細胞與候選分子接觸，并檢測所述細胞中的或所述細胞的VHZ的表達、量或活性的升高或降低。依照本發(fā)明的第十三方面，我們提供了一種鑒定適合于治療、預(yù)防或減輕癌癥的分子的方法，該方法包括測定候選分子是否是VHZ的或與其具有至少90%序列同一性的序列的激動劑或拮抗劑。所述方法可以包括將候選分子暴露于VHZ多肽或表達VHZ多肽的細胞，以便測定所述候選分子是否是其激動劑或拮抗劑。依照本發(fā)明的第十四方面，提供了一種鑒定VHZ的或與其具有至少90%序列同一性的序列的激動劑或拮抗劑的方法，該方法包括向動物施用候選分子，并測定所述動物是否展現(xiàn)出VHZ的表達、量或活性的升高或降低。依照本發(fā)明的第十五方面，我們提供了一種在個體中治療、預(yù)防或減輕癌癥的方法，該方法包括調(diào)控個體的細胞中的VHZ表達、量或活性。所述癌癥可以包括乳腺癌，諸如侵入性或轉(zhuǎn)移性癌癥諸如侵入性導(dǎo)管癌(IDC)。所述方法可以是這樣的，即使得所述VHZ的表達、量或活性在所述個體的乳腺細胞中降低。依照本發(fā)明的第十六方面，我們提供了一種在個體中診斷癌癥或?qū)Π┌Y的易感性或者的患有癌癥的個體預(yù)后的方法，該方法包括檢測所述個體的細胞中的VHZ的表達、量或活性的調(diào)控。所述癌癥可以包括乳腺癌，諸如侵入性或轉(zhuǎn)移性癌癥諸如侵入性導(dǎo)管癌(IDC)。依照本發(fā)明的第十七方面，我們提供了一種測定個體中的腫瘤是否是或者是否有可能是侵入性或轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法，該方法包括檢測所述個體的腫瘤細胞中的VHZ的表達、量或活性的調(diào)控。依照本發(fā)明的第十八方面，我們提供了一種在個體中治療、預(yù)防或減輕癌癥的方法，該方法包括檢測所述個體的細胞中的VHZ的表達、量或活性的調(diào)控，并基于所述腫瘤的攻擊性來向所述個體施用合適的療法。所述療法可以包括抗VHZ劑，如上文所描述的。所述癌癥可以包括乳腺癌，諸如侵入性或轉(zhuǎn)移性癌癥諸如侵入性導(dǎo)管癌(IDC)。通過評估腫瘤大小和/或淋巴結(jié)階段，任選地與其它風險因素一起或組合，可以進一步確定所述診斷、預(yù)后或療法的選擇。通過評估所述腫瘤的雌激素受體(ER)狀態(tài)，可以進一步確定所述診斷、預(yù)后或療法的選擇。依照本發(fā)明的第十九方面，我們提供了VHZ多肽的分子、激動劑或拮抗劑，其是通過如上文所列的方法或用途鑒定的。依照本發(fā)明的第二十方面，我們提供了一種供在治療、預(yù)防或減輕癌癥中使用的分子，其能夠調(diào)控諸如下調(diào)VHZ的表達。所述分子可以包含針對與人VHZ的氨基酸殘基(126-140)對應(yīng)的RRLRPGSIETYEQEK生成的抗肽抗體。除非另有指明，本發(fā)明的實踐會采用化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術(shù)，它們在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。文獻中解釋了此類技術(shù)。參見例如J·Sambrook,E.F.Fritsch,禾口Τ·Maniatis,1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，第1-3冊，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.M.等(1995和定期補充；CurrentProtocolsinMolecularBiology，第9章、第13章、和第16章，JohnWiley&Sons，NewYork,N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，禾口A.Kahn，1996，DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques,JohnWiley&Sons;J.Μ·PoIak禾口JamesO'D.McGee,1990,InSituHybridizationPrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress；Μ·J.Gait(編)，1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IrIPress；D.Μ.J.Lilley禾口J.Ε.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；Antibodies:ALaboratoryManual,EdHarlow(IS),DavidLane(IS)(1988，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2),1855.HandbookofDrugScreening,RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes編(2001,NewYork,BY,MarcelDekker，ISBN0-8247-0562-9)；及LabRef:AHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,JfaneRoskams禾口LindaRodgers編，2002，ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。本文通過提及而收錄這些通用教科書之每篇。附圖簡述圖IA和圖IB的圖像顯示了外源性VHZ位于中心體中，并遍及細胞質(zhì)。間接的免疫熒光顯示了中心體中的外源性VHZ。圖1A。VHZ-EGFP(綠色)被轉(zhuǎn)染入NRK細胞中，并展現(xiàn)出一定范圍的亞細胞定位(a)。VHZ的主要定位是中心體，在那里它與紅色的中心體標志物-粒周蛋白共定位(b)。使用To-pro-3碘化物來以藍色顯現(xiàn)細胞核(b)。合并的圖像顯示了VHZ-EGFP(綠色)與粒周蛋白共定位(c)。標尺，20μm。圖IB。將VHZ-EGFP轉(zhuǎn)染入NRK細胞中，并在處于各個細胞周期階段的細胞中顯現(xiàn)分裂間期(a)、前期(b)、中期(C)、和末期(d)。粒周蛋白以紅色顯示(a’_d’)，而細胞核用To-pro-3碘化物以藍色顯示(a’-d’)。如所顯示的那樣合并圖像(a”_d”)。標尺，10μm。圖2A和圖2B的圖像顯示了內(nèi)源性VHZ位于中心體和細胞質(zhì)中。圖2A。在NRK(a-c，標尺，10μm)和MCF-IOA(d-f，標尺，20μm)細胞中顯現(xiàn)內(nèi)源性VHZ，其通過用親和純化的家兔抗VHZ和小鼠抗Y-微管蛋白抗體，接著用偶聯(lián)有抗家兔-FITC(綠色)的抗家兔IgG和偶聯(lián)有抗小鼠-德克薩斯紅的抗小鼠IgG進行的雙重染色來實現(xiàn)。也在A431細胞(g-i，標尺，20μπι)中檢測內(nèi)源性VHZ，其通過用小鼠單克隆抗體抗VHZ(克隆編號25)和家兔抗粒周蛋白抗體，接著用偶聯(lián)有抗小鼠-FITC(綠色)的抗小鼠IgG和偶聯(lián)有抗家兔-德克薩斯紅的抗家兔IgG進行的雙重染色來實現(xiàn)。圖2Β。在經(jīng)過血清饑餓的NRK中顯現(xiàn)內(nèi)源性VHZ(a_c，標尺，20μm),其通過用家兔抗VHZ和小鼠抗Y-微管蛋白抗體，接著用偶聯(lián)有抗家兔-FITC(綠色)的抗家兔IgG和偶聯(lián)有抗小鼠_德克薩斯紅的抗小鼠IgG進行的雙重染色來實現(xiàn)。圖3A、圖3B和圖3C的圖像顯示了VHZ具有蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性，并且牽涉細胞周期調(diào)節(jié)。圖3A。我們對每種蛋白質(zhì)(0.675皮摩爾)測試其PTP酶活性。通過在反應(yīng)中添加10μM原釩酸鈉(VHZ-GST+釩酸鹽)或者通過將Cys95點突變成Ser[VHZ(C95S)-GST)]，完全消除VHZ的PTP酶活性。圖3Β。a。三份全細胞溶胞物衍生自表達VHZ-EGFP、VHZ(C95S)-EGFP、或EGFP載體的MCF-7細胞。通過用抗EGFP抗體進行的Western印跡來分析蛋白質(zhì)表達水平。使用GAPDH作為蛋白質(zhì)加載對照。b。通過BrdU摻入和FACS分析來測量DNA含量。APC-BrdU向新合成的DNA的摻入(Rl對應(yīng)于紅色熒光的量)。圖3C。穩(wěn)定地表達相同的三種表達構(gòu)建體的NRK細胞顯示VHZ能減少Gl但增加S群體。所得的直方圖由三種群體組成(按％計)M1:G1期、M2:S期和M3:G2/M期。該圖形顯示了對增殖中的細胞群體獲得的典型結(jié)果，那時通過FACS分析測定其個體細胞的DNA含量。圖4A和圖4B的圖像顯示了VHZ增強MCF-7細胞中的G1/S轉(zhuǎn)換。圖4A。對表達EGFP載體、VHZ(C95S)-EGFP或VHZ-EGFP的MCF-7細胞分析牽涉G1/S細胞周期控制的數(shù)種分子。有在Ser780、Ser795和Ser807/811處磷酸化的p21Wafl/Cipl、Cdk4、和Rb。圖4B。顯示了一種提出的模型，用以例示VHZ如何可以在G1/S期轉(zhuǎn)換中與這些分子協(xié)調(diào)。圖5A、圖5B和圖5C的圖像顯示了過表達的VHZ蛋白分布于一些乳腺癌樣品中的上皮腫瘤細胞的中心體中或細胞質(zhì)中。對福爾馬林固定的且石蠟包埋的乳腺癌樣品評估VHZ蛋白表達。圖5A。通過在相同的組織切片上進行的間接雙重免疫熒光標記看到VHZ在乳腺癌中定位至細胞的中心體。VHZ(a)和Y-微管蛋白(b)共定位于中心體(c)，如白色箭頭所標示的。圖像c顯示了合并的圖像a和b。標尺100μπι。圖5Β。為了進行免疫組織化學標記而處理乳腺癌樣品的兩份連續(xù)切片以分別檢測VHZ和Y-微管蛋白。通過用3，3’-二氨基聯(lián)苯胺色原(褐色)染色來檢測陽性信號。VHZ(a)和Y-微管蛋白定位(b)的相似中心體標記樣式以黑色箭標示?？偯矆D像(a’，b’)衍生自兩份相鄰切片。小圖a’至C’(放大率x630)中框示的三個矩形區(qū)域進行進一步放大(x5)，并分別顯示于小圖a至c，其中中心體以黑色箭標示。小圖C’和c顯示了作為對照的VHZ陰性樣品。最初的總貌圖像顯示于(圖8A)。圖5C。VHZ蛋白在一些乳腺癌樣品中的彌散上皮的整個細胞質(zhì)中過表達。最初的總貌圖像顯示于(圖8B)。來自不同乳房樣品的選定切片顯示于總貌圖像(a’和b’)?？偯矆D像(a’、b’和c’放大率x400)中框示的三個矩形區(qū)域進行進一步放大(x5)，并分別顯示于小圖a、b和C。小圖c和C’是作為對照顯示的VHZ陰性樣品。圖6A和圖6B的圖像顯示了VHZ在E-鈣粘著蛋白陰性細胞中的表達和VHZ的過表達增強MCF-7細胞的運動性。圖6A。兩份相鄰的福爾馬林固定的且石蠟包埋的乳腺癌樣品組織切片顯示了VHZ陽性細胞是E-鈣粘著蛋白陰性的(a，放大率x400)，而VHZ陰性上皮是E-鈣粘著蛋白陽性的(b，放大率x400)。圖6B。為了評估MCF-7-VHZ-EGFP和MCF-7-VHZ(C95S)-EGFP細胞運動性，將細胞在蓋玻片上以匯合的單層鋪板。然后使經(jīng)細胞包被的蓋玻片顛倒，其中細胞側(cè)向下至新鮮培養(yǎng)皿上。在0小時時和48小時時為MCF-7-VHZ-EGFP細胞(a，a’)和MCF-7-VHZ(C95S)-EGFP(b，b’)采集圖像。小圖a’顯示了自覆蓋的蓋玻片下移動到外面的MCF-7-VHZ-EGFP細胞(箭標示的)。免疫熒光圖像(a，b)。相差圖像(a’，b’放大率x200)。圖7A和圖7B的圖像顯示了VHZmRNA在組織和細胞中廣泛表達。人多組織陣列(產(chǎn)品目錄編號7776-1)獲自BDBioscience(SanJose,CA)。該陣列含有自65種不同人組織和8種人細胞系衍生的73份mRNA。圖7A。依照制造商的說明書(產(chǎn)品目錄編號1585584，Roche，Mannheim，Germany)用32P-dCTP放射性標記的人VHZCDNA探查點印跡。顯示了VHZmRNA表達樣式。VHZ主要在心臟(斑點4A、4C-4H)中和在許多其它組織中，以及在肺癌細胞系_A549(斑點-10H)中表達。圖7B。人多組織陣列的完整圖譜。圖8A和圖8B的圖像通過免疫組織化學顯示了VHZ蛋白在乳腺癌的中心體和細胞質(zhì)中過表達。圖8A。在乳腺癌的中心體中揭示了VHZ蛋白的過表達。中心體以黑色箭標示(放大率x400)。圖8B。在乳腺癌細胞的細胞質(zhì)中找到VHZ蛋白的過表達(放大率x200)。圖9A和圖9B的圖像顯示了家兔和小鼠抗VHZ抗體的表征。圖9A。用家兔和小鼠抗VHZ抗體進行的Western印跡分析。全細胞溶胞物衍生自A431、HaLa、殿1(、和MCF-7細胞。將MCF-7全細胞溶胞物與2μgVHZ-GST—起預(yù)溫育(第1道)。VHZ條帶的檢測被VHZ-GST特異性阻斷(箭標示的)。圖9B。VHZ單抗可用于ECL(A)、IF(B)和IHC(圖5)。圖10的圖像顯示了根據(jù)傷口愈合測定法，表達VHZ的MCFlOA細胞展示出比表達VHZ(C95S)的MCFlOA細胞增強的遷移特性。我們已經(jīng)經(jīng)由使用pBABEpuro載體進行的逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)在MCFlOA細胞(5x10s)中表達VHZ和VHZ(C95S)。根據(jù)傷口愈合測定法，表達VHZ的MCFlOA細胞展示出比表達VHZ(C95S)的MCFlOA細胞增強的遷移特性。可以觀察到開始時(0小時上部小圖)和終點時(8小時下部小圖)的細胞遷移的明顯差異。發(fā)明詳述本發(fā)明基于第一次證明了VHZ磷酸酶在癌癥中發(fā)揮作用。VHZ是最小的已知的有活性的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(僅16kDa)，并且屬于小牛痘病毒VHl相關(guān)雙特異性磷酸酶組。編碼VHZ的基因位于人染色體lq23.1上，并且僅由兩個編碼外顯子組成(Wu等，2004，IntJBiochemCellBiol.36(8)1542-53)VHZ顯示獨特的針對對硝基苯基磷酸酯以及含有磷酸酪氨酸和磷酸蘇氨酸殘基的寡肽磷酸酶活性。此外，VHZ在體外能使p44ERKl而非p38和p54SAPK0去磷酸化(Alonso等(2004).JBiolChem.20；279(34):35768_74)。我們顯示了VHZ主要與侵入性人上皮乳腺癌細胞有關(guān)。在所檢查的人乳腺癌樣品的中心體(6/65份病例)中或遍及細胞質(zhì)(11/65份病例)找到VHZ蛋白的過表達。因而，可以使用VHZ作為標志物來檢測乳腺癌?？梢允褂肰HZ表達的水平作為癌癥的指標，特別是乳腺癌諸如轉(zhuǎn)移性、攻擊性或侵入性乳腺癌。還可以使用VHZ表達的水平作為此類癌癥可能性的指標。因此，我們提供了診斷或檢測癌癥，特別是乳腺癌的方法。我們進一步提供了診斷和檢測此類癌癥的攻擊性或侵入性或轉(zhuǎn)移狀態(tài)，或者這些的任意組合的方法。該方法可以包括分析蛋白質(zhì)水平(例如免疫組織化學)或RNA水平(例如通過原位雜交)。下文更為詳細地描述了此類診斷和檢測方法。使用間接免疫熒光，我們顯示了外源性和內(nèi)源性VHZ蛋白二者在其胞質(zhì)分布外還定位于中心體中。因而，可以使用VHZ作為標志物來檢測中心體結(jié)構(gòu)。我們證明了VHZ調(diào)節(jié)細胞周期行進，并且它具有增強Gl-S期轉(zhuǎn)換的能力。我們證明了VHZ的過表達促成乳腺癌形成。對BrdU標記的被工程化改造成表達VHZ的MCF-7細胞的FACS分析指明VHZ能夠加速Gl期向S期轉(zhuǎn)換。來自對穩(wěn)定表達相同的三種表達構(gòu)建體的NRK細胞的FACS分析的類似結(jié)果顯示VHZ通過減少Gl但增加S群體來加速Gl向S期轉(zhuǎn)換。因而，我們提供了治療或預(yù)防患有癌癥的個體的方法。還可以使用VHZ水平向那些在正常組織中的VHZ水平的恢復(fù)作為恢復(fù)乳腺細胞正常功能的手段。因此，我們提供了VHZ核酸和多肽治療癌癥(包括乳腺癌)的用途?？梢允褂梦覀兊姆椒▉碇委熁蝾A(yù)防乳腺癌或侵入性癌癥諸如侵入性乳腺癌。我們還提供了VHZ在篩選針對癌癥(例如乳腺癌)的藥物中的用途。所述癌癥可以包括侵入性乳腺癌。VHZ過表達或表達不足的細胞以及包含其的組織、器官和生物體可以用作癌癥模型或者用于篩選抗癌劑。VHZ在MCF-7細胞中的過表達引起p21Cipl的下調(diào)和Cdk4的上調(diào)。結(jié)果，觀察到磷酸化的(失活的)視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Rb)的積累，如通過用磷酸特異性抗體進行的免疫印跡所評估的。表達沒有催化活性的VHZ(C95S)的細胞上文的VHZ介導(dǎo)的事件方面受到削弱，指明這些特性需要磷酸酶活性。VHZ中的催化性半胱氨酸殘基的突變(C95S)消除其蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP)活性。在使用術(shù)語“VHZ”時，這應(yīng)當被用于指任何VHZ序列，包括VHZ蛋白或VHZ核酸及其任何片段、變體同源物、衍生物、變體。VHZ的特性和活性記載于本文件中，例如在參考文獻中。VHZ多月太這里所描述的方法和組合物利用下文詳細描述的VHZ多肽。VHZ也稱為DUSP23、M0SP、LDP-3、DUSP25、FLJ20442和RP11-190A12.1。如本文所使用的，術(shù)語“VHZ多肽”意圖指具有GenBank登錄號NP_060293.2、NP_081001.1、XP_341157.1、XP_001170819.1、XP_001170835.1、XP_545747.2、NP_001076078.1、NP_001011371.1、NP_783859.1、NP_001034709.1、XP_001480730.1、XP_001117253.1或XP_001117256.1的序列。"VHZ多肽”可以包含人VHZ多肽諸如具有登錄號NP_060293的序列，或者由其組成。還包括任何、一些或所有這些多肽的其同源物變體和衍生物。VHZ多肽可以用于多種手段，例如，向患有或者懷疑患有乳腺癌的個體施用以進行治療。它們還可以用于生成或篩選抗VHZ劑，諸如特異性VHZ結(jié)合劑，特別是抗VHZ抗體。這些在下文更為詳細地進行描述?？梢詸z測VHZ多肽的表達以診斷或檢測癌癥，特別是乳腺癌。“多肽”指任何包含兩個或更多個彼此通過肽鍵或修飾的肽鍵(即肽等排體)相連接的氨基酸的肽或蛋白質(zhì)?！岸嚯摹敝付替?通常稱為肽、寡肽或寡聚物)和較長的鏈(通常稱為蛋白質(zhì))兩者。多肽可以含有20種由基因編碼的氨基酸以外的氨基酸。“多肽”包括通過天然過程(諸如翻譯后加工)或通過本領(lǐng)域中公知的化學修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。此類修飾詳細記載于基礎(chǔ)教科書和更詳細的專著，以及多卷的研究文獻中。修飾可以在多肽中的任何地方發(fā)生，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。應(yīng)當領(lǐng)會的是，相同類型的修飾可以以相同或不同程度存在于給定多肽中的數(shù)個位點。還有，給定多肽可以含有許多類型的修飾。多肽可以由于遍在蛋白化而分支，并且它們可以是環(huán)狀的、有分支的或沒有分支的。環(huán)狀的、分支的和分支環(huán)狀的多肽可以源自翻譯后天然過程或者可以通過合成方法制備。修飾包括乙?；Ⅴ；DP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價附著、血紅素模塊的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價附著、磷脂酰肌醇的共價附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、共價交聯(lián)的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、Y-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻?；⒀趸?、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的氨基酸向蛋白質(zhì)的添加(諸如精氨?；?、和遍在蛋白化。參見例如Proteins-StructureandMolecularProperties,第2版，Τ.Ε.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork,1993禾口Wold,F.,PosttranslationalProteinModifications!PerspectivesandProspects,MM~M2Jit,于PosttranslationalCovalentModificationofProteins,B.C.Johnson,編，AcademicPress,NewYork,1983;Seifter等，"Analysisforproteinmodificaionsandnonproteincofactors",MethEnzymol,(1990)182626-646禾口Rattan等，“ProteinSynthesis:PosttranslationalModificationsandAging，，，AnnNYAcadSci(1992)663:48_62。術(shù)語“多肽”包括本領(lǐng)域已知的各種合成肽變異諸如逆反(retr0inVerS0)D肽。肽可以是抗原決定簇和/或T細胞表位。肽在體內(nèi)可以是免疫原性的。肽可以能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)中和性抗體。如應(yīng)用于VHZ的，所得的氨基酸序列可以具有一種或多種活性，諸如與VHZ多肽(例如人VHZ多肽)共同的生物學活性。例如，VHZ同源物在乳腺癌細胞中比在正常的乳腺細胞中可以具有升高的表達水平。具體地，術(shù)語“同源物”涵蓋關(guān)于結(jié)構(gòu)和/或功能的同一性，只要所得的氨基酸序列具有VHZ活性。關(guān)于序列同一性(即相似性)，可以有至少70%，諸如至少75%，諸如至少85%，諸如至少90%序列同一性?？梢杂兄辽?5%，諸如至少98%序列同一性。這些術(shù)語還涵蓋自作為VHZ核酸序列等位變異的氨基酸衍生的多肽。在提及多肽諸如VHZ的“活性”或“生物學活性”時，這些術(shù)語意圖指VHZ的代謝或生理學功能，包括類似的活性或改善的活性或者不想要的副作用降低的這些活性。還包括VHZ的抗原性和免疫原性活性。此類活性的例子及測定和量化這些活性的方法是本領(lǐng)域已知的，并且詳細記載于本文件的別處。例如，此類活性可以包括任何下列一項或多項水解酶活性、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性、蛋白質(zhì)酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性和蛋白質(zhì)氨基酸去磷酸化。針對這些活性的測定法是本領(lǐng)域已知的，并且例如記載于Wu等(2004)，IntJBiochemCellBiol.36(8)1542-53和Alonso等(2004)·JBiolChem.20；279(34):35768_74。其它VHZ多肽VHZ變體、同源物、衍生物和片段也在本文所描述的方法和組合物中使用。涉及VHZ的術(shù)語“變體”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括一個(或多個)氨基酸自序列或向序列的任意替代、變異、修飾、替換、刪除、或添加。除非上下文另有承認，提及“VHZ”包括提及VHZ的此類變體、同源物、衍生物和片段。如本文中所使用的，“刪除”定義為核苷酸或氨基酸序列中分別缺失一個或多個核苷酸或氨基酸殘基的變化。如本文中所使用的，“插入”或“添加”指與天然存在的物質(zhì)相比分別已經(jīng)導(dǎo)致一個或多個核苷酸或氨基酸殘基的添加的核苷酸或氨基酸序列變化。如本文中所使用的，“替代”源自于一個或多個核苷酸或氨基酸分別被不同核苷酸或氨基酸替換。如本文所描述的VHZ多肽還可以具有產(chǎn)生沉默變化和導(dǎo)致功能等同氨基酸序列的氨基酸殘基刪除、插入或替代?？梢曰跉埢臉O性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、和/或兩親性質(zhì)的相似性來進行有意的氨基酸替代。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；而具有不帶電荷的極性首基(headgroup)、具有相似的親水性值的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以例如依照下表來進行保守的替代。第二欄中同一塊中的和第三欄中同一行中的氨基酸可以彼此替代脂肪族的非極性的IGΑρ_ILV__極性-不帶電荷的CSTM_NQ_極性-帶電荷的DE__KR_^^族的|hFWYVHZ多肽可以進一步包含異源氨基酸序列，通常在N端或C端，諸如N端。異源序列可以包括影響胞內(nèi)或胞外蛋白質(zhì)靶向的序列(諸如前導(dǎo)序列)。異源序列還可以包括提高VHZ多肽的免疫原性和/或便于多肽的鑒定、提取和/或純化的序列。可以使用的另一種異源序列是多氨基酸序列諸如多組氨酸，其可以是N端的?？梢圆捎弥辽?0個氨基酸，諸如至少17個氨基酸但少于50個氨基酸的多組氨酸序列。VHZ多肽可以處于“成熟的”蛋白質(zhì)形式，或者可以是較大蛋白質(zhì)諸如融合蛋白的一部分。通常有利的是包括額外氨基酸序列，其含有分泌或前導(dǎo)序列、前序列(pro-sequence)、有助于純化的序列諸如多組氨酸殘基、或為了重組生產(chǎn)過程中穩(wěn)定性的額外序列。通過使用已知技術(shù)的重組手段來有利地制備如本文所描述的VHZ多肽。然而，還可以通過使用熟練技術(shù)人員公知的技術(shù)進行的合成手段諸如固相合成來制備它們。此類多肽還可以作為融合蛋白生成，例如以便幫助提取和純化。融合蛋白配偶的例子包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄激活域)和β-半乳糖苷酶。也可能方便的是在融合蛋白配偶與感興趣蛋白質(zhì)序列之間包括蛋白水解切割位點以容許除去融合蛋白序列，諸如凝血酶切割位點。融合蛋白可以是不阻礙感興趣序列的蛋白質(zhì)的功能的融合蛋白。VHZ多肽可以處于基本上分離的形式。此術(shù)語意圖指自天然狀態(tài)的人為改變。若“分離的”組合物或物質(zhì)在自然界中存在，則它已經(jīng)自其最初環(huán)境改變和/或取出。例如，在本文中采用該術(shù)語時，活的動物中天然存在的多核苷酸、核酸或多肽不是“分離的”，但是與其天然狀態(tài)的共存物質(zhì)分開的該多核苷酸、核酸或多肽是“分離的”。然而，應(yīng)當理解的是，VHZ蛋白可以與不會干擾蛋白質(zhì)預(yù)期目的的載體或稀釋劑混合，并且仍被認為是基本上分離的。VHZ多肽也可以處于基本上純化的形式，在此情況中一般會在制備物中包含蛋白質(zhì)，其中所述制備物中超過90%，例如95%、98%或99%的蛋白質(zhì)是VHZ多肽。通過比對來自不同物種的VHZ序列，有可能確定氨基酸序列的哪些區(qū)域在不同物種間是保守的(“同源區(qū)”)，及哪些區(qū)域在不同物種間有變化(“異源區(qū)”)。因此，VHZ多肽可以包含至少對應(yīng)同源區(qū)的一部分的序列。同源區(qū)在至少兩個物種間顯示高度的同源性。例如，使用上文所描述的測試，同源區(qū)可以在氨基酸水平顯示至少70%，至少80%，至少90%或至少95%的同一性?？梢栽谥委煵呗灾惺褂冒瑢?yīng)于同源區(qū)的序列的肽，如下文更詳細解釋的?；蛘?，VHZ肽可以包含至少對應(yīng)異源區(qū)的一部分的序列。異源區(qū)在至少兩個物種間顯示低度的同源性。VHZ同源物公開的進行使用的VHZ多肽包括自任何來源獲得的同源序列，例如相關(guān)病毒/細菌蛋白質(zhì)、細胞同源物和合成肽，以及其變體或衍生物。如此，多肽還包括那些編碼來自其它物種(包括動物，諸如哺乳動物(例如小鼠、大鼠或家兔)，尤其是靈長類，更尤其是人)的VHZ同源物的。更具體地，同源物包括人同源物。在本文件的語境中，同源序列用于包括在氨基酸水平上，例如在至少50或100、110、115、120、125、130、135、140、141、142、143、144、145、146、147、148或149個氨基酸里，與相關(guān)VHZ序列的序列至少15、20、25、30、40、50、60、70、80或90%相同，諸如至少95或98%相同的氨基酸序列。具體地，同源性通常應(yīng)當關(guān)于那些已知對蛋白質(zhì)功能至關(guān)重要的序列區(qū)域而非不是至關(guān)重要的相鄰序列進行考慮。這在考慮來自遠親生物體的同源序列時是特別重要的。一個例子是人VHZ蛋白殘基號95處的或?qū)?yīng)于人VHZ蛋白殘基號95的半胱氨酸殘基(其顯示為對于磷酸酶功能是至關(guān)重要的)和周圍的殘基。雖然也可以根據(jù)相似性(即具有相似化學特性/功能的氨基酸殘基)來考慮同源性，但是在本文件的語境中同源性可以根據(jù)序列同一性來表述?？梢酝ㄟ^目視，或者更通常地，借助于容易獲得的序列比較程序來進行同源性比較。這些公用的和商品化的計算機程序能在兩種或更多種序列之間計算％同一性?？梢栽谶B續(xù)的序列里計算％同一性，S卩比對一種序列與另一種序列，并且直接比較一種序列中的每個氨基酸與另一種序列中的相應(yīng)氨基酸，每次一個殘基。這稱作“無缺口的”比對。通常，僅在相對較短數(shù)目的殘基(例如小于50個連續(xù)氨基酸)里實施此類無缺口比對。雖然這是非常簡單而一致的方法，但是它不能考慮到例如，在其它方面相同的一對序列中，一處插入或刪除會引起隨后的氨基酸殘基比對不成，如此在實施總體比對時潛在地導(dǎo)致％同源性的大量降低。因此，對大多數(shù)序列比較方法進行設(shè)計以產(chǎn)生最佳比對，其考慮到有可能的插入和刪除，而不過度地對總體同源性得分進行罰分。這是通過在序列比對中插入“缺口”以設(shè)法使局部同一性或相似性最大化來實現(xiàn)的。然而，這些較復(fù)雜的方法將“缺口罰分”分配給比對中出現(xiàn)的每個缺口，使得對于相同數(shù)目的相同氨基酸，具有盡可能少的缺口的序列比對——反映兩種比較序列之間的較高關(guān)聯(lián)性——會比具有許多缺口的序列比對達到更高的得分。通常使用“仿射缺口代價”，其對缺口的存在要求相對較高的代價，而對缺口中的每個隨后的殘基要求較小的罰分。這是最常用的缺口評分系統(tǒng)。高缺口罰分當然會產(chǎn)生具有較少缺口的優(yōu)化比對。大多數(shù)比對程序容許對缺口罰分進行修改。然而，可以在使用此類軟件比較序列時使用缺省值。例如在使用GCGWisconsin最佳擬合包(參見下文)時，氨基酸序列的缺省缺口罰分是針對缺口的-12和針對每個延伸的_4。因此，最大限度％同源性的計算首先要求產(chǎn)生考慮到缺口罰分的最佳比對。適合于實施此類比對的一種計算機程序是GCGWisconsin最佳擬合包(UniversityofWisconsin，U.S.A;Devereux等，1984，NucleicAcidsResearchl2:387)。能實施序列比較的其它軟件的例子包括但不限于BLAST包(參見Ausubel等，1999同上-第18章)、FASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEffORKS比較工具套件。BLAST禾口FASTA兩者都可進行離線和在線搜索(參見Ausubel等，1999同上，第7_58頁至第7_60頁)?？梢允褂肎CG最佳擬合程序。雖然可以根據(jù)同一性測量最終的％同源性，但是比對方法自身通常并不是基于全有或全無的成對比較。代替地，一般使用定標的相似性得分矩陣，其基于化學相似性或進化距離將得分分配給每個配對比較。通常使用的此類矩陣的一個例子是BL0SUM62矩陣-BLAST程序套件的缺省矩陣。GCGWisconsin程序一般使用公共缺省值或自定義符號比較表，若提供的話(關(guān)于進一步的詳情參見用戶手冊)。可以使用GCG包的公共缺省值，或者在其它軟件的情況中，可以使用缺省矩陣，諸如BL0SUM62。一旦軟件已經(jīng)產(chǎn)生最佳比對，便有可能計算％同源性，諸如％序列同一性。軟件通常將此作為序列比較的一部分進行，并產(chǎn)生數(shù)值結(jié)果。涉及氨基酸序列的術(shù)語“變體”或“衍生物”包括一個(或多個)氨基酸自序列或向序列的任意替代、變異、修飾、替換、刪除、或添加，只要所得的氨基酸序列保留與未修飾的序列基本上相同的活性，諸如至少具有與VHZ多肽相同的活性。為了在本文所描述的方法和組合物中使用，可以修飾具有本文所公開的VHZ氨基酸序列的多肽，或其片段或同源物。通常，進行的修飾維持序列的生物學活性?？梢赃M行氨基酸替代，例如自1、2或3至10、20或30處替代，只要經(jīng)修飾的序列保留未修飾序列的生物學活性?；蛘撸梢赃M行修飾以便有意地使本文所述多肽的一個或多個功能域失活。氨基酸替代可以包括使用非天然存在的類似物，例如以便延長治療性施用的多肽的血漿半衰期。VHZ片段本文所述方法和組合物中使用的多肽還包括上文所鑒定的任何VHZ多肽的全長序列的片段。片段可以包含至少一個表位。鑒定表位的方法是本領(lǐng)域公知的。片段通常會包含至少6個氨基酸，諸如至少10、20、30、50或100個氨基酸。包括如下片段，其包含來自相關(guān)VHZ氨基酸序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145個或更多個殘基，或由其組成。我們進一步描述了包含如本文所描述的VHZ多肽的一部分的肽。如此，包括VHZ及其同源物、變體或衍生物的片段。所述肽的長度可以在2個和200個氨基酸之間，諸如在4個和40個氨基酸之間。所述肽可以衍生自如本文所公開的VHZ多肽，例如通過用合適的酶諸如胰蛋白酶進行的消化來得到?；蛘撸鲭?、片段等可以通過重組手段來制備，或者以合成法合成?？梢允褂么祟怴HZ片段來生成探針以優(yōu)先檢測VHZ表達，例如經(jīng)由針對此類片段生成的抗體。這些抗體會特異性結(jié)合VHZ，并且在本文所公開的診斷和治療方法中是有用的?？梢酝ㄟ^重組手段來制備VHZ及其片段、同源物、變體和衍生物。然而，它們也可以通過使用熟練技術(shù)人員公知的技術(shù)進行的合成手段諸如固相合成來制備。所述蛋白質(zhì)還可以作為融合蛋白生成，例如以便幫助提取和純化。融合蛋白配偶的例子包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄激活域)和β-半乳糖苷酶。也可能方便的是在融合蛋白配偶與感興趣蛋白質(zhì)序列之間包括蛋白水解切割位點以容許除去融合蛋白序列。融合蛋白可以是不會阻礙感興趣序列的蛋白質(zhì)的功能的融合蛋白。還可以通過純化來自動物細胞的細胞提取物來獲得蛋白質(zhì)。本文所公開的VHZ多肽、變體、同源物、片段和衍生物可以處于基本上分離的形式。應(yīng)當理解的是，此類多肽可以與不會干擾蛋白質(zhì)預(yù)期目的的載體或稀釋劑混合，并且仍被認為是基本上分離的。VHZ變體、同源物、片段或衍生物也可以處于基本上純化的形式，在此情況中一般會在制備物中包含蛋白質(zhì)，其中所述制備物中超過90%，例如95%、98%或99%的蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)。可以用顯示標記物(revealinglabel)標記本文所公開的VHZ多肽、變體、同源物、片段和衍生物。所述顯示標記物可以是容許檢測出多肽等的任何合適的標記物。合適的標記物包括放射性同位素(例如125I)、酶、抗體、多核苷酸和接頭(諸如生物素)。可以在診斷規(guī)程諸如免疫測定法中使用經(jīng)過標記的多肽以測定樣品中的多肽量。也可以在血清學或細胞介導(dǎo)的免疫測定法中使用多肽或經(jīng)過標記的多肽以使用標準方案來檢測動物和人中針對所述多肽的免疫反應(yīng)性。也可以將本文所公開的VHZ多肽、變體、同源物、片段和衍生物(任選經(jīng)過標記的)固定至固相，例如免疫測定孔或浸漬片的表面?？梢詫⒋祟惤?jīng)過標記的和/或固定化的多肽與合適的試劑、對照、說明書等一起在合適的容器中包裝入試劑盒中。此類多肽和試劑盒可以在通過免疫測定法檢測針對多肽或其等位或物種變體的抗體的方法中使用。免疫測定方法是本領(lǐng)域公知的，并且一般會包括(a)提供包含下述表位的多肽，該表位可被針對所述蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合；(b)在容許抗體-抗原復(fù)合物形成的條件下將生物學樣品與所述多肽一起溫育；并(c)測定是否形成包含所述多肽的抗體_抗原復(fù)合物?？梢栽隗w外或體內(nèi)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中使用本文所公開的VHZ多肽、變體、同源物、片段和衍生物以研究它們相應(yīng)的基因及其同源物在細胞功能(包括它們在疾病中的功能)中的作用。例如，可以將截短的或經(jīng)修飾的多肽導(dǎo)入細胞中以破壞細胞中發(fā)生的正常功能?？梢酝ㄟ^自重組表達載體原位表達多肽來將多肽導(dǎo)入細胞中(參見下文)。任選地，表達載體攜帶誘導(dǎo)型啟動子，以便控制多肽的表達。合適的宿主細胞諸如昆蟲細胞或哺乳動物細胞的使用提供此類翻譯后修飾(例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，其可能是對重組表達產(chǎn)物賦予最佳生物學活性所需要的?？梢栽跍y定系統(tǒng)中使用其中表達本文所公開的VHZ多肽、變體、同源物、片段和衍生物的此類細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，以鑒定干擾或增強多肽在細胞中的功能的候選物質(zhì)。本文所描述的方法和組合物可以采用VHZ多核苷酸、VHZ核苷酸和VHZ核酸，以及這些中任一種的變體、同源物、衍生物和片段，作為用于檢測VHZ表達水平的手段。另外，我們公開了對于本文所描述的診斷方法有用的特定VHZ片段。VHZ核酸還可以用于所描述的治療或預(yù)防方法。術(shù)語“VHZ多核苷酸”、“VHZ核苷酸”和“VHZ核酸”可以互換使用，并且應(yīng)當理解為明確包括cDNA和基因組VHZ序列兩者。這些術(shù)語還意圖包括能夠編碼VHZ多肽和/或其片段、衍生物、同源物或變體的核酸序列。在提及VHZ核酸時，這應(yīng)當理解為提及VHZ核酸家族的任何成員。特別感興趣的是選自下組的VHZ核酸NM_017823.3、NM_026725.2、XM_341156.3、XM_001170819.1、XM_001170835.1、XM_545747.2、NM_001082609.1、NM_001011371.1、NM_175732.1、NM_001039620.1、XM_001480680.1、XM_001117253.1或XM_001117256.1。還包括如下文“其它VHZ核酸序列”所列的任何一種或多種核酸序列。例如，VHZ核酸可以包含具有GenBank登錄號NM_017823.3的人VHZ序列。VHZ核酸可以用于多種手段，例如，向患有或者懷疑患有乳腺癌的個體施用以進行治療?？梢詸z測VHZ核酸的表達以診斷或檢測癌癥，特別是乳腺癌。也可以使用VHZ核酸來表達或生成VHZ多肽?！岸嗪塑账帷币话阒溉魏味嗪颂呛塑账峄蚨嗝撗鹾颂呛塑账?，其可以是未修飾的RNA或DNA或經(jīng)修飾的RNA或DNA?！岸嗪塑账帷卑ǖ幌抻趩捂満碗p鏈DNA，作為單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的混合物的DNA、單鏈和雙鏈RNA、及作為單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的混合物的RNA、包含DNA和RNA的雜合分子，其可以是單鏈或者，更通常的是雙鏈或單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的混合物。另外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA兩者的三鏈區(qū)。術(shù)語多核苷酸還包括含有一個或多個經(jīng)修飾的堿基的DNA或RNA和具有出于穩(wěn)定性或其它原因而修飾的主鏈的DNA或RNA?！敖?jīng)修飾的”堿基包括例如三苯甲基化堿基和不常見堿基諸如肌苷。已經(jīng)對DNA和RNA進行多種修飾；如此，“多核苷酸”涵蓋多核苷酸的以化學方式、酶促方式或代謝方式修飾的形式，如通常在自然界中找到的，以及病毒和細胞特征下的DNA和RNA化學形式?！岸嗪塑账帷边€涵蓋相對較短的多核苷酸，通常稱為寡核苷酸。熟練技術(shù)人員應(yīng)當理解的是，許多核苷酸序列可以由于遺傳密碼的簡并性而編碼相同多肽。如本文中所使用的，術(shù)語“核苷酸序列”指核苷酸序列、寡核苷酸序列、多核苷酸序列及其變體、同源物、片段和衍生物(諸如其部分)。核苷酸序列可以是基因組或合成或重組起源的DNA或RNA，其可以是雙鏈的或單鏈的，無論表示有義鏈還是反義鏈或其組合?？梢酝ㄟ^使用重組DNA技術(shù)(例如重組DNA)來制備術(shù)語核苷酸序列。術(shù)語“核苷酸序列”可以指DNA。其它核酸我們還提供了如下的核酸，其是VHZ核酸的片段、同源物、變體或衍生物。涉及VHZ核酸的術(shù)語“變體”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括一個(或多個)核酸自VHZ核苷酸序列的序列或向該序列的任意替代、變異、修飾、替換、刪除或添加。除非上下文另有承認，提及“VHZ”和“VHZ”包括提及VHZ的此類變體、同源物、衍生物和片段。所得的核苷酸序列可以編碼具有任何一種或多種VHZ活性的多肽。術(shù)語“同源物”可以意圖涵蓋關(guān)于結(jié)構(gòu)和/或功能的同一性，使得所得的核苷酸序列編碼具有VHZ活性的多肽。例如，VHZ的同源物等在乳腺癌細胞中比在正常的乳腺細胞中可以具有升高的表達水平。關(guān)于序列同一性(即相似性)，可以有至少70%，至少75%，至少85%或至少90%序列同一性。與相關(guān)序列(例如具有GenBank登錄號NM_017823.3的VHZ序列)可以有至少95%，諸如至少98%的序列同一性。這些術(shù)語還涵蓋所述序列的等位變異。變體、衍生物和同源物VHZ核酸變體、片段、衍生物和同源物可以包含DNA或RNA。它們可以是單鏈的或雙鏈的。它們還可以是如下的多核苷酸，所述多核苷酸在其內(nèi)包括合成的或經(jīng)修飾的核苷酸。對寡核苷酸進行的許多不同類型的修飾是本領(lǐng)域已知的。這些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯主鏈、在所述分子的3’和/或5’末端添加吖啶或多賴氨酸鏈。出于本文件的目的，應(yīng)當理解的是，可以通過本領(lǐng)域中可用的任何方法來修飾多核苷酸。可以實施此類修飾以增強感興趣的多核苷酸的體內(nèi)活性或壽命。若多核苷酸是雙鏈的，則本文所描述的方法和組合物涵蓋雙鏈體的兩條鏈，或是個別地或是組合地。若多核苷酸是單鏈的，則應(yīng)當理解的是，還包括該多核苷酸的互補序列。涉及核苷酸序列的術(shù)語“變體”、“同源物”或“衍生物”包括一個(或多個)核酸自序列或向序列的任意替代、變異、修飾、替換、刪除、或添加。所述變體、同源物或衍生物可以編碼具有生物學活性的多肽。VHZ的此類片段、同源物、變體和衍生物可以包含經(jīng)調(diào)控的活性，如上文所列的。如上文所指明的，關(guān)于序列同一性，“同源物”與相關(guān)序列(例如具有GenBank登錄號NM_017823.3的VHZ序列)可以具有至少5%同一性、至少10%同一性、至少15%同一性、至少20%同一性、至少25%同一性、至少30%同一性、至少35%同一性、至少40%同一性、至少45%同一性、至少50%同一性、至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、或至少95%同一性?？梢杂兄辽?5%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性或至少99%同一性?？梢匀缟衔乃枋龅哪菢舆M行核苷酸同一性比較?？梢允褂玫男蛄斜容^程序是上文所描述的GCGWisconsin最佳擬合程序。缺省評分矩陣具有如下的匹配值針對每個相同核苷酸的10和針對每個錯配的-9。缺省缺口產(chǎn)生罰分是-50，而缺省缺口延伸罰分是針對每個核苷酸的-3。雜交我們進一步描述了能夠與本文中呈現(xiàn)的任何序列，或其任何變體、片段或衍生物，或與上文任一種的互補物選擇性雜交的核苷酸序列。核苷酸序列的長度可以是至少15個核苷酸，諸如至少20、30、40或50個核苷酸。如本文中所使用的，術(shù)語“雜交”應(yīng)當包括“核酸鏈經(jīng)由堿基配對而與互補鏈結(jié)合的過程”以及如聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)中所實施的擴增過程。能夠與本文中呈現(xiàn)的核苷酸序列，或與其互補物選擇性雜交的多核苷酸可以與本文中呈現(xiàn)的相應(yīng)核苷酸序列(例如具有GenBank登錄號NM_017823.3的VHZ序列)至少40%同源、至少45%同源、至少50%同源、至少55%同源、至少60%同源、至少65%同源、至少70%同源、至少75%同源、至少80%同源、至少85%同源、至少90%同源、或至少95%同源。一般而言，此類多核苷酸可以在至少20個，諸如至少25或30個，例如至少40個、60個或100個或更多個連續(xù)核苷酸的區(qū)域里與相應(yīng)的核苷酸序列至少70%、至少80或90%或至少95%或98%同源。術(shù)語“可選擇性雜交的”指在如下條件下使用作為探針使用的多核苷酸，在所述條件下發(fā)現(xiàn)靶多核苷酸以顯著高于背景的水平與探針雜交。可能發(fā)生背景雜交，這是由于在例如所篩選的cDNA或基因組DNA文庫中存在其它多核苷酸。在此事件中，背景暗示通過探針與文庫的非特異性DNA成員之間的相互作用產(chǎn)生的信號水平，其是用靶DNA觀察到的特異性相互作用的強度的不到1/10，諸如不到1/100。例如，可以通過用例如32P或33P放射性標記探針或者用非放射性探針(例如熒光染料、生物素或洋地黃毒苷)測量相互作用的強度。雜交條件基于核酸結(jié)合復(fù)合物的解鏈溫度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology，第152卷，AcademicPress,SanDiegoCA)中所教導(dǎo)的，并且賦予限定的“嚴格性”，如下文所解釋的。最大限度的嚴格性通常于約Tm_5°C(探針的Tm下5°C)發(fā)生；高嚴格性在Tm下約5°C至10°C發(fā)生；中等嚴格性在Tm下約10°C至20°C發(fā)生；而低嚴格性在Tm下約20°C至25°C發(fā)生。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解的，可以使用最大限度的嚴格性雜交來鑒定或檢測相同的多核苷酸序列，而可以使用中等(或低)嚴格性雜交來鑒定或檢測相似的或相關(guān)的多核苷酸序列。我們提供了可以能夠在嚴格條件(例如65°C和0.IxSSC(IxSSC=0.15MNaCl、0.015M檸檬酸三鈉pH7.0))下與VHZ核酸、片段、變體、同源物或衍生物雜交的核苷酸序列。同源物、變體和衍生物的生成可以以許多方式來獲得與相關(guān)序列(例如具有GenBank登錄號NM_017823.3的人VHZ序列)不是100%相同但是也包括在內(nèi)的多核苷酸，以及VHZ的同源物、變體和衍生物?？梢酝ㄟ^例如探查自一系列個體例如來自不同群體的個體制備的DNA文庫來獲得所述序列的其它變體。例如，可以自其它個體或其它物種鑒定VHZ同源物。可以如下生成別的重組VHZ核酸和多肽，即鑒定同源物中的相應(yīng)位置，并合成或生成所述分子，如本文件中別處描述的。另外，可以獲得VHZ的其它病毒/細菌、或細胞同源物，特別是哺乳動物細胞(例如大鼠、小鼠、牛和靈長類細胞)中找到的細胞同源物，并且一般而言，此類同源物及其片段會能夠與人VHZ選擇性雜交。可以使用此類同源物來設(shè)計非人VHZ核酸、片段、變體和同源物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的手段來實施誘變以產(chǎn)生別的種類(variety)?？梢匀缦芦@得VHZ同源物的序列，即探查自其它動物物種制備的cDNA文庫或來自其它動物物種的基因組DNA文庫，并在中等至高嚴格性條件下用包含VHZ核酸、片段、變體和同源物之任一種的或VHZ的其它片段的整個或部分的探針探查此類文庫。類似的考慮適用于獲得本文所公開的多肽或核苷酸序列的物種同源物和等位變體。也可以使用簡并PCR來獲得變體和品系/物種同源物，所述簡并PCR會使用設(shè)計用于靶向變體和同源物內(nèi)編碼VHZ核酸序列內(nèi)保守氨基酸的序列的引物?？梢酝ㄟ^例如比對來自數(shù)種變體/同源物的氨基酸序列來預(yù)測保守序列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的計算機軟件來實施序列比對。例如，廣泛使用GCGWisconsinPileUp程序。簡并PCR中使用的引物會含有一個或多個簡并位置，并且會在如下的嚴格條件使用，所述嚴格條件低于那些用于用針對已知序列的單一序列引物克隆序列的嚴格條件。熟練技術(shù)人員應(yīng)當領(lǐng)會的是，來自遠親生物體的序列之間的總體核苷酸同源性有可能是非常低的，并且如此在這些情況中簡并PCR可以是選擇的方法，而不是用經(jīng)過標記的VHZ序列片段篩選文庫。另外，可以通過使用搜索算法諸如BLAST程序套件搜索核苷酸和/或蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫來鑒定同源序列?；蛘撸梢酝ㄟ^對已表征序列(例如VHZ核酸、或其變體、同源物、衍生物或片段)的定點誘變來獲得此類多核苷酸。這在如下情況中可以是有用的，即例如序列需要沉默密碼子變化來針對表達多核苷酸序列的特定宿主細胞優(yōu)化密碼子偏愛。其它序列變化可能是想要的，以便引入限制酶識別位點，或改變由多核苷酸編碼的多肽的特性或功能?？梢允褂帽疚乃枋龅亩嗪塑账醽砩梢?，例如PCR引物，用于備選(alternative)擴增反應(yīng)的引物，探針，例如使用放射性或非放射性標記物通過常規(guī)手段用顯示標記物標記的探針，或者可以將多核苷酸克隆入載體中。此類引物、探針和其它片段的長度會是至少8個、9個、10個、或15個，諸如至少20個，例如至少25個、30個或40個核苷酸，并且也包括在術(shù)語“多核苷酸”內(nèi)，如本文中所使用的?？梢砸灾亟M方式、合成方式、或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何手段來生成多核苷酸諸如DNA多核苷酸和探針。它們也可以通過標準技術(shù)來克隆?！愣?，會通過合成手段來生成引物，牽涉逐步制備想要的核酸序列，每次一個核苷酸。用于使用自動化技術(shù)實現(xiàn)此制備的技術(shù)是本領(lǐng)域容易獲得的。包含VHZ片段的引物在檢測VHZ表達諸如VHZ表達的上調(diào)(例如如與乳腺癌有關(guān)的)的方法中是特別有用的。可以自任何合適的VHZ區(qū)段生成適合于擴增VHZ的引物。可以使用的引物包括那些能夠擴增特異性的VHZ序列的引物。雖然可以獨立地提供VHZ引物，但是它們作為引物對(包含正向引物和反向引物)提供是最有用的。一般而言，會使用重組手段例如使用PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))克隆技術(shù)來生成較長的多核苷酸。這會牽涉制備一對引物(例如有約15至30個核苷酸)，使引物與自動物或人細胞獲得的mRNA或cDNA接觸，在引起想要的區(qū)域擴增的條件下實施聚合酶鏈式反應(yīng)，分離所擴增的片段(例如通過在瓊脂糖凝膠上純化反應(yīng)混合物)，并回收所擴增的DNA。引物可以設(shè)計成含有合適的限制酶識別位點，使得能將所擴增的DNA克隆入合適的克隆載體中。多核苷酸或引物可以攜帶顯示標記物。合適的標記物包括放射性同位素諸如32P或35s、洋地黃毒苷、熒光染料、酶標記物、或其它蛋白質(zhì)標記物諸如生物素。可以將此類標記物添加至多核苷酸或引物，并且可以通過使用本身已知的技術(shù)來檢測。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在基于核酸的測試中使用標記的或未標記的多核苷酸或引物或其片段以檢測人體或動物體中的多核苷酸或?qū)ζ錅y序。此類用于檢測的測試一般包括使含有DNA或RNA的生物學樣品在雜交條件下與包含多核苷酸或引物的探針接觸，并檢測探針與樣品中的核酸之間形成的任何雙鏈體?？梢允褂弥T如PCR的技術(shù)或者如下來實現(xiàn)此類檢測，即在固體支持物上固定化探針，除去樣品中不與探針雜交的核酸，然后檢測已經(jīng)與探針雜交的核酸?；蛘?，可以在固體支持物上固定化樣品核酸，并可以檢測與此支持物結(jié)合的探針量。這種和其它形式的合適測定方法可以參見例如W089/03891和W090/13667。用于對核苷酸(例如VHZ核酸)測序的測試牽涉使含有靶DNA或RNA的生物學樣品在雜交條件下與包含多核苷酸或引物的探針接觸，并通過例如Sanger雙脫氧鏈終止方法(參見Sambrook等)來測定序列。此方法一般包括在存在合適的試劑的情況中通過合成與靶DNA或RNA互補的鏈來延伸引物，并在一個或多個A、C、G或T/U殘基處選擇性終止延伸反應(yīng)；容許發(fā)生鏈延伸和終止反應(yīng)；依照大小將所延伸的產(chǎn)物分開以測定已經(jīng)發(fā)生選擇性終止的核苷酸的序列。合適的試劑包括DNA聚合酶，脫氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP，緩沖液和ATP。使用雙脫氧核苷酸進行選擇性終止。VHZ控制區(qū)出于一些目的，可能有必要利用或調(diào)查VHZ的控制區(qū)。此類控制區(qū)包括啟動子、增強子和基因座控制區(qū)。控制區(qū)指能夠調(diào)控與其可操作連接的編碼序列的表達的核酸序列或結(jié)構(gòu)。例如，控制區(qū)在生成表達VHZ的轉(zhuǎn)基因動物中是有用的。此外，可以使用控制區(qū)來生成VHZ的表達構(gòu)建體。這在下文更為詳細地進行描述。VHZ控制區(qū)的鑒定是直接的，并且可以以多種方式實施。例如，可以如下自生物體獲得VHZ的編碼序列，即使用人或小鼠VHZcDNA序列作為探針來篩選cDNA文庫?？梢酝ㄟ^篩選合適的基因組文庫，或者通過如本領(lǐng)域中已知的引物延伸來獲得5’序列。也可以采用基因組數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)庫搜索。特別感興趣的此類5’序列包括非編碼區(qū)。可以通過目視或者借助于計算機程序來檢查5’區(qū)以鑒定指明啟動子和/或增強子區(qū)存在的序列基序。此外，可以進行來自兩種或更多種生物體的VHZ核酸序列的序列比對。通過比對來自不同物種的VHZ序列，有可能確定氨基酸序列的哪個區(qū)域在不同物種之間是保守的。此類保守區(qū)可能含有所討論的基因(即VHZ)的控制區(qū)。出于此目的可以采用如本文所公開的小鼠和人基因組序列，例如小鼠VHZ基因組序列。此外，可以使用標準的篩選方法來獲得來自其它生物體的VHZ同源物，其使用自小鼠和人VHZ序列生成的合適探針來實現(xiàn)。也可以篩選河豚(紅鰭東方飩(Takifugurubripes))或斑馬魚的基因組來鑒定VHZ同源物；如此，已經(jīng)鑒定出數(shù)種斑馬魚VHZ序列(上文所記錄的)?？梢允褂煤与嗷虬唏R魚VHZ基因與小鼠或人基因組VHZ序列的5’非編碼區(qū)比較來鑒定含有控制區(qū)的保守區(qū)。也可以進行刪除研究來鑒定VHZ的啟動子和/或增強子區(qū)?？梢酝ㄟ^分子生物學實驗來證實推定的控制區(qū)的身份，其中將候選序列與報告基因連接，并檢測報告物的表達。檢測和診斷方法VHZ表達的檢測我們在實施例中顯示了，在與正常的乳腺組織相比時，乳腺癌組織中的VHZ表達是上調(diào)的。因而，我們提供了一種診斷癌癥(包括乳腺癌諸如轉(zhuǎn)移性、攻擊性或侵入性乳腺癌)的方法，包括在個體的細胞或組織中檢測VHZ表達的調(diào)控，諸如VHZ表達的上調(diào)。可以使用VHZ表達、活性或量的檢測來提供一種測定細胞增殖狀態(tài)的方法。如此，增殖性細胞是與正常細胞相比具有高水平的VHZ表達、活性或量的細胞。類似地，非增殖性細胞可以是與正常細胞相比具有低水平VHZ表達、活性或量的細胞。也可以使用此檢測來測定細胞是否會變?yōu)榍秩胄缘幕蚬粜缘?。如此，在細胞中檢測出高水平的VHZ表達、量或活性可以指明該細胞有可能是或有可能變?yōu)楣粜缘?、轉(zhuǎn)移性的或侵入性的。類似地，若細胞具有低水平的VHZ表達、量或活性，則所述細胞不是或者不太可能是攻擊性的、轉(zhuǎn)移性的或侵入性的。應(yīng)當領(lǐng)會的是，若VHZ的水平隨腫瘤的攻擊性而變化，則也可以使用VHZ表達、量或活性的檢測來預(yù)測患有癌癥的個體的存活率，即高水平的VHZ指明較低的存活率或概率，而低水平的VHZ指明較高的存活率或概率，兩者都如與具有正常水平的VHZ的個體或關(guān)聯(lián)群體相比的。因此，VHZ表達、量或活性的檢測可以作為對患有癌癥的個體預(yù)后的方法使用?？梢允褂肰HZ表達、量或水平的檢測來測定特定療法在患有癌癥的個體中成功的可能性。它可以在測定個體中的腫瘤是否是或者是否有可能是侵入性或轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法中使用。本文件中所描述的診斷方法可以與所描述的治療方法組合。如此，我們提供了一種在個體中治療、預(yù)防或減輕癌癥的方法，該方法包括檢測所述個體的細胞中的VHZ的表達、量或活性的調(diào)控，并基于所述腫瘤的攻擊性來向所述個體施用合適的療法。所述療法可以包含如上文所描述的抗VHZ劑。典型地，使用對乳房身體檢查和乳房X線照相術(shù)來檢測乳腺癌。通常采集腫瘤活檢來進行組織病理學檢查以診斷乳腺癌?？梢允褂肰HZ表達、量或活性的檢測與標準的組織病理學規(guī)程一起來診斷乳腺癌，或進一步證實乳腺癌的診斷。這在組織病理學分析沒有產(chǎn)生清晰結(jié)果時可以是特別有用的。可以在樣品中檢測VHZ多肽和核酸的存在和數(shù)量，如下文更為詳細地描述的。如此，可以通過如下方法來診斷VHZ相關(guān)疾病(包括乳腺癌)，所述方法包括從自受試者衍生的樣品測定VHZ多肽或VHZmRNA的異常降低或升高的表達、量或活性，諸如升高的表達、量或活性。所述樣品可以包含來自患有或懷疑患有與升高的、降低的或在其它方面異常的VHZ表達、量或活性(包括表達、量或活性的水平或樣式的空間或時間變化)有關(guān)的疾病的生物體或個體的細胞或組織樣品。比較患有或懷疑患有此類疾病的生物體中的VHZ表達、量或活性的水平或樣式與正常生物體中的表達、量或活性的水平或樣式可以有效作為診斷疾病的手段。所述樣品可以包含來自患有或懷疑患有乳腺癌的個體的細胞或組織樣品，諸如乳房組織或細胞樣品。在一些實施方案中，在樣品中檢測出VHZ的表達、量或活性水平升高。在與正常細胞或已知不是癌性的細胞相比時，VHZ的水平可以是程度顯著地升高的?？梢宰运鶞y試的個體，或另一名個體諸如那些與所測試個體在年齡、體重、生活方式等方面匹配的個體獲得此類細胞。在一些實施方案中，VHZ的表達、量或活性水平升高10%、20%、30%或40%或更多。在一些實施方案中，VHZ的表達、量或活性水平升高45%或更多，諸如50%或更多，如通過cDNA雜交所判斷的?？梢砸远喾N方式來檢測VHZ的表達、量或活性，如本領(lǐng)域中已知的，和如下文更為詳細地描述的。通常，測量來自個體的組織樣品中的VHZ量，并與來自不受影響的個體的樣品比較。可以測量VHZ核酸以及VHZ多肽水平兩者?？梢允褂肰HZ量、活性或表達的檢測來對乳腺癌分級。例如，高水平的VHZ量、活性或表達可以指明攻擊性、侵入性或轉(zhuǎn)移性癌癥。類似地，低水平的VHZ量、活性或表達可以指明非攻擊性、非侵入性或非轉(zhuǎn)移性癌癥。此分級系統(tǒng)可以與已經(jīng)建立的分級系統(tǒng)諸如Elston-Ellis改良的Scarff，Bloom，Richardson分級系統(tǒng)(也稱為Nottingham分級系統(tǒng)(NGS))(5,6,Haybittle等，1982)一起使用。此系統(tǒng)是研究最多且廣泛使用的乳房腫瘤分級方法。NGS基于表型評分規(guī)程，其牽涉對腫瘤細胞的形態(tài)學和細胞學特征進行顯微鏡檢查評估，包括小管形成的程度、細胞核多形性和有絲分裂計數(shù)(6)。這些得分的總和將乳房腫瘤分層成等級I(Gl)(充分分化的、緩慢生長中的)、等級II(G2)(中等分化的)、和等級III(G3)(較差分化的、高度增殖性的)惡性腫瘤。可以使用許多不同技術(shù)來測定VHZ基因表達的水平。在RNA水平測量VHZ的表達可以在RNA水平檢測VHZ基因表達。因此，在一個實施方案中，我們公開了一種在樣品中檢測包含VHZ核酸的核酸的存在的方法，其如下進行，即使所述樣品與對VHZ核酸特異性的至少一種核酸探針接觸，并對所述樣品監(jiān)測VHZ核酸的存在。例如，所述核酸探針可以特異性結(jié)合VHZ核酸，或其一部分，并檢測兩者之間的結(jié)合；也可以檢測復(fù)合物自身的存在。如此，在一個實施方案中，可以在樣品中測量VHZmRNA形式的VHZ核酸的量?？梢酝ㄟ^原位雜交、Northern印跡和逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應(yīng)來測定VHZmRNA?？梢酝ㄟ^原位雜交、Southern印跡、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、PCR擴增和DNA芯片分析來鑒定核酸序列，其使用特異性引物(Kawasaki，1990；Sambrook,1992；Lichter等，1990；Orita等，1989；Fodor等，1993；Pease等，1994)?？梢允褂肦NA提取技術(shù)(包括例如使用酸性酚/胍異硫氰酸鹽提取(RNAzolB；Biogenesis)或RNeasyRNA制備試劑盒(Qiagen))自細胞提取VHZRNA。利用核糖核酸雜交的典型測定形式包括核連綴測定法(nuclearrun-onassay)、RT-PCR和RNA酶保護測定法(Melton等，Nuc.AcidsRes.127035)?？梢圆捎玫臋z測方法包括放射性標記物、酶標記物、化學發(fā)光標記物、熒光標記物和其它合適的標記物。這每一種方法容許進行定量測定，并且是本領(lǐng)域公知的。因此，可以使用本領(lǐng)域公知的對多核苷酸定量的任何方法在RNA水平測量降低的或升高的VHZ表達、量或活性?？梢允褂脕碜訴HZ序列的任何合適的探針(例如合適的人VHZ序列的任何部分)作為探針。用于設(shè)計VHZ探針的序列可以包括具有登錄號NM_015472的序列，或其部分。典型地，使用RT-PCR來擴增RNA靶物。在此方法中，使用逆轉(zhuǎn)錄酶來將RNA轉(zhuǎn)變成互補DNA(cDNA)，然后可以擴增所述互補DNA以便于檢測。許多DNA擴增方法是已知的，其中大多數(shù)依賴于酶促鏈式反應(yīng)(諸如聚合酶鏈式反應(yīng)、連接酶鏈式反應(yīng)、或自主序列復(fù)制)或者復(fù)制它被克隆其中的載體的整個或部分。許多靶物和信號擴增方法已經(jīng)記載于文獻中，例如這些方法的一般性綜述記載于Landegren,U.等，Science242:229_237(1988)禾口Lewis,R.,GeneticEngineeringNews101,54-55(1990)。例如，可以采用聚合酶鏈式反應(yīng)來檢測VHZmRNA。“聚合酶鏈式反應(yīng)”或“PCR”是一種核酸擴增方法，其特別記載于美國專利號4，683，195和4，683，202。在診斷背景中可以使用PCR來擴增任何已知的核酸(Mok等，1994，GynaecologicOncology52:247-252)。自主序列復(fù)制(3SR)是TAS的變型，其牽涉經(jīng)由由酶混合物和合適寡核苷酸引物介導(dǎo)的連續(xù)多輪逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、聚合酶和核酸酶活性來等溫擴增核酸模板(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA871874)。連接擴增反應(yīng)或連接擴增系統(tǒng)使用DNA連接酶和4種寡核苷酸，每條靶鏈兩種。此技術(shù)記載于Wu，D.Y.^Wallace,R.B.,1989,Genomics4:560。在Q3復(fù)制酶技術(shù)中，使用噬菌體Qβ的RNA復(fù)制酶(其復(fù)制單鏈RNA)來擴增靶DNA,如記載于Lizardi等，1988，Bio/Technology61197的。PCR規(guī)程基本上牽涉(1)處理所提取的DNA以形成單鏈互補鏈；(2)添加一對寡核苷酸引物，其中該對中的一條引物與有義鏈中的序列的一部分基本上互補，而每對中的另一條引物與互補反義鏈中的相同序列的不同部分基本上互補；(3)使配對引物與互補序列退火；(4)從每條引物的3’末端同時延伸退火的引物以合成與每條引物退火的鏈互補的延伸產(chǎn)物，其中所述延伸產(chǎn)物在與互補物分開后充當用于針對每對中的另一條引物合成延伸產(chǎn)物的模板；(5)分開所述延伸產(chǎn)物與所述模板以生成單鏈分子；并(6)通過重復(fù)至少一次所述退火、延伸和分開步驟來擴增所述單鏈分子?？梢圆捎媚孓D(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)。也可以使用定量RT-PCR。此類PCR技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并且可以采用來自VHZ序列的任何合適的引物。也可以利用備選的擴增技術(shù)。例如，滾環(huán)擴增(Lizardi等，1998，NatGenetl9225)是由DNA聚合酶驅(qū)動且能在等溫條件下以線性或幾何動力學復(fù)制環(huán)狀寡核苷酸探針的商品化擴增技術(shù)(RCATTM)。一種別的技術(shù)，即鏈置換擴增(SDA;Walker等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:392)以對特定靶物獨特的明確限定的序列開始。在多肽水平測量VHZ表達可以在多肽水平檢測VHZ表達。因此，在又一個實施方案中，可以通過檢測樣品中VHZ多肽的存在或量來檢測VHZ表達、量或活性。這可以是通過使用結(jié)合VHZ多肽的分子來實現(xiàn)的。直接或間接結(jié)合VHZ多肽以便檢測其存在的合適分子/試劑包括天然存在的分子諸如肽和蛋白質(zhì)，例如抗體，或者它們可以是合成分子。如此，我們公開了一種檢測VHZ多肽的存在的方法，即使細胞樣品與能夠結(jié)合所述多肽的抗體接觸，并對所述樣品監(jiān)測所述多肽的存在。例如，可以使用抗VHZ抗體來檢測VHZ多肽?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的手段(如下文更為詳細地描述的)來制備此類抗體。例如，抗VHZ抗體可以包含任何針對VHZ的商品化抗體，諸如但不限于雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號LS-C32281，氨基酸35至90，LS-C42458,LS-A6806和LS-A6803，LS-C32281,LifeSpanInc,Seattle,Washington,USA)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號DS-PB-00676，RayBiotechInc,Norcross,Georgia,USA)、雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號XW-7857，ProSciIncorporated,Poway,California,USA)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號F4560和D9840-66A，UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)、雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號D9840-66，UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號AHPl142,AdBSerotec,Oxford,UnitedKingdom)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號NBl10-40452,NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)、雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號NB100-75328，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)。這可以方便地通過監(jiān)測抗體與多肽之間形成的復(fù)合物的存在，或者監(jiān)測多肽與抗體之間的結(jié)合來實現(xiàn)。檢測兩個實體之間的結(jié)合的方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)、表面等離振子共振等?？梢允褂脴藴实膶嶒炇壹夹g(shù)諸如如上文所描述的免疫印跡來檢測VHZ蛋白水平改變，如與相同細胞群體中的未處理細胞相比的。也可以通過檢測VHZ多肽的翻譯后加工或VHZ核酸的轉(zhuǎn)錄后修飾的變化來測定基因表達。例如，可以測量VHZ多肽的差異磷酸化、對VHZ多肽的切割或?qū)HZRAN的可變剪接等?？梢允褂脤Ｓ械牡鞍踪|(zhì)測定法或技術(shù)諸如2D聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測基因產(chǎn)物諸如VHZ多肽的表達水平以及它們的翻譯后修飾?？梢杂糜跍y定VHZ蛋白在自宿主衍生的樣品中的水平的測定技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來對抗體測定免疫特異性結(jié)合?？梢允褂玫拿庖邷y定法包括但不限于使用如下技術(shù)的競爭性和非競爭性測定系統(tǒng)，諸如Western印跡、放射性免疫測定法、ELISA、三明治式免疫測定法、免疫沉淀測定法、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴散沉淀素反應(yīng)、免疫擴散測定法、凝集測定法、補體結(jié)合測定法、免疫放射計量測定法、熒光免疫測定法和蛋白A免疫測定法。此類測定法是本領(lǐng)域中常規(guī)的(參見例如Ausubel等編，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology，第1卷，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，通過提及而完整收入本文)。可以通過免疫組織化學和免疫細胞化學染色來對標本測定多肽/蛋白質(zhì)(一般參見Stites禾口Terr，BasicandClinicalImmunology，AppletonandLange，1994)、ELISA、RIA、免疫印跡、Western印跡、免疫沉淀、功能測定法和蛋白質(zhì)截短測試。其它測定方法包括放射性免疫測定法、競爭性結(jié)合測定法、Western印跡分析和ELISA測定法。ELISA測定法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢栽跍y定法中使用多克隆和單克隆抗體兩者。若合適的話，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它免疫測定法，諸如放射性免疫測定法(RIA)?？捎玫拿庖邷y定法廣泛記載于專利和科學文獻中。參見例如美國專利號3，791，932；3，839，153；3，850，752；3，850，578；3，853，987；3，867，517；3，879，262；3，901，654；3，935，074；3，984，533；3，996，345；4，034，074；4，098，876；4，879，219；5，011，771和5，281，521以及Sambrook等，1992。診斷試劑盒我們還提供了用于檢測個體中的乳腺癌或個體中對乳腺癌的易感性的診斷試劑品.ο診斷試劑盒可以包含用于檢測個體中的VHZ表達、量或活性的手段，其通過如本文件中所描述的任何手段來進行。因此，診斷試劑盒可以包含下列任何一種或多種VHZ多核苷酸或其片段；VHZ核酸的或其片段的互補核苷酸序列；VHZ多肽或其片段，或針對VHZ的抗體，諸如包含針對VHZ的抗VHZ抗體，例如抗肽抗體人VHZ抗體。診斷試劑盒可以包含使用指令或其它指示(indicia)。診斷試劑盒可以進一步包含用于治療或預(yù)防乳腺癌的手段，諸如本文件中所描述的任何組合物，或本領(lǐng)域已知的用于治療乳腺癌的任何手段。具體地，診斷試劑盒可以包含如所描述的抗VHZ劑，例如通過篩選獲得的。診斷試劑盒可以包含治療藥物諸如他莫昔芬(Tamoxifen，Nolvadex)或其變體諸如他莫昔芬、檸檬酸他莫昔芬或任何其它的抗雌激素或雌激素阻斷劑。治療藥物也可以包含抗VHZ抗體。預(yù)防和治療方法我們公開了治療與VHZ表達或活性的量不足有關(guān)的異常狀況諸如乳腺癌的方法。預(yù)防乳腺癌(即防范)的方法也適合采用相同或類似的辦法。一般而言，我們的方法牽涉通過調(diào)控(諸如下調(diào))細胞中的VHZ表達、量或活性來操作癌細胞?？梢栽诓僮鞑襟E前或后進行檢測細胞中調(diào)控的VHZ表達、量或活性的步驟。檢測步驟可以檢測上調(diào)的或下調(diào)的VHZ表達、量或活性。可以使用調(diào)控或下調(diào)VHZ的任何方法，如本文件中別處詳細描述的。所述方法可以包括將細胞暴露于合適的siRNA、shRNA或嵌合RNAi。例如，可以采用DUSP23預(yù)先設(shè)計嵌合RNAi(產(chǎn)品目錄編號H00054935-R01，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)來下調(diào)VHZmRNA表達。嵌合RNA干擾(嵌合RNAi)是小干擾RNA/DNA嵌合物觸發(fā)對初始基因mRNA的破壞的過程。嵌合RNAi詳細記載于Ui-TeiK等，2008，NucleicAcidsRes·，2008年4月；36:2136_2151，Naito等NucleicAcidsRes.,2005年7月；33:W589-W591,Ui-TeiK等，2004，NucleicAcidsRes.2004年2月9日；32(3):936-48及Naito等NucleicAcidsRes.2004年7月1日；32(網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器期號)W124-9。所述方法可以包括將細胞暴露于能夠特異性結(jié)合VHZ的抗VHZ抗體。此類抗體可以包括任何商品化的抗VHZ抗體，如上文所列出的。依照我們的方法，由于所述操作，癌細胞變?yōu)榉前┬缘幕蛘咔秩胄曰蜣D(zhuǎn)移性癌細胞變?yōu)榉乔秩胄缘幕蚍寝D(zhuǎn)移性的。具體地，癌癥可以包括乳腺癌。它可以包括侵入性或轉(zhuǎn)移性癌癥諸如侵入性導(dǎo)管癌(IDC)。因為VHZ與癌癥的攻擊性和侵入性有關(guān)，可以在患有癌癥的個體的細胞中、在癌或非癌細胞中檢測VHZ的水平，并且評估癌癥的攻擊性。與正常的細胞相比高水平的VHZ量、表達或活性指明攻擊性或侵入性癌癥，因此可需要和選擇更強的或更嚴厲的療法。類似地，較低水平可指明攻擊性或侵入性較小的療法。—般而言，可以使用本文所描述的辦法來治療任何VHZ相關(guān)疾病。VHZ相關(guān)疾病包括增殖性疾病，并且特別包括癌癥。例如，VHZ相關(guān)疾病可以包括乳腺癌，諸如轉(zhuǎn)移性、侵入性或攻擊性乳腺癌。若相對于對照而言與疾病有關(guān)的狀況受到顯著抑制(即達50%或更多)，則VHZ相關(guān)疾病被定義為得到“治療”。所述抑制相對于對照而言可以達至少75%，諸如相對于對照而言達90%、95%或100%。所述狀況可以包括細胞增殖，或者它可以包括細胞周期時間、細胞數(shù)目、細胞遷移、細胞侵入性等。術(shù)語“治療/處理”還包括預(yù)防或減輕癌癥。VHZ多肽表示療法抑制其功能的靶物，特別是在腫瘤細胞和其它增殖性細胞中。術(shù)語增殖性病癥在本文中以廣義使用，包括需要控制細胞周期的任何病癥。具體地，增殖性病癥包括惡性的和腫瘤發(fā)生前的(pre-neoplastic)病癥。本文所描述的方法和組合物涉及治療或診斷腺癌是特別有用的，諸如小細胞肺癌、和腎癌、子宮癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和乳腺癌。例如，可治療的惡性腫瘤包括急性和慢性白血病(leukaemia)、淋巴瘤(lymphoma)、骨髓瘤(myeloma)、肉瘤(sarcomas)諸如纖維肉瘤(fibrosarcoma)、粘液肉瘤(myxosarcoma)、月旨肪肉瘤(Iiposarcoma)、淋巴管內(nèi)皮肉瘤(Iymphangioendotheliosarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、內(nèi)皮肉瘤(endotheliosarcoma)、軟骨肉瘤(chondrosarcoma)、骨源性肉瘤(osteogenicsarcoma)、脊索瘤(chordoma)、淋巴管肉瘤(Iymphangiosarcoma)、滑膜瘤(synovioma)、間皮瘤(mesothelioma)、平滑肌肉瘤(Ieimyosarcoma)、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、結(jié)腸癌(coloncarcinoma)、卵巢癌(ovariancancer)、前列腺癌(prostatecancer)、胰腺癌(pancreaticcancer)、乳腺癌(breastcancer)、鱗狀細胞癌(squamouscellcarcinoma)、基底細胞癌(basalcellcarcinoma)、腺癌(adenocarcinoma)、汗腺癌(sweatglandcarcinoma)、皮脂腺癌(sebaceousglandcarcinoma)、乳頭狀癌(papillarycarcinoma)、乳頭狀腺癌(papillaryadenocarcinomas)、囊腺癌間(cystadenocarcinoma)、髓樣癌(medullarycarcinoma)、支氣管癌(bronchogeniccarcinoma)、絨毛膜癌(choriocarcinoma)、腎細胞癌(renalcellcarcinoma)、肝瘤(hepatoma)、膽管癌(bileductcarcinoma)、精原細胞瘤(seminoma)、胚胎性癌(embryonalcarcinoma)、宮頸癌(cervicalcancer)、辜丸腫瘤(testiculartumour)、肺癌(lungcarcinoma)、小細胞月市癌(smallcelllungcarcinoma)、月旁月光癌(bladdercarcinoma)、上皮癌(epithelialcarcinoma)、膠質(zhì)瘤(glioma)、星形細胞瘤(astrocytoma)、室管膜瘤(ependymoma)>松果體瘤(pinealoma)、成血管細胞瘤(hemangioblastoma)、聽神經(jīng)瘤(acousticneuoma)、髓母細胞瘤(medulloblastoma)、顱咽管瘤(craniopharyngioma)、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤(oligodendroglioma)、腦膜瘤(menangioma)、黑素瘤(melanoma)、成神經(jīng)細胞瘤(neutroblastoma)和視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma)。一種有可能用于治療此類病癥的辦法是表達針對如本文所描述的VHZ多核苷酸的反義構(gòu)建體，并向腫瘤細胞施用它們，以便抑制基因功能，并阻止腫瘤細胞生長或行進?？梢允褂梅戳x構(gòu)建體來抑制基因功能以阻止增殖性細胞的生長或行進。反義構(gòu)建體，即與有義核酸或mRNA互補的核酸諸如RNA構(gòu)建體詳細記載于US6，100，090(Monia等)及Neckers等，1992，CritRevOncog3(1-2):175_231，通過提及而明確收入所述文件的教導(dǎo)。在一個具體的例子中，可以如下治療或預(yù)防乳腺癌，即通過例如能夠結(jié)合和破壞VHZmRNA的siRNA來完全或部分降低VHZ的量、表達或活性。我們明確提供了一種通過RNA干擾來下調(diào)VHZ的抗VHZ劑?？筕HZ劑可以包含小干擾RNA(siRNA)或短發(fā)夾RNA(shRNA)。它可以包含嵌合RNAi諸如DUSP23預(yù)先設(shè)計嵌合RNAi(產(chǎn)品目錄編號H00054935-R01，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)。RNA干擾(RNAi)是一種通過直接引入雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)的方法，并且已經(jīng)顯現(xiàn)為用于敲除多種生物體中的特定基因的表達的有用工具。RNAi記載于Fire等，Nature391:806_811(1998)。PTGS的其它方法是已知的，并且包括例如引入轉(zhuǎn)基因或病毒。一般而言，在PTGS中，所沉默的基因的轉(zhuǎn)錄物被合成但不積累，因為其被快速降解。用于PTGS的方法(包括RNAi)記載于例如Ambion.com萬維網(wǎng)網(wǎng)站，在目錄“/hottopics/”中，在“rnai”文件中。本文中描述了適用于體外RNAi的方法。一種此類方法牽涉引入siRNA(小干擾RNA)。當前的模型指明這些21-23個核苷酸的dsRNA能誘導(dǎo)PTGS。用于設(shè)計有效的siRNA的方法記載于例如上文所描述的Ambion網(wǎng)站。RNA前體諸如短發(fā)夾RNA(shRNA)也可以由整個或部分VHZ核酸序列編碼?；蛘撸p鏈(ds)RNA是一種干擾一系列生物體中的基因表達的有力方式，最近已經(jīng)顯示了其在哺乳動物中是成功的(Wianny和Zernicka-Goetz，2000，NatCellBiol270-75)。可以將對應(yīng)于VHZ多核苷酸序列的雙鏈RNA導(dǎo)入候選生物體的卵母細胞和細胞中或者在其中進行表達以干擾VHZ活性。調(diào)控VHZ基因表達的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括顯性負性辦法。如此，另一種辦法是使用本文件中的VHZ多肽的非功能性變體，其與內(nèi)源基因產(chǎn)物競爭，導(dǎo)致功能抑制。VHZ的非功能性變體的一個例子是人序列(或?qū)?yīng)人序列)的第95位半胱氨酸突變。實施例顯示磷酸酶和相關(guān)生物學活性缺陷的VHZC95S變體的生成和使用。也可以通過引入抑制基因表達或功能活性的肽或小分子來調(diào)控VHZ基因表達。如此，可以向腫瘤或增殖性細胞施用通過本文所描述的測定法鑒定為結(jié)合或調(diào)控諸如下調(diào)VHZ多肽的量、活性或表達的化合物以阻止VHZ多肽的功能?？梢耘c藥學可接受載體一起以有效下調(diào)VHZ表達或活性的量施用此類化合物，或者通過活化或下調(diào)控制VHZ表達、活性或量的第二信號，由此減輕異常狀況。針對如本文中所描述的VHZ多肽的合適抗體也可以作為治療劑使用?？筕HZ抗體可以包含針對VHZ的家兔抗VHZ抗體。此外，抗VHZ抗體可以包含下列任何一項或多項雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號LS-C32281，氨基酸35至90，LS-C42458，LS-A6806和LS-A6803,LS-C32281,LifeSpanInc,Seattle,Washington,USA)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號DS-PB-00676，RayBiotechInc,Norcross,Georgia,USA)、雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號XW-7857，ProSciIncorporated,Poway,California,USA)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)BnngF4560禾口D9840—66Α，UnitedStatesBiological，Swampscott,Massachusetts,USA)、雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號D9840-66，UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號AHP1142，AdBSerotec,Oxford,UnitedKingdom)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號NB110-40452，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)、雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號NB100-75328，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)?；蛘?，可以采用基因療法來控制受試者中相關(guān)細胞諸如乳房細胞進行的VHZ內(nèi)源生成。例如，可以工程化改造編碼VHZsiRNA或其一部分的多核苷酸以在復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中表達，如下文所討論的。然后可以分離逆轉(zhuǎn)錄病毒表達構(gòu)建體，并導(dǎo)入用含有編碼抗VHZsiRNA的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的包裝細胞中，使得所述包裝細胞此刻生成含有感興趣序列的感染性病毒顆粒?？梢越o受試者施用這些生產(chǎn)細胞以在體內(nèi)工程化改造細胞，并在體內(nèi)調(diào)控VHZ多肽的表達。關(guān)于基因療法的綜述，參見第20章，GeneTherapyandotherMolecularGenetic-basedTherapeuticApproaches,(及其中所弓I用的參考文獻)于HumanMolecularGenetics,TStrachan禾口APRead,BIOSScientificPublishersLtd(1996)。在一些實施方案中，VHZ的水平在乳房細胞中降低。此外，在此類實施方案中，治療可以靶向乳房細胞，或者是對乳房細胞特異性的。VHZ的表達可以僅在患病的乳房細胞(即那些癌性細胞)中特異性降低，而在其它不患病的乳房細胞中基本上不降低。在這些方法中，VHZ的表達在其它細胞(即非乳房細胞的細胞)中基本上不降低。如此，在此類實施方案中，VHZ的水平在治療過程中或者在治療后在非乳房細胞中保持基本上相同或相似。可以通過靶向施用，即僅向乳房細胞而非其它細胞應(yīng)用治療來實現(xiàn)乳房細胞特異性的VHZ水平降低。然而，在其它實施方案中，采用乳房細胞中(而基本上不在其它細胞或組織類型中)的VHZ表達下調(diào)。此類方法可以有利地利用乳房特異性表達載體來進行例如siRNA的乳房特異性表達，如下文更為詳細地描述的。轉(zhuǎn)基因(抗VHZsiRNA)的乳房特異性表達癌基因療法不得不選擇性靶向腫瘤組織從而降低正常組織中的不想要的副作用。將轉(zhuǎn)基因表達靶向惡性組織需要使用特定的調(diào)控元件，包括基于腫瘤生物學的啟動子、組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型調(diào)控元件(Al)?；谀[瘤生物學的啟動子某些基因在乳腺癌中是上調(diào)的。可以使用這些基因的啟動子來驅(qū)動轉(zhuǎn)基因的腫瘤選擇性表達，其使用重組復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來實現(xiàn)。此類基因的例子包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長因子受體-I(VEGFR-I)和VEGFR-2，已知它們在乳腺癌中以腫瘤階段依賴性方式上調(diào)(A2)。c_erbB2癌基因在乳腺癌中選擇性上調(diào)(A3，A6)。L-絲束蛋白(plastin)、人肌動蛋白結(jié)合蛋白在惡性上皮細胞中而不是正常組織中(只是在成熟的造血細胞中有低水平表達)進行組成型且豐富的表達(A4)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了抗凋亡基因Bcl-2在乳腺癌細胞中上調(diào)(A5)。與正常的乳房組織相比，人乳房腫瘤表達高水平的MUCl(A7)。組織特異性啟動子某些基因在乳房組織中特異性表達。此類基因的例子是人α-乳清蛋白(ALA)和綿羊乳球蛋白(BLG)?？梢允褂么祟惢虻膯幼觼眚?qū)動腺病毒載體中的轉(zhuǎn)基因以乳腺癌細胞特異性方式表達(Α8)?？梢酝ㄟ^修改對此組織具有親和力的病毒諸如小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)來進行乳腺癌的基因療法。可以使用此逆轉(zhuǎn)錄病毒的糖皮質(zhì)激素響應(yīng)性長末端重復(fù)(LTR)作為啟動子用于轉(zhuǎn)基因的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的表達(Α9)。誘導(dǎo)型啟動子使用誘導(dǎo)型啟動子作為瞬時轉(zhuǎn)基因表達的介導(dǎo)物。放射或化學治療處理后，多種應(yīng)激基因在乳房腫瘤中是上調(diào)的。此類應(yīng)激基因的例子是熱休克蛋白(HSP)(AlO)和多抗藥性基因-I(MDR-I)(All)0因此，可以使用這些基因的啟動子來驅(qū)動轉(zhuǎn)基因在已經(jīng)進行過放射或化學療法的乳腺癌中的腫瘤特異性表達。通常通過直接瘤內(nèi)注射含有感興趣轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷型腺病毒表達載體來實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄靶向的基因療法(Α6，Α12，Α13)。也可以通過瘤內(nèi)注射與陽離子脂質(zhì)體形成的脂質(zhì)復(fù)合物來投遞轉(zhuǎn)基因(Α14，Α15)。乳腺癌依照本文所描述的方法和組合物，VHZ對于診斷或治療乳腺癌是有用的。若本文件提及“癌癥”，則這應(yīng)當理解成包括轉(zhuǎn)移性、攻擊性或侵入性癌癥。例如，所述癌癥可以是與VHZ過表達有關(guān)的癌癥。這意味著所討論的癌癥的癌細胞與非癌細胞相比展示出水平升高的VHZ表達或活性(或兩者)。有數(shù)種類型的乳腺癌。最通常的是導(dǎo)管癌，其在乳房乳管的襯里中開始。另一種類型(即小葉癌)在產(chǎn)生母乳的小葉中開始。若惡性腫瘤侵入鄰近的組織，則其被稱為浸潤性或侵入性癌癥。在乳腺癌在乳房外擴散時，通常在臂下的淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)癌細胞。乳腺癌細胞可以擴散出乳房，諸如至其它淋巴結(jié)、骨、肝、或肺。公認的乳腺癌階段包括0期極早期乳腺癌。此類型的癌癥尚未在乳房內(nèi)或乳房外擴散。它有時稱作DCIS、LCIS、或乳腺原位癌癥或非侵入性癌癥。I期癌癥的大小不大于約1英寸，并且尚未在乳房外擴散。(也描述為早期乳腺癌。)II期存在任何下列各項癌癥不大于1英寸，但是已經(jīng)擴散至臂下的淋巴結(jié)；癌癥在1和2英寸之間。它可以已經(jīng)或者可以尚未擴散至臂下的淋巴結(jié)；癌癥大于2英寸，但是尚未擴散至臂下的淋巴結(jié)。III期和IIIA期存在任何下列各項癌癥小于2英寸，并且已經(jīng)擴散至臂下的淋巴結(jié)，癌癥還正進一步擴散至其它淋巴結(jié)；癌癥大于2英寸，并且已經(jīng)擴散至臂下的淋巴結(jié)。IIIB期存在任何下列各項癌癥已經(jīng)擴散至乳房附近的組織(皮膚、胸壁，包括胸腔中的肋骨和肌肉)；癌癥已經(jīng)擴散至胸壁內(nèi)沿著胸骨的淋巴結(jié)。IV期癌癥已經(jīng)擴散至身體的其它部分，最通常是骨、肺、肝、或腦?；蛘撸[瘤已經(jīng)局部擴散至頸內(nèi)的皮膚和淋巴結(jié)，在鎖骨附近。炎性乳腺癌炎性乳腺癌是罕見的，但是是極嚴重的攻擊型乳腺癌。乳房可以顯紅色，并且感覺溫暖。在乳房上可以有脊(ridges)、風團(welts)、或蕁麻疹(hives)；或者皮膚可以顯得具皺。它有時被誤診為簡單感染。復(fù)發(fā)性乳腺癌復(fù)發(fā)性疾病指癌癥在其已經(jīng)得到治療后又回復(fù)(復(fù)發(fā))。它可以在乳房中、在胸腔(胸壁)的軟組織中，或者在身體的另一部分中回復(fù)。乳腺原位癌癌-DCIS和LCIS所找到的許多乳腺癌是稱為乳腺原位癌癥或非侵入性癌癥的極早期癌癥。大多數(shù)這些癌癥是通過乳房X線照相術(shù)找到的。這些極早期細胞變化可以變?yōu)榍秩胄匀橄侔?。兩種類型的乳腺原位癌包括下列各項DCIS(原位導(dǎo)管癌)，其意味著僅在乳房乳管的襯里中找到異常細胞。異常細胞尚未在導(dǎo)管外擴散。它們尚未在乳房內(nèi)擴散，尚未擴散出乳房，尚未擴散至臂下的淋巴結(jié)，或者尚未擴散至身體的其它部分。有數(shù)種類型的DCIS。若不除去，一些類型可隨著時間而變化，并變?yōu)榍秩胄园┌Y。一些可能從未變?yōu)榍秩胄园┌Y。(DCIS有時被稱作導(dǎo)管內(nèi)癌)。LCIS(原位小葉癌)，其意味著在乳小葉的襯里中找到異常細胞。雖然認為處于此非侵入性階段的LCIS不是實際的乳腺癌，但是它是形成侵入性癌癥風險升高的警告癥候。對在乳房X線照片上發(fā)現(xiàn)的另一處腫塊或不常見變化進行活檢時有時找到LCIS。患有LCIS的患者具有25%的機率在接下去的25年期間在任一乳房中形成乳腺癌。微鈣化是不能感覺到，但是能在乳房X線照片上看到的極小的鈣斑點。它們由正在快速分裂的細胞形成。在它們在乳房的一個區(qū)域中簇集時，這可以是乳腺原位癌癥的早期癥候。通過乳房X線照相術(shù)找到的約半數(shù)乳腺癌表現(xiàn)為微鈣化簇。另一半表現(xiàn)為腫塊。診斷我們的診斷方法可以與任何已知的乳腺癌診斷方法一起使用，包括檢測已知的乳腺癌基因BRCAl和BRCA2之任一者或兩者中的突變?；蛘?另外，可以如下實施診斷，即通過例如使用抗Her2抗體來檢測Her2表達。治療已知的針對乳腺癌的治療可以由下列任何一項或多項組成手術(shù)、放射療法、化學療法、高劑量化學療法、激素療法和免疫療法。因而，本文所描述的任何治療方法可以與任何一種或多種在先已知療法組合。另外，可以使用任何一種或多種已知對治療或減輕癌癥有效的下列一般療法。非特異性免疫調(diào)節(jié)劑非特異性免疫調(diào)節(jié)劑是刺激或間接提升免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。通常，這些藥劑靶向關(guān)鍵的免疫系統(tǒng)細胞，并引起次反應(yīng)諸如升高的細胞因子和免疫球蛋白生成。癌癥治療中使用的兩種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑是卡介苗(BCG)和左旋咪唑(levamisole)。本文所描述的抗VHZ劑可以與任何此類非特異性免疫調(diào)節(jié)劑一起使用。生物學應(yīng)答修飾劑可以在實驗室中生成一些抗體、細胞因子、和其它免疫系統(tǒng)物質(zhì)以在癌癥治療中使用。這些物質(zhì)通常稱作生物學應(yīng)答修飾劑(BRM)。它們改變身體的免疫防御與癌細胞之間的相互作用以加強、指導(dǎo)、或恢復(fù)身體抵抗疾病的能力。BRM包括干擾素、白介素、集落刺激因子、單克隆抗體、和疫苗。本文所描述的抗VHZ劑可以與任何此類生物學應(yīng)答修飾劑一起使用。干擾素(IFN)有三種主要類型的干擾素-干擾素α、干擾素β、和干擾素Y；干擾素α是癌癥治療中最廣泛使用的類型。干擾素能改善癌癥患者的免疫系統(tǒng)針對癌細胞起作用的方式。另外，干擾素可以直接對癌細胞起作用，其通過減緩它們的生長或促進它們形成更具正常行為的細胞來實現(xiàn)。一些干擾素還可以刺激NK細胞、T細胞、和巨噬細胞，加強免疫系統(tǒng)的抗癌功能。本文所描述的抗VHZ劑可以與任何此類干擾素一起使用。白介素(IL)與干擾素一樣，白介素是身體中天然存在的細胞因子。已經(jīng)鑒定出許多白介素；白介素-2(IL-2或阿地白介素)已經(jīng)在癌癥治療中進行了最廣泛的研究。IL-2刺激許多能破壞癌細胞的免疫細胞諸如淋巴細胞的生長和活性。本文所描述的抗VHZ劑可以與任何此類白介素一起使用。集落刺激因子(CSF)集落刺激因子(CSF)(有時稱作造血生長因子)通常不直接影響腫瘤細胞；更確切地，它們促進骨髓干細胞分裂和發(fā)育成白細胞、血小板、和紅細胞。骨髓對于身體的免疫系統(tǒng)是至關(guān)重要的，因為它是所有血細胞的來源。G-CSF(非格司亭(filgrastim))和GM-CSF(沙格司亭(sargramostim))能增加白細胞的數(shù)目，由此降低接受化學療法的患者的感染風險。G-CSF和GM-CSF還能刺激干細胞的生成，為干細胞或骨髓移植作準備；(促)紅細胞生成素能增加紅細胞的數(shù)目，并降低接受化學療法的患者對輸注紅細胞的需要；而奧普瑞白介素(Oprelvekin)能降低接受化學療法的患者對輸注血小板的需要。本文所描述的抗VHZ劑可以與任何此類集落刺激因子一起使用。單克隆抗體(單抗)使用赫賽汀來治療患有生成過量的稱作HER-2的蛋白質(zhì)的腫瘤的患者中的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。(約25%的乳腺癌腫瘤生成過量的HER-2)。在具體的實施方案中，本文所描述的治療方法可以與施用抗Her2抗體(例如赫賽汀)組合給所關(guān)注的個體使用。本文所描述的抗VHZ劑可以與任何此類單克隆抗體一起使用。Her2/NeuHER-2/neu(erbB-2)基因產(chǎn)物是185_kDA跨膜受體酪氨酸激酶，其屬于表皮生長因子受體家族。其較為詳細地記載于Reese，D.M.等，StemCells，15，1_8(1997)，通過提及而將其收入本文。最近，已經(jīng)對HER-2/neu在乳腺癌中的重要性給予了極大的關(guān)注。20_30%的人乳腺癌中過表達HER-2/neu，并且已經(jīng)將升高的表達與不良的預(yù)后聯(lián)系起來。此項發(fā)現(xiàn)已經(jīng)導(dǎo)致赫賽汀，即針對HER-2/neu的抗體的開發(fā)，在測試中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其延長轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的緩解(remission)時間。HER-2/neu是將生長信號傳送至細胞核的細胞表面受體。赫賽汀表現(xiàn)為阻斷這些信號，由此明顯抑制HER-2/neu陽性乳腺癌中由HER-2/neu介導(dǎo)的細胞增殖。也已經(jīng)在卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌(salivarycancer)、胰腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、和非小細胞肺癌的一部分中發(fā)現(xiàn)了HER-2/neu的過表達?？捎煤召愅撛诘刂委熍cHER-2-neu過表達有關(guān)的其它癌癥。因而，我們的診斷方法可以與在個體中檢測Her2的過表達組合。同樣地，在降低VHZ的活性、量或表達外，本文所描述的治療方法可以包括給個體施用赫賽汀。因此，我們提供了VHZ核酸或VHZ多肽與抗Her2抗體一起的組合。我們還提供了抗VHZ抗體與抗Her2抗體一起的組合。在一些實施方案中，所述抗Her2抗體包含赫賽汀。篩選抗VHZ劑鑒定VHZ調(diào)控劑、激動劑和拮抗劑可以使用拮抗劑，特別是小分子來特異性抑制VHZ以作為抗VHZ劑使用。因此，我們公開了VHZ拮抗劑和小分子VHZ抑制劑，以及用于篩選這些的測定法。可以通過檢測對結(jié)合或其它VHZ活性的調(diào)控諸如下調(diào)來篩選VHZ拮抗劑。因此，我們提供了一種能夠下調(diào)VHZ多肽的表達、量或活性的化合物?？梢栽诒疚乃枋龅姆椒ê徒M合物中使用此類化合物以治療或預(yù)防癌癥，特別是乳腺癌。因此，可以在例如細胞、無細胞的制備物、化學文庫、和天然產(chǎn)物混合物中使用VHZ來評估小分子物質(zhì)和配體的結(jié)合。這些物質(zhì)和配體可以是天然物質(zhì)和配體，或者可以是結(jié)構(gòu)或功能模擬物。參見Coligan等，CurrentProtocolsinImmunology1(2)第5章(1991)。此外，可以進行篩選以鑒定影響VHZ表達(特別是在乳房細胞中)的因子。一般而言，用于激動劑和拮抗劑的測定法依賴于測定候選分子對一種或多種VHZ活性的影響。測定法可以牽涉在存在候選分子的情況中，和任選地在沒有候選分子的情況中，或者在存在已知抑制或活化VHZ活性的分子的情況中測定VHZ活性。我們已經(jīng)證明了VHZ的表達在乳腺癌細胞中是升高的；因而，可以采用對VHZ表達的控制來治療乳腺癌和其它癌癥。因此，期望找到刺激VHZ的表達和/或活性，或者能抑制此蛋白質(zhì)的功能的化合物和藥物。一般而言，出于治療和預(yù)防目的對任何已知癌癥，特別是乳腺癌采用激動劑和拮抗劑?！跋抡{(diào)”包括對所研究行為的任何負面影響；這可以是完全的或者部分的。如此，在檢測結(jié)合的情況中，候選拮抗劑能夠降低、改善、或消除兩個實體之間的結(jié)合。與在沒有候選分子的情況中的結(jié)合(或無論哪種活性)相比，候選分子實現(xiàn)的結(jié)合(或任何其它活性)的下調(diào)可以是至少10%，諸如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多。如此，適合于作為拮抗劑使用的候選分子是能夠降低大于10%的結(jié)合或其它活性的分子。術(shù)語“化合物”指化學化合物(天然存在的或合成的)諸如生物學大分子(例如核酸、蛋白質(zhì)、非肽、或有機分子)，或自生物學材料諸如細菌、植物、真菌、或動物(特別是哺乳動物)細胞或組織制成的提取物，或者甚至無機元素或分子?；衔锟梢允强贵w。潛在的VHZ拮抗劑的例子包括抗體、小分子、核苷酸及其類似物，包括嘌呤和嘌呤類似物，寡核苷酸或與VHZ的結(jié)合配偶緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如結(jié)合配偶的片段，或如下的小分子等，所述小分子結(jié)合VHZ多肽，但不引發(fā)響應(yīng)，使得該多肽的活性得到阻止。篩選試劑盒可以將要進行的此類篩選所必需的材料包裝入篩選試劑盒中。此類篩選試劑盒對于鑒定VHZ多肽的激動劑、拮抗劑、配體、受體、底物、酶等或降低或增強VHZ生成的化合物是有用的。篩選試劑盒可以包含(a)VHZ多肽；(b)表達VHZ多肽的重組細胞；或(c)針對VHZ多肽的抗體。篩選試劑盒可以包含文庫。篩選試劑盒可以包含篩選所需要的任何一種或多種成分，如下文所描述的。任選地，篩選試劑盒可以包含使用指令。還可以提供能夠在核酸水平檢測VHZ表達的篩選試劑盒。此類試劑盒可以包含用于擴增VHZ的引物，或一對用于擴增的引物。可以自任何合適的序列(例如VHZ序列的一部分)選擇所述一種或多種引物。鑒定引物序列的方法是本領(lǐng)域公知的，并且熟練技術(shù)人員會能夠容易地設(shè)計此類引物。試劑盒可以包含用于VHZ表達的核酸探針，如本文件中所描述的。任選地，試劑盒還可以包含使用指令。理性設(shè)計可能能夠與VHZ相互作用的候選化合物的理性設(shè)計可以基于VHZ多肽的分子形狀的結(jié)構(gòu)研究。一種用于測定哪些位點與特定的其它蛋白質(zhì)相互作用的手段是物理結(jié)構(gòu)測定，例如X射線晶體學或二維NMR技術(shù)。這些會提供關(guān)于哪些氨基酸殘基形成分子接觸區(qū)的指導(dǎo)。關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的詳細描述，參見例如Blundell和Johnson(1976)ProteinCrystallography,AcademicPress,NewYork。多肽結(jié)合測定法可以通過本領(lǐng)域已知的任何手段來鑒定VHZ活性或表達的調(diào)控劑和拮抗劑。在它們的最簡單形式中，測定法可以僅包括以下步驟，即混合候選化合物與含有VHZ多肽的溶液以形成混合物，測量混合物中的VHZ多肽活性，并比較混合物與標準品的活性。此外，可以在檢測VHZ與推定分子之間的結(jié)合的測定法中通過對VHZ的結(jié)合來鑒定分子。一類用于鑒定結(jié)合本文所描述的VHZ多肽的物質(zhì)的測定法牽涉使固定化在固體支持物上的VHZ多肽與非固定化的候選物質(zhì)接觸，測定感興趣的VHZ多肽與候選物質(zhì)是否彼此結(jié)合和/或以何種程度彼此結(jié)合。或者，候選物質(zhì)可以是固定化的，而如本文件中所列出的VHZ多肽是非固定化的。所述物質(zhì)與VHZ多肽的結(jié)合可以是瞬時的、可逆的或永久的。所述物質(zhì)可以以如下的Kd值結(jié)合所述多肽，所述Kd值低于結(jié)合對照多肽(例如已知不涉及癌癥生長或行進的多肽)的Kd值。所述物質(zhì)的Kd值可以比結(jié)合對照多肽的Kd值小2倍，諸如比結(jié)合對照多肽的Kd小100倍的Kd值或小1000倍的Kd。在一個例示性的測定方法中，可以在珠諸如瓊脂糖珠上固定化VHZ多肽。通常，這可以如下實現(xiàn)，即在細菌、酵母或高等真核細胞系中以GST-融合蛋白表達VHZ多肽，并使用谷胱甘肽_瓊脂糖珠自粗制細胞提取物純化GST-VHZ融合蛋白(Smith和Johnson，1988；Gene67(10):31_40)。作為對照，可以在沒有VHZ多肽的情況中測定候選物質(zhì)(其不是GST-融合蛋白)與固定化的多肽的結(jié)合。然后可以測定候選物質(zhì)與固定化的VHZ多肽的結(jié)合。此類測定法在本領(lǐng)域中稱為GST下拉(pulldown)測定法。再一次，候選物質(zhì)可以是固定化的，而VHZ多肽是非固定化的。使用不同親和純化系統(tǒng)(例如Ni-NTA瓊脂糖和加有組氨酸標簽的成分)固定化成分之一來實施此類型的測定法也是有可能的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的多種方法來測定多肽與候選物質(zhì)的結(jié)合。例如，可以(用例如放射性標記物、表位標簽或酶-抗體偶聯(lián)物)標記非固定化的成分。或者，可以通過免疫學檢測技術(shù)來測定結(jié)合。例如，可以對反應(yīng)混合物進行Western印跡，并用檢測非固定化成分的抗體探查印跡。也可以使用ELISA技術(shù)。通常添加候選物質(zhì)至1至lOOOnmol/ml，諸如1至lOOnmol/ml的終濃度。在抗體的情況中，所使用的終濃度通常自100至500μg/ml，諸如自200至300μg/ml。也可以通過檢測對VHZ與此多肽結(jié)合的任何分子之間的結(jié)合的調(diào)控，或?qū)σ虼祟惤Y(jié)合或釋放引起的任何活性的調(diào)控來鑒定VHZ的調(diào)控劑和拮抗劑?；诩毎臏y定法基于細胞的測定法可以僅測試候選化合物的結(jié)合，其中借助于與候選化合物直接或間接關(guān)聯(lián)的標記物或者在牽涉與經(jīng)標記競爭劑競爭的測定法中檢測對攜帶VHZ多肽的細胞的粘著。此外，這些測定法可以測試候選化合物是否導(dǎo)致通過結(jié)合VHZ多肽產(chǎn)生的信號，其使用適合于在其表面上攜帶多肽的細胞的檢測系統(tǒng)來實現(xiàn)。一般而言，在存在已知激動劑的情況中測定活化的抑制劑，并觀察候選化合物的存在對激動劑進行的活化的影響。另一種篩選化合物的方法利用用表達化合物文庫的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細胞。可以使用此類細胞(或是活的或是固定的形式)來進行標準結(jié)合配偶測定法。還可參見Parce等(1989)Science246:243_247；和Owicki等(1990)Proc.Nat，1Acad.Sci.USA87；4007-4011，其記載了用于檢測細胞應(yīng)答的靈敏方法。競爭性測定法是特別有用的，其中使表達化合物文庫的細胞與已知結(jié)合VHZ多肽的經(jīng)標記抗體(諸如1251-抗體)、和測試樣品諸如候選化合物(其就是要測量其對結(jié)合組分的結(jié)合親和力的)接觸或一起溫育。然后分開結(jié)合的和游離的經(jīng)標記VHZ多肽結(jié)合配偶以評估結(jié)合程度。所結(jié)合的測試樣品量與結(jié)合VHZ多肽的經(jīng)標記抗體量成反比?？梢允褂帽姸嗉夹g(shù)之任一種來分開結(jié)合的與游離的結(jié)合配偶以評估結(jié)合程度。此分開步驟通?？蔂可嫒缦乱?guī)程，諸如對濾器的粘著，接著進行清洗，對塑料的粘著，接著進行清洗，或細胞膜離心。所述測定法可以牽涉將候選分子暴露于細胞，諸如乳房細胞，并通過任何合適的手段來測定VHZ的表達。任選地，可以選擇在此類測定法中下調(diào)VHZ表達的分子，用于進一步的研究，和作為下調(diào)VHZ表達的藥物使用。可以有效地采用此類藥物來治療或預(yù)防乳腺癌。也可以使用編碼VHZ蛋白的cDNA和針對所述蛋白質(zhì)的抗體來配置用于檢測添加的化合物對細胞中VHZmRNA和蛋白質(zhì)生成的影響的測定法。例如，可以構(gòu)建如下的ELISA，其用于通過本領(lǐng)域已知的標準方法使用單克隆和多克隆抗體來測量分泌的或細胞結(jié)合的VHZ多肽水平，并且這可以用于發(fā)現(xiàn)可抑制或增強自合適操作的細胞或組織生成VHZ蛋白的藥劑(分別也稱作拮抗劑或激動劑)。用于進行篩選測定法的標準方法是本領(lǐng)域中充分理解的?；钚詼y定法用于檢測調(diào)控劑或拮抗劑的測定法通常牽涉在存在候選分子的情況中檢測對VHZ的任何活性的調(diào)控，任選地，以及在沒有候選分子的情況中檢測對活性的調(diào)控?？梢允褂脵z測VHZ特定生物學活性諸如磷酸酶活性的測定法。該測定法通常牽涉使候選分子(例如文庫形式)與VHZ(無論以多肽、編碼多肽的核酸、還是以包含其的細胞、細胞器、提取物或其它材料形式)及候選調(diào)控劑接觸。可以檢測VHZ的相關(guān)活性(諸如磷酸酶活性，如下文所描述的)，以建立候選調(diào)控劑的存在是否有任何效果。磷酸酶測定法是本領(lǐng)域已知的，并且記載于Wu等(2004)，IntJBiochemCellBiol.36(8)1542-53和Alonso等(2004).JBiolChem.20；279(34):35768_74。此類測定法包括測定VHZ使合適的底物諸如對硝基苯基磷酸酯，或者如含有磷酸酪氨酸和磷酸蘇氨酸殘基的寡肽去磷酸化的能力?？梢栽诖嬖诨驔]有候選調(diào)控劑的情況中實施測定法，并檢測合適的活性以檢測對VHZ活性的調(diào)控，因此鑒定VHZ的候選調(diào)控劑和/或拮抗劑。也可以使用用于檢測能結(jié)合和/或影響VHZ的轉(zhuǎn)錄或表達的候選調(diào)控劑的啟動子結(jié)合測定法。然后可以為進一步研究而選擇或分離候選調(diào)控劑，或為了使用而分離候選調(diào)控劑。此類篩選規(guī)程的詳情是本領(lǐng)域公知的，并且例如記載于HandbookofDrugScreening,RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes編(2001,NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9)。本文所描述的篩選方法可以采用體內(nèi)測定法，雖然它們可以為了體外使用而進行設(shè)定。體內(nèi)測定法一般牽涉將包含VHZ的細胞暴露于候選分子。在體外測定法中，將VHZ暴露于候選分子，任選地，在存在其他成分諸如粗制的或半純化的細胞提取物，或純化的蛋白質(zhì)的情況中。若進行體外測定法，則這些可以采用候選分子的陣列(例如陣列化的文庫)?？梢圆捎皿w內(nèi)測定法。因此，VHZ多肽可包含在細胞中，諸如以異源方式。此類細胞可以是轉(zhuǎn)基因細胞，其已經(jīng)進行過工程化改造以表達如上文所描述的VHZ。若采用提取物，則它可以包含細胞質(zhì)提取物或細胞核提取物，其制備方法是本領(lǐng)域公知的。應(yīng)當領(lǐng)會的是，可以采用包含VHZ的細胞的任何成分，諸如細胞器。一個實施方案利用細胞質(zhì)或細胞核制備物，例如包含細胞核，其包含如所描述的VHZ。細胞核制備物可以包含一個或多個細胞核，其可通過例如去污劑處理來透化(permeabilise)或半透化。如此，在一個具體的實施方案中，測定形式可以包括建立多孔微量滴定板，每孔中包括一個或多個表達VHZ多肽的細胞；可以將自例如文庫衍生的個別候選分子，或候選分子的集合添加至各個孔，并測量對VHZ活性的調(diào)控。若使用集合，則可以將這些細分成進一步的集合，并以相同的方式測試。然后可以測定VHZ活性，例如結(jié)合活性或轉(zhuǎn)錄共活化活性，如本文件別處所描述的。作為上文所描述的測定方法的替代或附加，也可以使用“扣除”規(guī)程來鑒定VHZ的調(diào)控劑或拮抗劑。在此類“扣除”規(guī)程下，提供了多種分子，其包含一種或多種能夠發(fā)揮調(diào)控劑功能的候選分子(例如細胞提取物、細胞核提取物、分子文庫等)，并從所述多種分子除去、消減或扣除一種或多種成分。然后通過暴露于包含所述VHZ的細胞(或其成分)來對“扣除后的，，提取物等測定活性。如此，例如，可以進行“免疫消減”測定法來如下鑒定此類調(diào)控劑?？梢宰院线m的細胞制備細胞質(zhì)或細胞核提取物?？梢韵麥p或分級提取物來除去推定的調(diào)控劑，諸如通過使用用合適的抗體進行的免疫消減來實現(xiàn)。若提取物消減去調(diào)控劑，則它會喪失影響VHZ功能或活性或表達的能力?？赡苄枰幌盗锌鄢?或消減來鑒定調(diào)控劑或拮抗劑。還應(yīng)當領(lǐng)會的是，可以使用上文的“消減”或“扣除”測定法作為初步步驟來鑒定推定的調(diào)控因子以進行進一步篩選。此外/或者，可以使用“消減”或“扣除”測定法來證實通過其它手段(例如如本文件別處所描述的“正”篩選)鑒定為推定的調(diào)控劑的分子的調(diào)控活性?？梢苑蛛x進行所述測定法并發(fā)現(xiàn)為感興趣的候選分子，并進行進一步研究。分離感興趣分子的方法會取決于所采用分子的類型、其是否處于文庫形式、在任一時間測試多少候選分子、是否遵循分批規(guī)程等?？梢砸晕膸煨问教峁┖蜻x分子。在一個實施方案中，可以同時篩選超過一種候選分子?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的手段來生成候選分子的文庫，例如，小分子文庫、多肽文庫、核酸文庫、化合物文庫(諸如組合文庫)、反義分子諸如反義DNA或反義RNA的文庫、抗體文庫等。此類文庫適合于高通量篩選。可以將包含VHZ的不同細胞暴露于文庫的各成員，并測定對VHZ活性的影響?？梢詾榇四康牟捎藐嚵屑夹g(shù)。細胞在空間上可以是分開的，例如在微量滴定板的孔中。在一個實施方案中，采用小分子文庫?！靶》肿印敝钙浞肿恿靠梢孕∮诩s50kDa的分子。在具體的實施方案中，小分子可以具有小于約30kDa，諸如小于約15kDa或小于約IOkDa左右的分子量。此類小分子的文庫(在本文稱為“小分子文庫”)可以含有多肽、小肽，例如20個氨基酸或更少(例如15、10或5個氨基酸)的肽、簡單化合物等?；蛘?另外，可以對組合文庫(如下文更為詳細地描述的)篩選VHZ的調(diào)控劑或拮抗劑。上文描述了用于VHZ活性的測定法。文庫可以在本文所描述的VHZ拮抗劑和抑制劑的篩選中采用候選分子的文庫，諸如多肽或核酸的文庫。將此類文庫暴露于VHZ蛋白，并測定它們對蛋白質(zhì)活性的影響，若有的話。用于分離大文庫的想要成員的選擇方案是本領(lǐng)域已知的，如噬菌體展示技術(shù)所代表的。已經(jīng)證明了此類系統(tǒng)(其中多種多樣的肽序列展示在絲狀噬菌體的表面上(Scott和Smith(1990見上文))可用于創(chuàng)建抗體片段(和編碼它們的核苷酸序列)的文庫來體外選擇和擴增結(jié)合靶抗原的特異性抗體片段。將編碼Vh和\區(qū)的核苷酸序列與編碼將它們指引至大腸桿菌(E.coli)的周質(zhì)空間的前導(dǎo)信號的基因片段連接，因此所得的抗體片段展示在噬菌體的表面上，通常作為與噬菌體外殼蛋白(例如pill或pVIII)的融合物?；蛘?，在λ噬菌體殼體上在外部展示抗體片段(噬菌體抗體(phagebody))。基于噬菌體的展示系統(tǒng)的優(yōu)點在于，因為它們是生物學系統(tǒng)，所以能僅僅通過在細菌細胞中培養(yǎng)含有選定文庫成員的噬菌體來擴增選定的文庫成員。此外，因為編碼多肽文庫成員的核苷酸序列包含在噬菌體或噬菌粒載體上，所以測序、表達和隨后的遺傳操作是相對直接的。用于構(gòu)建噬菌體抗體展示文庫和λ噬菌體表達文庫的方法是本領(lǐng)域公知的(McCafferty等(1990)見上文；Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,884363；Clackson等(1991)Nature,352624；Lowman等(1991)Biochemistry,3010832；Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,8810134；Hoogenboom^(1991)NucleicAcidsRes.，194133；Chang等(1991)J.Immunol.，1473610；Breitling等(1991)Gene,104147；Marks等(1991)見上文；Barbas等(1992)見上文；Hawkins和Winter(1992)JImmunol.,22867；Marksφ,1992,J.Biol.Chem.,26716007；Lerner等(1992)Science,258:1313，通過提及而收入本文)。若對于表達(一般是多肽文庫的)必要的話，可以修改此類技術(shù)。一種特別有利的辦法是scFv噬菌體文庫的使用(Bird，R.Ε.等(1988)Science242423-6,Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.，85:5879_5883；Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,871066-1070；McCafferty^(1990)見上文；Clackson等(1991)見上文；Marks等(1991)見上文；Chiswell等(1992)TrendsBiotech.，1080；Marks等(1992)見上文)。展示在噬菌體外殼蛋白上的scFv文庫的各種實施方案已經(jīng)有記載。噬菌體展示辦法的改進也是已知的，例如如記載于W096/06213、W092/01047(MedicalResearchCouncil等)和W097/08320(Morphosys,見上文)的，通過提及而將其收入本文。備選的文庫選擇技術(shù)包括噬菌體λ表達系統(tǒng)，其可以直接以噬菌體噬斑或者以溶源體菌落篩選，均如先前所記載的(Huse等(1989)Science,2461275；Caton^PKoprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,87；Mullinax等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,878095；Persson等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.,882432),并且在本文所描述的方法和組合物中使用?？梢允褂眠@些表達系統(tǒng)來篩選文庫中約IO6或甚至更高階的眾多不同成員。其它篩選系統(tǒng)依賴于例如文庫成員的直接化學合成。一種早期方法牽涉在一組針或棒上合成肽，諸如記載于W084/03564的。一種牽涉珠上的肽合成的類似方法(其形成肽文庫，其中每粒珠是單個文庫成員)記載于美國專利號4，631，211，而一種相關(guān)方法記載于W092/00091?；谥榈姆椒ǖ娘@著改進牽涉用獨特的標識標簽諸如寡核苷酸給每粒珠加上標簽，以便促進對每個文庫成員的氨基酸序列的鑒定。這些改良的基于珠的方法記載于W093/06121。另一種化學合成方法牽涉以如下方式在表面上合成肽(或肽模擬物(peptidomimetics))的陣列，所述方式在陣列中在離散的、預(yù)定的位置處放置每個獨特的文庫成員(例如獨特的肽序列)。每個文庫成員的身份由其在陣列中的空間位置決定。測定陣列中發(fā)生預(yù)先確定的分子(例如受體)與反應(yīng)性文庫成員之間的結(jié)合相互作用的位置，由此基于空間位置來鑒定反應(yīng)性文庫成員的序列。這些方法記載于美國專利號5，143，854；W090/15070和W092/10092；Fodor等(1991)Science,251767；Dower和Fodor(1991)Ann.Rep.Med.Chem.，26271。用于生成多肽或核苷酸文庫的其它系統(tǒng)牽涉使用無細胞的酶促機器(machinery)來在體外合成文庫成員。在一種方法中，通過交替多輪的針對靶配體的選擇和PCR擴增來選擇RNA分子(Tuerk和Gold(1990)Science，249505；Ellington和Szostak(1990)Nature,346:818)?？梢允褂妙愃频募夹g(shù)來鑒定結(jié)合預(yù)先確定的人轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列(Thiesen禾口Bach(1990)NucleicAcidsRes.，183203；Beaudry禾口Joyce(1992)Science,257635；W092/05258和W092/14843)。以類似的方式，可以使用體外翻譯來合成多肽，作為一種用于生成大文庫的方法。這些一般包含穩(wěn)定化的多核糖體復(fù)合物的方法進一步記載于W088/08453，W090/05785,W090/07003,W091/02076,W091/05058，和W092/02536。不基于噬菌體的備選展示系統(tǒng)諸如那些披露于W095/22625和W095/11922(Affymax)的展示系統(tǒng)使用多核糖體來展示多肽以進行選擇。也通過提及而將這些和所有上述文件收入本文。組合文庫文庫，特別是候選分子的文庫可以適當?shù)靥幱诮M合文庫(也稱為組合化學文庫)的形式?！敖M合文庫”在該術(shù)語在本文件中使用時指由隨機選擇的亞基組成的多種化學化合物的集合?？梢詫M合文庫篩選能夠抑制VHZ的分子。化學化合物的多種組合文庫是目前可用的，包括對蛋白水解酶和非蛋白水解酶有活性的文庫、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的激動劑和拮抗劑的文庫、對非GPCR靶物(例如整聯(lián)蛋白、離子通道、域相互作用、細胞核受體、和轉(zhuǎn)錄因子)有活性的文庫和全細胞腫瘤學和抗感染靴物的文庫等。在Dolle和Nelson(1999)，JournalofCombinatorialChemistry，第1卷第4期，235-282中提供了組合文庫，特別是其構(gòu)建和用途的全面綜述。還可參考Combinatorialpeptidelibraryprotocols(ShmuelCabilly編，Totowa,NJ.HumanaPress,cl998.MethodsinMolecularBiologyv.87)。特定的組合文庫和其構(gòu)建方法披露于美國專利6，168，914(Campbell等)，以及Baldwin等(1995)，"SynthesisofaSmallMoleculeLibraryEncodedwithMolecularTags,"J.Am.Chem.Soc.1175588-5589，及那些文件中所提及的參考文獻。在一個實施方案中，篩選的組合文庫是為了潛在地包括與細胞成分相互作用以影響基因表達的分子而設(shè)計的組合文庫。例如，可以篩選針對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白的組合文庫。對于該實施方案有用的其它文庫包括針對組蛋白修飾酶(例如組蛋白乙?；蚪M蛋白甲基化酶)、或DNA修飾(例如DNA甲基化或脫甲基化)的組合文庫。記載化學組合文庫、其生成和用途的別的參考文獻包括那些可自URLhttp://www.netsci.org/Science/Combichem/獲得的，包括TheChemicalGenerationofMolecularDiversity.MichaelR.Pavia，SphinxPharmaceuticals，ADivisionofEliLilly(1995年7月出片反)；CombinatorialChemistry:AStrategyfortheFuture-MDLInformationSystemsdiscussestheroleitsProjectLibraryplaysinmanagingdiversitylibraries(1995年7月出片反)；SolidSupportCombinatorialChemistryinLeadDiscoveryandSAROptimization,AdnanM.M.Mjalli禾口BarryE.Toyonaga,OntogenCorporation(1995年7月出片反)；Non-PeptidicBradykininReceptorAntagonistsFromaStructurallyDirectedNon-PeptideLibrary.SarvajitChakravarty,BabuJ.Mavunkel,RobinAndy,DonaldJ.Kyle*，SciosNovaInc.(1995年7月出片反)；CombinatorialChemistryLibraryDesignusingPharmacophoreDiversityKeithDaviesandCliveBriant,ChemicalDesignLtd.(1995年7月出片反)；ADatabaseSystemforCombinatorialSynthesisExperiments-CraigJamesandDavidWeininger,DaylightChemicalInformationSystems,Inc.(1995年7月出片反)；AnInformationManagementArchitectureforCombinatorialChemistry,KeithDaviesandCatherineWhite,ChemicalDesignLtd.(1995年7月出片反)；NovelSoffwareToolsforAddressingChemicalDiversity,R.S.PearIman,LaboratoryforMolecularGraphicsandTheoreticalModeling,CollegeofPharmacy,UniversityofTexas(1996年6月/7月出片反)；OpportunitiesforComputationalChemistsAffordedbytheNewStrategiesinDrugDiscovery:AnOpinion,YvonneConnollyMartin,ComputerAssistedMolecularDesignProject,AbbottLaboratories(1996年6月/7月出片反)；CombinatorialChemistryandMolecularDiversityCourseattheUniversityofLouisville:ADescription,ArnoF.Spatola,DepartmentofChemistry,UniversityofLouisville(1996年6月/7月出版)；ChemicallyGeneratedScreeningLibraries:PresentandFuture.MichaelR.Pavia,SphinxPharmaceuticals,ADivisionofEliLilly(1996年6月/7月出版)；ChemicalStrategiesForIntroducingCarbohydrateMolecularDiversityIntoTheDrugDiscoveryProcess.MichaelJ.Sofia,TranscellTechnologiesInc.(1996年6月/7月出片反)；DataManagementforCombinatorialChemistry.MaryjoZaborowski,ChironCorporation禾口SheilaH.DeWitt,Parke-DavisPharmaceuticalResearch,DivisionofWarner-LambertCompany(1995^11^Hj)；及TheImpactofHighThroughputOrganicSynthesisonR&DinBio-BasedIndustries,JohnP.Devlin(1996年3月出片反)。組合化學中的技術(shù)在用于產(chǎn)生新的藥學前導(dǎo)物(pharmaceuticallead)的現(xiàn)代方法中獲得廣泛的接受(Gallop,Μ.Α.等，1994，J.Med.Chem.37:1233_1251；Gordon,Ε.Μ.等，1994，J.Med.Chem.37:1385-1401)。使用的一種組合辦法基于如下策略，其牽涉在每個固相支持物顆粒上合成含有不同結(jié)構(gòu)的文庫，使文庫與可溶性受體相互作用，鑒定與大分子靶物相互作用的“珠”，并測定由鑒定出的“珠”攜帶的結(jié)構(gòu)(Lam,K.S.等，1991，Nature35482-84)。此辦法的一種備選是自固體支持物序貫釋放化合物的確定等分試樣，隨后測定溶液中的活性，鑒定釋放活性化合物的顆粒，并通過直接測序(Salmon，S.Ε.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11708-11712)，或者通過閱讀其密碼(Kerr,J.Μ.等，1993，J.Am.Chem.Soc.115:2529_2531；Nikolaiev,V.等，1993，P印t.Res.6:161_170；Ohlmeyer,M.H.J.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9010922-10926)來闡明其結(jié)構(gòu)?？梢允褂糜蒄urka首次記載的用于產(chǎn)生肽的等摩爾混合物的簡單原理來合成(Furka,Α.φ,1988,XthInternationalSymposiumonMedicinalChemistry,Budapest1988；Furka,A.等，1988,14thInternationalCongressofBiochemistry,Prague1988；Furka,A.等，1991,Int.J.PeptideProteinRes.37487-493)。用于重復(fù)篩選的可溶性文庫的構(gòu)建也已經(jīng)有記載(Houghten，R.Α.等，1991，Nature354:84_86)。K.S.Lam披露了使用不溶性隨機組合文庫的新的且有力得出乎意料的技術(shù)。Lam在固相支持物上合成隨機組合文庫，使得每個支持物具有一致分子結(jié)構(gòu)的測試化合物，并在事先不從支持物除去測試化合物的情況中通過固相結(jié)合方案來篩選文庫(Lam,K.S.等，1991，Nature354:82-84)。如此，候選分子的文庫可以是合成的組合文庫(例如組合化學文庫)、細胞提取物、體液(例如尿液、血液、淚液、汗液、或唾液)，或者合成的或天然的產(chǎn)物的其它混合物(例如小分子的文庫或發(fā)酵混合物)。分子文庫可以包括例如氨基酸、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、或肽或蛋白質(zhì)的片段；核酸(例如反義的；DNA；RNA；或肽核酸，即PNA)；適體；或碳水化合物或多糖。文庫的每個成員可以是單個的或者可以是混合物(例如壓縮的文庫)的一部分。文庫可以含有純化的化合物或者可以是“臟的”(即，含有顯著數(shù)量的雜質(zhì))。也可以與本文所描述的方法一起使用商品化的文庫(例如來自Affymetrix、ArQuleλNeoseTechnologies、SarcoΛCiddco、OxfordAsymmetry、Maybridge、Aldrich、Panlabs、Pharmacopoeia、Sigma、$Tripose)0在如上文所描述的文庫外，可以使用稱作多樣性文件的特殊文庫來評估新方法的特異性、可靠性、或再現(xiàn)性。多樣性文件含有許多化合物(例如1000種或更多種小分子)，其代表多類能潛在導(dǎo)致測定法中的非特異性檢測的化合物。多樣性文件是商品化的或者也可以自購自上文所列廠商的個別化合物裝配?？筕HZ抗體抗VHZ劑(包括VHZ的拮抗劑或調(diào)控劑)(其可以用于調(diào)節(jié)此蛋白質(zhì)的活性，例如用于治療或預(yù)防疾病諸如癌癥的方法，如本文件中所描述的)可以包括針對VHZ蛋白的抗體。因此，我們提供了結(jié)合VHZ多肽、其片段、同源物、變體或衍生物的抗體。此類抗體在檢測VHZ表達，并且特別在診斷VHZ相關(guān)疾病諸如乳腺癌中是有用的。其它抗體包括那些具有治療活性的，即其可以以治療方式用于治療、管理或預(yù)防任何VHZ相關(guān)疾病(包括乳腺癌)?？梢酝ㄟ^與人VHZ的氨基酸殘基(126-140)對應(yīng)的肽RRLRPGSIETYEQEK進行的免疫來生成針對VHZ的抗體，如實施例中所描述的。能夠結(jié)合VHZ的抗體的例子包括雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號LS-C32281，氨基酸35至90，LS-C42458,LS-A6806和LS-A6803，LS-C32281，LifeSpanInc,Seattle,Washington,USA)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號DS-PB-00676，RayBiotechInc,Norcross,Georgia,USA)、雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號XW-7857，ProSciIncorporated,Poway,California,USA)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號F4560和D9840-66A，UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)>X|ifiAVHZJfi#(ΛβπD9840-66,UnitedStatesBiological,Swampscott,Massachusetts,USA)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號AHP1142，AdBSerotec，Oxford，UnitedKingdom)、家兔抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號NBl10-40452，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)、雞抗人VHZ抗體(產(chǎn)品目錄編號NB100-75328，NovusBiologicals,Littleton,Colorado,USA)。此外，可以針對任何合適的表位(例如自VHZ蛋白衍生的表位)生成對VHZ特異性的抗體。合適的VHZ片段的序列可以包含VHZ的殘基C95，并且可以使用來自此序列的任何表位來生成特異性VHZ抗體。出于本文件的目的，術(shù)語“抗體”指能夠結(jié)合選定靶物的完整抗體或抗體片段。除非相反地規(guī)定，該術(shù)語包括但不限于多克隆的、單克隆的、天然的或工程化改造的抗體，包括嵌合的、CDR嫁接的和人源化的抗體，和使用噬菌體展示或備選技術(shù)生成的人工選擇的抗體。該術(shù)語還包括單鏈、Fab片段和自Fab表達文庫生成的片段。此類片段包括整個抗體中保留其對靶物質(zhì)的結(jié)合活性的片段、Fv、F(ab’)和F(ab’)2片段，以及單鏈抗體(scFv)、包含抗體的抗原結(jié)合位點的融合蛋白和其它合成蛋白。小片段諸如Fv和ScFv由于其小尺寸和隨后的卓越組織分布而在診斷和治療應(yīng)用方面擁有有利的特性?？贵w及其片段可以是人源化抗體，例如如記載于EP-A-239400的。此外，也可以使用具有完全人的可變區(qū)的抗體(或其片段)，例如如記載于美國專利號5，545，807和6，075，181的。中和性抗體(即那些抑制VHZ的任何生物學活性的抗體)可以用于診斷學和治療學。本文所描述的抗體可以是經(jīng)過改變的抗體，其包含效應(yīng)蛋白諸如標記物。可以使用容許在體內(nèi)或在體外對抗體分布成像的標記物。此類標記物可以是放射性標記物或不透射線的標記物，諸如金屬顆粒，其可容易地在胚胎或細胞團內(nèi)顯現(xiàn)。此外，它們可以是在組織樣品上可顯現(xiàn)的熒光標記物或其它標記物?？梢酝ㄟ^標準技術(shù)諸如通過免疫或者通過使用噬菌體展示文庫來生成抗體。此類抗體可能夠特異性結(jié)合VHZ蛋白或同源物、片段等。多克隆抗體若多克隆抗體是想要的，則可以用包含VHZ多肽或肽的免疫原性組合物來免疫選定的哺乳動物(例如小鼠、家兔、山羊、馬等)。根據(jù)宿主物種，可以使用各種佐劑來提高免疫學應(yīng)答。此類佐劑包括但不限于弗氏，礦物凝膠諸如氫氧化鋁，和表面活性物質(zhì)諸如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔i成血藍蛋白、和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)是潛在有用的人佐劑，如果出于刺激系統(tǒng)防御的目的給免疫學受損的個體施用純化的物質(zhì)氨基酸序列，那么其可以被采用。依照已知的規(guī)程收集和處理來自經(jīng)過免疫的動物的血清。若含有針對自VHZ多肽可獲得的表位的多克隆抗體的血清含有針對其它抗原的抗體，則可以通過免疫親和層析來純化多克隆抗體。用于生成和加工多克隆抗血清的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的。為了可以制備此類抗體，我們還提供了作為半抗原與另一種氨基酸序列聯(lián)合(haptenise)的VHZ氨基酸序列或其片段以在動物或人中作為免疫原使用。單克隆抗體本領(lǐng)域技術(shù)人員也能容易地生成針對自VHZ多肽或肽可獲得的表位的單克隆抗體。用于通過雜交瘤制備單克隆抗體的一般方法是公知的?？梢酝ㄟ^細胞融合，并且也可以通過其它技術(shù)諸如用致癌性DAN直接轉(zhuǎn)化B淋巴細胞，或者用埃巴病毒進行轉(zhuǎn)染來創(chuàng)建永生的抗體生成細胞系?？梢詫︶槍舯砦?orbitepitope)生成的數(shù)組單克隆抗體篩選各種特性，即同種型和表位親和力。可以使用提供由培養(yǎng)中的連續(xù)細胞系進行的抗體分子生成的任何技術(shù)來制備單克隆抗體。這些包括但不限于最初由Koehler和Milstein記載的雜交瘤技術(shù)(1975Nature256:495-497)、三源雜交瘤(trioma)技術(shù)、人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等(1983)ImmunolToday472；Cote等(1983)ProcNatlAcadSci80:2026_2030)和EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,第77頁-第96頁，AlanR.Liss,Inc.,1985)?？梢允褂弥亟MDNA技術(shù)來改善抗體，如本文所描述的。如此，可以構(gòu)建嵌合抗體以在診斷或治療應(yīng)用中降低其免疫原性。此類技術(shù)包括將小鼠抗體基因剪接至人抗體基因以獲得具有合適的抗原特異性和生物學活性的分子(Morrison等(1984)ProcNatlAcadSci816851-6855；Neuberger等(1984)Nature312:604_608；Takeda等(1985)Nature314452-454)。此外，可以如下使免疫原性最小化，即通過⑶R嫁接[參見歐洲專利申請0239400(Winter)]和任選地，框架修飾[EP0239400]來使抗體人源化?；蛘撸梢愿木帪樯蓡捂溈贵w而描述的技術(shù)(美國專利號4，946，779)以生成物質(zhì)特異性單鏈抗體。針對自VHZ多肽或肽可獲得的表位的抗體(單克隆和多克隆兩者)在診斷中是特別有用的。具體地，可以使用單克隆抗體來制備抗獨特型抗體?？躬毺匦涂贵w是攜帶所期望的保護針對的物質(zhì)和/或媒介物的“內(nèi)影像”(internalimage)的免疫球蛋白。用于制備抗獨特型抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的。這些抗獨特型抗體在治療中也可以是有用的。也可以如下生成抗體，即在淋巴細胞群體中誘導(dǎo)體內(nèi)生成或者篩選重組免疫球蛋白文庫或數(shù)組高度特異性的結(jié)合劑，如披露于Orlandi等(1989，ProcNatlAcadSci86:3833-3837)及WinterG和MilsteinC(1991；Nature349:293_299)的。還可以生成含有針對多肽或肽的特異性結(jié)合位點的抗體片段。例如，此類片段包括但不限于可以通過對抗體分子的胃蛋白酶消化而生成的F(ab’)2片段和可以通過還原F(ab’)2片段的二硫橋而生成的Fab片段?；蛘?，可以構(gòu)建Fab表達文庫以容許快速且容易地鑒定具有想要的特異性的單克隆Fab片段(HuseWD等(1989)Science256:1275_1281)。也可以改編用于生成單鏈抗體的技術(shù)(美國專利號4，946，778)來生成針對VHZ多肽的單鏈抗體。還有，可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠或其它生物體(包括其它哺乳動物)來表達人源化抗體?？梢圆捎蒙衔乃枋龅目贵w來分離或鑒定表達多肽的克隆或者通過親和層析來純化多肽?？贵w生成的重組技術(shù)可以依照已建立的規(guī)程使用重組DNA技術(shù)在細菌或哺乳動物細胞培養(yǎng)物中生成抗體。選定的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以分泌抗體產(chǎn)物。因此，我們公開了一種用于生成抗體的方法，包括培養(yǎng)宿主(例如大腸桿菌或哺乳動物細胞)，并分離所述蛋白質(zhì)，所述宿主已經(jīng)用包含如下表達盒的雜合載體轉(zhuǎn)化，所述表達盒包含啟動子、與其可操作連接的編碼信號肽的第一DNA序列、與第一DNA序列以符合正確讀碼框的方式連接的編碼所述抗體蛋白質(zhì)的第二DNA序列。在合適的培養(yǎng)基中實施雜交瘤細胞或哺乳動物宿主細胞的體外增殖，所述合適的培養(yǎng)基是常規(guī)的標準培養(yǎng)基，例如Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)或RPMI1640培養(yǎng)基，任選地，補充有哺乳動物血清，例如胎牛血清、或痕量元素和生長維持補充物，例如飼養(yǎng)細胞諸如正常的小鼠腹膜滲出細胞、脾細胞、骨髓巨噬細胞、2-氨基乙醇、胰島素、運鐵蛋白、低密度脂蛋白、油酸等。同樣在本領(lǐng)域已知的合適培養(yǎng)基中實施宿主細胞(其是細菌細胞或酵母細胞)的增殖，例如對于細菌，在培養(yǎng)基LB、NZCYM、NZYM、NZM、極端培養(yǎng)基(TerrificBroth)、SOB、S0C、2xYT、或M9基本培養(yǎng)基中，而對于酵母，在培養(yǎng)基YPD、YEPD、基本培養(yǎng)基、或完全極限撤除成分培養(yǎng)基(CompleteMinimalDropoutMedium)中。體外生成提供相對較純的抗體制備物，并容許放大至給出大量的想要抗體。用于細菌細胞、酵母或哺乳動物細胞培養(yǎng)的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括均質(zhì)懸浮培養(yǎng)，例如在氣升式反應(yīng)器中或者在連續(xù)攪拌器反應(yīng)器中，或者固定化的或俘獲的(entrapped)細胞培養(yǎng)，例如在空心纖維、微膠囊中、在瓊脂糖微珠或陶瓷筒上。也可以通過在體內(nèi)增殖哺乳動物細胞來獲得大量的想要抗體。出于此目的，將生成想要的抗體的雜交瘤細胞注射入組織相容性哺乳動物中以引起抗體生成腫瘤的生長。任選地，用烴引發(fā)(prime)動物，尤其是礦物油諸如姥鮫烷(四甲基十五烷)，之后進行注射。1至3周后，自那些哺乳動物的體液分離抗體。例如，將通過融合合適的骨髓瘤細胞與來自Balb/c小鼠的抗體生成脾細胞獲得的雜交瘤細胞，或自雜交瘤細胞系Sp2/0衍生的生成想要的抗體的經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞腹膜內(nèi)注射入任選地用姥鮫烷預(yù)處理的Balb/c小鼠中，并在1至2周后，自動物采集腹水。上述的和其它的技術(shù)記載于例如Kohler和Milstein,(1975)Nature256495-497；US4，376，110；Harlow禾口Lane，Antibodies:aLaboratoryManual,(1988)ColdSpringHarbor，通過提及而收入本文。用于制備重組抗體分子的技術(shù)記載于上文的參考文獻中，并且還記載于例如EP0623679；EP0368684和EP0436597，通過提及而將它們收入本文。對細胞培養(yǎng)物上清液篩選想要的抗體，其優(yōu)先通過對PGC或其它多能細胞諸如ES或EG細胞的免疫熒光染色、通過免疫印跡、通過酶免疫測定法(例如三明治式測定法或斑點測定法)、或放射性免疫測定法來進行。為了分離抗體，可以通過例如用硫酸銨進行的沉淀、針對吸濕性材料諸如聚乙二醇進行的透析、流過選擇性膜的過濾等來濃縮培養(yǎng)物上清液中或腹水中的免疫球蛋白。若必要和/或想要的話，通過常規(guī)的層析方法，例如凝膠過濾、離子交換層析、流過DEAE-纖維素的層析和/或(免疫)親和層析(例如用抗原或其片段)、或用蛋白A進行的親和層析來純化抗體。還提供了分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞。雜交瘤細胞可以是遺傳方面穩(wěn)定的，分泌具有想要的特異性的單克隆抗體，并可以通過融化和再克隆自深度冷凍培養(yǎng)物活化。還包括一種用于制備分泌針對VHZ多肽的單克隆抗體的雜交瘤細胞系的方法，其特征在于用一種或多種VHZ多肽或其抗原性片段免疫合適的哺乳動物例如Balb/c小鼠；融合經(jīng)過免疫的哺乳動物的抗體生成細胞與合適的骨髓瘤細胞系的細胞，克隆在融合中獲得的雜交細胞，并選擇分泌想要的抗體的細胞克隆。例如，融合用VHZ免疫的Balb/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞系PAI或骨髓瘤細胞系Sp2/0-Agl4的細胞，對獲得的雜交細胞篩選想要的抗體的分泌，并克隆陽性雜交瘤細胞。我們描述了一種用于制備雜交瘤細胞系的方法，其特征在于在數(shù)月(例如2個和4個月之間)里通過數(shù)次(例如4至6次)皮下和/或腹膜內(nèi)注射10和107和108個之間的表達VHZ的細胞和合適的佐劑來免疫Balb/c小鼠，并在最后一次注射后2至4天采集來自經(jīng)過免疫的小鼠的脾細胞，并在存在融合促進劑諸如聚乙二醇的情況中與骨髓瘤細胞系PAI的細胞融合?？梢栽诤屑s30%至約50%的分子量4000左右的聚乙二醇的溶液中融合骨髓瘤細胞與3至20倍過量的來自經(jīng)過免疫的小鼠的脾細胞。融合后，如上文所描述的那樣在合適的培養(yǎng)基中擴充細胞，以有規(guī)律的時間間隔補充選擇培養(yǎng)基，例如HAT培養(yǎng)基，以便阻止正常的骨髓瘤細胞長得超過想要的雜交瘤細胞。還公開了包含插入物的重組DNA，所述插入物編碼如上文所描述的針對VHZ的抗體的重鏈可變域和/或輕鏈可變域。根據(jù)定義，此類DNA包含編碼單鏈DNA、由所述編碼DNA構(gòu)成及其互補DNA構(gòu)成的雙鏈DNA、或這些互補(單鏈)DNA自身。此外，編碼針對VHZ的抗體的重鏈可變域和/或輕鏈可變域的DNA可以是以酶促方式或以化學方式合成的DNA，其具有編碼重鏈可變域和/或輕鏈可變域的真實DNA序列或其突變體。真實DNA的突變體是編碼上文所提及抗體的重鏈可變域和/或輕鏈可變域的DNA，其中刪除一個或多個氨基酸或者一個或多個氨基酸用一個或多個其它氨基酸替換。修飾可以在抗體的重鏈可變域和/或輕鏈可變域的CDR外。還意圖此類突變型DNA是沉默突變體，其中一個或多個核苷酸用其它核苷酸替換，新的密碼子編碼相同的氨基酸。此類突變型序列也是簡并序列。簡并序列在遺傳密碼的意義內(nèi)是簡并的，即不限數(shù)目的核苷酸用其它核苷酸替換，而不導(dǎo)致最初編碼的氨基酸序列的變化。此類簡并序列由于它們不同的限制性位點和/或特定宿主(特別是大腸桿菌)優(yōu)選的特定密碼子的頻率(以便獲得重鏈鼠可變域和/或輕鏈鼠可變域的最佳表達)而可以是有用的。術(shù)語突變體意圖包括依照本領(lǐng)域已知的方法通過在體外誘變真實DNA來獲得的突變體。為了裝配完整的四聚體免疫球蛋白分子和表達嵌合抗體，融合編碼重鏈和輕鏈可變域的重組DNA插入物與編碼重鏈和輕鏈恒定域的相應(yīng)DNA，然后轉(zhuǎn)移入合適的宿主細胞中，例如在摻入雜合載體中后。還公開了包含如下插入物的重組DNA，所述插入物編碼與人恒定域g，例如Yl、Y2、γ3或γ4，諸如Yl或Y4融合的針對VHZ的抗體的重鏈鼠可變域。同樣的，還公開了包含如下插入物的重組DNA，所述插入物編碼與人恒定域κ或λ諸如κ融合的針對VHZ的抗體的輕鏈鼠可變域。在另一個實施方案中，我們公開了編碼重組多肽的重組DNA，其中重鏈可變域和輕鏈可變域經(jīng)由間隔物基團而相連接，任選地，包含便于在宿主細胞中加工抗體的信號序列和/或編碼便于純化抗體的肽和/或切割位點和/或肽間隔物和/或效應(yīng)分子的DNA。意圖編碼效應(yīng)分子的DNA是編碼在診斷或治療應(yīng)用中有用的效應(yīng)分子的DNA。如此，特別指明如下的效應(yīng)分子，其是毒素或酶，特別是能夠催化前藥活化的酶。編碼此類效應(yīng)分子的DNA具有天然存在的酶的序列或者毒素編碼DNA，或其突變體，并且可以通過本領(lǐng)域公知的方法來制備。用途可以在檢測生物學樣品中存在的VHZ多肽的方法中使用抗VHZ抗體，其通過包括如下各項的方法來進行(a)提供抗VHZ抗體；(b)在容許形成抗體_抗原復(fù)合物的條件下將生物學樣品與所述抗體一起溫育；并(c)測定是否形成包含所述抗體的抗體-抗原復(fù)合物。合適的樣品包括提取物組織諸如腦、乳房、卵巢、肺、結(jié)腸、胰、睪丸、肝、肌肉和骨組織或者來自自此類組織衍生的贅生性生長。具體地，樣品可以包含乳房組織，諸如來自懷疑患有乳腺癌的個體的乳房組織?？梢詫⒖贵w結(jié)合至固體支持物和/或在合適的容器中與合適的試劑、對照、指令等一起包裝入試劑盒中?？贵w投遞可以依靠本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如通過使用脂質(zhì)體、聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物、聚酰胺型胺類(polyamidoamine，PAMAM)樹狀聚物、HEMA、線性聚酰胺型胺類聚合物等)等將針對VHZ蛋白的抗體投遞入細胞中。也可以將免疫球蛋白和/或抗體作為蛋白質(zhì)融合物或與能夠穿越質(zhì)膜和/或核膜的蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物投遞入細胞中。例如，可以將免疫球蛋白和/或靶物與來自負責移位活性的此類蛋白質(zhì)的域或序列融合或偶聯(lián)。移位域和序列可以包括來自HIV-I反式活化蛋白(Tat)、果蠅(Drosophila)觸角(Antennapedia)同源域蛋白和單純皰疹_1病毒VP22蛋白的域和序列。藥用組合物和施用雖然有可能單獨施用抗VHZ劑，包括VHZ核酸、多肽、其片段、同源物、變體或衍生物，調(diào)控劑、激動劑或拮抗劑，結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物，或任一者的酸式鹽，可以將活性成分配制為藥學配制劑。因此，我們還公開了包含抗VHZ劑的藥用組合物。此類藥用組合物可用于向個體投遞抗VHZ劑諸如以如所描述的組合物的形式以治療或減輕癥狀，如所描述的。本文件的上下文中的藥用組合物是至少包含抗VHZ劑(作為活性成分)的物質(zhì)組合物。藥學配制劑包含有效量的抗VHZ劑以及一種或多種藥學可接受載體?！坝行Я俊敝缸阋詼p輕如所描述的疾病的至少一種癥狀的量。根據(jù)要治療或減輕的特定疾病或綜合征、以及其它因素，包括患者的年齡和重量、疾病等狀態(tài)是何種程度的晚期、患者的一般健康、癥狀的嚴重程度、和抗VHZ劑是單獨施用還是與其它療法組合施用，有效量會有所變化。合適的藥學可接受載體是本領(lǐng)域公知的，并且隨藥學配制劑的想要的施用形式和模式而變化。例如，它們可以包括稀釋劑或賦形劑諸如填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、表面活性劑、滑潤劑等。通常，載體是固體、液體或可蒸發(fā)的載體，或其組合。每種載體應(yīng)當是“可接受的”，其意義為與配制劑中的其它成分是相容的而且對患者無害。載體應(yīng)當是生物學可接受的，在給宿主施用時不會引發(fā)不利反應(yīng)(例如免疫應(yīng)答)。涵蓋的是，藥用組合物的活性成分在例如減輕癌癥、腫瘤、新生物和其它相關(guān)疾病中展現(xiàn)出治療活性?？梢哉{(diào)整劑量方案來提供最佳的治療響應(yīng)。例如，可以每天施用數(shù)個分劑或者可以根據(jù)治療狀況的緊急事件所指明的按比例降低劑量?？梢砸苑奖愕姆绞街T如通過口服、靜脈內(nèi)(在水溶性的情況中)、肌肉內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或栓劑路徑或植入(例如使用緩慢釋放分子)來施用活性化合物。根據(jù)施用路徑，活性成分可能需要被包被在某種材料中以保護所述成分免于可滅活所述成分的酶、酸和其它天然條件的作用?？梢詥为毜鼗蚺c其它治療劑組合地施用抗VHZ劑。適合于本文中使用的其它治療劑是對預(yù)期目的有效的任何相容性藥物或與藥劑配制劑互補的藥物?？梢耘c其它治療同時或者序貫施用聯(lián)合療法中利用的配制劑，使得實現(xiàn)聯(lián)合效果?？诜┯迷谝恍嵤┓桨钢校钥诜M合物形式提供并相應(yīng)施用VHZ活性、表達或量的抑制劑。VHZ活性、表達或量的抑制劑的劑量可以在約Img/天至約IOmg/天之間?？梢栽谄瑒?、膠囊或溶液形式的口服配制劑中施用藥用組合物。每天給患者施用1至3次有效量的口服配制劑，直至疾病的癥狀得到減輕。藥劑的有效量取決于患者的年齡、重量和狀況。一般而言，藥劑的日口服劑量小于1200mg，且大于lOOmg。日口服劑量可以是約300_600mg。方便地以單位劑量形式呈現(xiàn)口服配制劑，并且可以通過藥學領(lǐng)域已知的任何方法來制備。組合物可以與合適的藥學可接受載體一起配制成任何想要的劑量形式。典型的單位劑量形式包括片劑、丸劑、粉劑、溶液、懸浮液、乳液、粒劑、膠囊、栓劑。一般而言，如下制備配制劑，即均一且密切地達到藥劑組合物與液體載體或細碎的固體載體或兩者的關(guān)聯(lián)，并在必要時，使產(chǎn)物成形。可以以液體、粉劑、片劑或膠囊形式將活性成分摻入各種基本材料中以給出有效量的活性成分來治療疾病?？梢赃m當?shù)嘏c例如惰性稀釋劑或可同化的、可食用的載體一起口服施用組合物，或者它可以裝入硬殼或軟殼明膠膠囊中，或者它可以壓制成片劑，或者它可以直接與飲食食物一起摻入。為了口服治療性施用，可以將活性化合物與賦形劑一起摻入，并且以可攝食的片劑、口含片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、速溶片(wafer)等形式使用。會獲得此類合適劑量的此類治療有用組合物中的活性化合物的量。片劑、錠劑、丸劑、膠囊等還可以含有下列成分粘合劑諸如黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑諸如磷酸二鈣；崩解劑諸如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、褐藻酸等；潤滑劑諸如硬脂酸鎂；并可以添加甜味劑諸如蔗糖、乳糖或糖精或調(diào)味劑諸如薄荷、冬青油、或櫻桃調(diào)味劑。在劑量單位形式是膠囊時，在上述類型的材料外，它可以含有液體載體。多種其它材料可以作為涂層存在或者以其它方式修飾劑量單位的物理形式。例如，可以用紫膠/蟲膠、糖或兩者包被片劑、丸劑、或膠囊。糖漿或酏劑可以含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、染料和調(diào)味劑諸如櫻桃或桔香料。當然，制備任何劑量單位形式中所使用的任何材料應(yīng)當是藥學上純的，且所采用的量基本上無毒。另外，可以將活性化合物摻入持續(xù)釋放制劑和配制劑中?？勺⑸浠蜢o脈內(nèi)施用在一些實施方案中，作為可注射或靜脈內(nèi)組合物提供并相應(yīng)施用抗VHZ劑?？筕HZ劑抑制劑的劑量可以在約5mg/kg/2周至約10mg/kg/2周之間。可以以10_300mg/天之間，諸如至少30mg/天，小于200mg/天或30mg/天至200mg/天之間的劑量提供抗VHZ劑抑制劑。適合于可注射使用的藥學形式包括無菌水溶液(在水溶性的情況中)或分散體和供即時制備無菌可注射溶液或分散體用的無菌粉劑。在所有情況中，所述形式必須是無菌的，而且必須有存在容易的可注射性的程度的流動性。它在制造和貯存條件下必須是穩(wěn)定的，而且必須針對微生物諸如細菌和真菌的污染作用進行保存/防腐。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物、和植物油?？梢岳缤ㄟ^使用涂層諸如卵磷脂、在分散體的情況中通過維持所要求的粒度、及通過使用表面活性劑來維持適當?shù)牧鲃有?。表面施用本文所公開的藥用組合物包括那些適合于表面和口服施用的，其中表面配制劑在受累組織主要是皮膚或表皮(例如，銀屑病、濕疹和其它表皮疾病)的情況中是優(yōu)選的。表面配制劑包括如下那些藥學形式，其中通過與要治療的皮膚表面直接接觸來外部應(yīng)用所述組合物。供表面應(yīng)用的常規(guī)藥學形式包括浸泡液、軟膏劑、乳劑、洗劑、糊劑、凝膠、貼片(stick)、噴霧劑、氣霧劑、沐浴油、溶液等。通過各種媒介物投遞表面療法，媒介物的選擇可以是重要的，并且一般涉及要治療的是急性還是慢性疾病。作為一個例子，一般用水性干燥制劑治療急性皮膚增殖疾病，而用水合制劑治療慢性皮膚增殖疾病。浸泡液是干燥急性潮濕疹的最早方法。洗劑(水懸浮液中的粉末)和溶液(溶解于溶劑中的藥療)對于多毛和擦爛區(qū)域是理想的。軟膏劑或油包水乳劑是最有效的水合劑，適合于干燥的鱗屑疹，但是是多脂的，并且取決于損傷位置有時是不想要的。在適當時，它們可以與繃帶聯(lián)合應(yīng)用，特別在想要提高藥劑組合物透入損傷中時。乳劑或水包油乳劑和凝膠是可吸收的，并且在美容方面是患者最可接受的(Guzzo等，于Goodman&Gilman’sPharmacologicalBasisofTherapeutics，第9版，第1593頁-第15950頁(1996))。一般而言，乳劑配制劑包括如下成分，諸如石油、羊毛脂、聚乙二醇、礦物油、甘油、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸甘油酯、鯨蠟硬脂醇(cetearylalcohol)、醋酸生育酷(tocopherylacetate)、肉豆蓮酸異丙酉旨(isopropylmyristate)、羊毛脂醇、西甲硅油(simethicone)、卡波姆(carbomen)、甲基氯異噻唑啉酮(methylchlorisothiazolinone)、甲基異噻唑啉酮(methylisothiazolinone)、環(huán)甲娃油(cyclomethicone)和羥丙基甲基纖維素，以及其混合物。供表面應(yīng)用的其它配制劑包括洗發(fā)劑、肥皂、搖蕩劑等，特別是那些配制成在下面的皮膚諸如頭皮上留下殘留物的(Arndt等，于DermatologyInGeneralMedicine22838(1993))。一般而言，表面配制劑中的組合物濃度為約0.5至50%(按組合物的重量計)，諸如約1至30%，約2-20%，或約5-10%的量。最初，所使用的濃度可以在范圍的上部部分中，隨著治療繼續(xù)，可以降低濃度或者配制劑的應(yīng)用頻率可以更小。表面應(yīng)用通常每天應(yīng)用兩次。然而，較大劑量的每天一次應(yīng)用或較小劑量的較頻繁應(yīng)用可以是有效的。角質(zhì)層可以起貯器作用，并容許藥物在延長的一段時間里逐漸滲透入活的皮膚層中。在表面應(yīng)用中，足夠量的活性成分必須滲透患者的皮膚，以便獲得想要的藥理學效果。一般了解的是，藥物向皮膚中的吸收是藥物性質(zhì)、媒介物行為、和皮膚的函數(shù)。三個主要變量導(dǎo)致不同表面藥物或不同媒介物中的相同藥物的吸收或流出速率；媒介物中的藥物濃度、角質(zhì)層和媒介物之間的藥物分配系數(shù)和角質(zhì)層中的藥物擴散系數(shù)不同。為了有效治療，藥物必須穿越負責皮膚屏障功能的角質(zhì)層。一般而言，施加高的體外皮膚滲透的表面配制劑在體內(nèi)是有效的。Ostrenga等(J.Pharm.Sci.,601175-1179(1971))證明了表面應(yīng)用的類固醇的體內(nèi)功效與體外類固醇進入取皮的(dermatomed)人皮膚中的滲透速率(rate)成比例?？梢詫⑵つw病學可接受的且與藥劑相容的皮膚滲透增強劑摻入配制劑中以提高活性化合物自皮膚表面進入表皮角質(zhì)形成細胞中的滲透。提高活性化合物進入皮膚的吸收的皮膚增強劑降低有效治療所需要的藥劑量，并提供持續(xù)更長的配制劑效果。皮膚滲透增強劑是本領(lǐng)域公知的。例如，已知二甲亞砜(美國專利No.3，711，602)；油酸、1，2_丁二醇表面活性劑(Cooper,J.Pharm.Sci.,731153-1156(1984))；乙醇和油酸或油醇的組合(EP267，617)、2_乙基-1，3-己二醇(W087/03490)；癸基甲基亞砜和Azone.RTM.(Hadgraft,Eur.J.Drug.Metab.Pharmacokinet，21165-173(1996))；醇、亞砜、脂肪酸、酯、Azone.RTM.、吡咯烷酮、尿素和多元醇(polyoles)(Kalbitz等，Pharmazie,51:619_637(1996))；萜諸如1，8_桉油素、薄荷酮、檸檬烯和橙花叔醇(Yamane，J.Pharmacy&Pharmocology，47:978-989(1995))；Azone.RTM.禾口Transcutol(Harrison等，PharmaceuticalRes.13542-546(1996))；和油酸、聚乙二醇和丙二醇(Singh等，Pharmazie，51:741_744(1996))改善活性成分的皮膚滲透?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來確定藥劑或組合物的滲透水平。例如，對活性化合物放射性標記，接著測量皮膚吸收的放射性標記的化合物的量使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用測定測試化合物的皮膚滲透的數(shù)種方法之任一種來測定所吸收的組合物的水平。涉及皮膚滲透研究的出版物包括Reinfenrath，WG和GSHawkins.TheWeaningYorkshirePigasanAnimalModelforMeasuringPercutaneousPenetration.于SwineinBiomedicalResearch(M.E.Tumbleson編)Plenum,NewYork,1986,禾口Hawkins,G.S.MethodologyfortheExecutionofInVitroSkinPenetrationDeterminations.于:MethodsforSkinAbsorption,BWKemppainen禾口WGReifenrath編，CRCPress,BocaRaton，1990，第67頁-第80頁；及W.G.Reifenrath，Cosmetics&Toiletries，1103-9(1995)。對于一些應(yīng)用，可以使用本領(lǐng)域已知的配制劑諸如聚合物來施用長效形式的藥劑或組合物。可以依照本領(lǐng)域已知的方法將藥劑摻入皮膚貼片(Jimginger，H.E.，于ActaPharmaceuticaNordica4:117(1992)；Thacharodi等，于Biomaterials16:145-148(1995)；NiednerR.，于Hautarzt39:761-766(1988))或繃帶中，以提高向要治療的區(qū)域投遞藥物的功效。任選地，本文所描述的表面配制劑可以具有例如別的賦形劑；防腐劑諸如對羥基苯甲酸甲酯、苯甲醇、山梨酸或季銨化合物；穩(wěn)定劑諸如EDTA，抗氧化劑諸如丁羥甲苯或丁羥茴醚，和緩沖劑諸如檸檬酸鹽和磷酸鹽。胃腸外施用也可以胃腸外或腹膜內(nèi)施用活性化合物。也可以在甘油、液體聚乙二醇、及其混合物中和在油中制備分散體。在一些實施方案中，可以在30%Capsitol(CyDex，Inc.,Lenexa,Kansas,USA)中制備分散體。Capsitol是一種聚陰離子β_環(huán)糊精衍生物，其中磺酸鈉鹽通過丁基醚間隔基團，或磺丁基醚(SBE)與親脂性空穴分開。環(huán)糊精可以是SBE7-3-CD。佐劑組合物可以在佐劑中施用，與酶抑制劑共施用或者在脂質(zhì)體中施用。佐劑以其最廣義使用，并且包括任何免疫刺激化合物諸如干擾素。本文中所涵蓋的佐劑包括間苯二酚、非離子表面活性劑諸如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制劑包括胰腺胰蛋白酶。脂質(zhì)體包括水包油包水CGF乳劑以及常規(guī)的脂質(zhì)體。微生物生長的預(yù)防在貯存和使用的通常條件下，這些制劑可以含有防腐劑以阻止微生物生長?？梢酝ㄟ^各種抗細菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等來引起對微生物作用的預(yù)防。在許多情況中，有可能包括等張劑，例如糖或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中使用延遲吸收的藥劑例如單硬脂酸鋁和明膠來引起可注射組合物的吸收延長。如下制備無菌可注射溶液，即在根據(jù)需要含有上文所列舉的各種其它成分的合適溶劑中摻入需要量的活性化合物，接著進行過濾滅菌。一般而言，分散體通過將經(jīng)過滅菌的活性成分摻入無菌媒介物中而制備，所述無菌媒介物含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自那些上文所列舉的成分的所需其它成分。在供制備無菌可注射溶液用的無菌粉劑的情況中，制備方法可以包括真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其自先前經(jīng)過無菌過濾的溶液產(chǎn)生含有活性成分加任何別的所需成分的粉末。藥學可接受載體如本文中所使用的，“藥學可接受載體和/或稀釋劑”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑等。對藥學活性物質(zhì)使用此類介質(zhì)和藥劑是本領(lǐng)域公知的。除非任何常規(guī)的介質(zhì)或藥劑與活性成分不相容，涵蓋其在治療性組合物中的應(yīng)用。還可以將補充性的活性成分摻入組合物中。劑量單位形式為了容易施用和劑量的一致性，以劑量單位形式配制藥用組合物是特別有利的。如本文中所使用的，劑量單位形式指物理上離散的單元，適合作為要治療的受試者的單一劑量；每個單元含有與所需要的藥學載體聯(lián)合的，預(yù)先確定數(shù)量的活性材料，其根據(jù)計算，產(chǎn)生想要的治療效果。新的劑量單位形式的規(guī)格由下述各項規(guī)定，并直接取決于下述各項(a)所述活性材料的獨特特性和要達到的具體治療效果，和(b)本領(lǐng)域配合此類活性材料以治療身體健康受損的具有患病狀況的活受試者中的疾病所固有的限制。為了方便且有效的施用，主要的活性成分以有效量與合適的藥學可接受載體在劑量單位形式中配合。在含有補充性的活性成分的組合物的情況中，通過參照施用所述成分的通常劑量和方式來確定劑量。實施例實施例1:VHZ-EGFP、VHZ(C95S)-EGFP,VHZ-GST、和VHZ(C95S)-GST表達構(gòu)建體的生成在VHZ片段的生成中使用人通用快速克隆IIcDNA文庫(BD，產(chǎn)品目錄編號637260)作為模板。使用正向弓I物A:5，gcgaattcaccatgggcgtgcagccccccaacttctcc3，禾口反向引物B:5’gtggatcccgtttcgttcgctggtag3，來實施PCR(94，55，72°C，40個循環(huán))。然后將VHZPCR片段插入pEGFP-Nl載體的EcoRI和BamHI位點中，產(chǎn)生C端加有EGFP標簽的VHZ(VHZ-EGFP)。為了構(gòu)建VHZ(C95S)，如先前所描述的那樣(Zeng等2003)在類似的策略中使用上述正向引物A和反向引物B以及中部反向引物5’gccaaagcccagagcagagtgcactcccacagc3，和中部正向弓丨物5，gcgaattcaccatgggcgtgcagccccccaacttctcc3，以制備沒有催化活性的VHZ(C95S)。然后將VHZ(C95S)PCR片段插入pEGFP-Nl載體的EcoRI和BamHI位點中以形成C端加有EGFP標簽的突變型VHZ，即VHZ-(C95S)-EGFP。分別將VHZ和VHZ(C95S)PCR產(chǎn)物插入pGEX-KG中以形成VHZ-GST和VHZ(C95S)-GST。通過對編碼區(qū)進行DNA測序來確認所有克隆。實施例2穩(wěn)定表達VHZ-EGFP、VHZ-EGFP(C95S)和單獨的EGFP載體的MCF-7禾口NRK細胞集合的生成使用Lipofectamine2000(Invitrogen)來將三種表達構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細胞系MCF-7(ATCCHTB-22)或正常大鼠腎細胞NRK(ATCCCRL-6509)中。將細胞在補充有10%胎牛血清和2mML-谷氨酰胺(Invitrogen)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在Img/mlG418中選擇細胞達20-30天以建立穩(wěn)定細胞集合。然后通過FACSVantage，SE模式(BectonDickinson)對穩(wěn)定集合(IO6個細胞/ml)進行EGFP分選以選擇EGFP陽性細胞。實施例3對VHZ-EGFP亞細胞定位進行的共焦顯微術(shù)和分析將用VHZ-EGFP表達載體轉(zhuǎn)染的NRK細胞在蓋玻片上培養(yǎng)，并用PBSCM(含有ImMMgCl2和ImMCaCl2的PBS)清洗一次。然后在2.7%低聚甲醛中于室溫(RT，24°C)固定細胞達20分鐘。用PBSCM再清洗兩次后，用PBSCM中的0.12%皂苷透化細胞達15分鐘，并與來自Covance，Inc(Princeton,NJ)的家兔抗粒周蛋白抗體一起于RT溫育1小時，然后于4°C過夜。用PBSCM溫和地清洗細胞三次，并與偶聯(lián)有德克薩斯紅的抗小鼠IgG(Sigma)—起于RT溫育4小時。通過熒光顯微術(shù)來直接顯現(xiàn)VHZ-EGFP(綠色)。實施共焦成像(ZeissLSM510圖像瀏覽器)。實施例4小鼠單克隆和家兔多克隆抗VHZ抗體的生成先前描述了該方法(Li等，2005)。我們使用CIonaCeIItm-HY雜交瘤克隆試劑盒(StemcellTechnologiesInc.)來生成VHZ雜交瘤。融合自用VHZ-GST免疫的小鼠衍生的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞后，分離出506個存活的雜交瘤克隆，并培養(yǎng)。首先通過ELISA對所有克隆測試VHZ結(jié)合。80個克隆顯示出與VHZ的良好反應(yīng)，而選擇具有最強反應(yīng)性的兩個特定VHZ克隆，因為這兩個克隆能在數(shù)種應(yīng)用中使用(圖10)。生成家兔多克隆抗VHZ血清(GenemedSynthesis，Inc.)。通過用與人VHZ的氨基酸殘基(126-140)對應(yīng)的合成肽CRRLRPGSIETYEQEK免疫家兔來生成抗體。通過蛋白A，然后通過肽親和層析來純化抗體。在對自數(shù)種細胞系衍生的細胞溶胞物的免疫印跡分析中通過此抗體檢測出具有預(yù)期大小(16kDa)的特定條帶，并且此條帶的檢測受到VHZ-GST融合蛋白特異性阻斷(圖10A)。實施例5對NRK、MCF_10A、和A431細胞中的內(nèi)源性VHZ進行的共焦顯微術(shù)和分析將NRK細胞、人乳房上皮細胞MCF-10A(ATCCCRL-10317)、和人上皮癌瘤細胞A431(ATCCCRL-1555)在蓋玻片上培養(yǎng)，并用PBSCM(含有ImMMgCl2禾口ImMCaCl2的PBS)清洗一次。然后在100%甲醇中于-20°C固定細胞達15分鐘。用PBSCM再清洗兩次后，用PBSCM中的0.12%皂苷透化細胞達15分鐘，并與小鼠抗γ-微管蛋白(Sigma)和家兔抗VHZ抗體(1150稀釋)一起于RT溫育1小時，然后于4°C過夜。用PBSCM溫和地清洗細胞三次，并與偶聯(lián)有德克薩斯紅的抗小鼠IgG(Sigma)和偶聯(lián)有FITC的抗家兔IgG(Sigma)一起于RT溫育4小時。實施共焦成像(ZeissLSM510圖像瀏覽器)。實施例6酪氨酸磷酸酶測定法使用EnzChek試劑盒(Invitrogen，R22065)。按照制造商的方案，在測定孔中用緩沖液重建熒光底物；將想要的潛在的PTP酶(每種蛋白質(zhì)VHZ-GST、VHZ-GST+磷酸酶抑制劑、VHZ(C95S)-GST、和對照GST為0.675皮摩爾)添加至各孔，并分別溫育30分鐘或90分鐘。然后使用GeminiXPS微量板熒光分光光度計(MolecularDevices)量化熒光。以10分鐘的時間間隔分別在358和452nm的激發(fā)和發(fā)射波長測量熒光。在測定法中使用磷酸酶抑制劑原釩酸鈉(10μM)作為陰性對照。實施例7通過BrdU標記來測量新合成的DNA通過使用APCBrdU流動試劑盒(BDPharmingen)依照制造商的方案測量新合成的DNA來評估細胞增殖。使用WinMDI2.8軟件來分析FACS數(shù)據(jù)。測定APC標記的細胞(FL2)的百分比。實施例8=Western印跡分析詳細的步驟如先前所描述的(Li等，2005)。以1500稀釋度使用家兔抗VHZ抗體。磷酸-Rb(Ser780)、磷酸-Rb(Ser795)、磷酸-Rb(Ser807/811)、和b_肌動蛋白抗體來自CellSignalingTechnology(Beverly,MA)。GAPDH抗體來自SantaCruzBiotechnology(SantaCruz)。實施例9免疫組織化學(IHC)我們對人乳腺癌標本調(diào)查VHZ蛋白表達。用VECTASTAINABC試劑盒(OrtonSouthgate,Peterborough,England)，使用家兔抗VHZ抗體(1300稀釋)來實施IHC實驗。自HenanMedicalHospital病理科的檔案收集原發(fā)性人乳腺癌樣品的總共65份福爾馬林固定的且石蠟包埋的手術(shù)標本。另外，人乳腺癌瘤組織陣列TMA(CC08-ll-008)購自Cybrdi(Frederick)以再次確認結(jié)果。先前描述了IHC方法(Li等，2005)。購買E-鈣粘著蛋白抗體(CellSignalingTechnology)。實施例10:MCF-7-VHZ-EGFP和MCF-7-VHZ(C95S)-EGFP細胞運動性我們?nèi)缦惹八枋龅哪菢舆M行評估(Sherri等，2006)。通過將細胞在蓋玻片(12mm)上以匯合的單層鋪片，然后將經(jīng)細胞包被的蓋玻片倒置，細胞一側(cè)向下至新鮮的培養(yǎng)皿(35mm)。溫和地將新鮮的培養(yǎng)基(2ml含10%FBS的RPMI)添加入該皿中。在O小時和48小時時拍攝圖像。實施例11通過逆轉(zhuǎn)錄病毒生成和感染建立表達VHZ-EGFP和VHZ(C95S)-EGFP的MCF-IOA穩(wěn)定集合分別將VHZ和VHZ(C95S)PCR片段克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pBABEpuro)的EcoRI和BamHI酶位點中。使用Lipofectamine依照制造商的指令(Invitrogen)分別用pBABEpuro-VHZ或pBABEpuro_VHZ(C95S)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染雙嗜性Phoenix包裝細胞。48小時后，收集逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，過濾(0.4511111;1^11丨01^)，并在存在5118/1111Polybrene(Sigma-Aldrich)的情況中添加至靶MCFlOA細胞上達6_8小時。完成兩次感染。感染后，用嘌呤霉素(lyg/ml)選擇細胞達1周，之后進行分析。實施例12傷口愈合測定法中的MCF-IOA-VHZ-EGFP和MCF-IOA-VHZ(C95S)-EGFP細胞運動性通過用黃色移液頭產(chǎn)生傷口來在細胞單層上實施測定法。用PBS清洗后，將細胞在新鮮的培養(yǎng)基中進行連續(xù)性溫育。在測定法開始時(O小時，上部小圖)和結(jié)束時(8小時，下部小圖)為受傷區(qū)域拍照。實施例13內(nèi)源性VHZ定位于中心體中并遍及胞質(zhì)測定蛋白質(zhì)的胞內(nèi)定位有時能提供關(guān)于蛋白質(zhì)可能的生物學功能的線索。為了評估VHZ的亞細胞定位，我們生成穩(wěn)定表達VHZ-EGFP的NRK細胞。對這些細胞進行的共焦顯微術(shù)顯示，VHZ具有一系列亞細胞定位。在質(zhì)膜和胞質(zhì)處發(fā)現(xiàn)EGFP信號(圖1A)。重要的是，加有EGFP標簽的VHZ在中心體中的富集在細胞周期的所有階段中都是明顯的，因為它與中心體標志物-粒周蛋白共定位(圖1B)。內(nèi)源性VHZ定位于中心體和胞質(zhì)中。加有EGFP標簽的VHZ蛋白提供關(guān)于其亞細胞定位的有用信息。為了理解VHZ的因果性質(zhì)(causalnature)，有必要檢查內(nèi)源性VHZ蛋白的亞細胞分布。使用用親和純化的家兔多克隆抗VHZ抗體連同小鼠單克隆(mAb)抗Y-微管蛋白(另一種中心體標志物)抗體進行的雙重免疫熒光標記，在NRK細胞中(圖2A，小圖A-C)和在MCF-10A細胞中(圖2A，小圖D-F)在中心體中清楚地看到內(nèi)源性VHZ與γ-微管蛋白共定位。另外，抗VHZ單抗與家兔多克隆抗粒周蛋白抗體一起再次顯示，內(nèi)源性VHZ在Α431細胞中被共定位至中心體(圖2Α，小圖G-I)。血清饑餓后，內(nèi)源性VHZ從細胞質(zhì)移位至細胞核，在中心體中富集。將NRK細胞進行血清饑餓過夜。用家兔抗VHZ抗體和抗Y-微管蛋白mAb進行雙重免疫熒光標記，觀察到內(nèi)源性VHZ蛋白在中心體中是更集中的。此外，在NRK細胞中令人驚訝地觀察到胞質(zhì)分布的降低及伴隨地細胞核中的升高(圖2Β)。實施例14=VHZ是蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶為了證實VHZ確實是活性酪氨酸磷酸酶，我們測定VHZ-GST或沒有催化活性的VHZ(C95S)-GST融合蛋白的PTP活性，與作為對照蛋白質(zhì)的單獨的GST比較。通過將Cys95突變成Ser或者通過將磷酸酶抑制劑(原釩酸鈉)添加入測定法中，VHZ-GST的PTP酶活性被消除，其表現(xiàn)為漸增的藍色熒光(激發(fā)/發(fā)射最大值約358/452nm)(圖3A，小圖A)。實施例15=VHZ通過促進G1/S轉(zhuǎn)換來增強細胞增殖VHZ與中心體的關(guān)聯(lián)給我們提示，VHZ可在控制細胞周期調(diào)控中具有潛在功能。為了對此進行測試，我們生成穩(wěn)定表達三種不同表達構(gòu)建體1.VHZ-EGFP；2.VHZ(C95S)-EGFP；和3.EGFP載體的MCF-7細胞。對3種穩(wěn)定集合分析其細胞增殖。發(fā)現(xiàn)VHZ能夠增強細胞增殖速率(數(shù)據(jù)未顯示)。為了確認此觀察結(jié)果，使用APC-BrdU進入新合成的DNA中的摻入來在這三種細胞系中測量DNA合成速率。實驗顯示表達VHZ-EGFP的細胞中的BrdU摻入顯著高于表達VHZ(C95S)-EGFP或單獨的EGFP載體的細胞(圖3B)。通過對穩(wěn)定表達相同的三種表達構(gòu)建體的NRK細胞的FACS分析也獲得類似的結(jié)果，并暗示VHZ能通過減少Gl但增加S群體來加速G/S轉(zhuǎn)換(圖3C)。這提出如下的可能性，即野生型VHZ可在G1/S期行進中具有作用。實施例16=VHZ能間接引起視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Rb)的超磷酸化為了了解VHZ如何能促進G1/S期轉(zhuǎn)換和為了解決可能的分子機制，我們對調(diào)控細胞周期自Gl行進至S期中重要的數(shù)種主要分子實施免疫印跡研究。我們發(fā)現(xiàn)VHZ能下調(diào)腫瘤抑制蛋白p21Wafl/Cipl，及上調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶(Cdk)4。Cdk4是決定Gl向S期行進的主要參與物之一，并且能使視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白PRB磷酸化(Sherr和Roberts，1999)。與此一致，我們顯示VHZ磷酸酶的過表達能間接導(dǎo)致Rb在殘基Ser780、Ser795、和Ser807/811處的磷酸化積累，如通過磷酸特異性抗體所評估的(圖4A，第3道)。實施例17在人乳腺癌上皮的中心體(約10%)或胞質(zhì)(約17%)中找到過量生成的VHZ蛋白VHZ與PRL-3磷酸酶共享28%的氨基酸序列相似性?；赑RL-3是與結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的磷酸酶的實情(Saha等，2001)，我們假設(shè)VHZ磷酸酶可能具有牽涉一些癌癥的轉(zhuǎn)移的類似功能。為了調(diào)查VHZ與多份人癌癥標本之間的關(guān)系，使用親和純化的抗VHZ家兔抗體來進行免疫組織化學以評估VHZ蛋白表達。我們發(fā)現(xiàn)VHZ過表達優(yōu)先與乳腺癌有關(guān)。65份乳腺癌樣品(30份IDC/ILCI期，35份IDCII期)中，6份在中心體中表達高水平的VHZ蛋白，這得到用家兔抗VHZ和中心體標志物小鼠抗Y_微管蛋白對癌癥樣品的同一切片進行的雙重免疫熒光(圖5A)和用家兔抗VHZ抗體或小鼠抗Y-微管蛋白抗體對兩張相鄰切片進行的單一免疫組織化學(圖5B，小圖A-B)兩者的證明。免疫熒光和免疫組織化學兩者都確認，VHZ在診斷為侵入性導(dǎo)管癌(IDC)或侵入性小葉癌(ILC)I期的一些乳腺癌樣品的中心體中是過表達的(圖8A)。除了VHZ的中心體染色，我們在診斷為IDCII期的乳腺癌樣品的不同子集中找到VHZ的交替(alternate)染色樣式。65份乳腺癌樣品中，11份顯示遍及擴散上皮腫瘤細胞的胞質(zhì)分布的高水平VHZ蛋白，所述擴散上皮腫瘤細胞展示成纖維細胞樣形態(tài)學(圖5C，小圖A-B)(圖8B)。實施例18=VHZ的過表達與乳腺癌中喪失E-鈣粘著蛋白表達相關(guān)聯(lián)因為我們在VHZ蛋白在乳腺癌樣品的擴散成纖維細胞樣細胞中特異性過表達的一些微環(huán)境內(nèi)捕獲到一種出乎意料的現(xiàn)象，我們調(diào)查這些細胞是否正在經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)。EMT在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生過程中發(fā)生，其中上皮細胞獲得成纖維細胞樣特性，并喪失上皮細胞粘附和細胞骨架成分(Thiery和Sleeman，2006)。E-鈣粘著蛋白的喪失導(dǎo)致細胞-細胞粘著連接的分解和體內(nèi)腫瘤細胞侵入性升高，并且是EMT的標志(Kang等，2004)。我們觀察到，大多數(shù)VHZ過表達細胞(紅色箭標示)已經(jīng)喪失E-鈣粘著蛋白的表達(黑色箭標示)(圖6A)，提示這些癌細胞可已經(jīng)經(jīng)歷整個EMT過程。實施例19:MCF-7細胞中的VHZ過表達增強細胞遷移因為在乳腺癌行進過程中VHZ表現(xiàn)為與EMT有關(guān)，然后我們測試VHZ是否能在觸發(fā)癌細胞遷移中起作用。為了研究由VHZ驅(qū)動的細胞遷移，對表達VHZ-EGFP或VHZ(C95S)-EGFP的MCF-7細胞檢查細胞遷移特性。因為MCF-7細胞的遷移難以使用常規(guī)的傷口愈合或Transwell腔式測定法來測量，我們使用備選的先前所描述的“倒置蓋玻片”測定法(Sherri等，2006)。如顯示的，MCF-VHZ細胞遷移出蓋玻片(圖6B，小圖A，的白色箭)，但是MCF-VHZ(C95S)細胞保留在蓋玻片內(nèi)(圖6B，小圖B’的白色箭)。結(jié)果提示，VHZ能夠促進細胞遷移。使用永生化的人乳房上皮-MCFlOA細胞來進一步調(diào)查VHZ在促進細胞遷移中的特性(圖10)。實施例20討論我們已經(jīng)顯示，VHZ是新的中心體磷酸酶。中心體是在細胞周期行進和細胞分裂中起關(guān)鍵作用的細胞器。它貫穿細胞周期組織微管排列，并且在減數(shù)分裂和有絲分裂細胞中在調(diào)控細胞分裂中發(fā)揮樞要作用。中心體細胞器的失調(diào)與人類遺傳疾病和癌癥有聯(lián)系。實際上，許多人腫瘤顯示中心體失常(Doxsey，2001；Nigg,2002)0我們的結(jié)果即VHZ在MCF-7細胞和NRK細胞中過表達支持如下結(jié)論，即VHZ磷酸酶可以在細胞周期行進過程中在促進G1/S轉(zhuǎn)換方面起作用。在試圖解決VHZ在促進MCF-7細胞生長中的機械學作用的嘗試中，檢查在G1/S細胞周期控制中起至關(guān)重要的作用的數(shù)種重要分子。我們發(fā)現(xiàn)，VHZ過表達能下調(diào)腫瘤抑制蛋白p21Wafl/Cipl，即細胞周期行進的一種抑制劑。p21Wafl/Cipl用來抑制激酶活性，并阻斷通過G1/S的行進(Pestell等，1999)。VHZ對p21Wafl/Cipl的下調(diào)可以釋放p21對細胞周期蛋白依賴性激酶(Cdk)4的抑制(Sherr和Roberts，1999)。與此相一致，我們發(fā)現(xiàn)，VHZ能上調(diào)Cdk4表達。真核細胞周期進行部分依賴于受到緊密調(diào)控的CDK活性。Cdk4活化能將視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白Rb靶向磷酸化(Lukas等，1996)。因此，VHZ間接引起Rb磷酸化的增強。已知Rb的超磷酸化使Rb經(jīng)由細胞周期的Gl期內(nèi)的限制點控制行進的功能失活(Lukas，等，1996，Sherr,1996)。如此，VHZ過表達能間接經(jīng)由Rb失活來克服G1/S期限制點。雖然需要未來的研究，我們的結(jié)果使我們能夠提出關(guān)于VHZ在細胞周期行進中的作用的工作模型(圖4B)。在一些乳腺癌樣品中，我們發(fā)現(xiàn)VHZ蛋白在上皮腫瘤細胞的中心體(約10%)或胞質(zhì)(約17%)中過表達。VHZ更通常在展示遷移成纖維細胞樣形態(tài)學的癌細胞中過表達。我們觀察到，VHZ中心體陽性細胞顯示就ILC或IDCI期乳腺癌樣品而言的典型的上皮形態(tài)學；而VHZ胞質(zhì)溶膠陽性細胞更通常與IDCII期樣品中分散的上皮有關(guān)。結(jié)果可指明，VHZ可以首先在中心體中，且隨后遍及獲得細胞運動性的腫瘤細胞的整個胞質(zhì)溶膠過表達。值得注意的是，強烈染色的VHZ胞質(zhì)溶膠陽性細胞是E-鈣粘著蛋白陰性。E-鈣粘著蛋白的喪失在將上皮轉(zhuǎn)變成遷移間充質(zhì)細胞的EMT復(fù)雜過程中扮演(play)初始步驟(Kang等，2004)。E-鈣粘著蛋白的喪失導(dǎo)致細胞_細胞粘著連接的分解，并提高腫瘤細胞侵入性。VHZ的上調(diào)能充當啟動EMT，或改變典型的上皮現(xiàn)象以促進細胞遷移的驅(qū)動力之一。癌細胞需要獲得增強的運動性來克服贅生性上皮鄰近物的屏障；導(dǎo)致惡性細胞進入新位置的侵入和長出(Thiery和Sleeman，2006)。腫瘤細胞以多種多樣的樣式(包括個體和集合細胞遷移策略兩者)浸潤周圍組織基質(zhì)(Friedl，2003；Vogelstein和Kinzler，2004)。在我們的研究中，我們顯示個體(圖5C，小圖A)和集合細胞遷移(圖5C，小圖B)兩者均同時存在于VHZ胞質(zhì)溶膠陽性細胞中。這些現(xiàn)象可以重演和代表由體內(nèi)微環(huán)境內(nèi)的VHZ驅(qū)動的局部侵入的相對早期發(fā)作。雖然不知道VHZ在腫瘤行進和癌細胞遷移中發(fā)揮的精確作用，我們的數(shù)據(jù)提示，VHZ的過表達或其升高的活性可以是局部侵入的至關(guān)重要的早期事件。與此假設(shè)相一致，我們能夠顯示，VHZ能增強MCF-7細胞遷移(圖6B)。這里我們的研究提供了如下的證據(jù)，即VHZ是牽涉細胞周期調(diào)控和乳腺癌行進的磷酸酶。我們的發(fā)現(xiàn)揭示對此小磷酸酶作為未來診斷和治療策略中的重要靶物的新了解。我們提出，對VHZ的抑制可以是在早期阻斷乳腺癌轉(zhuǎn)移的擴散的治療辦法的基礎(chǔ)。參考文獻PolyakK.Onthebirthofbreastcancer.BiochimBiophysActa.20011552(1):1_13.綜述新加坡癌癥登記報告No.5“CancerIncidenceinSingapore，1993-1997”2000年出版AlonsoA,BurkhalterS,Sasin,J,TautzL,BogetzJ,HuynhH等(2004a).Theminimalessentialcoreofacysteine-basedprotein-tyrosinephosphataserevealedbyanovel16-kDaVHl-Iikephosphatase,VHZ.JBiolChem279:35768-35774.AlonsoA,SasinJ,BottiniN,FriedbergI,OstermanA,Godzikk等(2004b).Proteintyrosinephosphatasesinthehumangenome.Cell117:699—711.BessetteDC,QiuD,PallenCJ.(2008).PRLPTPs:mediatorsandmarkersofcancerprogression.CancerMetastasisRevDOI10.1007/sl0555-008-9121-3.DoxseyS.(2001).Re-evaluatingcentrosomefunction.NatRevMolCellBiol2:688_698.FriedlP,WolfK.(2003)·Tumour-cellinvasionandmigration!diversityandescapemechanisms.NatRevCancer3:362—374.KangY,MassagueJ.(2004).Epithelial-mesenchymaltransitions:twistindevelopmentandmetastasis.Cell118:277—279.LiJjGuoK，KohVW,TangJPiGanBQ，ShiH，LiHX,ZengQ.(2005).GenerationofPRL-3—andPRL—l—specificmonoclonalantibodiesaspotentialdiagnosticmarkersforcancermetastases.ClinCancerRes11:2195_2204.LukasJ，BartkovaJ，BartekJ.(1996).Convergenceofmitogenicsignal1ingcascadesfromdiverseclassesofreceptorsatthecyclinD-cyclin-dependentkinase-pRb-controlledGlcheckpoint.MolCellBiol16:6917—6925.NiggEA.(2002).C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水平。14.一種鑒定能夠結(jié)合VHZ多肽的分子的方法，該方法包括使VHZ多肽或與其具有至少90%序列同一性的序列與候選分子接觸，并測定所述候選分子是否結(jié)合所述VHZ多肽或與其具有至少90%序列同一性的序列。15.一種鑒定VHZ調(diào)控物的方法，該方法包括使細胞與候選分子接觸，并檢測所述細胞中的或所述細胞的VHZ的表達、量或活性的升高或降低。16.一種鑒定適合于治療、預(yù)防或減輕癌癥的分子的方法，該方法包括測定候選分子是否是VHZ的或與其具有至少90%序列同一性的序列的激動劑或拮抗劑，優(yōu)選地，通過將候選分子暴露于VHZ多肽或表達VHZ多肽的細胞，以便測定所述候選分子是否是其激動劑或拮抗劑來進行。17.一種鑒定VHZ的或與其具有至少90%序列同一性的序列的激動劑或拮抗劑的方法，該方法包括向動物施用候選分子，并測定所述動物是否展現(xiàn)出VHZ的表達、量或活性的升高或降低。18.一種在個體中治療、預(yù)防或減輕癌癥(例如乳腺癌，諸如侵入性或轉(zhuǎn)移性癌癥諸如侵入性導(dǎo)管癌(IDC))的方法，該方法包括調(diào)控個體的細胞中的VHZ表達、量或活性，優(yōu)選地，其中所述VHZ的表達、量或活性在所述個體的乳腺細胞中降低。19.一種在個體中診斷癌癥或?qū)Π┌Y(例如乳腺癌，諸如侵入性或轉(zhuǎn)移性癌癥諸如侵入性導(dǎo)管癌(IDC))的易感性或者對患有癌癥的個體預(yù)后的方法，該方法包括檢測所述個體的細胞中的VHZ的表達、量或活性的調(diào)控。20.一種測定個體中的腫瘤是否是或者是否有可能是侵入性或轉(zhuǎn)移性腫瘤的方法，該方法包括檢測所述個體的腫瘤細胞中的VHZ的表達、量或活性的調(diào)控。21.一種在個體中治療、預(yù)防或減輕癌癥(例如乳腺癌，諸如侵入性或轉(zhuǎn)移性癌癥諸如侵入性導(dǎo)管癌(IDC))的方法，該方法包括檢測所述個體的細胞中的VHZ的表達、量或活性的調(diào)控，并基于所述腫瘤的攻擊性來向所述個體施用合適的療法，諸如抗VHZ劑。22.依照權(quán)利要求18至22任一項的方法，其中通過評估腫瘤大小和/或淋巴結(jié)階段，任選地與其它風險因素一起或組合來進一步確定所述診斷、預(yù)后或療法的選擇，優(yōu)選地，其中通過評估所述腫瘤的雌激素受體(ER)狀態(tài)來進一步確定所述診斷、預(yù)后或療法的選擇。23.VHZ多肽的分子、激動劑或拮抗劑，其是通過依照權(quán)利要求14至17任一項的方法或用途鑒定的。24.一種供在治療、預(yù)防或減輕癌癥中使用的分子，其能夠調(diào)控諸如下調(diào)VHZ的表達，諸如針對與人VHZ的氨基酸殘基(126-140)對應(yīng)的RRLRPGSIETYEQEK生成的抗肽抗體。25.一種方法或事物，如本文參照附圖的圖1至11所描述的，和如附圖的圖1至11中所顯示的。全文摘要我們提供了在個體中治療、預(yù)防或減輕癌癥諸如乳腺癌的方法中使用的VHZ。我們提供了用于治療、預(yù)防或減輕癌癥的抗VHZ劑。我們進一步提供了用于檢測個體中的乳腺癌或個體對乳腺癌的易感性的試劑盒，其包含用于檢測個體或自他/她采集的樣品中的VHZ表達的手段，以及檢測癌細胞的方法，該方法包括檢測細胞中的VHZ的表達、量或活性的調(diào)控。文檔編號A61P35/00GK101820894SQ200880111036公開日2010年9月1日申請日期2008年8月8日優(yōu)先權(quán)日2007年8月10日發(fā)明者曾琦申請人:新加坡科技研究局