專利名稱：阿江欖仁酸在制備糖苷酶抑制劑藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及從紫薇屬植物中分
離得到的一個五環(huán)三萜酸化合物阿江欖仁酸(arjunolic acid)用于制備抑制糖 苷酶抑制劑藥物的藥物用途。該化合物，即2(1,3^23-三羥基-齊墩果-12-烯-28-
酸具有強(qiáng)效抑制oc-葡萄糖苷酶的生物活性，因此該化合物或其可藥用的鹽，以 及與制劑允許的藥物賦形劑或載體制備成的藥物組合物可預(yù)期作為糖苷酶抑 制劑藥物尤其是防治II型糖尿病也即非胰島素依賴型糖尿病藥物之用途。
背景技術(shù)：
糖尿病是臨床常見的內(nèi)分泌代謝性疾病。隨著科技進(jìn)步和生活水平的提高， 在全球范圍內(nèi)，糖尿病的發(fā)病率正在提高。據(jù)統(tǒng)計，糖尿病發(fā)生在約3%的人 身上，全世界患者總?cè)藬?shù)已超過一億兩千萬，造成國民經(jīng)濟(jì)的重大損失。
西醫(yī)認(rèn)為糖尿病病人可分為兩種即I型糖尿病(或稱胰島素依賴型，
IDDM)和II型糖尿病(或稱非胰島素依賴型，NIDDM)，其中II型糖尿病 的發(fā)病率及患病率皆遠(yuǎn)高于I型糖尿病，因此危害更大。
文獻(xiàn)報道，使用競爭性a-糖苷酶抑制劑，可以推遲淀粉、蔗糖等糖類化合 物在消化道內(nèi)的轉(zhuǎn)化和吸收，減輕腎臟負(fù)擔(dān)，控制飯后血糖急劇上升，使血糖 濃度在一天內(nèi)變化波動幅度減小。德國拜耳公司研制的oc-葡萄糖苷酶抑制劑阿 卡波糖(acarbose)于1990年在德國首次上市，現(xiàn)已成為多個國家包括我國治 療II型糖尿病一線用藥，其商品名為拜糖平。日本開發(fā)的a-糖苷酶抑制劑 voglibose也已于1994年上市。正在臨床試驗的a-糖苷酶抑制劑還有miglitol， emigliate等。
中醫(yī)常稱糖尿病為消渴癥。李時珍本草綱目中記錄單味中藥用于治療糖尿 病者有苦蕎麥、苦瓜、三七、夏枯草等187種。但從中分離確定的以a-糖苷酶 抑制劑為作用機(jī)制的活性先導(dǎo)物和藥物鮮見報道。
千屈菜科紫薇屬植物在我國大部分分布于云南省(全國有16個種，而在云 南的有15種)，臨床上該屬植物有用于降糖的報道，因此，從中進(jìn)行活性檢 測下的活性成分篩選具有開發(fā)出新的a-糖苷酶抑制劑之潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供阿江欖仁酸或其可藥用的鹽在制備oc-葡萄糖苷酶抑 制劑的藥物中的應(yīng)用，藥理實驗證實本發(fā)明提供的阿江欖仁酸具有強(qiáng)效抑制a-葡萄糖苷酶的作用，其中，與a-糖苷酶引起或有關(guān)的生理改變或疾病包括 但不限于II型糖尿病。
本發(fā)明所述的阿江欖仁酸化合物，具體結(jié)構(gòu)式如下
<formula>formula see original document page 4</formula>式(1)
稱為2a,3(3,23-三羥基-齊墩果-12-烯-28-酸。
阿江欖仁酸來源于千屈菜科紫薇屬植物的各個部位，優(yōu)選從云南省分布廣 泛的常見的紫薇種，例如絨毛紫薇aagerWraew,'a Prezl)、西南紫
薇(Zv"gera/raem/a intermediate Koehne)、 大卩十紫薇(丄agea/rae/m'a reginae Roxb)、大果紫薇(丄agerWn9e/m'a flos-reginae Retz) 、 <|、口十紫薇(丄"gera^oewZo pavviflora)、長毛紫薇(丄agerWraew/fl villosa Kurz)制備而得。優(yōu)選植物的根 莖和葉，可以是干品或鮮品。
本發(fā)明人以往的植物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)紫薇屬植物中主要含有三萜類、香豆素 類、酚酸類、倍半萜類、木質(zhì)素類、和胡蘿卜素類化合物[竇輝，張榮平，婁 旭，賈女走，周長新，趙昱，5/oc/zemfca/ SjAstem"dos 五co/o", 2005, 33, 639-642]。本發(fā)明中，以a-葡萄糖苷酶抑制率(a-glucosidaseinhibition)為生物活 性篩選模型，對上述六種紫薇屬植物的乙酸乙酯提取部位進(jìn)行篩選，并通過多 種正、反相層析手段對最強(qiáng)效抑制a-葡萄糖苷酶部位跟蹤篩選得到該有效抑制 a-葡糖苷酶的式(1)活性化合物，并經(jīng)紅外、質(zhì)譜、紫外和核磁共振波譜等 綜合解析推導(dǎo)出其化學(xué)結(jié)構(gòu)為阿江欖仁酸(arjunolicacid)，即2a,3(3,23-三羥 基-齊墩果-12-烯-28-酸。
本發(fā)明的阿江欖仁酸或其可藥用的鹽可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié) 合，制備得到具有阿江欖仁酸抑制活性從而可以用于防治n型糖尿病等與a-糖苷酶相關(guān)疾病的藥物或藥物組合物。該藥物或藥物組合物可以采用片劑、顆 粒齊U、膠囊、口服液、滴丸、注射劑、透皮貼劑、氣霧劑等劑型；還可以采用 現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。本發(fā)明從采自云南的數(shù)種紫薇屬植物之根、葉等部位提取物中，用a-葡萄 糖苷酶抑制作用為篩選指標(biāo)，活性追蹤提純其最有效抑制a-葡萄糖苷酶的部 位，并從中得到一個抑制a-葡萄糖苷酶作用最強(qiáng)的單體化合物，經(jīng)化學(xué)測定其 結(jié)構(gòu)為一個五環(huán)三萜酸化合物阿江欖仁酸(arjunolicacid)，即2a,3(3，23-三羥 基一齊墩果-12-烯-28-酸，從而提供了可期待用于制備oc-糖苷酶抑制劑的藥物。 其中，與a-糖苷酶引起或有關(guān)的生理改變或疾病包括但不限于II型糖尿病。
本發(fā)明的有益之處是紫薇屬植物為中國西南常見植物藥材，從中提取分 離強(qiáng)效的ct-葡萄糖苷酶抑制劑，其制備過程簡便、成本低廉、低污染，且其植 物來源豐富，提取方便，用植物葉子進(jìn)行提取可以使得植物本身不經(jīng)破壞而得 到多次循環(huán)利用，既提高了經(jīng)濟(jì)效益，又對環(huán)境友好，且該單體化合物產(chǎn)品穩(wěn) 定、易存放。其抑制ot-葡萄糖苷酶活性高，極有可能進(jìn)一步發(fā)展成為臨床治療 NIDDM的藥物，并且符合醫(yī)藥市場上回歸自然的趨勢，具有潛在的經(jīng)濟(jì)效益 和社會效益，因此具有較好的市場化前景。
具體實施例方式
下面通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。必須說明，下述實施例是用于說明本 發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬 于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實施例1:絨毛紫薇干葉中阿江欖仁酸(arjunolicacid)的制備 U儀器與試劑
核磁共振氫譜^H-NMR)，核磁共振碳譜(13C-NMR)和二維核磁共振 波譜(2D NMR)由INOVA型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(VARJAN INOVA-400 MHz) 測定(四甲基硅醚為內(nèi)標(biāo))；電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)由Bruker Esquire 3000+ 質(zhì)譜儀測定，柱層析用硅膠(100-200， 200-300)以及薄層層析用硅膠GF254 (10-40目)均購自青島海洋化工廠；所用試劑均為分析純，其中石油醚沸程 為60-90。C;薄板(TLC)檢測用254nm和365nm的紫外燈；顯色劑用10% 硫酸-乙醇以及溴甲酚綠溶液。 1.2植物來源與鑒定
供提取用藥材為絨毛紫薇(丄ag^^raew/"towwtoyaPrezl)于2001年8月采自 云南省境內(nèi)，由中國科學(xué)院昆明植物研究所彭華研究員鑒定。 1.3提取與分離
樣品(絨毛紫薇干葉，重0.5公斤)粉碎后用95%乙醇室溫下浸提兩次， 每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得51克棕褐色粘稠狀粗提物。將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用乙酸乙 酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(12.5克) 用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析，以石 油醚-丙酮(100:0~0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份，薄 層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測oc-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第 55-76流份所測得oc-葡萄糖苷酶抑制活性為65.7% (粗提物于100微克/毫升濃 度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無色 針晶化合物即阿江欖仁酸(42毫克)。 1.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定
阿江欖仁酸無色針晶；熔點250-252。C(未校)；ESI-MS w/z: 487[M-H〗-; 核磁共振氫譜(CD3OD，400MHz):c5 5.29(lH), 3.73(1H，多重峰)，3.54 (1H,雙 峰，J= 10.0 Hz), 3.39 (1H,雙峰，9.6 Hz)， 3.35 (2H，單峰)，3.31 (1H,雙峰， =10.0 Hz), 2.89 (1H,多重峰)，1.22 (3H,單峰)，1.14 (3H,單峰)，1.10 (3H,單 峰)，0.98(3H,單峰)，0.95(3H,單峰)，0.86 (3H,單峰)，0.74 (3H,單峰)；核磁共 振碳譜(Me2CO畫4 100 MHz): 3 181.84 (C， C-28), 145.37 (C, C-13), 123,40 (CH， C-12), 78.13 (CH, C-3), 69.65 (CH, C-2), 66.23 (CH2, C-23), 48.92 (CH, C-5), 48.13 (CH, C-9)， 47.86 (CH2, C-l), 47.21 (CH2, C-19), 47.61 (C, C-17), 44.10 (C, C-4), 43.00 (C， C-14), 42.70 (CH, C-18), 39.02 (s, C-10), 34.87 (CH2, C-21)， 33.81 (CH2, C-7), 33.55 (CH3, C-29), 33.32 (CH2, C-22)， 31.60 (C, C-20), 28.76 (CH2, C-15), 26.45 (CH3， C-27), 24.60 (CH2, C-ll), 24.02 (CH3, C-30), 23.97 (CH2， C-16), 19.08 (CH2， C-6)， 17.76 (CH3, C-25), 17.52 (CH3， C-26), 13.86 (CH3, C-24)。
根據(jù)上述結(jié)構(gòu)鑒定相關(guān)數(shù)據(jù)可以看出，該化合物的H-NMR和l3C-NMR 譜與化合物阿江欖仁酸基本一致[Kundu, A.P.; Mahato, S.B. P/^toc/^柳'W^, 1993, 32, 999; Yu Shao; Bing-Nan Zhou， Long-Ze Lin et al; / /^toc/7em&^7,1996, (6)， 1487-1492]，從而鑒定出該化合物結(jié)構(gòu)為阿江欖仁酸(arjunolic acid)， 即2a,3p,23-三羥基-齊墩果-12-烯-28-酸。
<formula>formula see original document page 6</formula>實施例2:絨毛紫薇鮮葉中阿江欖仁酸(arjunolicadd)的制備 2.1儀器與試劑同實施例1。 2.2植物來源與鑒定同實施例1。 2.3提取與分離
樣品(鮮葉重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95%乙醇室溫下浸提 兩次，每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得35克褐黑色粘稠狀粗 提物。將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用 乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(8.3 克)用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析， 以石油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份， 薄層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測oc-葡萄糖苷酶抑制活性。合并 第45-53流份所測得oc-葡萄糖苷酶抑制活性為59.7% (粗提物于與100微克/ 毫升濃度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得 到無色針晶化合物即阿江欖仁酸(28毫克)。 2.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例3:絨毛紫薇莖枝及根皮中阿江欖仁酸(arjunolicadd)的制備 3.1儀器與試劑同實施例1。 3.2植物來源與鑒定同實施例l。 3.3提取與分離
樣品(莖枝及根皮干重0.5公斤)粉碎后并用95%乙醇室溫下浸提兩次， 每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得43克棕褐色粘稠狀粗提物。 將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用乙酸乙 酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(9.6克) 用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析，以石 油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份，薄 層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測a-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第 50-57流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為51.5% (粗提物于100微克/毫升濃 度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無色 針晶化合物即阿江欖仁酸(26毫克)。 3.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例4:西南紫薇干葉中阿江欖仁酸(arjimolicacid)的制備 4.1儀器與試劑同實施例1。4.2植物來源與鑒定
供提取用藥材為西南紫薇(丄agerWraem^ intermediate Koehne)于2001年 8月采自云南省境內(nèi)，由中國科學(xué)院昆明植物研究所彭華研究員鑒定。 4.3提取與分離
樣品(西南紫薇干葉，重0.5公斤)粉碎后用95%乙醇室溫下浸提兩次， 每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得48.9克棕褐色粘稠狀粗提物。 將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用乙酸乙 酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(14.1克) 用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析，以石 油醚一丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份，薄 層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測oc-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第 53-70流份所測得oc-葡萄糖苷酶抑制活性為62.1% (粗提物于100微克/毫升濃 度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無色 針晶化合物即阿江欖仁酸(24毫克)。
4.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例5:西南紫薇鮮葉中阿江欖仁酸(arjunolicacid)的制備 5.1儀器與試劑同實施例1。 5.2植物來源與鑒定同實施例4。 5.3提取與分離
樣品(鮮葉重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95%乙醇室溫下浸提 兩次，每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得39克褐黑色粘稠狀粗 提物。將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用 乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(10.1 克)用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析， 以石油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份， 薄層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測a-葡萄糖苷酶抑制活性。合并 第52-59流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為53.2% (粗提物于100微克/毫升 濃度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無 色針晶化合物即阿江欖仁酸(18毫克)。 5.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例6:西南紫薇莖枝及根皮中阿江欖仁酸(aijunolicacid)的制備 6.1儀器與試劑同實施例1。6.2植物來源與鑒定同實施例4。
6.3提取與分離
樣品(莖枝及根皮干重0.5公斤)粉碎后并用95%乙醇室溫下浸提兩次， 每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得37克棕褐色粘稠狀粗提物。 將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用乙酸乙 酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(7.7克) 用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析，以石 油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份，薄 層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測a-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第 60-66流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為56.8% (粗提物于100微克/毫升濃 度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無色 針晶化合物即阿江欖仁酸(27毫克)。 6.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例7:大葉紫薇干葉中阿江欖仁酸(arjunolicadd)的制備 7.1儀器與試劑同實施例1。 7.2植物來源與鑒定
供提取用藥材為大葉紫薇a"gera的e/w'areginaeRoxb)于2001年8月采自云 南省境內(nèi)，由中國科學(xué)院昆明植物研究所彭華研究員鑒定。 7.3提取與分離
樣品(大葉紫薇干葉，重0.5公斤)粉碎后用95%乙醇室溫下浸提兩次， 每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得52.5克棕褐色粘稠狀粗提物。 將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用乙酸乙 酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(15.6克) 用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析，以石 油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份，薄 層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測a-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第 60-72流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為65.5% (粗提物于100微克/毫升濃 度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無色 針晶化合物即阿江欖仁酸(28毫克)。 7.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例8:大葉紫薇鮮葉中阿江欖仁酸(arjunolicacid)的制備 8.1儀器與試劑同實施例1。8.2植物來源與鑒定同實施例7。
8.3提取與分離
樣品(鮮葉重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95%乙醇室溫下浸提 兩次，每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得45.3克褐黑色粘稠狀 粗提物。將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而 用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏 (10.6克)用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層 析，以石油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一 流份，薄層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測a-葡萄糖苷酶抑制活性。 合并第58-69流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為60.1% (粗提物于100微克/ 毫升濃度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得 到無色針晶化合物即阿江欖仁酸(26毫克)。 8.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例9:大葉紫薇莖枝及根皮中阿江欖仁酸(arjimolicacid)的制備 9.1儀器與試劑同實施例1。 9.2植物來源與鑒定同實施例7。 9.3提取與分離
樣品(莖枝及根皮干重0.5公斤)粉碎后并用95%乙醇室溫下浸提兩次， 每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得46.4克棕褐色粘稠狀粗提物。 將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用乙酸乙 酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(11.2克) 用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析，以石 油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份，薄 層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測a-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第 58-63流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為56.7% (粗提物于100微克/毫升濃 度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無色 針晶化合物即阿江欖仁酸(22毫克)。 6.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例10:大果紫薇干葉中阿江欖仁酸(arjimolicadd)的制備 10.1儀器與試劑同實施例l。 10.2植物來源與鑒定
供提取用藥材為大果紫薇(丄^erafrae w'a flos-reginae Retz)于2001年8月采自云南省境內(nèi)，由中國科學(xué)院昆明植物研究所彭華研究員鑒定。 10.3提取與分離
樣品(大果紫薇干葉，重0.5公斤)粉碎后用95%乙醇室溫下浸提兩次， 每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得50.7克棕褐色粘稠狀粗提物。 將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用乙酸乙 酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(13.8克) 用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300 f:l ， 150克)柱層析，以石 油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份，薄 層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測a-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第 60-68流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為62.7% (粗提物于100微克/毫升濃 度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無色 針晶化合物即阿江欖仁酸(26毫克)。 10.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例11:大果紫薇鮮葉中阿江欖仁酸(arjunolicacid)的制備 11.1儀器與試劑同實施例1。 11.2植物來源與鑒定同實施例IO。 11.3提取與分離
樣品(鮮葉重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95%乙醇室溫下浸提 兩次，每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得42.7克褐黑色粘稠狀 粗提物。將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而 用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏 (9.7克)用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析， 以石油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每IOO毫升為一流份， 薄層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測oc-葡萄糖苷酶抑制活性。合并 第48-57流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為58.2% (粗提物于100微克/毫升 濃度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無 色針晶化合物即阿江欖仁酸(14毫克)。 11.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例12:大果紫薇莖枝及根皮中阿江欖仁酸(arjunolicacid)的制備 12.1儀器與試劑同實施例1。 12.2植物來源與鑒定同實施例10。 12.3提取與分離樣品(莖枝及根皮干重0.5公斤)粉碎后并用95%乙醇室溫下浸提兩次， 每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得44.6克棕褐色粘稠狀粗提物。 將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用乙酸乙 酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(8.7克) 用10克100—200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200—300目，150克)柱層析，以石 油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份，薄 層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測a-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第 52-58流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為50.2% (粗提物于100微克/毫升濃 度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無色 針晶化合物即阿江欖仁酸(14毫克)。 12.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例13:小葉紫薇干葉中阿江欖仁酸(aijunolicacid)的制備 13.1儀器與試劑同實施例1。 13.2植物來源與鑒定
供提取用藥材為小葉紫薇a^^Wraew/G pavviflora)于2001年8月采自 云南省境內(nèi)，由中國科學(xué)院昆明植物研究所彭華研究員鑒定。 13.3提取與分離
樣品(小葉紫薇干葉，重0.5公斤)粉碎后用95%乙醇室溫下浸提兩次， 每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得50.2克棕褐色粘稠狀粗提物。 將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用乙酸乙 酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(13.6克) 用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析，以石 油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份，薄 層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測oc-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第 54—63流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為63.3% (粗提物于IOO微克慮升濃 度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無色 針晶化合物即阿江欖仁酸(22毫克)。 13.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例14:小葉紫薇鮮葉中阿江欖仁酸(arjunolicadd)的制備 14.1儀器與試劑同實施例1。 14.2植物來源與鑒定同實施例13。 14.3提取與分離樣品(鮮葉重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95%乙醇室溫下浸提 兩次，每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得41.1克褐黑色粘稠狀 粗提物。將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而 用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏 (9.2克)用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析， 以石油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份， 薄層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測ot-葡萄糖苷酶抑制活性。合并 第50-61流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為50.3% (粗提物于100微克/毫升 濃度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無 色針晶化合物即阿江欖仁酸G3毫克)。 14.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例15.-小葉紫薇莖枝及根皮中阿江欖仁酸(arjunolicacid)的制備 15.1儀器與試劑同實施例1。 15.2植物來源與鑒定同實施例13。 15.3提取與分離
樣品(莖枝及根皮干重0.5公斤)粉碎后并用95%乙醇室溫下浸提兩次， 每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得43.2克棕褐色粘稠狀粗提物。 將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用乙酸乙 酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(8.9克) 用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析，以石 油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份，薄 層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測a-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第 53-62流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為51.5% (粗提物于100微克/毫升濃 度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無色 針晶化合物即阿江欖仁酸(16毫克)。 15.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例16:長毛紫薇干葉中阿江欖仁酸(arjunolicacid)的制備 16.1儀器與試劑同實施例1。 16.2植物來源與鑒定
供提取用藥材為長毛紫薇(丄age/^rae柳'a villosa Kurz)于2001年8月采
自云南省境內(nèi)，由中國科學(xué)院昆明植物研究所彭華研究員鑒定。 16.3提取與分離樣品(長毛紫薇干葉，重0.5公斤)粉碎后用95%乙醇室溫下浸提兩次， 每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得46.4克棕褐色粘稠狀粗提物。 將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用乙酸乙 酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(12.7克) 用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，50克)柱層析，以石 油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份，薄 層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測a-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第 59-70流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為60.4% (粗提物于100微克/毫升濃 度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無色 針晶化合物即阿江欖仁酸(30毫克)。 16.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例17:長毛紫薇鮮葉中阿江欖仁酸(arjimolicacid)的制備 17.1儀器與試劑同實施例1。 17.2植物來源與鑒定
同實施例16。 17.3提取與分離
樣品(鮮葉重0.5公斤)采回后立即用刀剁碎后并用95%乙醇室溫下浸提 兩次，每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得40.8克褐黑色粘稠狀 粗提物。將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而 用乙酸乙酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏 (8.9克)用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析， 以石油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為--流份， 薄層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測a-葡萄糖苷酶抑制活性。合并 第49-62流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為51.7% (粗提物于與100微克/ 毫升濃度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得 到無色針晶化合物即阿江欖仁酸(16毫克)。 17.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例1。
實施例18:長毛紫薇莖枝及根皮中阿江欖仁酸(arjimolicadd)的制備 18.1儀器與試劑同實施例1。 18.2植物來源與鑒定同實施例16。 18.3提取與分離
樣品(莖枝及根皮干重0.5公斤)粉碎后并用95%乙醇室溫下浸提兩次，每次24小時，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得41.8克棕褐色粘稠狀粗提物。 將粗提物用2升熱水溶解，石油醚脫脂(2升/每次，共3次)，繼而用乙酸乙 酯萃取(2升/每次，共5次)，減壓蒸除溶劑，得到的乙酸乙酯浸膏(7.8克) 用10克100-200目硅膠拌樣，用硅膠柱(200-300目，150克)柱層析，以石 油醚-丙酮(100:0-0:100)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每100毫升為一流份，薄 層層析檢測相同組分之流份，減壓脫溶后送測a-葡萄糖苷酶抑制活性。合并第 55-63流份所測得a-葡萄糖苷酶抑制活性為52.0% (粗提物于100微克/毫升濃 度下測定)，繼而減壓整除其溶劑，以甲醇為溶劑進(jìn)行多次重結(jié)晶，得到無色 針晶化合物即阿江欖仁酸(18毫克)。 18.4阿江欖仁酸的結(jié)構(gòu)鑒定同實施例l。
實施例19:化合物阿江欖仁酸對a-葡萄糖苷酶的抑制活性檢測 19.1儀器與試劑
19丄1實驗儀器酶標(biāo)儀ELISA plate reader (Bio-Tek Instruments, USA) 19.1.2試劑
a-glucosidase即a-葡萄糖苷酶(Sigma， 500U/毫升)；4-硝基酚-ot-D-吡喃 葡萄糖苷(PNPG， Merck)，還原性谷胱甘肽(上海生工)，阿卡波糖即拜糖 平(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，北京)。 19.2測試方法
化合物對(x-葡萄糖苷酶的抑制作用測定釆用比色法。樣品孔中加入磷酸 緩沖液(67毫摩爾/升,pH6.8， 170微升)，還原型谷光甘肽(l毫克/毫升， 5微升)，oi-葡萄糖苷酶(用磷酸緩沖液稀釋成0.2 U/毫升，25微升)，化合 物阿江欖仁酸用二甲亞砜溶解，用磷酸緩沖液稀釋，每孔25微升，使其終濃 度為0.04毫克/毫升，0.004毫克/毫升，0.0004毫克/毫升，最后加入底物4-硝基酚-a-D-吡喃葡萄糖苷(23.2毫摩爾/升，25微升)，37°C，水浴反應(yīng)15 分鐘后，加入碳酸鈉(1摩爾/升，50微升)終止反應(yīng)，在405nm波長處比 色測定?？瞻卓字杏孟嗤w積的Tris-HCl緩沖液代替底物。溶劑對照孔中加 入與化合物等濃度的二甲亞砜。化合物抑制率由樣品OD值對于空白和對照 OD值計算。其中受測化合物對(x-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)由劑量 效應(yīng)曲線得到。 19.3試驗結(jié)果參見表h表1
樣品半數(shù)抑制濃度IC5。(微克/毫升)
阿江欖仁酸45.0 ±3.6
阿卡波糖 (acarbose)44.4 ±3.7
19.4實驗結(jié)論
a-葡萄糖苷酶是a-糖苷酶抑制劑藥物篩選中的指標(biāo)性測試酶，許多藥物是 基于對a-葡萄糖苷酶競爭性抑制作用而成為降糖藥物的。本實驗表明該齊墩果 烷型五環(huán)三砲酸具有強(qiáng)效抑制(x-葡萄糖苷酶的作用，其抑制活性堪比一線用藥 阿卡波糖，因而具有較強(qiáng)的開發(fā)潛力，有可能進(jìn)一步發(fā)展成為新的預(yù)防或治療 II型糖尿病用藥。
權(quán)利要求
1. 一種阿江欖仁酸或其可藥用的鹽在制備糖苷酶抑制劑藥物中的應(yīng)用，所述阿江欖仁酸及其可藥用的鹽是一種五環(huán)三萜化合物，其結(jié)構(gòu)式為式(1)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于在制備預(yù)防或治療由a-葡 萄糖苷酶引起的II型糖尿病藥物中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物由阿江欖仁酸或 其可藥用的鹽與制劑允許的藥物賦形劑或載體制備成藥物組合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述式(1)化合物由紫薇 屬植物之任一部位提取分離得到。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述紫薇屬植物選自絨毛 紫薇、西南紫薇、大葉紫薇、大果紫薇、小葉紫薇、長毛紫薇的干品或鮮品中 的一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述紫薇屬植物選自絨毛 紫薇、西南紫薇、大葉紫薇、大果紫薇、小葉紫薇或長毛紫薇的葉。
全文摘要
本發(fā)明提供阿江欖仁酸或其可藥用的鹽在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明從紫薇屬植物中提取分離強(qiáng)效的α-葡萄糖苷酶抑制劑，植物來源豐富，提取方便，植物本身可多次循環(huán)利用，既提高了經(jīng)濟(jì)效益，又對環(huán)境友好，且該單體化合物產(chǎn)品穩(wěn)定、易存放。藥理實驗證實阿江欖仁酸具有強(qiáng)效抑制α-葡萄糖苷酶的作用，其中，與α-糖苷酶引起或有關(guān)的生理改變或疾病包括但不限于II型糖尿病?？蛇M(jìn)一步發(fā)展成為臨床治療NIDDM的藥物，具有較好的市場化前景。本發(fā)明所述的阿江欖仁酸化合物的結(jié)構(gòu)式如上。
文檔編號A61K31/56GK101416970SQ200810162810
公開日2009年4月29日 申請日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者周長新, 巫秀美, 張榮平, 蘇 曾, 輝 竇, 約阿施·史托克希特, 婕 賈, 昱 趙, 鄭漢其, 郝小江 申請人:浙江大學(xué)