專利名稱：：用于診斷和治療癌癥的磷脂類似物的制作方法相關申請本申請請求2004年3月2日提交的美國臨時申請60/521,166的優(yōu)先權(quán)，為所有目的通過引用將該臨時申請并入本文。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明一般涉及腫瘤的診斷成像，特別涉及采用磷脂類似物的腫瘤的診斷成像。癌癥的早期檢測一直是現(xiàn)代成像技術(shù)的主要目標之一，因為在局限階段可疑腫瘤的鑒定顯著地增加了成功治療和消除癌性組織的機會。因此設計了大量的成像策略，使用多種技術(shù)和模式，以幫助醫(yī)生盡可能早地作出準確的診斷。不幸地的是，傳統(tǒng)的成像技術(shù)如計算機斷層掃描術(shù)(CT)和MRI(磁共振成像)受到它們提供可疑病變的結(jié)論性診斷能力的限制，因為它們僅能夠觀察到組織的密度或形態(tài)學上的差別。為提供確定的診斷，經(jīng)常需要更加侵入性和高成本的活組織檢查方法。相反，核醫(yī)學技術(shù)如正電子成像術(shù)(PET)和單光子發(fā)射體層攝影術(shù)(SPECT)可以提供關于特定器官或目標部位的機能或生物化學信息。然而，這些核成像技術(shù)的成功在很大部分上取決于適合的放射性藥物的選擇性攝取和檢測。選擇性攝取又取決于對靶組織具有高度專一性的放射性藥物的開發(fā)。不幸地的是，因此為腫瘤學應用開發(fā)的腫瘤-定位劑僅有有限的應用。例如，這些現(xiàn)有技術(shù)化合物之一，檸檬酸鎵67Ga，當初通過其在腫瘤組織中蓄積的能力來鑒別。不幸地的是，檸檬酸鎵67Ga也被多種其它非癌性病變吸收，包括炎性病變，并且不可接受量的放射性也可以在肝和脾組織中累積。在這些器官中放射性藥物的快速聚集可嚴重地干擾附近病變的成像，并且還消極地影響可安全地給予患者的劑量?？商娲姆椒ㄊ前l(fā)展定向于腫瘤-特異性抗原的放射性標記的單克隆抗體(Mabs)。然而，這些單克隆抗體僅對產(chǎn)生它們的特定腫瘤組織有特異性，因此將不會普遍地集中在腫瘤組織中。而且，Mabs用于診斷成像的用途產(chǎn)生了另外的問題，包括抗原表達的程度不同、低的腫瘤攝取、非特異性結(jié)合和不利的免疫原性反應。在解決這些問題的嘗試中，本發(fā)明人近來鑒別和開發(fā)了一系列新化合物，它們證實了有用的腫瘤特異性。參見，例如美國專利第4,925,649、4,965,391、5,087,721、5,347,030和6,417,384號，通過引用將它們?nèi)坎⑷氡疚?。?jù)認為，這些放射性碘化的磷脂醚類似物利用了惡性腫瘤細胞的獨特生物化學特性；即，相對于相應的正常組織，在腫瘤細胞膜上有大濃度的天然存在醚類脂。盡管還不完全了解準確的作用機理，但占主流的假說是磷脂醚類似物受陷于腫瘤膜上。因此，這些化合物集中于腫瘤組織中并原地保留用于診斷和/或治療應用。在上述專利中描述的放射性標記的磷脂醚類似物的選擇性滯留已在多種嚙齒動物和動物腫瘤異種移植物中得到了證明，但未在被認為更接近模擬人類疾病的自發(fā)性腫瘤模型中得到證明。不幸地的是，從這些研究中獲得的數(shù)據(jù)還證明放射性藥物化合物從血液中相對快速的清除，以及被非靶組織的不期望蓄積。如上所注釋的，非靶組織攝取可以通過產(chǎn)聲高背景活性或引起放射敏感性組織過度暴露于所注射的放射活性，而減少放射診斷成像的功效。因此，在本領域中對具有如下特征的放射性藥物存在顯著需求，該放射性藥物表現(xiàn)出從非靶組織中的快速清除率，以及在血漿中的延長半衰期，同時仍保持它對腫瘤組織的特異性和活性。這樣的藥劑不但應該有助于原發(fā)性腫瘤的非侵入性成像，而且還應該起惡性腫瘤組織的位點特異性根除的細胞毒劑的載體的作用，特別是因為其涉及癌癥的最常見診斷形式。進一步合乎需要的是，放射性藥物對惡性腫瘤是選擇性的，而對包括腺瘤和增生的癌變前組織則不是選擇性的。在美國每年有大約147,000例結(jié)腸直腸癌的新病例得到診斷。因此，結(jié)腸直腸癌是第四最常見的癌癥，每年60,000人因此死亡。1治療主要取決于癌癥階段，但是可以包括外科手術(shù)、輻射、化學療法和/或射頻或冷凍消融。然而，對結(jié)腸直腸癌患者的常規(guī)隨訪中，癌胚抗原(CEA)、結(jié)腸直腸腫瘤標記的測定，以及重復的結(jié)腸鏡檢查5在超過50％患者未能檢測出復發(fā)性疾病。6因此，對開發(fā)另外的檢測復發(fā)性疾病的方法存在需求。再有，在使用CT掃描和RF消融治療和診斷期間，從CT掃描中難以獲得機能信息。用對比增強的螺旋CT，在一定程度上可以評價腫瘤血管分布，但是沒有辦法準確測定能生存的腫瘤細胞是否還保留在RF損傷中。此外，由RF產(chǎn)生的熱損傷通常在操作CT掃描后具有環(huán)繞它們的炎癥邊緣，直至操作后6個月。一直使用PET掃描來跟蹤消融后的患者，但是環(huán)繞RF熱損傷的炎癥邊緣通常顯示出增加的吸收，甚至在不存在能生存的腫瘤的情況下。這降低了再發(fā)性腫瘤的早期檢測的靈敏度和專一性。因此，如NM404那樣對惡性瘤細胞具有選擇性并且惡性瘤細胞不明確保持的藥劑是優(yōu)選的，不同于FDG，其對腫瘤細胞沒有選擇性并且引發(fā)傳染性位點和增生(Barret′sEsophagus)。而且，如同含有124I的NM404的化合物，其具有4天的物理半衰期并且可以運送到世界上的任何地方，與具有110分鐘的半衰期因此僅可以有限地分布在產(chǎn)地200英里范圍內(nèi)的FDG相比是優(yōu)選的。此外，如同經(jīng)受延長的滯留(沒有被代謝)的NM404的化合物是優(yōu)選的，因為更有可能的是，當與適合的放射性同位素如131I配合時，它們具有顯著的治療潛力。還有，雖然在非常低的靈敏度水平，象NM404的化合物與FDG相比是優(yōu)選的，象NM404的化合物可以用多種碘同位素標記而且具有擴展的多功能性(診斷和治療以及作為實驗動物研究的工具)，而FDG僅限于用于PET掃描的18F，或者可能用于磁共振成像的19F(穩(wěn)定的)。不論其腫瘤靶向能力，F(xiàn)DG由于其在腫瘤細胞內(nèi)的快速代謝，沒有治療潛力。因此，需要其它的化合物來研究RF后的局部復發(fā)。同樣地，如果通過局部腫瘤的進行或復發(fā)腫瘤變成轉(zhuǎn)移性的，則雜交成像方式(PET和CT組合)，取代操作后單獨CT和PET掃描，是非常理想的。此外，即使當化療是治療的模式時，改進對化療反應的監(jiān)測是也必需的。因此，理想的是開發(fā)研究對化療反應的早期標記，使醫(yī)生能夠快速中止使用無效的化療方案，而不使患者暴露在延長治療的毒性下。當外部射線輻射治療是患有相似組織學的腫瘤的患者的可替代治療時，腫瘤對治療為目的的外部輻射治療(XRT)可能具有顯著不同的反應。用手術(shù)前輻射治療的某些直腸癌患者，將具有完全性反應，而具有相似組織學(在光學顯微術(shù)水平)的其它患者對治療的反應較差，疾病將復發(fā)。對輻射的反應是最終腫瘤控制和很多癌，包括許多胃腸癌、肺癌、頭頸癌和婦科癌癥的存活的前兆性因素。大多數(shù)反應表征方法(雖然能很好地預測反應)是在治療完成后實現(xiàn)的。雖然某些治療內(nèi)臨床評估在調(diào)整治療中是有用的，14但在大多數(shù)情況下，在實際治療過程中沒有預測腫瘤反應的準確方法。這樣的測試，尤其是適用于寬范圍的腫瘤位點和組織學的測試，顯然將是非常有用和合乎需要的。其它的治療和診斷方法，它包括已被提出用來預測對治療反應的分子測試法，以及近來的努力包括采用DNA微陣列來辨別與對治療反應或無反應相關的基因變化。這些還都處于研究階段，沒有一種處于常規(guī)臨床使用中。其它診斷和治療的方法，它包括在XRT治療過程中使用成像方式來預測反應。使用FDG的治療內(nèi)PET掃描正處于活躍的研究中，其中將在原發(fā)性腫瘤中途通過輻射治療的同位素攝取同治療前攝取相比較。多個回顧性研究提示，在治療過程中具有連續(xù)強攝取的受試者與在治療過程中其腫瘤較少吸收FDG的受試者相比，具有更糟的腫瘤控制結(jié)果。15然而，極其希望得到的是用于不同癌癥的更有效的篩選、診斷和治療方法。其它被充分觀察的腫瘤包括惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤，其是原發(fā)性腦瘤的最常見類型。盡管采用手術(shù)、輻射和化療進行攻擊性治療，但潛伏有這些腫瘤的大多數(shù)患者在診斷后存活期少于2年。近來在神經(jīng)放射學和磁共振成像(MRI)上的進展在這些腫瘤的早期診斷和治療上產(chǎn)生了顯著的影響。然而，大多數(shù)的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有侵潤性成分，通過目前的成像技術(shù)很難將該成分與水腫性腦組織區(qū)分。最難以治療且造成局部復發(fā)的原因常常就是該腫瘤的這種組分。毫無疑問，侵入性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的更好顯像對于有效的治療性處理而言是理想的。同樣地，胰腺癌是高致命性疾病，在所有的主要惡性腫瘤中具有最小的存活可能性。在美國胰腺癌是第五位的癌癥死亡原因，并且在美國所有新診斷的癌癥中，每年有2％歸咎于胰腺癌。然而，胰腺癌是最高致命性疾病之一，其占所有癌癥死亡的5％。MillerBA等人，NIHPub.No.96-4104.Bethesda，Md.1996。這得到了以下事實的證明在患有不可切除疾病的患者中沒有5年存活者。此外，盡管手術(shù)切除提供了治愈的唯一希望，但是切除后5年存活率僅有20％。GeerRJ，BrennanMF.AmJSurg1993；16568-72；YeoCJ，CameronJL，等人，AnnSurg1997。盡管采用18-FDG的PET掃描在使多種其它原發(fā)性癌癥成像中已表現(xiàn)出希望，但是似乎僅有有限的提高胰腺癌患者CT掃描的成像能力的能力，特別是在評價轉(zhuǎn)移性疾病中。KasperkRK，RiesenerKP，等人，WorldJSurg2001；251134-1139；SendlerA，AvrilN，等人，WorldJSurg2000；241121-1129。因此，對使患有隱伏的轉(zhuǎn)移性胰腺癌的患者準確成像的方法仍然存在需求。肝細胞癌是全世界最常見的實體器官惡性腫瘤，這是因為其常見病因?qū)W是由肝炎或酒精中毒所致的慢性肝損傷。發(fā)病率變化顯著，北美每100,000中有2.1個，在中國的高發(fā)病率區(qū)每100,000中有80個。在肝硬化患者中發(fā)展成HCC的風險是每年1-6％。盡管切除是唯一的治療選擇，但是在呈現(xiàn)的時候，僅有10-30％的患者適于手術(shù)，因為較少的肝儲量或存在不能切除或轉(zhuǎn)移的疾病。治愈切除后5年的存活率僅有15-35％，證實了這種疾病的攻擊性的性質(zhì)。TreiberG.DigestiveDiseases(2001)19311-323。今天在美國乳腺癌是女性的主要健康憂慮。預期2004年僅在美國接近216,000婦女被診斷患有乳腺癌，并且預期其中的40,000人會死亡。局部、區(qū)域和遠處轉(zhuǎn)移性擴散的準確評估對于最佳的疾病治療和處理來說是關鍵的。將允許檢測和或表征局部或遠處乳腺癌轉(zhuǎn)移癌(包括淋巴結(jié)累及)的非侵入性成像方式的發(fā)展將代表這種疾病處理中的顯著進步。盡管乳房X線照片術(shù)是目前選擇用于早期檢測乳腺癌的篩查方法，但組織學證實和向毗鄰淋巴結(jié)的區(qū)域擴散通?？炕罱M織檢查來評估。包括采用99mTc-Sestamibi的閃爍照片掃描和18F-FDGPET掃描在內(nèi)的更復雜的成像方法現(xiàn)已被廣泛地考查，但是沒有顯著地影響治療計劃，主要是歸因于其不可預知的專一性。WahlRL.QuartJofNuclMed(1998)421-7。然而，在監(jiān)測對化療的腫瘤反應中PET掃描的作用顯示出有效性。SmithIC，WelchAE，等人，JofClinOncol(2000)181676-1688；SchellingM，AvrilN，等人，JofClinOncol(2000)181689-1695。放射治療在乳腺癌中的作用已被很好地確定，主要因為許多實體上皮腫瘤包括侵潤性導管癌對離子輻射的敏感性。DeVitaV，HellmanS，RosenbergS.CancerPrinciplesandPracticeofOncology，6thedition.Philadelphia(Pa.)Lippincott，WilliamsandWilkins，2002，pp.1667-1680。在乳腺癌中輻射的最常見指征是作為局部病灶切除(lumpectomy)或乳房切除后的輔助治療。在本上下文中，通過消除這些組織中顯微沉積物，放射治療已經(jīng)表現(xiàn)出顯著地減少局部和區(qū)域復發(fā)的發(fā)病率。當患者有轉(zhuǎn)移性疾病或被認為有增加隱伏轉(zhuǎn)移的風險時，進行化療。在該后者適應癥中，輔助的化療給藥的研究證實接受輔助化療和激素治療的患者的存活率提高了。輻射還用于減輕背景中，在減少實體器官和骨中轉(zhuǎn)移瘤的疼痛和體積效應中具有良好的效果。因為多因素的原因，很多患者在明確的治療后復發(fā)。獲得的對輻射和化療的抗性勿庸置疑地是造成初期治療后復發(fā)的原因。此外，輻射的使用與特殊的毒性有關，該毒性通常是晚期出現(xiàn)和劑量限制性的。如果采用過度劑量的輻射，纖維化、神經(jīng)損傷和軟組織壞死可能是嚴重的。對于乳腺癌患者而言，手臂淋巴水腫是最常見的且是令人畏懼的毒性，通常是由腋窩解剖(為診斷目的而進行)和對腋窩的輔助輻射的組合而產(chǎn)生的。與主要靶向?qū)Ω魈囟[瘤類型特異的受體或分子的新抗癌藥相比，非常希望有依靠適于多種不同腫瘤類型的共同機理的新化合物。由此，對提供高靈敏度和專一性的非侵襲性乳腺癌成像技術(shù)仍然存在迫切的臨床需求。此外，同時傳送治療劑量的碘-131至原發(fā)性瘤和轉(zhuǎn)移性瘤的潛力是顯著額外的利益。今天在美國非小細胞肺癌(NSCLC)是癌癥死亡的主要原因。在適當選擇的患者中手術(shù)切除提供了長期存活的最好機會，并且可以治愈。因此，局部、區(qū)域和遠處轉(zhuǎn)移擴散的準確手術(shù)前評估對于最佳的治療來說是關鍵的。因為結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移(其在幾乎半數(shù)NSCLC患者中發(fā)生)，可能是治療的最常見障礙，所以縱隔淋巴結(jié)狀態(tài)的評估是必需的。準確的疾病分期還可以使患者減少不必要、非治療性外科手術(shù)的發(fā)病率。采用FDG-PET掃描成像迅速成為使NSCLC成像的金標準，這是因為其提高了靈敏度等級，特別是當和CT成像比較時。然而，這是一種昂貴的成像檢測，其在大多數(shù)的社區(qū)實踐中是不適用的。因此，仍然需要這樣一種成像技術(shù)，它是靈敏的、專一的并且是對大多數(shù)患者來說可輕易得到的使用資源。作為一種成像技術(shù)，采用18F-FDG的正電子成像術(shù)(PET)掃描已經(jīng)引起相當?shù)呐d趣。近來的研究前瞻性地比較了用于NSCLC分期的標準方法(CT、超聲、骨掃描等)和用于檢測縱隔淋巴結(jié)和遠處部位中的轉(zhuǎn)移的PET掃描的能力。PietermanRM，vanPuttenJWG，MeuzzelaarJJ，MooyaartEL，ValburgW，KoeterGH，F(xiàn)idlerV，PriumJ，GroenHJM.PreoperativeStagingofNon-SmallCellLungcancerwithPositron-EmissionTomography.NewEngJMed343254-261，2000。在組織病理學上證實了縱隔累及，并且通過其它成像檢測證實了遠處轉(zhuǎn)移。用于檢測縱隔轉(zhuǎn)移的PET的靈敏度和專一性分別是91％和86％；用于檢測遠處轉(zhuǎn)移的靈敏度和專一性分別是82％和93％。這好比縱隔累及的CT掃描的靈敏度和專一性分別為75％和66％。另一項研究將用FDG-PET、CT的成像和組織學結(jié)果進行了比較。用于縱隔結(jié)點分類(在54個患者中n＝168)的PET的總體靈敏度、專一性和準確度是96％、93％和94％，與之相比的是采用CT的68％、65％和6％。GuptaNC，GraeberGM，BishopHA.Comparativeefficacyofpositronemissiontomographywithfluorodeoxyglucoseinevaluateofsmall(＜1cm)，intermediate(1to3cm)，andlarge(＞3cm)lymphnodelesions。Chest117(3)773-778，2000。然而，PET掃描的局限包括高成本、有限的利用度、不能檢測1cm以下的損傷、缺乏專一性，特別是在有炎癥或肉芽腫疾病的患者中。StokkelMP，BakkerPF，HeineR，SchlosserNJ，LammersJW，VanRijkPP.StagingoflymphnodeswithFDGdualheadedPETinpatientswithnon-smallcelllungcancer。NuclMedCommunications20(11)1001-1007，1999；KapucoLO，MeltzerCC，TownsendDW，KeenanRJ，LuketichJD.Fluorine-18-fluoro-deoxyglucoseuptakeinpneumonia.JNuclMed39(7)1267-1269，1998。盡管治療后腫瘤收縮，但傳統(tǒng)解剖學上的成像技術(shù)如CT掃描也不擅長預測治療之后的存活。在近來的研究中，所述研究包括56個NSCLC患者，他們接受用于晚期疾病的基于順鉑的化療/放療的同時治療或單獨放療的治療，由傳統(tǒng)CT成像得到的反應和存活率沒有關聯(lián)。MacManusMP，HicksRJ，WadaM，HoffA，MatthewsJ，WirthA，RischinD，BallDL.EarlyF-18FDG-PETresponsetoradicalchemoradiotherapycorrelatesstronglywithsurvivalinunresectablenon-smallcelllungcancer.ProcASCO19483a，2000。然而，通過FDG-PET掃描得到的反應與存活率非常相關(p＝0.0006)。就24個患者而言(他們已經(jīng)在PET上獲得了完全反應)，從隨訪PET掃描的日期算起1年和2年的存活率分別是84％和84％，但是沒有在PET上獲得完全反應的32個患者中僅有43％和31％(p＝0.010)。這些結(jié)果證實了近來由其他作者報道的相似發(fā)現(xiàn)。PatzEFJr，ConnollyJ，HerndonJ.PrognosticvalueofthoracicFDGPETimagingaftertreatmentfornon-smallcelllungcancer.AmJRoentgenology174(3)769-774，2000；VansteenkisteJF，StroobantsSG，DupontPJ，DeLeynPR，VerbekenEK，DeneffeGJ，MortelmansLA，DemedtsMG.Prognosticimportanceofthestandardizeduptakevalueon(18)F-fluoro-2-deoxy-glucosepositronemissiontomographyscaninnon-smallcelllungcancerAnanalysisof125cases.JClinOncol17(10)3201-3206，1999；AhujaV，ColemanRE，HerndonJ，PatzEFJr.Theprognosticsignificanceoffluorodexoyglucosepositronemissiontomographyimagingforpatientswithnon-smallcelllungcarcinoma.Cancer83(5)918-924，1998。因此，就腫瘤分類和對治療的反應而言，可以準確地鑒別和潛在地早期治療NSCLC患者中早期轉(zhuǎn)移性疾病的易于利用的放射性藥物，將對患者的醫(yī)療具有重要的影響。盡管PET成像方法在這個領域中獲得了有效性，但高成本和不可獲得性嚴重地限制了其實際應用。對基于腫瘤特異的機能的準確功能成像技術(shù)仍然存在需求，該成像技術(shù)采用相對便宜和可廣泛得到的成像裝置可以非侵入性地篩查整個身體。發(fā)明概述本發(fā)明一般地提供了用于檢測和治療不同癌癥的方法和技術(shù)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種用于檢測和定位患有或懷疑有癌癥的受試者中肺癌、腎上腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、皮下癌、腸癌、肝細胞癌、成視網(wǎng)膜細胞瘤、宮頸癌的方法。所述方法包括以下步驟(a)向所述受試者給予磷脂醚類似物；并且(b)測定受試者的懷疑有癌癥的器官與周圍區(qū)域相比是否保持較高水平的所述類似物，其中較高保留區(qū)域表明所述癌癥的檢出和定位。在這個方法中，磷脂類似物選自其中，X選自碘的放射性同位素；n是16到30之間的整數(shù)；Y選自NH2、NR2和NR3，其中R是烷基或芳基烷基取代基或其中，X是碘的放射性同位素；n是16到30之間的整數(shù)；Y選自H、OH、COOH、COOR和OR，并且Z選自NH2、NR2和NR3，其中R是烷基或芳基烷基取代基。在這個方法中，X選自由122I、123I、124I、125I和131I組成的碘的放射性同位素的組。優(yōu)選地，在這個方法中，所述磷脂醚是18-(對-碘代苯基)十八烷基磷酸膽堿、1-O-[18-(對-碘代苯基)十八烷基]-1，3-丙二醇-3-磷酸膽堿或1-O-[18-(對-碘代苯基)十八烷基]-2-O-甲基-外消旋-丙三醇-3-磷酸膽堿，其中碘是放射性同位素的形式。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療受試者中癌癥的方法。該方法包括向所述受試者給予有效量的含有如上述的磷脂醚類似物的分子。在這個方法中，癌癥選自肺癌、腎上腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、皮下癌、腸癌、肝細胞癌、成視網(wǎng)膜細胞瘤、宮頸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、胰腺癌、癌肉瘤和平臥癌(Prostratecancer)。本發(fā)明還涉及磷脂醚類似物用于制備治療癌癥的藥物組合物中的用途。這些磷脂類似物選自上文討論的那些物質(zhì)的組。本發(fā)明的還一個實施方案提供了一種區(qū)分受試者體內(nèi)炎癥、腺瘤和增生與瘤形成的方法。該方法包括以下步驟(a)向所述受試者給予磷脂醚類似物，并且(b)測定所述受試者的懷疑有炎癥、腺瘤、增生或瘤形成的器官與周圍區(qū)域相比是否保持較高水平的所述類似物。當所述受試者表現(xiàn)出較高保留區(qū)域時，它表明所述瘤形成的檢出和定位，當所述受試者表現(xiàn)出較低保留區(qū)域時，它表明懷疑有腺瘤、增生或炎癥的器官的存在。本發(fā)明的另一個實施方案提供了一種在含磷脂酶D(PLD)的組織樣品中檢測瘤形成的方法。該方法包括以下步驟(a)定量所述組織樣品中PLD蛋白質(zhì)活性水平或PLDmRNA水平；并且(b)測定所述組織樣品與周圍組織區(qū)域相比是否具有較低水平的蛋白質(zhì)活性，其中較低活性區(qū)域表明瘤形成的檢出和定位，或者(c)測定所述組織樣品與周圍組織區(qū)域相比是否具有較低水平的mRNA，其中較低mRNA水平區(qū)域表明瘤形成的檢出和定位。這個方法中，通過使所述組織樣品和上述的PLE類似物接觸，可以定量PLD蛋白質(zhì)活性或mRNA水平。本發(fā)明的再一個實施方案提供了一種抗腫瘤藥劑，其通過篩選含PLD的組織樣品的方法來選擇，該方法包括以下步驟(a)定量PLD蛋白質(zhì)活性或PLDmRNA水平，其中與周圍組織區(qū)域相比減少的PLD蛋白質(zhì)活性或減少的mRNA水平預示瘤形成。通過使組織樣品和上述的PLE類似物接觸，可以定量PLD蛋白質(zhì)活性或mRNA水平。從詳細的說明、附圖和說明書所附的權(quán)利要求中，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將是顯而易見的。附圖簡要說明圖1.PLE腫瘤細胞成像假說。圖2.在IV給予1mCi131I-NM324后第1、2和6天得到的患者03前胸的閃爍顯像。在左小舌肺癌(T)中見到吸收，隨時間增加腫瘤對背景的比值。圖3.PLE類似物的結(jié)構(gòu)。圖3A.NM404類似物。圖4.IV給藥后，NM324和NM404在SCID小鼠A549肺腫瘤模型中的對照。注意的是，在腸內(nèi)而不是在腫瘤(植入大腿)中發(fā)現(xiàn)大部分NM324活性，然而在各大腿中NM404鑒別了一種腫瘤。圖4A.在手術(shù)除去原發(fā)性腫瘤位點(小腿)的哥本哈根(Copenhagen)大鼠體內(nèi)的DunningR3327轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤的閃爍顯像NM404圖像。兩個淋巴結(jié)腫瘤在mortem后查證。圖6.切除的CT-26腫瘤(T)與左和右淋巴結(jié)(LN)的數(shù)字照片(A)。顯示腫瘤中放射性的相關性的Bioscan圖像(B)與合并照片/Bioscan圖像(C)。圖7.顯示CT-26腫瘤(箭頭)的大小和位置的圖6的活小鼠的微CT圖像。3D-表面受阻和整平的切片圖像(A，B)以及冠狀(C)和軸向(D)切片(40μm厚)。圖8.正常(左)和RF-切除(右)CT-26腫瘤的組織學切片(H&E)。切除的切片喪失了膜完整性，顯得致密。圖9.125I-NM404注射后4天，c-myc胰腺腫瘤小鼠的體內(nèi)合并Bioscan/數(shù)字照片圖像(A)。用于和數(shù)字照片(C)比較的切除的腫瘤的離體成像(B)。顏色分類和圖10中的相同。圖10.125I-NM404給藥后4天，c-myc胰腺腫瘤鼠的Bioscan成像。和顯示大(2cm)胰腺腫瘤(T)存在的解剖小鼠(B)的數(shù)字照片相比的體內(nèi)圖像(A)。切除三個腫瘤并掃描殘留的尸體(C)。掃描切除的腫瘤(D)，用于和數(shù)字照片(E)比較。彩色溫標從0(黑色)變化至40(白色)cpm。圖11.帶有胰腺腫瘤的小鼠的MicroCT軸向掃描。在圖A中，在軸向圖像中很容易看得兩個大腫瘤(T)。B中不同小鼠的圖像描述了位于脾鄰近的胰腺腫瘤(箭頭)。在小鼠中，胰是一種遍在的組織。切除的脾和連附屬的腫瘤的數(shù)字照片顯示在11C中，用于對照。圖12.假對照大鼠腦(A)的Bioscan圖像(IV注射125I-NM404后4天)和重疊在顯示正常腦組織中NM404低背景水平的切除的大鼠腦的相應數(shù)字照片的相同Bioscan圖像。圖13.IV注射125I-NM404后4天，切除的帶有C6-神經(jīng)膠質(zhì)瘤的大鼠腦(B)的數(shù)字照片(A)和相應的Bioscan圖像。位置和大小配對的合并的Bioscan圖像和照片(C)顯示NM404在腫瘤中的強定位。在D中H&E染色的樣品中在組織學上證實了腫瘤的存在。圖14.在125I-NM404注射后10天，帶有TGFα肝癌的小鼠的冠狀微CT掃描(左)和背側(cè)Bioscan圖像(右)。在微CT圖像上使用ITG增強了肝，ITG是一種肝細胞選擇性CT造影劑(腫瘤＝T)。圖15.NM404注射后7天，切除的帶有CT-26腫瘤的小鼠肝的照片(A)和Bioscan圖像(B)。肝腫瘤累及是廣泛的。此次掃描前15天植入腫瘤。切除的解剖的腫瘤(T)和正常的未累及的肝(L)的Bioscan圖像(C)和照片(D)。圖16.顯示多發(fā)性CT26腫瘤存在的圖15中呈現(xiàn)的相同小鼠的微CT。使用ITG增強肝，ITG是一種肝細胞選擇性造影劑。腫瘤細胞植入后10天和上述Bioscan成像之前5天得到這些圖像。(用箭頭描述腫瘤，膽囊＝GB)。圖17.在IV給予125I-NM404(15μCi)后的不同時間，有自發(fā)性右腋窩乳房腫瘤(直徑10mm)的Min老鼠的NM404的Bioscan圖像。顯示了冠狀microCT圖像(非對比增強)，用于解剖學上的比較(右圖，T＝腫瘤)。圖18.切除的左和右腹乳腺的胭脂紅染色照片(A，C)和Bioscan圖像(B，D)。注意在圖A中2mm的腫瘤，其在左腺的BioscanImage(B)中容易檢測到。淋巴結(jié)(A中的小箭頭)顯示了無NM404的吸收。在右腺(C，D)中用肉眼檢測不到腫瘤。結(jié)腸的照片(E)和Bioscan圖像(F)顯示在腺瘤息肉(箭頭)中無NM404的吸收。圖19.圖18的Min小鼠的MicroCT掃描。圖A是顯示大左腋窩乳房腫瘤的低密度的表面表現(xiàn)。圖B是給予血池CT造影劑BP10以幫助定位腫瘤飼養(yǎng)脈管之后的高密度表面表現(xiàn)。圖C是合成的冠狀CT圖像和高密度表面表現(xiàn)，其顯示了絕對的飼養(yǎng)脈管定位。在圖C中取向是從下望上看，而圖A和B是從上望下看。圖20.在IV給予125I-NM404(15μCi)后的不同時間，具有自發(fā)性右腋窩乳房腺瘤(直徑10mm)的Min小鼠的NM404Bioscan圖像。顯示冠狀的微CT圖像(非對比增強)，用于解剖學上的比較(左圖，T＝腫瘤)。圖21.來自NM404給藥后8天的FVBxB6Min小鼠的切除的乳腺(A)和結(jié)腸(E)的Bioscan圖像。在B和D中分別是相同的切除組織的相應數(shù)字照片。胭脂紅著色放大的照片(C)顯示了存在增生(箭頭)，但是在Bioscan圖像(A)中無相應的病灶活動。Bioscan圖像(A)上的腫瘤吸收對應于B中的較大腺癌。切除的結(jié)腸的照片(D)和Bioscan圖像(E)表明在腺瘤息肉(箭頭)中無NM404的吸收。圖22.圖21中顯示的Min小鼠的微CT掃描。圖A是顯示大左軸向乳房腫瘤的低密度表面表現(xiàn)。圖B是給予血庫CT造影劑BP10以幫助定位腫瘤飼養(yǎng)脈管之后的高密度表面表現(xiàn)。圖C是合成的冠狀CT圖像和高密度表面表現(xiàn)，顯示了絕對的供給脈管定位。在圖C中取向是從下望上看，而圖A和B是向上望下看。圖23.在含A549肺CAmicromets(直徑＜1mm)的切除的SCID小鼠肺中125I-NM404(A&B)和NM324(C&D)攝取的對照。圖24.PLE的酶代謝。圖25.在ENU-處理的Min/+小鼠中至第一個腫瘤的時間。在ENU后至第一個乳房腫瘤的時間(表示為天數(shù))。雌性Min/+小鼠用ENU處理，并每周檢查2次乳房腫瘤的存在。對于B6Min/+(n＝45)(□)、BRB6Min/+(n＝18)(△)、FVBB6Min/+(n＝18)(◇)，以5天間隔將ENU處理后至第一個腫瘤的時間作圖。圖26.125I-NM404給藥后1天(A)和7天(B)的俯臥FVBxB6Min小鼠的Bioscan圖像表明大腋窩乳房腫瘤的存在。注射后10天切除的乳腺的Bioscan圖像顯示在大的10mm腺癌和在體內(nèi)掃描中看不見的較小鄰近2mm腫瘤中的NM404的結(jié)合。圖27.如圖26中所示的相同的FVBxB6Min小鼠的微CT圖像，顯示了大的腋窩乳房腫瘤。在A和B中顯示了冠狀和軸向切片，而3D-表面(金色)和冠狀切片同時顯示在后視(C)和前視(D)圖中。圖28.注射125I-NM404后的明顯SCC1和6腫瘤消退。圖29.在131I-NM404注射后第4天和11天患者1伽馬相機成像(左圖)，其顯示了該藥劑在兩個NSCLC腫瘤(箭頭)中的強和延長的滯留。軸向CT掃描(右圖)顯示了在左肺(A)中局部3cm病變的定位和大小，以及在在右肺(B)中的大侵潤性腫塊(箭頭)。圖30.在iv給予131I-NM404之后，患者2前和后整個身體的平面核醫(yī)學圖像(左圖)。軸向(A)和冠狀(B)CT掃描(右圖)顯示了大的6cm的NSCLC(箭頭)的定位。I.本發(fā)明的一般性說明本發(fā)明的一般性說明在描述本發(fā)明的方法之前，應當理解得是本發(fā)明不限于描述的特定的方法學、方案、細胞系和試劑，因為這些可以變化。還應當理解，在此所用的術(shù)語是僅用于描述特定實施方案的目的，其將不限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅限于所附的權(quán)利要求。必須注意的是，如在此和附加的權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式“一”、“一”和“該”包括復數(shù)，除非上下文另有清楚地指出。因此，例如，提到“一個細胞”包括這樣的細胞的復數(shù)和本領域技術(shù)人員已知的等同物，等等。同時，術(shù)語“一”(或″一″)、″一個或多個″和“”至少一個”可以在此交替使用。還應當注意，術(shù)語“包含”、“包括”和“具有”可以互換使用。除非另有定義，在此所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領域的普通技術(shù)人員常規(guī)理解的相同的意思。盡管與在此描述的那些相似或等同的任何方法和材料可以用于本發(fā)明的實踐或試驗中，優(yōu)選的方法和材料是目前描述的。就描述和公開化學試劑、細胞系、載體、動物、儀器、統(tǒng)計分析和方法學的目的而言，通過引用將在此提及的所有出版物并入本文，其在出版物中報道了，所述出版物可以與本發(fā)明結(jié)合使用。在此沒有任何內(nèi)容將被解釋為承認本發(fā)明沒有根據(jù)在先發(fā)明的實質(zhì)將這類公開提前的權(quán)利。如在此定義，術(shù)語“同分異構(gòu)體”包括，但不限于旋光異構(gòu)體和類似物、結(jié)構(gòu)同分異構(gòu)體和類似物、構(gòu)象異構(gòu)體和類似物等等。在一個實施方案中，本發(fā)明包括了式3A的抗腫瘤化合物的不同旋光異構(gòu)體的用途。本領域技術(shù)人員應當理解，本發(fā)明適用的抗腫瘤化合物可以含有至少一個手性中心。因此，本發(fā)明方法中所用的化合物可以光學活性或外消旋形式存在，或被分離。某些化合物還可以展現(xiàn)同質(zhì)多晶現(xiàn)象。應當認識到，本發(fā)明可以包括使用任何外消旋、光學活性、同質(zhì)多晶或立體異構(gòu)的形式，或其混合物，所述形式具有適用于治療在此描述和要求保護的腫瘤相關的病癥的性質(zhì)。在一個實施方案中，抗腫瘤化合物可以包括純的(R)-異構(gòu)體。在另一個實施方案中，抗腫瘤化合物可以包括純的(s)-異構(gòu)體。在另一個實施方案中，化合物可以包括(R)和(S)異構(gòu)體的混合物。在另一個實施方案中，化合物可以包括含(R)和(S)異構(gòu)體的外消旋混合物。怎樣制備光學活性形式(例如，通過重結(jié)晶技術(shù)拆分外消旋形式，通過光學活性原料的合成、通過手性合成或通過采用手性固定相的色譜分離)是本領域熟知的。本發(fā)明包括氨基取代化合物與有機酸或無機酸的藥學上可接受的鹽的用途，所述酸例如檸檬酸和鹽酸。本發(fā)明還包括在此描述的化合物的氨基取代基的N-氧化物。藥學上可接受的鹽還可以用無機堿，例如氫氧化鈉處理酚類化合物制得。還有，酚類化合物的酯類可以由脂肪族或芳香族羧酸制得，例如乙酸和苯甲酸酯。如在此所用，術(shù)語“藥學上可接受的鹽”涉及由堿化合物配制的化合物，其實質(zhì)上達到與堿化合物相同的藥效。本發(fā)明進一步包括利用抗腫瘤衍生物的方法。術(shù)語“衍生物”包括但不限于醚衍生物、酸衍生物、酰胺衍生物、酯衍生物等等。此外，本發(fā)明進一步包括利用抗腫瘤化合物的水合物的方法。術(shù)語“水合物”包括但不限于，半水合物、一水合物、二水合物、三水合物等等。本發(fā)明進一步包括利用抗腫瘤化合物代謝產(chǎn)物的方法。術(shù)語“代謝產(chǎn)物”指的是由另一種物質(zhì)經(jīng)過新陳代謝或代謝過程產(chǎn)生任何物質(zhì)。如此定義的，“接觸”指的是把本發(fā)明所用的抗腫瘤化合物引入試管、燒瓶、組織培養(yǎng)物、芯片、陣列、平板、微量培養(yǎng)板、毛細管等中含有受體的樣品里，并且在足以允許抗腫瘤化合物和受體結(jié)合的溫度和時間下培養(yǎng)。使樣品和抗腫瘤化合物或其它特異性結(jié)合組分接觸的方法對本領域技術(shù)人員來講是已知，并且可以根據(jù)將要運行的檢測實驗設計來選擇。培育方法也是標準的，并且對本領域技術(shù)人員也是已知的。在另一個實施方案中，術(shù)語“接觸”意思是把本發(fā)明所用的抗腫瘤化合物引入接受治療的患者，并且允許該化合物在體內(nèi)發(fā)生接觸。如在此所用，術(shù)語“治療”包括預防和疾病緩解治療。如在此所用，術(shù)語“減少”、“遏制”和“抑制”具有它們通常了解的減輕或減少的含義。如在此所用，術(shù)語“進展”指得是范圍或嚴重性的增加、推進、增長或變得更糟。如在此所用，術(shù)語“復發(fā)”指的是減輕后疾病的恢復。如這里所用的術(shù)語“給予”是指使患者、組織、器官或細胞與抗腫瘤磷脂醚化合物接觸。如在此所用，給予可以在體外即在試管內(nèi)實現(xiàn)，或在體內(nèi)即在活的生物例如人的細胞或組織中實現(xiàn)。在某些實施方案中，本發(fā)明包括向患者或受試者給予本發(fā)明適用的化合物。“患者”或“受試者”，在這里可等同使用，是指哺乳動物，優(yōu)選是人，其(1)具有通過給予利用磷脂醚化合物的抗腫瘤物質(zhì)可糾正或可治療的病癥，或者(2)易患通過給予利用磷脂醚化合物的抗腫瘤化合物可預防的病癥。如在此所用的，“藥物組合物”意思是治療有效量的抗腫瘤化合物加之適合的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑和輔助劑，統(tǒng)稱“藥學上可接受的載體”。如在此所用的，術(shù)語“有效量”和“治療有效量”是指足以產(chǎn)生期望的治療響應而沒有過度的不良副作用如毒性、刺激或過敏反應的活性治療藥劑量的量。顯然地，特定的“有效量”將隨這樣的因素而變化，如要治療的特定病癥、患者的身體狀況、要治療動物的類型、治療的持續(xù)時間、同時治療(如果有)的性質(zhì)和使用的特定制劑以及化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)。在這樣的情況下，如果其產(chǎn)生以下的一種或多種情形(a)疾病(例如，胰腺癌、乳腺癌)的預防；(b)這些疾病的逆轉(zhuǎn)或穩(wěn)定，將認為量是治療有效的。本領域的技術(shù)人員采用常規(guī)的實驗，可以輕易地確定最佳的有效量。藥物組合物是液體或凍干或其它干燥形式，包括多種緩沖含量(例如，Tris-HCl、醋酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強度的稀釋劑、添加劑例如防止向表面吸收的白蛋白或明膠、去污劑(例如，吐溫(聚山梨酯)20、吐溫80、PluronicF68、膽汁酸鹽)、增溶劑(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇、尼泊金酯類)、膨脹物質(zhì)或張度修飾劑(例如乳糖、甘露醇)、共價結(jié)合的聚合物如與蛋白質(zhì)結(jié)合的聚乙二醇、與金屬離子的配位、或物質(zhì)結(jié)合到聚合化合物的特定制劑中或其上，所述聚合化合物如聚乳酸、聚羥基乙酸、水凝膠等，或結(jié)合在脂質(zhì)體、微乳、微團、單層或多層的囊泡、紅細胞影或球形體上。這樣的組合物將影響物理狀態(tài)、溶解性、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放的速率、體內(nèi)清除的速率。受控或持續(xù)釋放組合物包括在親脂貯庫(例如脂肪酸、蠟、油類)中的制劑。本發(fā)明還包括的是給予用聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)包衣的顆粒組合物的方法。組合物其它的實例包括用于多種給藥途徑(包括局部、胃腸外、肺部、鼻和口)的顆粒形式防護包衣、蛋白酶抑制劑或滲透增強劑。在一個實施方案中，藥物組合物經(jīng)胃腸外、癌旁邊(paracancerally)、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、顱內(nèi)、和瘤內(nèi)給藥。進一步，如這里所用的“藥學上可接受的載體”也是本領域技術(shù)人員熟知的，并包括但不限于01-0.1M，優(yōu)選是0.05M的磷酸鹽緩沖液或0.9％的鹽水。此外，這樣的藥學上可接受的載體可以是水溶液或非水溶液、懸浮液和乳液。非水溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射的有機酯類如油酸乙酯。水性載體包括水、含醇/含水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖媒介物。胃腸外載體包括氯化鈉溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格液和固定油。靜脈內(nèi)載體包括流體和營養(yǎng)劑補充物、電解質(zhì)補充物如以林格葡萄糖為基礎的那些，等等。還可以有防腐劑和其它添加劑，如，例如抗微生物劑、抗氧化劑、校正(collating)劑、惰性氣體等等。按照本發(fā)明可給予的控釋或緩釋組合物包括在親脂性貯庫(例如脂肪酸、蠟、油類)中的制劑。本發(fā)明還包括的是用聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)包衣的顆粒組合物和連接至導向組織特異的受體、配體或抗原的抗體的化合物，或連接至組織特異的受體的配體的化合物。按照本發(fā)明給予的組合物的其它實施方案包括用于多種給藥途徑(包括胃腸外、肺、鼻和口)的顆粒形式、防護包衣、蛋白酶抑制劑或滲透增強劑。已知通過共價結(jié)合的水溶性聚合物如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸修飾的化合物與相應的未修飾的化合物相比，靜脈內(nèi)注射后在血液中表現(xiàn)出實質(zhì)上更長的半衰期(Abuchowski等人，1981；Newmark等人.，1982；和Katre等人，1987)。這樣修飾還可以增加化合物在水性溶液中的溶解度，消除聚集，提高化合物的物理和化學穩(wěn)定性，很大地減少了化合物的免疫原性和反應性。結(jié)果，與給予未修飾的化合物相比，通過以更少的次數(shù)或更低的劑量給藥這樣的聚合物-化合物可以取得在體內(nèi)期望的生物學活性。而在本發(fā)明的另一種方法中，藥物組合物可以控釋系統(tǒng)來傳送。例如，藥劑可以采用靜脈內(nèi)輸注、可植入的滲透泵、透皮貼片、脂質(zhì)體或其它的給藥模式給藥。在一個實施方案中，可以使用泵(參見Langer，supra；Sefton，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等人，Surgery88507(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321574(1989)。在另一個實施方案中，可以使用聚合材料。而在另一個實施方案中，控釋系統(tǒng)可以放置于接近治療靶點例如肝，因此僅需要全身用藥量的一部分(參見，例如Goodson，inMedicalApplicationsofControlledRelease，supra，第2卷，115-138頁(1984))。其它控釋系統(tǒng)在Langer所著的評論中進行了討論(Science2491527-1533(1990))。藥物制劑可以僅僅包含抗腫瘤化合物，或可以進一步包含藥學上可接受的載體，可以為固體或液體形式如片劑、散劑、膠囊、丸劑、溶液、懸浮液、酏劑、乳劑、凝膠、乳膏或栓劑，包括直腸栓和尿道栓。藥學上可接受的載體包括樹膠、淀粉、糖類、纖維素物質(zhì)及其混合物。含抗腫瘤化合物的藥劑，例如可以通過小丸的皮下植入給藥于患者。在另一個實施方案中，丸劑提供了抗腫瘤化合物在一段時間內(nèi)的控釋。制劑可以通過液體制劑的靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射而給予，通過液體或固體制劑的口服而給予，或者通過局部施用而給予。還可以使用直腸栓或尿道栓來實現(xiàn)給藥?？赏ㄟ^本發(fā)明給予的藥物制劑可以通過已知的溶解、混合、制?；蛐纬善瑒┎僮髦频?。就口服給藥而言，抗腫瘤化合物或其生理學耐受的衍生物如鹽類、酯類、N-氧化物類等等可以為了這個目的和常規(guī)的添加劑如載體、穩(wěn)定劑或無活性稀釋劑混合，并或通過常規(guī)的方法改變成適合的給藥形式如片劑、包衣片劑、硬或軟明膠膠囊、水性溶液、含醇的溶液或油性溶液。適合的無活性的載體的實例是傳統(tǒng)的片劑基質(zhì)如乳糖、蔗糖或玉米淀粉，結(jié)合粘合劑如阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠，結(jié)合崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸，或結(jié)合潤滑劑如硬脂酸或硬脂酸鎂。適合的油性載體或溶劑的實例是植物油或動物油如向日葵油或魚肝油。制劑可以制成如干?；驖窳?。用于胃腸外給藥(皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射)，抗腫瘤化合物或其生理學可耐受的衍生物如鹽類、酯類、N-氧化物類等等可以轉(zhuǎn)變成溶液、懸浮液，或乳液，如果需要，與常規(guī)并適于此目的的物質(zhì)，例如穩(wěn)定劑或其它輔劑一起轉(zhuǎn)化。實例是有或沒有添加表面活性劑和其它藥學上可接受的輔助劑的無菌液體如水和油。用作說明的油類是石油、動物、植物或合成來源的哪些，例如花生油、大豆油或礦物油。通常，水、鹽水、葡萄糖水溶液和有關的糖溶液，以及二醇類如丙二醇或聚乙二醇是優(yōu)選的液體載體，特別是用于注射液。含活性成分的藥物組合物的制劑是本領域熟知的。這樣的組合物可以制成傳送至鼻咽的氣霧劑或注射劑，為液體溶液或懸浮液；然而，還可以制備注射前為適于溶于液體或懸浮于液體中的固體形式。制劑還可以是乳化的?；钚灾委煶煞殖３Ｅc賦形劑混合，所述賦形劑是藥學上可接受的并與活性成分相配伍。合適的賦形劑，例如是水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇或類似物，或其任何組合。此外，組合物可以含有較少量的輔助物質(zhì)如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑，其增強了活性成分的有效性?；钚越M分可以配制到組合物中，以中和的藥學上可接受的鹽形式。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽，其是與無機酸或有機酸形成的，無機酸例如鹽酸或磷酸，有機酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸，等等。由游離羧基形成的鹽還可以由無機堿例如鈉、鉀、銨、鈣或氫氧化鐵得到，并且這樣的有機堿如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等。對于使用例如乳膏、凝膠、滴劑等的身體表面的局部給藥，以含有或不含有藥用載體的生理學可接受的稀釋劑中的抗腫瘤化合物或它們的生理學可耐受的衍生物如鹽類、酯類、N-氧化物類等的溶液、懸浮液或乳液的形式制備和應用。在本發(fā)明的另一種方法中，活性化合物可以囊泡(vesicle)的形式傳送，尤其是脂質(zhì)體(參見Langer，Science2491527-1533(1990)；Treat等人，inLiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer，Lopez-BeresteinandFidler(eds.)，Liss，N.Y.，第353-365頁(1989)；Lopez-Beresteinibid.，第317-327頁；通常參見如上)。就在藥物中的使用而言，抗腫瘤化合物的鹽類可以是藥學上可接受的鹽。然而，其它鹽在本發(fā)明的化合物及其藥物接受的鹽的制備中是有用的。該化合物的適合的藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽，例如其可以通過將本發(fā)明的化合物的溶液和藥物可接受酸的溶液混合制成，所述藥學上可接受的酸如鹽酸、硫酸、甲磺酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。一般而言，NM404是用于監(jiān)測多種腫瘤治療方式的治療響應的有希望的新的腫瘤選擇性診斷顯像劑。放射性碘化的NM404，第二代磷脂醚類似物，在10/10異種移植腫瘤模型和最近在另一種14/14自發(fā)嚙齒動物腫瘤模型中已顯示出顯著的腫瘤選擇性。因為在腫瘤細胞的膜上缺少代謝的磷脂酶，這種方法的占優(yōu)勢的假設是磷脂醚類似物在腫瘤細胞膜上被全部捕獲，因為它們不能被代謝或清除。因此，從正常細胞和有活力的腫瘤細胞中磷脂醚的差別清除速率形成了這個概念的基礎。在多種腫瘤模型中獲得的結(jié)果表明，NM404被有活力的腫瘤細胞隱蔽(sequestered)和選擇性地保留，并集中于原發(fā)和轉(zhuǎn)移性病變中，與解剖學位置包括在淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)的那些無關。和FDG不同，這種試劑不集中于感染位點。NM404相對于FDG的其它優(yōu)點包括以下NM404對惡性腫瘤細胞是選擇性的而且被惡性瘤細胞不確定地保留，而FDG對于腫瘤細胞無選擇性并進入感染性位點和增生(Barret′sEsophagus)。進一步地，因為124I具有4天的物理半衰期，其可以運送到世界的任何地方，然而FDG具有110分鐘的半衰期，有限地分布于生產(chǎn)場所200英里的范圍之內(nèi)。NM404經(jīng)受延長滯留(不代謝)，因此當與合適的放射性同位素如131I配對時獲得了顯著的治療潛力，然而FDG不具有任何治療潛力。雖然在非常低的靈敏度水平，NM404可以用多種碘同位素標記，擴展了其多用性(診斷和治療，以及用于實驗動物研究的工具)，然而FDG限于用于PET掃描的18F，或者可能用于磁共振成像的19F(穩(wěn)定)。不管其腫瘤靶向能力，由于其在腫瘤細胞內(nèi)的快速代謝，用于治療沒有潛力。NM404提供了不但準確地預測了對不同治療模式的局部腫瘤響應的可能，并且還提供了在亞治療原發(fā)性腫瘤治療的情況中檢測遠處轉(zhuǎn)移病變的可能。II.本發(fā)明本發(fā)明一般地提供了檢測和治療多種癌癥的方法和技術(shù)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種用于檢測和定位患有或懷疑患有癌癥的受試者的肺癌、腎上腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、皮下癌、腸癌、肝細胞癌、成視網(wǎng)膜細胞瘤、宮頸癌的方法。所述方法包括以下步驟(a)向所述受試者給予磷脂醚類似物；和(b)測定所述受試者的懷疑有癌癥的器官與周圍區(qū)域相比是否保持較高水平的所述類似物，其中較高保留區(qū)域表明癌癥的檢出和定位。在這個方法中，磷脂類似物選自其中，X選自碘的放射性同位素；n是16到30之間的整數(shù)；Y選自NH2、NR2和NR3，其中R是烷基或芳基烷基取代基或其中X是碘的放射性同位素；n是16到30之間的整數(shù)；Y選自H、OH、COOH、COOR和OR，并且Z選自NH2、NR2和NR3，其中R是烷基或芳基烷基取代基。在這個方法中，X選自由122I、123I、124I、125I和131I組成的碘的放射性同位素的組。優(yōu)選地，在這個方法中，磷脂醚是18-(對-碘代苯基)十八烷基磷酸膽堿、1-O-[18-(對-碘代苯基)十八烷基]-1，3-丙二醇-3-磷酸膽堿或1-O-[18-(對-碘代苯基)十八烷基]-2-O-甲基-外消旋-丙三醇-3-磷酸膽堿，其中碘是放射性同位素的形式。各種磷脂醚和用于生產(chǎn)和使用磷脂醚化合物的相關的方法學描述于美國專利號4,925,649、4,965,391、5,087,721、5,347,030、6,255,519和6,417,384中，其所有內(nèi)容在此并入作為參考。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療受試者癌癥的方法。該方法包括向所述受試者給予有效量的含有如上述的磷脂醚類似物的分子。在這個方法中，癌癥選自肺癌、腎上腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、皮下癌、腸癌、肝細胞癌、視網(wǎng)膜細胞瘤、宮頸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、胰腺癌、癌肉瘤和平臥癌。本發(fā)明還涉及磷脂醚類似物用于制備一種治療癌癥的藥物組合物中的用途。這些磷脂類似物選自上文討論的組。本發(fā)明的另一個實施方案提供了一種區(qū)分受試者中瘤形成和炎癥、腺瘤、增生的方法。該方法包括以下步驟(a)向所述受試者給予磷脂醚類似物，并且(b)測定所述受試者的懷疑有炎癥、腺瘤、增生或瘤形成的器官與周圍區(qū)域相比是否保持較高水平的所述類似物。當患者表現(xiàn)出較高保留區(qū)域，表明檢出和定位瘤形成，當患者表現(xiàn)出較低保留區(qū)域，表明懷疑有炎癥、腺瘤、增生的器官的存在。本發(fā)明的另一個實施方案提供了一種在含磷脂酶D(PLD)的組織樣品中檢測瘤形成的方法。該方法包括以下步驟(a)定量組織樣品中PLD蛋白質(zhì)活性水平或PLDmRNA水平；和(b)測定組織樣品與周圍組織區(qū)域相比是否具有較低水平的蛋白質(zhì)活性，其中較低的活性區(qū)域表明瘤形成的檢出和定位，或(c)測定組織樣品與周圍組織區(qū)域相比，是否具有較低水平的mRNA，其中較低的mRNA水平區(qū)域表明瘤形成的檢出和定位。這個方法中，通過使組織樣品和上述的PLE類似物接觸，可以定量PLD蛋白質(zhì)活性或mRNA水平。然而，本發(fā)明的另一個實施方案提供了一種抗腫瘤藥劑，其通過篩選含PLD的組織樣品的方法來選擇，該方法包括以下步驟(a)定量PLD蛋白質(zhì)活性或PLDmRNA水平，其中與周圍組織區(qū)域相比，減少的PLD蛋白質(zhì)活性或減少的mRNA水平預示瘤形成。通過使組織樣品和上述的PLE類似物接觸，可以定量PLD蛋白質(zhì)活性或mRNA水平。以下的部分討論了僅涉及特定的磷脂醚化合物的方法和用途，然而，這樣的用途是示例性的，不應該認為是縮小本發(fā)明的保護范圍。例如，在很多實驗性腫瘤模型中，磷脂醚NM404已證明對于瘤形成組織有顯著的專一性，但是沒有證明對腫瘤形成前的組織也有顯著的專一性。NM404相對于背景的高腫瘤親和力和腫瘤選擇性提示，其用于治療中腫瘤成像有可能優(yōu)于18F-FDGPET掃描。NM404腫瘤專一性的精確機理正在研究中，當前不能如18F-FDG吸收的葡萄糖利用機理那樣很好描述。未能很好確定的是，在瘤形成組織中的NM404的吸收是否取決于那個組織的生存力，或者這樣的吸收現(xiàn)象是否涉及某些與組織生存力無關的膜或基質(zhì)成分。如果這樣的吸收和專一性是和腫瘤的生存能力有聯(lián)系，結(jié)果是最近被輻射滅菌的腫瘤中的NM404吸收將不存在或很少，反之對輻射耐受的腫瘤將表現(xiàn)出連續(xù)的吸收。近來，發(fā)明者證明了在裸鼠中的放射敏感和放射耐受的鱗狀癌細胞中的NM404攝取和消除(SCC1和6)。這樣一種試驗在處理用放療治療的患者中是非常寶貴的，因為沒有出現(xiàn)治療后NM04定位的患者將表明治療，而具有耐受的腫瘤的那些患者(繼續(xù)吸收NM404)可以被給予其它非輻射選擇(手術(shù)、化療等)。一種發(fā)展敏感性的方法，更適用的成像測驗的方法是設計載體分子，其能夠選擇性地傳送放射性藥物探針至期望的靶組織。發(fā)明人的方法是利用顯示高度的組織或腫瘤選擇性的分子的獨特的生物化學或藥理學性質(zhì)。Snyder和同事16，17觀察到，多種動物和人腫瘤細胞和正常組織相比，在細胞膜上含有更高得多濃度的天然存在的醚類脂。他提出，腫瘤中醚類脂的蓄積是腫瘤細胞代謝這些類脂的能力較低的結(jié)果，原因是其缺少關鍵的代謝酶。發(fā)明人通過合成大量的放射性碘化的磷脂醚(PLE)類似物，作為潛在的腫瘤選擇成像劑，而利用了這個觀察。在廣泛的多種自生的和移植的大鼠、鼠和人腫瘤模型(24/24)中，這些PLE類似物的多個已經(jīng)表現(xiàn)出顯著的和明顯的普遍的定位于其中的能力，并被其選擇性保留的能力。發(fā)明人主要的假說(圖1)是磷脂醚陷在有活力的腫瘤細胞膜上，因為它們不能代謝或消除。放射性碘化的磷脂醚給藥后腫瘤的提取，顯示了僅有完整試劑的存在，然而尿和糞便的分析顯示出僅有代謝物。因此，形成這個概念的基礎是磷脂醚從正常細胞與腫瘤細胞中的差別清除速率。在超過24個異種移植和自生腫瘤模型中獲得的初步結(jié)果普遍地顯示，NM404經(jīng)歷了選擇性吸收，并在腫瘤中延長保留。因為藥物在一定程度上在肝中代謝，由于高度的肝背景放射性水平，發(fā)明人避免在肝腫瘤模型中的早期的化合物評價。進一步，因為NM404與其前期物質(zhì)相比提供了較低的肝背景水平，根據(jù)用HCC成像的患者有很多問題的事實，發(fā)明人將評估擴大到肝腫瘤中。很多患者具有根本的肝硬化，因此根據(jù)交叉的切片成像辨別再生的小瘤與HCC是很困難的。而且，評估采用FDG的PET掃描的初步研究在檢測所述疾病時僅表現(xiàn)出20-50％的靈敏度。VerhoefC，ValkemaR.等人，Liver(2002)2251-56。進一步，PET-FDG在腦的診斷篩選中是無用的。相似地，F(xiàn)DG在評估肝的疾病中是無用的，因為肝細胞的高度的固有吸收。以下的實施例描述了本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，并且用于說明目的。這些實施例不應該認為是縮小本發(fā)明的保護范圍。III.實施例A.實施例INM404的合成、放射性標記和制劑本發(fā)明人的合成方法是基于銅催化的格利雅試劑和烷基烷基甲苯磺酸酯或鹵化物的交叉偶合反應，用于烷基鏈延長(參見下文的流程圖)。這個合成由對-碘代苯甲醇1開始，通過和三甲基甲硅烷基溴反應，將其轉(zhuǎn)化成對-碘代芐基溴2。對-碘代芐基溴2在催化劑Li2CuCl4的存在下，進一步和格利雅試劑3偶合。將第一個偶合產(chǎn)物4脫保護后得到的12-(對-碘代苯基)十二烷醇5轉(zhuǎn)化成甲苯磺酸酯6。在下個步中，甲苯磺酸酯6和含6個碳原子的格利雅試劑7偶合，這就完成了鏈延長的過程。8的THP脫保護得到8-(對-碘代苯基)十八烷醇9，其通過如流程圖表示的兩步反應轉(zhuǎn)化成10(NM-404)。進一步，用任何碘同位素，包括124I、125I和131I標記NM404的快速高產(chǎn)率合成過程通過以下過程完成。首先，將鋁加熱塊裝置預熱到145℃，使用5ml用完即可丟棄的注射器管和頂部的橡膠隔膜制得冷凝器，注射器管裝配有彎曲的1.5英寸的18ga用完即可丟棄的針。第二，開始HPLC系統(tǒng)，貯液器里面填充脫氣的溶劑(己烷/異丙醇/水(40∶52∶8))。平衡系統(tǒng)，接著系統(tǒng)性檢查輔助系統(tǒng)如泵、檢測器、圖記錄儀和計算機積分儀。第三，通過在底部使用玻璃棉塞，用2.5mL顆粒狀活性炭充填注射器，加入另外的玻璃棉塞并在頂部插入隔膜來制得3-ml的用完即可丟棄的注射器活性捕獲器。將一根短的輸液管針放置在注射器上，18-ga的針通過在頂端隔膜插入?；钚蕴坎东@器連接于冷凝器的上部，通過硫代硫酸鈉捕獲器排向空氣。第四，將5mg的硫酸銨加到2ml的硼硅玻璃V-管形瓶中的20μL的去離子水中，接著向管形瓶中加入含20μg的未標記的NM404的20μl的無水乙醇。將管形瓶輕輕地旋轉(zhuǎn)或輕打來確?；旌?，6個硼硅玻璃珠(3mm)也加入管形瓶。該管形瓶然后用特弗隆包被的丁基橡膠隔膜和鋁折皺壓緊蓋密封。隔膜用18-ga針穿刺，穿過隔膜通過Hamilton微型注射器，加入期望量的碘-131化鈉水溶液(在0.1NNaOH中，通常是15μl中5mCi)。將管形瓶再輕輕地旋轉(zhuǎn)或輕打確?；旌稀９苄纹吭趧┝啃势髦羞M行測定。第五，活性炭捕獲注射器插入反應管形瓶中，反應管形瓶放進加熱的方塊孔(用砂填充一半)。該反應管形瓶在145℃加熱40分鐘，在此過程中，大部分溶劑蒸餾除去，并在冷凝器中凝聚。用25ml的注射器把空氣流(4×25ml)緩慢地注入反應管形瓶。反應管形瓶的溫度增加到155℃，并且加熱再持續(xù)30分鐘。反應管形瓶從方柱加熱器中移開，冷凝器/捕獲器的組合部件分離并丟棄，管形瓶冷卻至室溫。第六，0.5ml的無水乙醇加入反應管形瓶中。將管形瓶輕輕地旋轉(zhuǎn)，并在劑量校準器中進行測定。第七，用硅膠(氯仿/甲醇/水(65/35/4))進行粗制的標記產(chǎn)物混合物的放射-TLC分析。第八，在5ml的無水乙醇中預浸濕1.0g的樹脂30分鐘制得安伯萊特(Amberlite)IRA400-OH樹脂柱。潷去乙醇，樹脂用另外兩份5ml的乙醇漂洗。濕樹脂加入一個3ml的用完即可丟棄的注射器管中，底部用玻璃棉塞上，裝配有Acrodisc過濾器和1-通閥門。粗制的放射性碘化的產(chǎn)物的乙醇溶液通過樹脂柱逐漸被洗脫進5ml的管形瓶中。第九，嵌入隔膜，用氮氣流把溶劑吹掉。開始氮氣流之前，活性炭注射器連接在管形瓶的出口。一旦干燥，50μl的乙醇用于稀釋，并將內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到300μl的V型管形瓶中。源管形瓶用第二個50μl的乙醇漂洗，并轉(zhuǎn)移到V型管形瓶中。第十，穩(wěn)定HPLC泵，建立1.0ml/min的溶劑流。反應混合物在Perkin-Elmer柱體二氧化硅柱(4.3×33mm，3μm二氧化硅)上用HLPC純化，用己烷/異丙醇/水(40∶52∶8)以1.0ml/分鐘來洗脫。峰檢測用230nm和254nm的UV和放射性來完成。一旦在無菌管形瓶中收集到適合的峰，取出少量樣品用于放射-TLC分析，剩下的溶劑用氮氣流來蒸發(fā)干燥，得到期望的化合物，為干的殘留物。根據(jù)需要計算比活。第十一，將聚山梨酯20以0.1μl/1.0μgNM-404的比例加入到燒瓶中，形成含5％的聚山梨酯20的無水乙醇的儲液。聚山梨酯20是藥用級的吐溫20，目前其用于人和動物的NM404研究中。溶劑在30℃以下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥10分鐘除去。殘留物在足夠的無菌水混合溶解，得到2％的聚山梨酯20溶液。配制的產(chǎn)品從無菌的0.2μmPall-GelmanAcrodisc過濾器(13mm)中通過進入干的、無菌、多劑量管形瓶(Hollister-Stier)，其用另一個無菌的0.2μm的過濾器通氣。100μl的產(chǎn)品溶液轉(zhuǎn)移進一個管形瓶中，用于QC分析。第十二，在劑量校準器中測量放射性，進行質(zhì)量控制試驗(無菌、無熱原)。所有未標記的NM404從近來經(jīng)歷急性毒理學測試的原始儲備批中取出，以便使研究之間的潛在的合成差異最小化。NM404的放射性碘化通常由發(fā)明人開發(fā)的在熔化的新戊酸中的同位素交換反應來獲得19，或者通過在此描述的新方法得到，并根據(jù)發(fā)明人描述的標準方法制備用于注射。22這個操作有效地用于制備用于最初的使用NM324(NM404的前期物質(zhì))的人體試驗的無菌材料，已超過40次用于制得125I-和131I-標記的NM404。一般地，通過HPLC純化和準確質(zhì)量定量之后，將放射性藥物溶解于無水乙醇(50-500μl)和聚山梨酯20(0.1μl/μg的化合物)中。真空下除去乙醇，殘留物溶解于無菌水中得到含有不超過2-3％的聚山梨酯20的最終溶液。通過無菌的0.2μm的過濾單元過濾實現(xiàn)滅菌。最終的放射化學純度在動物上使用前，必須超過97％。最終比活的定量和計算通過采用熟知質(zhì)量標準的HPLC分析實現(xiàn)，并且放射性(125I)的定量通過稀釋法并用PEWallac伽馬計數(shù)器計數(shù)來完成，以便避免衰減擔心。使用劑量校準器完成包括131I的較高能量的同位素的定量，劑量校準器建立于這些同位素的環(huán)境中。通常獲得放射性碘化的NM404的1mCi/100μg的比活。注射量通常是每只小鼠約100μl。組織分布數(shù)據(jù)表達為每克組織的百分比注射劑量(+SEM)，當根據(jù)發(fā)明人建立的公開的操作稱重整個器官時，還可以將其表達為每個器官的百分比注射劑量。22在各個時間點，以每克組織的百分比注射劑量為基礎計算腫瘤與組織的比值。全身組織分布(TD)分析根據(jù)發(fā)明人開發(fā)的標準操作，在雌性小鼠上進行生物分布研究。27放射性碘化的NM404(100μl中5μCi)通過尾靜脈注射給藥。在預定的時間點，當在戊巴比妥麻醉下的時候通過放血，使動物(3/時間點)安樂死。切除總共16個組織，包括血液、血漿、腎上腺、膀胱、骨髓、脂肪、心、腎、肝、肺、肌肉、脾、卵巢、皮膚、甲狀腺和腫瘤、漂洗并解剖除去外部的組織。大器官切碎，雙份組織稱重并放置于塑料導管中用于同位素計數(shù)。注射位點和殘留的動物尸體的放射性也在井式計數(shù)器中測定。在適當?shù)膭游镒o理和輻射安全性認可下，這些標準的操作在發(fā)明人的實驗室中利用了多年。計算機程序產(chǎn)生組織分布表，所述計算機程序產(chǎn)生了衰減校正的組織放射性濃度數(shù)據(jù)，以百分比注射劑量/g、％kg劑量和百分比注射劑量/器官+SEM為基礎。在各個時間點，基于每克組織的百分比注射劑量來計算腫瘤與組織的比值。在攜帶腫瘤的小鼠上NM404注射后的4、7、14、21和28天進行對照TD研究(3只小鼠/時間點，共15只小鼠)，以便建立所有治療方案的比較TD表。全身成像實驗設計動物通過尾靜脈注射接受125I-NM404(10μCi)并且此后在預定時間點麻醉(戊巴比妥鈉麻醉，0.06mg/gbw)，經(jīng)受使用為了小鼠成像的改良的BioscanAR2000放射性-TLC掃描器的放射性核素掃描(1mm高分辨率準直管/每道1分鐘采集時間/1mm道增量)。采用Bioscan的Winscan2D軟件定量和給出數(shù)據(jù)。一旦切除，對照和治療的腫瘤也用Bioscan單元離體掃描，以便通過排除整個軀體放射性核素衰減而獲得更準確的ROI分析。動物(戊巴比妥鈉麻醉，0.06mg/gbw)經(jīng)受microCT掃描(ImtekMicroCATI，390步采集/43Kvp/410μA)，使用介質(zhì)拆分獲得參數(shù)。3維重建數(shù)據(jù)集，并使用AMIRA3D-可視化軟件顯影。軟件允許進行ROI密度分析和方便的在屏測量。B.實施例II第一代PLE類似物的臨床前研究采用發(fā)明人開發(fā)的同位素交換方法，用碘放射性同位素可以容易標記磷脂醚19。碘代苯基磷脂醚類似物是特別設計的，以便附著每個分子的放射性碘在體內(nèi)脫碘作用下易于穩(wěn)定。合成超過20個放射標記的PLE化合物，并在體外和體內(nèi)測試。20-22這些中的兩個，即NM294和NM324[12-(3-碘代苯基)-十二烷基-磷酸膽堿]，在動物腫瘤定位研究中最初顯示了最大希望。這些原型化合物，用碘-125標記，在以下的動物腫瘤模型中隨著時間選擇性地定位于腫瘤中；1)攜帶Walker256癌肉瘤的斯普拉-道來(氏)(Sprague-Dawley)大鼠；2)攜帶乳房腫瘤的Lewis大鼠；3)攜帶DunningR3327前列腺腫瘤的的哥本哈根大鼠；4)攜帶Vx2腫瘤的兔子；5)攜帶人乳房腫瘤(HT39)、小細胞肺腫瘤(NCl-69)、結(jié)腸直腸腫瘤(LS174T)、卵巢腫瘤(HTB77IP3)和黑色素瘤的無胸腺的小鼠。這些試劑的最佳的腫瘤定位發(fā)生在1天到數(shù)天。關于PLE類似物的力學研究；NM324和NM404與米替福新(十六烷基磷酸膽堿，一種在歐洲最被廣泛研究的抗腫瘤醚類脂)在結(jié)構(gòu)上相似。米替福新和其它抗腫瘤磷脂醚類似物的抗腫瘤性質(zhì)已經(jīng)在廣泛的腫瘤細胞系中證實，包括前列腺癌、膀胱癌和畸胎癌、鼠和人白血病，以及肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、腦癌和乳腺癌。23在和很多抗癌藥物的對比中，這些磷脂醚類似物不直接結(jié)合DNA并且不是誘變劑。盡管精確的抗增殖作用機理還未確定，但它們顯然作用于若干腫瘤細胞位點。這些化合物和多種細胞效應有關，包括轉(zhuǎn)運、細胞因子形成的促進、細胞凋亡誘導以及干擾多種關鍵類脂代謝和細胞信號酶，該酸大多數(shù)位于細胞膜上。盡管存在關于吸收進入細胞的模式的爭論，但目前大多數(shù)的報道支持這樣的觀點，即這些醚類脂直接被吸收進入它們蓄積的細胞膜中。普遍的看法是這些藥劑通過擾亂膜磷脂代謝而起作用，然而，用這些藥劑的細胞分級分布研究受到限制，由于在勻漿化和亞細胞分級分離操作中，自發(fā)的細胞小室重分配。與發(fā)明人使用的示蹤劑成像劑量(幾個μg)對比，僅在通常超過300-1000mg/天的劑量下才看到抗腫瘤效應。23對多個PLE類似物包括NM324、NM404的前期物質(zhì)進行正式的代謝研究。在這些研究中，試驗每種試劑來測定它們用作與PLE代謝有關的酶的底物的能力。如圖24所示，在PLE的代謝中涉及三種主要的酶途徑。O-烷基丙三醇單加氧酶(AGMO)是負責C-1處的烷基醚鍵的分裂，形成長鏈脂肪醇或隨后形成相應的脂肪酸。磷脂酶C(PLC)和D(PLD)，在另一個方面分別產(chǎn)生丙三醇或磷脂酸產(chǎn)物。使用微粒體的AGMO酶制劑，當與[3H]-lyso-PAF(血小板活化因子)比較時NM324不是這種酶的底物，其廣泛地引起代謝。在相似的方法中，NM324作為從蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)分離出的PLC的底物來分析，相對于遭遇顯著的水解的1-棕櫚酰-2-[3H]-棕櫚酰-L-3-磷脂酰膽堿(DPPC)不水解。最后，多個PLE類似物接受PLD測定。從甘藍中分離的PLD，與哺乳動物的PLD相似，因為當有乙醇存在下進行酶反應時，甘藍型除了提供磷脂酸之外，還提供磷脂酰乙醇-型產(chǎn)物。接受這些測定條件的多種PLE類似物，確實產(chǎn)生了磷脂酰乙醇加合物，顯示可能和PLD相互作用。多個NM404前體進行了體外在多種細胞系中的代謝研究，包括Walker腫瘤細胞、大鼠肌肉(H9c2)和大鼠肝細胞。在這些研究中，代謝的程度在培育不同時間周期后形成的放射標記的產(chǎn)物的基礎上進行確定，并且將結(jié)果標準化為細胞數(shù)或細胞蛋白質(zhì)的量。培育介質(zhì)和細胞懸浮液的隨后的類脂提取證實了在Walker腫瘤細胞中很少PLE代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，然而在48小時的研究周期內(nèi)，在肌肉細胞和肝細胞中發(fā)現(xiàn)了代謝產(chǎn)物的大量生成。這些結(jié)果和體內(nèi)的對所有類似物完成的生物分布研究非常相關聯(lián)。盡管已經(jīng)完成了多個研究，但代謝捕獲在腫瘤細胞中放射標記的PLE類似物的吸收和保留中的角色并沒有很好地定義，當前仍然是實驗的活躍領域。NM324的臨床評估在多個有希望的第一代PLE類似物中，NM324是更容易合成的，因此選擇作為最初臨床研究的主導化合物。盡管在5位已檢測出腫瘤的人肺癌癥患者中獲得成像，圖像由于高的肝放射性而是復雜的。第二代的PLE類似物為了減少肝吸收并延長血漿期，合成了NM324的9個結(jié)構(gòu)類似物，并用125I放射標記，用于在攜帶DunningR3327前列腺腫瘤的哥本哈根大鼠中的最初的成像分析?；谶@個最初的篩選，NM347、NM404[18-(4-碘代苯基)-十八烷基磷酸膽堿]和NM412(圖3)選擇用于在動物腫瘤模型中經(jīng)歷進一步的成像和生物分布分析。在動物模型中采用NM404和NM412的更最近的成像研究表明，兩者在使多種腫瘤的顯影中都優(yōu)于NM324。重要地，在靜脈內(nèi)給藥NM404或NM412后，在轉(zhuǎn)移的前列腺腫瘤模型中清楚地描繪了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤。最重要地，示蹤劑沒有被未受累及的淋巴結(jié)所保留。24(圖4A)。盡管在前列腺模型中進行，但這個發(fā)現(xiàn)尤其和乳腺癌有關，其中淋巴結(jié)累及是這樣的一種重要的預后指示劑。在攜帶人A549NSCLC腫瘤的SCID小鼠上進行的初步中試研究是鼓舞人心的，并且證明NM404克服了NM324高的肝清除的問題。NM404表現(xiàn)出極好的腫瘤造影，特別在延遲成像上是顯著的，和NM324相比具有最少的肝和腎吸收(圖4)。組織生物分布研究進一步地證實存在于腫瘤中的高水平的放射性。盡管成像結(jié)果與NM404和NM412相似，但發(fā)現(xiàn)相對于NM412，NM404在大鼠中獲得的顯示了相對低的腎劑量的劑量學數(shù)據(jù)，因此選擇NM404用于進一步研究。在有前列腺的SCID小鼠和A549肺癌腫瘤模型中的NM324和NM404的比較生物分布數(shù)據(jù)揭示，使用NM404具有高的腫瘤與正常組織比，并有超過25％注射劑量的腫瘤吸收。目的在于測定廣泛的多種腫瘤模型中的吸收特征，在小鼠模型中完成的動物成像研究總結(jié)于表1中。在B6ApcMin/+小鼠中的初步結(jié)果顯示，在這個模型中NM404未被腺瘤息肉吸收，但是被乳房腺癌吸收和保留，因此表明對于惡性腫瘤細胞可能的專一性。這些研究旨在測定NM404非侵襲性表征腫瘤的潛力。NM404在研究的每個腺癌模型中已經(jīng)顯示了顯著的腫瘤吸收和保留。CT26鼠動物腫瘤模型的關聯(lián)性發(fā)明人研究了NM-404，在用皮下的CT26細胞接種于小鼠的肋腹的鼠(BALB/c小鼠)模型中，其作為腫瘤響應的預言者。CT26細胞系是分化不良的鼠腺癌，其通過在BALB/c小鼠中直腸注射N-亞硝基-N-甲基尿烷誘導產(chǎn)生。細胞系簡單在體外生長，當注入脈管系統(tǒng)(尾靜脈注射，轉(zhuǎn)移模型)或注入皮膚(圖5)或肝時產(chǎn)生可預料的生長模式。25，26因為細胞系是由結(jié)腸直腸癌產(chǎn)生，這種鼠模型對這些研究有高度的臨床相關性。在CT26腫瘤中采用NM404的初步成像結(jié)果在顯示了NM404定位于皮下的CT26異種移植物中的初步的試驗中，兩種動物用125I-NM404(10μCi)注射(IV尾靜脈)，隨后在注射后的1、4和7天用改良的BioscanAR2000放射TLC掃描儀(裝備了高分辨率1mm準直儀和2-D采集和分析軟件)成像。在第7天，動物安樂死，除去腫瘤，照相并用Bioscan離體掃描(圖6)。離體掃描在發(fā)明人的實驗室是標準的程序，因為與碘-125相關的嚴重的組織衰減效應。在安樂死和剝離腫瘤前，在第7天，每個動物還經(jīng)過微CT掃描(圖7)。在離體Bioscan成像(圖6)上局部熱斑直觀地與所有腫瘤相關聯(lián)。盡管淋巴結(jié)是可見的，沒有放射性和它們有關，表明缺乏腫瘤細胞浸潤。圖6和7中的主要腫瘤在組織學上被分類為腺癌。發(fā)明人已經(jīng)用微CT掃描了廣泛多種的皮下腫瘤，全部可非常容易地檢測到直徑低于少于300微米。皮下的小鼠CT26腫瘤的最初的RF消融是成功的，并產(chǎn)生嚴重的細胞損傷(圖8)，如在處理的H&E-染色切片上細胞膜損失所顯示的。C.實施例III非小細胞肺癌在攜帶人NSCLC腺癌A549細胞系(腺癌已經(jīng)成為最常見的人肺癌組織學類型)的SCID(嚴重組合的免疫缺陷突變)小鼠上進行成像和生物分布研究。在五只動物中的初步中試結(jié)果是鼓舞人心的，并證明了新藥劑NM404克服了NM-324化合物的局限性。同時對NM324有適當?shù)牧己媚[瘤吸收，由于高的肝首過清除損害了成像。然而，NM404表現(xiàn)出極好的腫瘤顯影，在延遲成像上是特別顯著的，具有最少的肝和腎吸收。而且，組織生物分布研究進一步證實了存在于腫瘤的高水平的放射性。在SCID小鼠-人NSCLC模型中，NM324和NM404成像的比較如圖4所示。注意到用NM404的肝、腎和腸活性相對缺乏和極好的腫瘤顯影有關。盡管成像結(jié)果與NM404和NM412相似，但發(fā)現(xiàn)相對于NM412用NM404在大鼠中得到的最近劑量學數(shù)據(jù)顯示了較低的腎劑量，因此選擇NM404用于進一步研究。在數(shù)個腫瘤模型中原型藥劑125I-NM324的廣泛的生物分布數(shù)據(jù)，先前已經(jīng)匯編。CounsellRE，SchwendnerSW，MeyerKL，HaradahiraT，GrossMD.Tumorvisualizationwitharadioiodinatedphospholipidether.JNuclMed31(3)332-336，1990；PlotzkeKP，F(xiàn)isherSJ，WahlRL，OlkenNM，SkinnerS，GrossMD，CounsellRE.Selectivelocalizationofaradioiodinatedphospholipidetheranaloginhumantumorxenograftes.JNuclMed34(5)787-792，1993；RampyMA，BrownRS，PinchukAN，WeichertJP，SkinnerRW，F(xiàn)isherSJ，WahlRL，GrossMD，EtheirSP，CounsellRE.Biologicaldispositionandimagingofaradioiodinatedalkyphospholineintworodentmodelsofbreastcancer.JNuclMed37(9)1540-1545，1996。在注射后的延遲的時間，發(fā)現(xiàn)腫瘤與血液的比值超過8∶1。例如，在大鼠乳房腫瘤模型中，在96小時，腫瘤與正常組織的比值達到最大值，腫瘤與血液的比值是8.6，腫瘤與肌肉的比值是20∶1。RampyMA，BrownRS，PinchukAN，WeichertJP，SkinnerRW，F(xiàn)isherSJ，WahlRL，GrossMD，EtheirSP，CounsellRE.Biologicaldispositionandimagingofaradioiodinatedalkyphosphocholineintworodentmodelsofbreastcancer.JNuclMed37(9)1540-1545，1996。此外，PLE-相關的放射性的生物分布在腫瘤中是不均勻的，如由顯微放射自顯影術(shù)研究證明的，所述研究顯示了PLE放射性唯一地存在于有活力的腫瘤細胞中，所述腫瘤細胞位于朝外側(cè)區(qū)域而不是中心壞死區(qū)域。RampyMA，BrownRS，PinchukAN，WeichertJP，SkinnerRW，F(xiàn)isherSJ，WahlRL，GrossMD，EtheirSP，CounsellRE.Biologicaldispositionandimagingofaradioiodinatedalkyphosphocholineintworodentmodelsofbreastcancer.JNuclMed37(9)1540-1545，1996。至此僅在前列腺和A549肺癌模型中完成了NM324和NM404在SCID小鼠的比較生物分布數(shù)據(jù)。這些研究揭示了，使用NM404具有高的腫瘤與正常組織比，超過25％注射劑量的腫瘤吸收，因此支持我們用于在更多自發(fā)腫瘤模型和人中研究PLE類似物的生物分布的愿望。在SCID小鼠A549肺癌模型中，進行了一個另外的解決NM404和NM324的相對敏感性的研究。每個動物的肺在給藥相同劑量的各種藥劑后10天被切除，為了增強分辨率，離體成像1小時。圖23所示的低分辨率和高放大成像顯示了在用NM404成像的兩只動物的肺中的病灶放射性的存在，在NM324對中很少或者無吸收。隨后的病理學分析證實了在所有4只動物中少量A549微小-轉(zhuǎn)移瘤(直徑少于1mm)的存在。在NM404小鼠中的計數(shù)率大于在對應的NM324小鼠中的計數(shù)率的2.5倍，再次表明NM404優(yōu)于NM324。很可能是，因為腫瘤靶向策略看起來好像是隨時間包括選擇性腫瘤滯留，在目前，相對短生命的核素如18F或者甚至99mTc用于標記是不實用的。然而，隨著單克隆抗體的早期應用，其只用碘的放射性同位素標記，在將來其可能用選擇性的標記如碘-124，標記PLE類似物，其中物理半衰期與PLE腫瘤吸收和保留動力學很好地匹配。事實上，作為腫瘤選擇性PET試劑的124I-標記的NM404的效用是我們微PET采集的中試計劃的主題。這個計劃的目標是評估用碘-124標記NM404的可行性，碘-124是有4天物理半衰期的相對新的正電子同位素，并評估其用于小動物模型中腫瘤的PET成像的希望。相對于傳統(tǒng)的伽馬相機成像，除了利用分辨率增強和提供3-維能力PET成像之外，這個方法將突出氟-18FDG的用途，因為其在腫瘤細胞中的吸收是以不同于利用葡萄糖的生物化學機理發(fā)生的。如以上討論的，當前可用的示蹤劑(例如67Ga和18F-FDG)的效用是受限的，由于對從炎癥中區(qū)分新生物缺乏專一性。然而，用PLE試劑的初步研究已獲得克服這種臨床顯著局限性的希望，其中在大鼠中角叉藻聚糖-誘導的肉芽腫在背景活性上無法顯影而且沒有顯示組織保留。CounsellRE，SchwendnerSW，MeyerKL，HaradahiraT，GrossMD.Tumorvisualizationwitharadioiodinatedphospholipidether.JNuclMed31(3)332-336，1990。然而，檸檬酸鎵，在那個研究中作為對照利用，在肉芽腫中顯著地集中。這樣的發(fā)現(xiàn)進一步證明，擴展了發(fā)明人用PLE類似物試劑作為潛在有用的腫瘤選擇性成像試劑的研究。人類研究基于動物中的非常有希望的藥物動力學和成像數(shù)據(jù)，發(fā)明人受激勵把放射標記的磷脂醚的研究進入到臨床上。在研究中，最初評估未標記的NM404對大鼠和兔子的急性毒性，所述研究在毒理學研究中心進行，在Buffalo的StateUniversityofNew(SUNY)。在這些急性劑量毒理學研究中，在3.2mg/kg(大于最高預期人劑量的的150倍)的劑量水平?jīng)]有察覺毒性效應。而且，在該高劑量水平證明無血小板激活性質(zhì)。未標記的NM324給予五個正常的無疾病的人，以便獲得放射性藥物研究委員會(RDRC)對放射標記的藥劑用以人給藥的批準。這些受試者沒有中毒的跡象，如通過癥狀、臨床檢查、生命指征和連續(xù)的血液化學顯示的。作為中試可行性計劃，4個肺癌患者在AnnArbor，MichiganVA醫(yī)院在RDRC批準下，采用131I-標記的NM324進行研究。肺部腫瘤在患有肺癌的全部三個患者(兩個具有NSCLC，而1個具有小細胞肺癌)中是清楚顯影，以下詳細描述。腫瘤吸收的程度，在不同的時間點，從1+(背景上幾乎不能看得見)變化到3+(強烈地吸收，比正常結(jié)構(gòu)大得多)。注意的是，選擇用于這些最初研究的患者是患有已知的相對大的癌癥的那些。在這個階段沒有計劃研究其中存在腫瘤分類問題的患者。病史患者01是一位55歲的老年婦女，患有右中葉肺腫塊，侵蝕到右肋，組織學上是很可能肺起源的粘蛋白產(chǎn)生性腺癌。在6小時的最初的131I-NM324閃爍成像中顯示了在右側(cè)肺中部的吸收的病灶。因為與閃爍研究無關的原因，患者不能夠返回醫(yī)院超過進一步的成像期6小時?；颊?2是62歲的老年男人，患有大(9×7×7.5cm)的從主動脈肺窗和左臍擴散的分成小葉的縱隔腫塊。組織類型是小細胞未分化的(燕麥形細胞)癌。131I-NM324內(nèi)爍成像顯示了在左上肺部病灶的吸收，隨時間發(fā)展相對于正常的背景活動，其在強度上增加了?；颊?3，一位74歲的老年男人，患有右上葉NSCLC(腺癌)，先前放療治療了5個月。疾病在左小舌(2.5×2×3em的塊)、下胸椎(大約是T8)和肝的右葉上復發(fā)。131I-NM324閃爍顯像術(shù)顯示了在肺部腫塊和胸椎病變相當確定的吸收，其證明了隨時間發(fā)展增加了靶點與背景的比值(圖2)。在肝轉(zhuǎn)移中的吸收不能被消除在正常肝背景之上。這些研究提供了放射標記的PLE類似物的臨床希望的早期模糊感覺。盡管131I是用于成像目的的次最適度的試劑，但清楚描述了在所有三種肺腫瘤中的吸收。如期望的，基于先前的動物生物分布實驗，在腫瘤中的活性隨時間增加，如在患者02和03中清楚地證明了。在患者03中，腫瘤與正常組織的比值從第2天的2.74增加至第7天的4.23。因后來的成像期間超過6小時，患者01不能返回。增加的靶點與背景的比值構(gòu)成了有力的證據(jù)，證明腫瘤顯影的機理不是僅僅基于異常的血流或腫瘤的血管過度形成。實際上，使用99mTc人血清白蛋白的動物研究證實這個發(fā)現(xiàn)。評估用NM404的非小細胞肺癌(NSCLC)患者的臨床試驗盡管在25/25異種移植物和自發(fā)嚙齒動物模型中，NM404已經(jīng)表現(xiàn)出選擇性和延長的腫瘤保留，但醫(yī)生發(fā)起的IND最近開始了該試劑在4期人非小細胞肺癌患者中的臨床評估，以便確定它在人類中是否表現(xiàn)出相似的腫瘤吸收和保留性質(zhì)。到此為止，兩個具有晚期NSCLC的患者在注射小于1mCi的131I-NM404后成像。在預定的時間收集血液和尿樣品，在給藥后的數(shù)個時間點進行伽馬成像。在兩個患者中，在原發(fā)性肺癌中證明了NM404的顯著腫瘤吸收和保留，如圖29和30中所見的。相對于采用其第一代前期物質(zhì)NM324先前所見的高的肝吸收值，NM404在肝和腹部活性低得多，這提示評價這種試劑在其它腹部癌癥包括胰腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中的可行性。材料和方法靜脈內(nèi)注射碘-131標記的NM40(1mCi/20μg)后，具有晚期NSCLC的患者用GEMaxxus雙頭SPECT掃描儀在第3、6、24、48、96小時和第7天和第11天掃描。收集血液和尿樣品用于藥物動力學分析和臨床血液學，腎和肝的生物學分析。結(jié)果初期的定性成像結(jié)果顯示盡可能早在注射后24小時碘-131標記的NM404清楚地集中于左右肺的腫塊中，并選擇性保留于這些腫瘤中超過11天。此外，肝和下腹部包括膀胱、腎和腸的背景放射性顯著地低于用其前期物質(zhì)NM324先前觀察到的。在任何患者中沒有觀察到不良反應。結(jié)論這些初步發(fā)現(xiàn)建議，NM404在人NSCLC中顯示了與在嚙齒動物模型中先前所見的相似的腫瘤吸收和保留性質(zhì)。盡管僅以在這個點的兩個患者為基礎，但看起來NM404在人非小細胞肺癌中的確集中并經(jīng)受選擇性和延長的腫瘤保留?；颊?55歲的老年男性，具有雙側(cè)3cm的左葉和浸潤的右葉NSCLC、腦轉(zhuǎn)移和小右腎上腺腫塊。他已經(jīng)參與很多標準的和實驗性的治療方案。圖像包括在圖29中?；颊?70歲老年男性，近來診斷有6cm上葉非小細胞腫塊，5mm的肝腫塊、髂骨轉(zhuǎn)移和非常小的腦轉(zhuǎn)移。他開始NM404試驗的前一周最近完成了對髂骨和腦轉(zhuǎn)移的低劑量的卡鉑/紫杉醇化療和治標的放療。圖像如圖30所示。D.實施例IV小鼠胰腺癌模型發(fā)明人還在c-myc小鼠胰腺癌模型中研究NM404(第二代PLE類似物)的腫瘤親合力，已知該模型產(chǎn)生具有混合的腺泡/導管表型的非侵襲性腫瘤。材料和方法兩種鼠品系，對于熟知的癌基因c-myc或k-ras其是內(nèi)源性的，已經(jīng)在威斯康辛州大學被開發(fā)。SandgrenEP，QuaifeCJ，etal.，ProcNatlAcadSciUSA.1991；8893-97；GrippoPJ.NowlinPS.等人，CancerResearch.63(9)2016-9，2003。c-myc的表達定向于胰腺腺泡細胞，因為它連接彈性蛋白酶啟動子，其僅在胰中表達。這些ela-1-myc內(nèi)源性的小鼠形成了腺泡和導管的瘤形成，其導致了在2-7個月大小之間的死亡。到1個月大小時，胰看起來增厚并堅硬。因此，1-3個月大小的小鼠用作研究胰腺癌的極好的模型。大多數(shù)人胰贅生物具有導管形態(tài)學，Dr.Sandgren″s轉(zhuǎn)基因靶向策略旨在使腫瘤顯影，所述腫瘤對胰腺的導管上皮是特異的。c-myc模型產(chǎn)生的腫瘤是侵襲性的腺癌，具有混合的腺泡/導管表型。k-ras模型的生物學是明顯不同的。k-ras腫瘤已經(jīng)分類為“原位癌”，指得是它們具有瘤形成的特征，但是它們不侵入，通常保持小型的(＜2mm)。它們的細胞外觀非常像早期的人腫瘤，因此從組織學角度看，它們是人類疾病更相關的模型。進一步，它們類似人類疾病的非常早期的階段。相對于檢測c-myc小鼠體內(nèi)大和更晚期腫瘤，檢測k-ras腫瘤的“早期”發(fā)育的能力將是朝向鑒別人類中早期(可能醫(yī)治的)病變特別重要的步驟。k-ras突變是超過90％的人胰腺腺癌的病因，這對評估新腫瘤成像試劑的這種模型的有效性提供更進一步的支持。成像研究為了確定NM404是否集中于小鼠胰腺腫瘤中，從尾靜脈注射125I-NM404(15μCi/20gbw)后2-21天起，六只c-myc內(nèi)源性小鼠用BioscanAR-2000放射TLC掃描儀(在發(fā)明人的實驗室內(nèi)經(jīng)改良用于鼠的成像)掃描。在最后的那天，小鼠還經(jīng)受微CT掃描(42kvp，410μA，390步，MicroCAT-I，ImTek，Inc.，Knoxville，Tenn.)。麻醉小鼠的體內(nèi)成像后，切除胰腺腫瘤，用相同的掃描儀(裝備有高分辨率1mm準直儀和2-D采集和分析軟件)離體掃描，以便避免和碘-125低能量有關的組織衰減(圖9-10)。處死時，切除組織，稱重并在伽馬計數(shù)器中定量放射性。結(jié)果和討論在c-myc模型中采用NM404的最初成像結(jié)果表明，在直徑5-12mm的所有的腺癌中有顯著的吸收和延長的保留(＞21天)。如在先前細胞培養(yǎng)物和體內(nèi)動物模型研究中觀察到的，NM404明顯被代謝和從正常細胞中清除，但是被代謝地陷于腫瘤細胞膜上。在其它腫瘤模型中的先前的放射自顯影實驗已建議，僅是有活力的腫瘤細胞而不是正常組織或壞死組織能夠積累NM404。盡管小鼠體內(nèi)的胰的普遍存在的性質(zhì)，但發(fā)明人采用微CT還能夠檢測活的小鼠體內(nèi)的胰腺腫瘤(圖11)。盡管攜帶胰腺腫瘤的動物的數(shù)量是少數(shù)(n＝6)，但原發(fā)性NM404腫瘤對于背景的數(shù)據(jù)看起來是有希望的。結(jié)論NM404在這個研究檢查的自發(fā)的胰腺腺癌中顯示了選擇性和延長的保留，因此進一步擴大了這種試劑的腫瘤選擇性。E.實施例V大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型材料和方法所有的動物都是依照成斯康辛州大學研究動物資源中心指導方針來飼養(yǎng)和管理。大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞在DMEM培養(yǎng)基(LifeTechnologies，Gaithersburg，Md.)中繁殖，培養(yǎng)基中添加10％的熱滅活的FBS(BioWhittaker，Walkersville，Md.)、100U/ml青霉素G、100mg/ml的鏈霉素和0.01M的HEPES(LifeTechnologies，Gaithersburg，Md.)。顱內(nèi)腫瘤的植入根據(jù)先前描述的完成(參考文獻)。簡言之，將1×106C6細胞再懸浮于5ml的1.2％的甲基纖維素中，并注射進麻醉的雌性Wistar大鼠(Harlan，Indianapolis，Ind.)的額葉。假手術(shù)的動物接受相同量的不含腫瘤細胞的甲基纖維素的顱內(nèi)注射。成像研究植入后10天，通過MRI證實了顱內(nèi)腫瘤的存在。簡言之，麻醉的大鼠(6)接受2ml的釓雙胺(Gd，釓雙胺和卡地胺鈉注射劑287mg/ml，Nycomed，Princeton，N.J.)腹膜內(nèi)注射，10分鐘后采用1.5德斯拉的臨床用MR系統(tǒng)(GESignaLX)和GE分階段的排列末端線圈來成像。檢查覆蓋了每只大鼠的整個大腦的T1-加權(quán)的(TR＝500ms，TE＝16.5ms)多切片序列，用以選擇攜帶腫瘤的大鼠，具有多種腫瘤大小，假手術(shù)的大鼠注射NM404。通過在熔化的新戊酸中和Na125I的同位素交換，NM404[18-(4-碘代苯基)-十八烷基磷酸膽堿](圖3A，100mg)用125I來放射性碘化。Weichert，等人.IntJApp.RadIsotopes.1986；37907-913。HPLC純化后，尾靜脈注射(5-20μCi/200g的大鼠)進入4只攜帶腫瘤的大鼠和3只假手術(shù)的大鼠之前，NM404用2％聚山梨酯20的水溶液溶解。NM404注射后1(n＝1)、2(n＝1)和4(n＝2)天，動物安樂死(CO2)，切除腦，用改良的BioscanAR2000放射-TLC掃描儀(2分鐘的采集/道時1mm的增量和1mm高分辨率準直儀)成像。此外，稱重正常的腦、血液、腎、肝、脾、甲狀腺和腫瘤組織，并在伽馬計數(shù)器中計算放射性。然后將放射性組織分布和腦組織學相關聯(lián)。結(jié)果和討論使用NM404的最初成像結(jié)果表明，在直徑3-5mm的所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤中有顯著的吸收和延長的保留。在假手術(shù)對照動物的正常腦組織中的放射性是最小的(圖12)，然而NM404在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中強烈集中(圖13)。在攜帶C6的大鼠中腫瘤與腦的比值(％注射劑量/克)在24、48和96小時時分別是10.5、12.2和6.7。如在先前的細胞培養(yǎng)物和體內(nèi)動物模型研究中所觀察到的，NM404明顯被代謝并從正常組織中清除，但在腫瘤細胞膜上代謝地受陷。在其它腫瘤模型中先前的放射自顯影實驗提示，僅是有活力的腫瘤細胞而不是正常組織或壞死組織能夠積累NM404。感興趣地，甚至測量直徑為幾個mm的小腫瘤，在給藥NM404后也能檢出。這些初步的發(fā)現(xiàn)建議，NM404還可以用于小侵襲性腫瘤病灶的顯影。結(jié)論如在先前檢查的所有腫瘤模型中的情況，NM404顯示出對在這個研究評價的大鼠C6-神經(jīng)膠質(zhì)瘤的選擇性和被其延長的保留。實施例VI鼠肝腫瘤在14個異種移植物和自生腫瘤模型中獲得的最初結(jié)果普遍地顯示了NM404在腫瘤中經(jīng)歷了選擇性吸收和延長的保留。進一步地，因為NM404較其前期物質(zhì)提供了更低的肝背景水平，發(fā)明人根據(jù)使HCC患者成像已有問題的事實將評價擴大到肝腫瘤中。很多患者具有根本的肝硬化，因此用交叉斷面成像是難以從HCC中區(qū)分再生的小瘤。此外，評估用PDG掃描的PET初步研究在檢測疾病中已經(jīng)顯示了僅有20-50％的靈敏度。VerhoefC，ValkemaR.等人，Liver(2002)2251-56。材料和方法內(nèi)源性小鼠HCC模型。在過度表達TGFα基因的內(nèi)源性小鼠中自生的肝細胞癌的發(fā)生，已廣泛地評估了，并且是用于研究這種疾病的非常有希望的動物模型。LeeGH，MerlinoG，F(xiàn)austoN.CancerResearch(1992)525162-5170。TGFα是上皮細胞的促細胞分裂劑，結(jié)合EGF受體；TGFα的未調(diào)節(jié)的表達導致腫瘤的形成。在鋅誘導的金屬硫蛋白1(MT1)啟動子控制下表達轉(zhuǎn)基因TGFα的雄性CD1小鼠中，12個月大小之后，75-80％發(fā)生HCC。然而，當在出生的第15天用烷化劑二乙基亞硝胺(DEN)(化學致癌劑)誘導腫瘤的生長時，90％的小鼠到6個月大才發(fā)生HCC。在組織學檢查中，這些腫瘤由充分分化的實體型式的肝細胞癌組成。因為腫瘤自發(fā)地出現(xiàn)，發(fā)明人利用這些動物作為臨床前研究的合適的模型。CT26結(jié)腸腺癌異種移植模型除了自生的HCC模型之外，NM404還在異種移植結(jié)腸腺癌腫瘤模型中進行評估，借此CT26細胞(5×105細胞/50μl)先前直接注射進雌性BALB/c小鼠的肝實質(zhì)中，用于產(chǎn)生局部肝腫瘤。成像研究通過在熔化的新戊酸中的同位素交換，NM404(圖3A，100μg)用125I來放射性碘化。WeichertJP，等人，IntJAppliedRadiatIsot(1986)37(8)907-913。HPLC純化后，尾靜脈注射(15μCi/20g的小鼠)進入3只TGFα內(nèi)源性小鼠或可替代地注射進3只攜帶CT26-腫瘤的小鼠之前，NM404用2％聚山梨酯20的水溶液溶解。小鼠被麻醉，直至注射后第21天，用改良的BioscanAR2000放射-TLC掃描儀(2分鐘采集/道時，1mm的增量和1mm高分辨率準直儀)掃描，還在ImTek微CT掃描器(390步)中掃描用于解剖學對比。采用Amira軟件顯示了微CT圖像。處死時，最初切除攜帶腫瘤的肝，并離體掃描。然后切除腫瘤，稱重、離體掃描并計算放射性。病變樣品接受組織學分類。結(jié)果和討論采用NM404的最初成像結(jié)果(圖14、15)顯示，在肝的自生癌和植入癌中有顯著的吸收(＞20％劑量/克)和延長的保留。NM404腫瘤的保留在這些動物中持續(xù)了21天，預定的研究終末點。增強對比度的微CT圖像證實了所有肝腫瘤的存在和精確定位(圖14，16)。腫瘤組織的類脂提取和隨后的HPLC分析顯示，放射性仍然和母體化合物有關。如在先前的細胞培養(yǎng)物和體內(nèi)動物模型研究中所觀察到的，NM404明顯被代謝并從正常細胞中清除，但是在腫瘤細胞膜上代謝受陷。結(jié)論如在檢查的所有先前腫瘤模型中的所述情況，NM404通過在這個研究中評估的自生的和異種移植鼠肝腫瘤模型顯示了選擇性和延長的保留。G.實施例VIIApcMin/+自生的乳腺癌模型材料和方法ApcMin/+小鼠模型這個模型由攜帶Apc的Min等位基因的小鼠(ApcMin/+小鼠)組成。這個模型提供了相對于異種移植模型的特異優(yōu)點，因為雌性ApcMin/+小鼠是易發(fā)生乳腺增生和乳腺癌、腸腺癌。針對C57BL/6J遺傳背景，約5％的未處理的雌性動物到100天大小時發(fā)生乳腺腫瘤。MoserAR，Dove，等人.ProcNatlAcadSciUSA(1993)908977-81。乳腺病變的發(fā)病率和多樣性可以由單劑量的乙基亞硝基脲(ENU)(直接作用的烷化劑)而增加。用ENU處理導致90％的B6ApcMin/+雌性動物發(fā)生平均數(shù)為3個乳腺鱗狀細胞癌(SCC)，但是處理后60天內(nèi)很少增生病變。ApcMin/+小鼠在Apc(腺瘤樣結(jié)腸息肉)基因中攜帶單個堿基對改變。APC/Apc基因編碼具有多個潛在的功能結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。Groden，J.，Thliveris，A.，Samowitz，W.，Carlson，M.，Gelbert，L.，Albertsen，H.，Joslyn，G.，Stevens，J.，Spirio，L.，Robertson，M.等人.Identificationandcharacterizationofthefamilialadenomatouspolyposiscoligene.Cell，(1991)66，589-600；Kinzler，K.W.，Nilbert，M.C.，Vogelstein，B.，Bryan，T.M.，Levy，D.B.，Smith，K.J.，Preisinger，A.C.，Hamilton，S.R.，Hedge，P.，Markham，A.等人。Identificationofagenelocatedatchromosome5q21thatismutatedincolorectalcancers.Science，(1991)257，1366-70。小鼠和人APC蛋白質(zhì)是90％相同的，所有潛在的功能結(jié)構(gòu)域是保守的。APC調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白水平。β-連環(huán)蛋白在細胞中有多種作用，包括E-鈣粘蛋白的穩(wěn)定和通過LEF和TCF家族的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。Aberle，H.，Schwartz，H.和Kemler，R.Cadherin-CateninComplex--ProteinInteractionsandTheirImplicationsForCadherinFunction.JournalofCellularBiochemistry，(1996)67，514-523；Huber，O.，Korn，R.，McLaughlin，J.，Ohsugi，M.，Herrmann，B.G和Kemler，R.Nuclearlocalizationofbeta-cateninbyinteractionwithtranscriptionfactorLEF-1.MechanismsofDevelopment，(1996)59，3-10；Behrens，J.，Vonkries，J.P.，Kuhl，M.，Bruhn，L.，Wedlich，D.，Grosschedl，R.和Birchmeier，W.FunctionalInteractionofBeta-CateninWiththeTranscriptionFactorLef-1.Nature，(1996)382，638-642。β-連環(huán)蛋白水平的調(diào)節(jié)包括APC、axin或conductin，與含β-連環(huán)蛋白的糖原合酶激酶3β(GSK3β)的相互作用。Behrens，J.，Jerchow，B.A.，Wurtele，M.，Grimm，J.，Asbrand，C.，Wirtz，R.，Kuhl，M.，Wedlich，D.和Birchmeier，W.Functionalinteractionofanaxinhomolog，conductin，withbeta-catenin，APC，andGSK3beta.Science，(1998)280，596-9；Ikeda，S.，Kishida，S.，Yamammoto，H.，Murai，H.，Koyama，S.和Kikuchi，A.Axin，anegativeregulatoroftheWntsignalingpathway，formsacomplexwithGSK-3betaandbeta-cateninandpromotesGSK-3beta-dependentphosphorylationofbeta-catenin.EMBOJournal，(1998)77，1371-84；Kishida，S.，Yamamoto，H.，Ikeda，S.，Kishida，M.，Sakamoto，I.，Koyama，S.和Kikuchi，A.Axin，anegativeregulatorofthewntsignalingpathway，directlyinteractswithadenomatouspolyposiscoliandregulatesthestabilizationofbeta-catenin.JournalofBiologicalChemistry，(1998)273，10823-6；Sakanaka，C.，Weiss，J.B.和Williams，L.T.Bridgingofbeta-cateninandglycogensynthaseKinase-3betabyaxinandinhibitionofbeta-cutenin-mediatedtranscription.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，(1998)95，3020-3；Rubinfeld，B.，Albert，I.，Porfiri，E.，F(xiàn)iol，C.，Munemitsu，S.和Polakis，P.BindingofGSK3betatotheAPC-beta-catenincomplexandregulationofcomplexassembly.Science，(1996)272，1023-6；Rubinfeld，B.，Souza，B.，Albert，I.，Muller，O.，Chamberlain，S.H.，Masiarz，F(xiàn).R.，Munemitsu，S.和Polakis，P.AssociationoftheAPCgeneproductwithbeta-catenin.Science，(1993)262，1731-4；Polakis，P.Theadenomatouspolyposiscoli(APC)tumorsuppressor.BiochimicaetBiophysicaActa，(1997)7332，F(xiàn)127-47。這種相互作用導致β-連環(huán)蛋白的磷酸化，其通過泛激素-蛋白酶體途徑靶向它進行降解。Rubinfeld，B.，Souza，B.，Albert，I.，Muller，O.，Chamberlain，S.H.，Masiarz，F(xiàn).R.，Munemitsu，S.和Polakis，P.AssociationoftheAPCgeneproductwithbeta-catenin.Science，(1993)262，1731-4；Su，L.K.，Vogelstein，B.和Kinzler，K.W.AssociationoftheAPCtumorsuppressorproteinwithcatenins.Science，(1993)262，1734-7；Polakis，P.MutationsintheAPCgeneandtheirimplicationsforproteinstructureandfunction.CurrentOpinioninGenetics&Development，(1995)5，66-71；Aberle，H.，Bauer，A.，Stappert，J.，Kispert，A.和Kemler，R.beta-cateninisatargetfortheubiquitin-proteasomepathway.EMBOJournal，(1997)76，3797-804。在APC中的大多數(shù)種系和體細胞突變導致蛋白質(zhì)丟失一部分或所有的β-連環(huán)蛋白結(jié)合位點。26，28，29Polakis，P.MutationsintheAPCgeneandtheirimplicationsforproteinstructureandfunction.CurrentOpinioninGenetics&Development，(1995)5，66-71；Nagase，H.andNakamura，YMutationsoftheAPC(adenomatouspolyposiscoli)gene.HumanMutation.(1993)2，425-34；Beroud，C.andSoussi，T.APCgenedatabaseofgermlineandsomaticmutationsinhumantumorsandcelllines.NucleicAcidsResearch，(1996)24，121-4。該相互作用需要APC的兩個區(qū)域；由Min等位基因編碼的截短的蛋白質(zhì)缺乏這些區(qū)域的這兩個；Polakis，P.MutationsintheAPCgeneandtheirimplicationsforproteinstructureandfunction.CurrentOpinioninGenetics&Development，(1995)5，66-71；Su，L.K.，Kinzler，K.W.，Vogelstein，B.，Preisinger，A.C.，Moser，A.R.，Luongo，C.，Gould，K.A.和Dove，W.F.MultipleintestinalneoplasiacausedbyamutationinthemurinehomologoftheAPCgene.Science，(1992)256，668-70。APC還在β-連環(huán)蛋白向細胞核外的轉(zhuǎn)運中起作用。因此，缺乏APC功能時，β-連環(huán)蛋白將在細胞質(zhì)和細胞核中聚積，可能影響靶基因的轉(zhuǎn)錄和通過E-鈣粘蛋白的細胞-細胞相互作用。APC突變在人的數(shù)種腫瘤類型包括腸腫瘤和其它上皮腫瘤中是常見的。在APC基因座雜合性的缺失或增加β-連環(huán)蛋白的水平，在超過25％的乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了。Furuuchi，K.，Tada，M.，Yamada，H.，Kataoka，A.，F(xiàn)uruuchi，N.，Hamada，J.，Takahashi，M.，Todo，S.，和Moriuchi，T.SomaticmutationsoftheAPCgeneinprimarybreastcancers.SomaticmutationsoftheAPCgeneinprimarybreastcancers，AmericanJournalofPathology.(2000)1561997-2005；Jonsson，M.，Borg，A.，Nilbert，M.，和Andersson，T.Involvementofadenomatouspolyposiscoli(APC)/beta-cateninsignalinginhumanbreastcancer.Involvementofadenomatouspolyposiscoli(APC)/beta-cateninsignalinginhumanbreastcancer，EuropeanJournalofCancer.(2000)36242-248。因此，在這些小鼠中出現(xiàn)的病變的類型和人乳腺癌比，在分子和組織學上將是相似的。遺傳背景可影響發(fā)生乳腺病變的發(fā)病率、潛伏期以及類型。例如，F(xiàn)VB×B6ApcMin/+雌性小鼠中每只小鼠發(fā)生平均0.2個乳腺腫瘤，但是在120天治療中每只小鼠4個增生。BALB/×B6ApcMin/+每只小鼠發(fā)生平均1.8個乳腺腫瘤和0.6個增生。MoserA.R.，HeggeL.F.，CardiffR.D.CancerResearch(2001)613480-3485。FVB×B6和BALB/×B6ApcMin/+小鼠都會生成乳腺SCC和腺癌(AC)。FVB×B6ApcMin/+小鼠中的增生病變可被分類為小泡狀增生或鱗狀小結(jié)。MoserA.R.，HeggeL.F.，CardiffR.D.GeneticbackgroundaffectssusceptibilitytomammarytumorsandhyperplasiasinApcMin/+mice，遺傳背景對ApcMin/+小鼠乳腺腫瘤的易感性和超常增生的影響，CancerResearch(2001)613480-3485。小泡狀增生是腺癌的前期形式，鱗狀小結(jié)是SCC的前期病變。因此，通過操縱遺傳背景，可產(chǎn)生發(fā)生多種類型的超常增生和癌的小鼠，通常在同一動物中。類似非典型小葉的小泡狀增生(A型)通?？稍谌祟惾榉繕悠分邪l(fā)現(xiàn)。Cardiff，R.D.和Wellings，S.R.人類和小鼠乳腺的比較病理學，Thecomparativepathologyofhumanandmousemammaryglands，JournalofMammaryGlandBiology&Neoplasia.(1999)4105-22。這些非典型小葉在患有乳腺癌癥的女性的癌性乳腺或?qū)?cè)乳房中更普遍。盡管SCC不是乳房腫瘤的常見類型，但AC類似人類乳房腫瘤的普通類型。此外，在人類乳癌中普遍存在具有APC途徑變更的腫瘤。APC部位的雜合性的損失或β-連環(huán)蛋白水平的增加在超過25％乳癌中發(fā)現(xiàn)。Furuuchi，K.，Tada，M.，Yamada，H.，Kataoka，A.，F(xiàn)uruuchi，N.，Hamada，J.，Takahashi，M.，Todo，S.，和Moriuchi，T.初期乳癌中APC基因的軀體變異，SomaticmutationsoftheAPCgeneinprimarybreastcancer，AmericanJournalofPathology.(2000)1561997-2005.35。Jonsson，M.，Borg，A.，Nilbert，M.，和Andersson，T.。包含在人類乳癌中腺癌的結(jié)腸息肉病(APC)/β-連環(huán)蛋白的傳號。Involvementofadenomatouspolyposiscoli(APC)/β-cateninesignalinginhumanbreastcancer，EurJournalofCancer，(2000)36242-248。因此，這些小鼠上出現(xiàn)的病變類型將在分子水平上、組織結(jié)構(gòu)上與人類乳癌相似。該模型的獨特的方面和優(yōu)點是能夠產(chǎn)生通常在同一個動物上生成多種類型的乳房超常增生和癌的小鼠。這樣我們可以測試NM404在同一動物上對多種類型的超常增生和腫瘤的吸收和保留。小鼠感染多瘤病毒導致產(chǎn)生多種腫瘤類型包括乳房腫瘤。在小鼠乳房腫瘤病毒LTR(MMTV)的控制下表達多瘤中T抗原(PyVT)的內(nèi)源小鼠迅速產(chǎn)生多病灶的乳房發(fā)育異常和腫瘤。AmyMoser；Guy，C.T.，Cardiff，R.D.，和Muller，W.J.表達多瘤病毒中T腫瘤基因?qū)θ榉磕[瘤的誘導作用用于轉(zhuǎn)移疾病的內(nèi)源小鼠模型，InductionofmammarytumorsbyexpressionofpolyomavirusmiddleToncogeneatransgenicmousemodelformetastaticdisease，Molecular&CellularBiology.(1992)12954-61。原位癌的證據(jù)可早在3周時被發(fā)現(xiàn)，100％的乳房腫瘤發(fā)病率可早在5周時被發(fā)現(xiàn)。腫瘤主要被分類為AC和/或腺癌。小鼠在出現(xiàn)原發(fā)性腫瘤的50天內(nèi)在肺部發(fā)生多重轉(zhuǎn)移病變。Lifsted，T.，LeVoyer，T.，Williams，M.，Muller，W.，Klein-Szanto，AA.，Buetow，K.H.，和Hunter，K.W.鑒別包含乳房腫瘤基因修飾因子的近親繁殖的小鼠品種的發(fā)病時間和轉(zhuǎn)移進展，Identificationofinbredmousestrainsharboringgeneticmodifiersofmammarytumorageofonsetandmetastaticprogression，IntJofCancer.(1998)77640-4。因此，這些小鼠提供了轉(zhuǎn)移乳癌的快速模型。至于ApcMin/+小鼠，遺傳背景影響腫瘤發(fā)生的時間過程以及轉(zhuǎn)移的傳播。Lifsted，T.，LeVoyer，T.，Williams，M.，Muller，W.，Klein-Szanto，AA.，Buetow，K.H.，和Hunter，K.W.鑒別包含乳房腫瘤基因修飾因子的近親繁殖的小鼠品種的發(fā)病時間和轉(zhuǎn)移進展，Identificationofinbredmousestrainsharboringgeneticmodifiersofmammarytumorageofonsetandmetastaticprogression，IntJofCancer.(1998)77640-4。因此，發(fā)明人使用雜交產(chǎn)生腫瘤發(fā)生較慢過程的小鼠。PyVT可伴隨SRC激酶家族的成員，磷脂酰肌醇-3”激酶，SHC銜接蛋白和蛋白磷酸酶2A。Dankort，D.L.和Muller，W.J.乳癌轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)基因模型，Transgenicmodelsofbreastcancermetastasis，CancerTreatment&Research.(1996)8371-88。在人類乳房腫瘤中常常可觀察到SRC家族激酶的激活作用。AmyMoser；Muthuswarny，S.K.和Muller，W.J.Src家族的酪氨酸酶在乳房腫瘤發(fā)生中的激活作用，ActivationoftheSrcfamilyoftyrosinekinasesinmammarytumorigenesis，AdvencesinCancerResearch(1994)64111-23。成像研究在熔融的新戊酸中用125I通過同位素交換將NM404(圖3A，100μg)放射性碘化。HPLC純化之后，將其溶解于2％吐溫-20的水溶液中，然后經(jīng)尾部靜脈注射(15μCi/20g小鼠)入6只雌性ApcMin/+小鼠中。將小鼠麻醉并在改良的BioscanAR2000radio-TLC掃描儀(2min采集/道時1mm增值，以及1mm高分辨率準直儀)以及ImTek微CT掃描儀(390步)上進行掃描以直到注射后50天進行解剖學對照。微CT成像用Amira軟件顯示。處死小鼠時，將乳腺或切除的腫瘤離體成像，將病變切除，稱重，并放射性定量。病變樣品進行組織學分類。如果需要，可將在發(fā)明人的實驗室中開發(fā)的適合用于長時間微CT采集次數(shù)的長效CT血池造影劑(BP10)，在CT掃描之前靜脈內(nèi)注射，以使幫助血管顯影。(圖19)。WeichertJP，等，Radiology(2000)216865-871。結(jié)果和討論該模型由于超常增生乳房病變、乳房癌和腸腺瘤發(fā)生在同一小鼠上而顯得獨特。使用NM404的初始成像結(jié)果(圖17，18)表明，在所有自發(fā)的乳房癌，其直徑為2-15mm中有顯著的吸收(＞20％劑量/g)以及延長的保留。盡管腫瘤定位看起來很快，但在身體的清除期，肝和膽的背景放射性仍持續(xù)幾天。經(jīng)HPLC分析放射性尿和糞便表明，代謝產(chǎn)物的存在且沒有母體化合物NM404。腫瘤對NM404的保留持續(xù)50天，即預定的研究終點。然而NM404并不集中在這些小鼠中常見的腸腺瘤的息肉中(圖18)。微CT成像證實了所有乳房腫瘤的存在及其精確位置(圖19)。腫瘤組織的脂類提取以及之后的HPLC分析表明母體化合物仍伴隨著放射性。如在先前的細胞培養(yǎng)物研究中觀察到的，NM404在正常細胞中被明顯地代謝和消除，但在腫瘤細胞膜中被代謝地捕獲。結(jié)論NM404在至今試驗的動物和人類的異種移植腫瘤模型中顯示出顯著的腫瘤親和力。此外，盡管其在該自發(fā)性腫瘤模型中顯示出對乳房腫瘤的選擇性和被其延長的保留，但它不會集中在有關的腸腺瘤息肉中。H.實施例VIII在ApcMin/+內(nèi)源性乳房腺癌模型中超常增生與瘤形成的特異性材料和方法ApcMin/+小鼠模型該模型由推帶有Apc的Min等位基因小鼠(ApcMin/+小鼠)構(gòu)成。該模型提供與異種移植物模型相比特殊的優(yōu)點，因為雌性ApcMin/+小鼠易發(fā)生乳房超常增生和癌以及腸腺瘤。在C57BL/6J基因背景上，大約5％未處理的雌性小鼠在100天時將發(fā)生乳房腫瘤。MoserAR，Dove等，ProcNatlAcadSclUSA(1993)908977-81。單一劑量的乙基亞硝酸脲(ENU)，一種直接作用的烷化劑可增加乳房病變的發(fā)生率和多樣性。用ENU處理使90％的B6ApcMin/+雌性小鼠在處理后60天內(nèi)發(fā)生平均3個乳房鱗狀細胞癌(SCC)，但是很少超常增生病變。遺傳背景可影響發(fā)生的乳房病變的發(fā)病率、潛伏期以及類型。例如，F(xiàn)VB×B6ApcMin/+雌性小鼠中每只小鼠發(fā)生平均0.2個乳房腫瘤，但是在120天治療中每只小鼠4個增生。BALB/×B6ApcMin/+每只小鼠發(fā)生平均1.8個乳房腫瘤和0.6個增生。MoserA.R.，HeggeL.F.，CardiffR.D.CancerResearch(2001)613480-3485。FVB×B6和BALB/×B6ApcMin/+小鼠都會生成乳房SCC和腺癌(AC)。成像研究在熔融的新酸中用125I通過同位素交換將NM404(圖3A，100μg)放射性碘化。HPLC純化之后，將其溶解于2％吐溫-20的水溶液中，然后經(jīng)尾部靜脈注射(15μCi/20g小鼠)入6只雌性ApcMin/+小鼠中。將小鼠麻醉并直到注射后30天在改良的BioscanAR2000放射-TLC掃描儀(2min采集/道時1mm增值，以及1mm高分辨率準直儀)以及ImTek微CT掃描儀(390步)上進行掃描以進行解剖學對照。微CT成像用Amira軟件顯示。處死小鼠時，將乳腺或切除的腫瘤離體成像，將病變切除，稱重，并放射性定量。將損傷樣品進行組織學分類。如果需要，可將在發(fā)明人的實驗室中開發(fā)的適合用于長時間微CT采集次數(shù)的長效CT血池造影劑(BP10)，在CT掃描之前靜脈內(nèi)注射，以便幫助血管顯影。(圖22)。WeichertJP，等，Radiology(2000)216865-871。結(jié)果和討論該模型由于超常增生乳房病變、乳房癌和腸腺瘤發(fā)生在同一小鼠上而顯得獨特。使用NM404的初始成像結(jié)果(圖20，21)表明，在所有自發(fā)的乳房癌，其直徑為2-15mm中有顯著的吸收(＞20％劑量/g)以及延長的保留。盡管腫瘤定位看起來很快，但在身體的清除期，肝和膽的背景放射性仍持續(xù)幾天。經(jīng)HPLC分析放射性尿和糞便顯示出代謝產(chǎn)物的存在且沒有母體化合物NM404。腫瘤對NM404的保留持續(xù)＞21天，即預定的研究終點。然而NM404并不集中在這些小鼠中常見的局部小泡狀超常增生或腸腺瘤樣息肉中(圖21)。微CT成像證實了所有乳房腫瘤的存在及其精確定位(圖22)。NM404在正常細胞中被明顯地代謝和消除，但在腫瘤細胞膜中被代謝地捕獲得。結(jié)論NM404在至今試驗的20/20動物和人類的異種移植腫瘤模型中顯示出顯著的腫瘤親和力。此外，盡管其在該自發(fā)性腫瘤模型中顯示出對乳房腺癌和鱗狀細胞癌的選擇性和被其延長的保留，但它不集中在有關的局部小泡狀超常增生或腸腺瘤息肉中并因此表現(xiàn)出對惡性腫瘤細胞的選擇性。I.實施例IXNM404選擇性保留的機制前言特定的磷脂醚類似物，如NM404，選擇性地在許多類型腫瘤細胞中保留很長時間。發(fā)明人尋求利用酶評價法來測定磷脂酶D(PLD)蛋白的活性和定量PCR，來評價NM404在腫瘤細胞中的選擇性保留的機制。發(fā)明人假定腫瘤細胞中PLD水平的降低導致代謝和排泄NM404能力的降低。方法鼠類腫瘤細胞系的單細胞懸浮液，包括hepa-1(肝癌)，CT26(直腸結(jié)腸腺癌)以及TS/A(乳房腺癌)用下列兩種方法分析(1)AmplexRed測定法，用商業(yè)上可獲得的試劑盒(MolecularProbes)，其用熒光微板讀數(shù)器評價PLD蛋白活性，以及(2)定量PCR測定PLDmRNA的水平。將腫瘤細胞系與正常的肝臟組織相比較，其顯示較高的NM404的吸收和消除水平并因此與其他正常組織相比可能具有較低的PLD水平。對于AmplexRed測定法，用洗滌劑溶液(Triton-X-100)提取出總蛋白并且將PLD的量與標準陽性對照進行比較。對于PCR，將mRNA純化并且用逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)轉(zhuǎn)化為cDNA。實時PCR的放大cDNA的條件包括(94℃，30sec；65℃，30sec；和72℃，30秒)循環(huán)50次(iCycler，iQmix，Bio-Rad)。使用PLD1引物，(正文)5′-TCTGGTTTCACCCCGTCAGM-3′，(反義)5′-TTGCTCATATCTGCGGCGAT-3′。將產(chǎn)品與從1μg稀釋至10-7μg的標準cDNA(GAPDH，Biosource)相對比。所有的測試均為雙份。結(jié)果PLD測定的數(shù)量如表3所示。所有細胞系中的PLD蛋白活性和mRNA水平均顯著低于正常肝臟組織(p＜0.05，T-檢驗)。結(jié)論在鼠類腫瘤細胞系中觀察到了降低的PLD蛋白活性和PLDmRNA的減少。因此，NM404的選擇性保留的機制可能歸因于PLD分解NM404減少。腫瘤中降低的PLD活性可能起抗腫瘤藥物的潛在分子靶的作用。表3J.實施例X內(nèi)源性鼠類乳房腫瘤模型中的治療特征NM404治療研究的模型盡管長期的存活對成像研究并不是必需的，但是對提出的治療研究來說是有利的。用于成像研究的模型患有伴隨而來且常常致使動物死亡的腸腫瘤。為了增加每只小鼠發(fā)生腫瘤的數(shù)量并減少腸腫瘤的數(shù)量，以期望增加攜帶腫瘤小鼠的壽命，Dr.Moser最近將B6Min/+雄性小鼠與C57BR/cdj(BR)雌性小鼠雜交。得到的BRB6F1Min/+雌性小鼠與B6Min/+小鼠相比明顯發(fā)生更多的乳房腫瘤(P＝0.016)，平均為近5個。這兩個品系之間患腫瘤小鼠的數(shù)目以及至第一個腫瘤的時間并沒有什么區(qū)別(分別為P＝1和P＝0.06)(圖25)。BRB6F1小鼠乳房腫瘤數(shù)目的增多，可能部分歸因于，與B6Min/+小鼠相比雜交BRB6F1Min/+小鼠的存活時間顯著更長(P＝2×10-7)。B6和BRB6F1Min/+小鼠在乳腺表型上十分相似，但是在腸腫瘤的易感性方面非常不同。B6和BR品系可被認為對于Min-誘導的乳房腫瘤生成的敏感背景，因為在ENU處理后短時間內(nèi)小鼠出現(xiàn)了大量腫瘤。然而，BR品至在影響腸腫瘤發(fā)生的修飾基因座攜帶顯性抵抗等位基因，這可以證實與提出的治療研究的相關性。這些品系的比較見表2。表2.遺傳背景影響Min/+小鼠中乳房和腸腫瘤生成*16只小鼠的信息，如2只小鼠的腸在處理中丟失。小鼠由各個品系的雌性和B6Min/+雄性交配產(chǎn)成。雌性小鼠30-45天大小時，用ENU處理，當瀕死時處死小鼠。僅顯示了來自Min/+小鼠的結(jié)果。乳房腫瘤定義為在尸體剖檢時辨別的那些腫瘤，同時乳房病變是在1st、4th和5th乳腺的全部量中記錄的小的局部病變。腸腫瘤是以來自小腸(十二指腸、空腸和回腸)和整個結(jié)腸的三個4cm的切片計數(shù)。所有Min/+小鼠出現(xiàn)腸腫瘤。數(shù)值是均值±SD。Min小鼠中NM404的初步成像結(jié)果在初步試驗中顯示NM404集中在內(nèi)源性FVB×B6ApcMin/+小鼠的乳房腫瘤中，兩只動物被注射(IV尾靜脈)125I-NM404(15μCi)并且在注射后的1、4和7天時在改良的BioscanAR2000放射TLC掃描儀(配備高分辨率1mm準直儀和2-D采集以及分析軟件)上成像(圖27A，B)。每只動物在安樂死前10天進行微CT掃描(圖27)并解剖除去乳腺和伴隨的腫瘤。從離體Bioscan成像(圖27)上可看到所有腫瘤與局部熱斑是相互關聯(lián)的。盡管淋巴結(jié)可見，但是并沒有伴隨放射性，說明未被腫瘤細胞浸潤。在圖27C中的主要腫瘤在組織學上分類為腺癌。兩只小鼠都各有四個乳房腫瘤，并且在切除乳腺的離體Bioscan成像上可輕易鑒別。NM404的放射療潛力在目前用“成像”劑量(15-20μCi/20g小鼠)的125I-標記的NM404進行的小鼠腫瘤吸收和保留研究過程中，觀察到幾個明顯的治療反應(未公開的結(jié)果)。在ApcMin/+小鼠乳房腫瘤模型中，已普遍注意到，單次靜脈內(nèi)注射NM404之后，腫瘤生長保持靜止。注射后約8天一些動物在較大乳房腫瘤上還掉光所有的毛。此外，這些小鼠還生成腸腫瘤，并且常常遭受腸出血，導致的嚴重貧血，這使它們的腳變白。Dr.Moser注意到在單次注射NM404后大約5天，這些小鼠的腳恢復為粉色。這些動物最后的解剖時，注意到預期的20個左右在該年齡常見的腸腫瘤中只有很少，如果有的話，實際存在?！澳_由白變粉”現(xiàn)象也在個體，但是更有力地是，在腸腺癌小鼠模型中觀察到，其中在給予NM404之后的12天解剖，這又一次顯示，預期的腸腫瘤中的大部分，如果不是全部，消失了。在兩個腸模型中，接受NM404的動物輕易地比它們未處理的同窩仔配對物活得更長。在兩個各包含多于6只小鼠的單獨年齡-配對組中，這些巧合的發(fā)現(xiàn)再次被證實。給予125I-NM404后的這些觀察結(jié)果表明了用于放射療法使用的潛力，尤其如果用碘-131標記。在這個提出的乳房腫瘤模型中進行的定量的腫瘤吸收和保留研究還提供充足的數(shù)據(jù)以開始著手廣泛的該試劑的劑量學分析，以便評估其真實的放射治療潛力。同位素選擇由于其具有60天的物理半衰期以及低能量28KeV光子發(fā)射，碘-125適合用于小鼠和大鼠的成像試驗。碘-125還具有治療特征，目前已用于長期前列腺簡化療法(brachytherapy)植入物。在一個成像試驗中，2只裸小鼠分別在對側(cè)脅腹接種皮下鱗狀細胞1和6腫瘤細胞。使用SCC1和6細胞是由于其中一個相對于另一個是放射敏感的。14天后當腫瘤平均尺寸(共4個)接近0.5cm的直徑時，其中一只小鼠接受20μCi的用125I標記的NM404，另一只小鼠接受未標記的相同劑量NM404。僅接受未標記化合物的小鼠在注射后20天被處死，因為兩個腫瘤都已達到我們動物試驗計劃書中定義的終端尺寸極限。125I-NM404小鼠的兩個腫瘤在數(shù)周內(nèi)戲劇化和出人意料地退化(圖28)。事實上，該小鼠的腫瘤從未達到終端尺寸，90天后該小鼠被實際處死以收集組織學切片。此時，腫瘤的中心已壞死，而周圍的邊緣變得有些活力的。組織學檢查證實了中心壞死和邊緣變得有活力。盡管供血因子可能導致該觀察結(jié)果，但還有可能是125I發(fā)射的光子使腫瘤外周的電子平衡較差，導致腫瘤的“皮”的供給不足。該電子平衡的問題在輻射腫瘤學中十分重毒。光子在與組織互相影響并發(fā)揮其生物學作用之前，經(jīng)過有限的距離(通過其能量進行測定)。具有過高能量的光子可導致腫瘤小結(jié)外周的供給不足，因為光子會在沉積其劑量之前離開小結(jié)(離開腫瘤)。這可能成為125I光子的問題，但是，低能量能夠保證非常集中的沉積。ComplexMonteCarlo計算法可使該估算值更準確，但是最好的確定最佳同位素的方法是試驗法，因為有許多因素參，其不可能被準確地做成模型(組織分布，多重路徑的細節(jié)，等等)。125I的一個優(yōu)點是所有的光子都具有低能量，保證了圍繞腫瘤的正常組織的暴露非常有限。碘-131已被用于治療甲狀腺癌，功效顯著。非常安全劑量的131I可控制充分分化的甲狀腺癌的亞臨床沉積，其與正常甲狀腺相比能非?？焖俚丶械?。這活躍的吸收過程幫助限制對正常組織的劑量。碘-131有β和幾種γ發(fā)射，但是占優(yōu)勢的組織劑量由β發(fā)射引起。發(fā)明人將基于甲狀腺癌的臨床上成功與用Bexxar(以碘-131標記的抗體為基礎的試劑)在低級淋巴瘤患者中獲得的結(jié)果相結(jié)合，來選擇131I標記的NM404。占優(yōu)勢的β發(fā)射和大部分低能量γ發(fā)射在腫瘤小結(jié)自身中優(yōu)化劑量的均一性。并且，更短的半衰期(8天)與125I的60天半衰期相比，能提供臨床上更相關的劑量強度。這些因素可幫助發(fā)明人進行最地判斷該物質(zhì)抗腫瘤的功效。131I的一個潛在缺點是其具有較高能量的γ發(fā)射，其實際上可能使鄰近周圍組織暴露于與125I相比更多的輻射中。本文提出的內(nèi)源性模型中的腫瘤集中在乳腺的周圍，因此不應當對動物整體的健康產(chǎn)生直接的威脅。由于器官毒性也是本研究的終點之一，周圍組織和關鍵器官系統(tǒng)(骨髓、肝臟、腎臟、腸、腦等等)的反應也被評估。組織分布數(shù)據(jù)和放射性標記的NM404的實際劑量學將決定其最佳治療潛力。在治療環(huán)境中有可能不同的同位素將互相補充。應當理解本文描述的實施例和實施方案僅被用于說明目的，并且本領域技術(shù)人員可以此為依據(jù)作各種修改和改變，并且這些改動包含在本申請的精神和范圍和附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文中提到的所有申請、專利、專利申請的全文引入作為參考。IV.參考文獻(1)CancerFactsandFigures.AmericanCancerSociety2001。(2)PennaC，NordlingerB.Colorectalmetastasis(liverandlung).SurgClinNorthAm2002；821075-10xi。(3)FongY，F(xiàn)ortnerJ，SunRL，BrennanMF，BlumgartLH.Clinicalscoreforpredictingrecurrenceafterhepaticresectionformetastaticcolorectalcanceranalysisof1001consecutivecases.AnnSurg1999；230309-318。(4)IkeH，ShimadaH，OhkiS，TogoS，YamaguchiS，IchikawaY.Resultsofaggressiveresectionoflungmetastasesfromcolorectalcarcinomadetectedbyintensivefollow-up.DisColonRectum2002；45468-473。(5)O′DwyerPJ，StevensonJP，HallerDG，RotmanN，GiantonioBJ.Follow-upofstageBandCcolorectalcancerintheUnitedStatesandFrance.SeminarsinOncology2001；28附錄-9。(6)WichmannMW，Lau-WernerU，MullerC，HornungHM，StieberP，SchildbergFW，TheColorectalCancerStudyGroup.Carcinoembryonicantigenforthedetectionofrecurrentdiseasefollowingcurativeresectionofcolorectalcancer.AnticancerResearch2000；204953-4955。(7)LencioniR，CioniD，BartolozziC，Percutaneousradiofrequencythermalablationoflivermalignanciestechniques，indications，imagingfindings，andclinicalresults，AbdomImaging2001；26345-360。(8)CurleySA，IzzoF，DelrioP，等人.RadiofrequencyablationofunresectableprimaryandmetastatichepaticmalignanciesResultsin123patients.AnnSurg1999；2301-8。(9)SolbiatiL，LivraghiT，GoldbergSN，等人，Percutaneousradio-frequencyablationofhepaticmetastasesfromcolorectalcancerlong-termresultsin117patients.Radiology2001；221159-166.(10)SaltzLB，CoxJV，BlankeC，RosenLS，F(xiàn)ehrenbacherL，MooreMJ，MarounJA，AcklandSP，LockerPK，PirottaN，ElfringGL，MillerLL.Irinotecanplusfluorouracilandleucovorinformetastaticcolorectalcancer.IrinotecanStudyGroup.NEnglJMed2000；343905-914。(11)DeGramontA，BossetJF，MilanC，RougierP，BoucheO，EtiennePL，MorvanF，LouvetC，GuillotT，F(xiàn)rancoisE，BedenneL.Randomizedtrialcomparingmonthlylow-doseleucovorinandfluorouracilboluswithbimonthlyhigh-doseleucovorinandfluorouracilboluspluscontinuousinfusionforadvancedcolorectalcanceraFrenchintergroupstudy.JClinOncol1997；15808-815。(12)ModulationoffluorouracilbyleucovorininPatientswithadvancedcolorectalcancerevidenceintermsofresponserate.AdvancedcolorectalcancerMeta-AnalysisProject.JClinOncol1992；10896-903.(13)GiacchettiS，PerpointB，ZidaniR，LeBailN，F(xiàn)aggiuoloR，F(xiàn)ocanC，CholletP，LloryJF，LetourneauY，CoudertB，Bertheaut-CvitkovicF，Larregain-FournierD，LeRolA，WalterS，AdamR，MissetJL，LeviF.PhaseIIImulticenterrandomizedtrialofoxaliplatinaddedtochronomodulatedfluorouracil-leucovorinasfirst-linetreatmentofmetastaticcolorectalcancer.JournalofClinicalOncology2000；18136-147。(14)MayrNA.TaokaT.YuhWT，等人.Methodandtimingoftumorvolumemeasurementforoutcomepredictionincervicalcancerusingmagneticresonanceimaging.InternationalJournalofRadiationOncology，Biology，Physics2002；52；114-22.(15)GrevenK.WilliamsD.KeyesJ，等人.Canpositronemissiontomographydistinguishtumorrecurrencefromirradiationsequelaeinpatientstreatedforlarynxcancer？CancerJournalScientificaAmerican1997；3353-357。(16)SnyderF，WoodR.Alkylandalk-1-enylethersofglycerolinlipidsfromnormalandneoplastichumantissues.CancerResearch.1969；29251-257。(17)SnyderF，BlankML，MorrisHP.Occurrenceandnatureofo-alkylando-alkyl-l-enylmoietiesofglycerolinlipidsofMorristransplantedhepatomasandnormalratlivers.BiochemBiophysActa.1969；176502-510。(18)RampyMA，PinchukAN，WeichertJP，SkinnerRW，F(xiàn)isherSJ，WahlRL，GrossMD，CounsellRE.Synthesisandbiologicalevaluationofradioiodinatedphospholipidetherstereoisomers.JMedChem.1995；3833156-3162。(19)WeichertJP，VanDortME，GroziakMP，CounsellRE.Radioiodinationviaisotopeexchangeinpivalicacid.IntJApplRadIsotopes.1986；37.907-913。(20)PlotzkeKP，HaradahiraT，Stancato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有癌癥的器官與周圍區(qū)域相比是否保持較高水平的所述類似物，其中較高保留區(qū)域表明癌癥的檢測和定位。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療受試者中癌癥方法。包括給予有效量的含磷脂醚類似物的分子。文檔編號A61K51/00GK1929869SQ200580007056公開日2007年3月14日申請日期2005年3月2日優(yōu)先權(quán)日2004年3月2日發(fā)明者J·魏歇特,M·隆基諾,A·平丘克申請人:塞勒克塔有限公司