專利名稱：：葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備治療腦血管及相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及組合物的應(yīng)用，特別涉及葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備治療腦血管及相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腦血管病是危害人類生命與健康的常見病和多發(fā)病，具有"發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高、并發(fā)癥多"一"四高一多"的特點(diǎn)，是中年人致死和致殘的主要疾病。由于老年人口的不斷增加和生活水平的提高，腦血管病的發(fā)病率仍在不斷上升。在人類各種疾病死因的排序中，腦血管病一直列于前三位之內(nèi)，成為人類死亡的主要原因之一。在全球范圍內(nèi)，每年使460萬人死亡，其患病和死亡主要在65歲以上的人群。我國也是腦卒中死亡率高發(fā)地區(qū)，據(jù)估計(jì)居民現(xiàn)患腦血管病600萬，每年新發(fā)生腦血管病130萬人、死亡近100萬人，在幸存者中約3/4的人留下偏癱等后遺癥狀，部分病人喪失勞動能力和生活能力。腦血管病，是指腦部動脈或支配腦的頸部動脈發(fā)生病變，或由于各種原因?qū)е碌哪X血管的堵塞或破裂，致使顱內(nèi)血液循環(huán)障礙，腦組織受損的一組疾病。能引起相關(guān)癥狀，是一種危害人民健康，威脅生命，影響勞動力的常見病和多發(fā)病。常見的腦血管病大致可以分為缺血性腦中風(fēng)和出血性腦中風(fēng)兩大類。缺血性腦中風(fēng)包括短暫性腦缺血發(fā)作、腦血栓、腦栓塞和腦梗塞等四種，臨床較多見，約占全部腦血管病人的70%~80%，是由于腦動脈硬化等原因，使腦動脈管腔狹窄，血流減少或完全阻塞，腦部血液循環(huán)障礙，腦組織受損而發(fā)生的一系列癥狀。出血性腦中風(fēng)包括腦出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血兩種疾病，多由長期高血壓、先天性腦血管畸形等因素所致。由于血管破裂，血液溢出，壓迫腦組織，血液循環(huán)受阻，病人常表現(xiàn)顱內(nèi)壓增高、神志不清等癥狀。這類病人約占腦血管病的20%30%左右。目前治療或防治腦血管及相關(guān)疾病的藥物不多，具有顯著效果的則更少。而中藥復(fù)方含多味藥，單味藥含有多種成分，因此中藥可以通過多層次、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，隨著科學(xué)的進(jìn)展與研究的深入，目前一些中藥制劑，如醒腦靜、川芎嗪、復(fù)方丹參、銀杏達(dá)莫、脈絡(luò)寧等注射制劑相繼在臨床上使用，并獲得好評。葒草和燈盞細(xì)辛組合物由葒草和燈盞細(xì)辛兩味藥組成。其中葒草為蓼科植物紅蓼PolygonumorientaleL.的全草或帶根全草，具有祛風(fēng)除濕，活血止痛的功效；燈盞細(xì)辛為菊科植物短葶飛蓬Erigeronbreviscapus(Vaniot)Hand.-Mazz.的干燥全草，具有解表散寒，活血舒筋，止痛消積的功效。葒草可用于增加心臟冠脈流量，減緩氧耗，抗心肌缺血，抗支氣管痙攣等；而燈盞細(xì)辛具有抗血栓、改善微循環(huán)、抗心肌缺血、腦缺血、改善腎功能、抗肝纖維化、改善腎功能等廣泛的藥理作用。兩者合用更能增強(qiáng)抗冠心病心絞痛等耗氧、缺血方面心臟疾病的作用。但未見利用葒草和燈盞細(xì)辛組合物對腦血管及相關(guān)疾病防治作用的臨床藥理研究方面的報(bào)道。中國專利申請02128066.5和200610051009.0中提出的發(fā)明是復(fù)方葒草制劑及其制備方法，主要用于治療冠心病心絞痛的用途。但本申請人經(jīng)過進(jìn)一步的試驗(yàn)研究后，還意外地發(fā)現(xiàn)，葒草和燈盞細(xì)辛組合物在治療其他疾病方面也具有明顯的治療效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種葒草和燈盞細(xì)辛組合物的第二醫(yī)藥用途，即其在制備治療腦血管及相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的腦血管疾病包括缺血性腦血管病和出血性腦血管病，具體包括中風(fēng)、中風(fēng)后遺癥、局部缺血、出血、出血后水腫、再灌注損傷、血栓、血管收縮、梗塞和阿爾茨海默氏病；本發(fā)明所述的腦血管相關(guān)疾病包括各種原因引起的眩暈，如腦動脈供血不足、梅尼埃病、高血壓腦病、冠心病、椎-基底動脈供血不足等造成的眩暈。本發(fā)明提供了葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備以下方面作用的藥物中的應(yīng)用(1)腦中風(fēng)及后遺癥；(2)腦缺血、NMDA受體誘導(dǎo)腦神經(jīng)細(xì)胞損傷；(3)腦缺血/再灌注損傷；(4)腦血栓、腦梗塞；本發(fā)明提供了葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備治療腦出血包括急性期腦出血、高血壓腦出血、腦出血后水腫的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備治療阿爾茨海默氏病，改善大鼠記憶的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備治療各種原因引起的眩暈，如腦動脈供血不足、梅尼埃病、高血壓腦病、冠心病、椎-基底動脈供血不足等造成的眩暈的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述葒草和燈盞細(xì)辛組合物是由中藥原料葒草和燈盞細(xì)辛合并后提取所得的提取物或分別提取后合并所得的提取物。按照生藥的重量配比葒草1-10份燈盞細(xì)辛1-10份優(yōu)選的配比為葒草3-8份燈盞細(xì)辛l-5份最優(yōu)選的配比為葒草5份燈盞細(xì)辛l份4本發(fā)明的葒草和燈盞細(xì)辛組合物，其中葒草具有散血、消積、止痛的功能，主要含黃酮類葒草素、葒草甙、葉綠醌等成分，可用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心肌缺血、降血壓、腳氣痛腫的治療，為主藥；燈盞細(xì)辛具有散寒解表，活血舒筋，止痛消積的功能，用于癱瘓、風(fēng)濕痹痛、胃痛、牙痛、急性腎功能衰竭、跌撲損傷等，為輔藥。本發(fā)明提供的葒草和燈盞細(xì)辛組合物中，其葒草、燈盞細(xì)辛的有效成分提取物可以按照專利號為02128066.5中的合并煎煮、醇沉、樹脂分離的方法進(jìn)行提取，也可以按照專利號為200610051009.0中的單獨(dú)提取分離的方法進(jìn)行提取，還可以用常規(guī)的方法進(jìn)行提取。本發(fā)明的葒草和燈盞細(xì)辛組合物可以根據(jù)需要加入一種或多種藥學(xué)上可以接受的載體，如稀釋劑、賦形劑、填充劑、崩解劑、濕潤劑、粘合劑、表面活性劑、吸收促進(jìn)劑、潤滑劑等等，按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法，制備需要的劑型。本發(fā)明所述的葒草和燈盞細(xì)辛組合物制成的復(fù)方葒草制劑包括注射制劑、片劑、丸劑、滴丸、膠囊劑、顆粒劑、口服液。優(yōu)選為注射制劑。本發(fā)明所述復(fù)方葒草制劑的有效劑量根據(jù)病人的情況而定，如30-90mg生藥/kg體重/天，優(yōu)選為60mg生藥/kg體重/天。通過動物試驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的葒草和燈盞細(xì)辛組合物可以治療腦血管病以及由腦部缺血等相關(guān)疾病引起的眩暈等，確切地說，本發(fā)明提供的葒草和燈盞細(xì)辛組合物具有治療腦中風(fēng)、中風(fēng)后遺癥、局部缺血、出血、再灌注損傷、血栓、血管收縮、梗塞和阿爾茨海默氏病的作用，還具有治療各種原因引起的眩暈，如腦動脈供血不足、梅尼埃病、高血壓腦病、冠心病、椎-基底動脈供血不足等造成的眩暈的作用。為了使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明，以下通過實(shí)驗(yàn)及實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明復(fù)方葒草制劑的組成、其制備方法及用途實(shí)驗(yàn)用藥物復(fù)方葒草注射液，是根據(jù)實(shí)施例1和2的方法制備的。試驗(yàn)內(nèi)容試驗(yàn)1葒草和燈盞細(xì)辛組合物對不完全性腦缺血的影響1.1實(shí)驗(yàn)材料動物Wistar大鼠，體重220-260g，貴陽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。藥物復(fù)方葒草注射液，將按照實(shí)施例方法提取的葒草、燈盞細(xì)辛提取物合并，按照常規(guī)的方法制備成注射液；血塞通注射液，昆明制藥股份有限公司生產(chǎn)。1.2試驗(yàn)方法與結(jié)果1.2.l對血管通透性的影響取40只健康大鼠，隨機(jī)分為4組空白對照組，缺血模型組，血塞通注射液57.Omg/kg劑量給藥組，復(fù)方葒草60.0mg/kg劑量給藥組，每天一次，靜脈給藥三天。末次給藥前，先將動物腹腔注射水合氯醛300mg/kg麻醉，分離雙側(cè)頸總動脈，穿線以被結(jié)扎。藥后15min于動物舌下靜脈注射伊文思藍(lán)50mg/kg，5min后結(jié)扎，逐層縫合皮膚?？瞻讓φ战M只將頸總動脈分離后不結(jié)扎。4小時后處死大鼠，取同樣重量腦組織，置于3ml0.5y。Na2S03生理鹽水溶液一丙酮(3:7)溶液中，搗碎，充分浸泡24小時，離心，上清液于650mn處比色，計(jì)算其中伊文思藍(lán)含量。結(jié)果見下表l:表l對不完全性腦缺血大鼠腦組織中伊文思藍(lán)含量的影響(x士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由上表可知，復(fù)方葒草組和血塞通注射液組可明顯降低腦中伊文思藍(lán)含量，且組間無顯著差異，表明兩者治療效果相當(dāng)。1.2.2對腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量的影響同樣取40只大鼠，隨機(jī)分為4組空白對照組，缺血模型組，血塞通注射液57.Omg/kg劑量給藥組，復(fù)方葒草60.0mg/kg劑量給藥組，每天一次，靜脈給藥三天。末次給藥后15min,同樣進(jìn)行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎，造成大鼠不完全性腦缺血。4小時后斷頭處死大鼠，立即取腦，在4下勻漿、離心，提取S0D，并測定其活性；同時測定MDA含量。結(jié)果見下表2:表2對不完全性腦缺血大鼠腦組織中MDA含量及SOD活性的影響(x士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由上表可知，大鼠腦缺血后，其中MDA含量明顯升高，SOD活性顯著降低，與空白對照組比P〈0.01;而血塞通和復(fù)方葒草組的動物腦組織中MDA含量明顯較模型組降低，同時S0D活性明顯升高。試驗(yàn)2葒草和燈盞細(xì)辛組合物對局灶性腦缺血的影響2.1試驗(yàn)藥物復(fù)方荮草注射液，將按照實(shí)施例方法提取的葒草、燈盞細(xì)辛提取物合并,按照常規(guī)的方法制備成注射液；血塞通膠囊，云南白藥集團(tuán)文山七花有限公司生產(chǎn)。2.2試驗(yàn)動物Wistar大鼠，體重230-270g，貴陽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。2.3試驗(yàn)方法健康成年大鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，其中缺血對照組用生理鹽水灌胃；復(fù)方葒草組50.0mg/kg劑量給藥；血塞通組42.Omg/kg劑量給藥。動物模型的建立采用兩血管閉塞合并放血法，造成急性腦缺血。實(shí)驗(yàn)動物先麻醉后固定在手術(shù)臺上。經(jīng)頸正中切口，鈍性分離兩側(cè)頸總動脈，絲線結(jié)扎懸掛30min，同時斷尾放血0.8ml，然后松開絲帶結(jié)扎線10min，再結(jié)扎兩側(cè)頸總動脈30min后松開。術(shù)后給予進(jìn)食進(jìn)水。觀測指標(biāo)(1)凝血系統(tǒng)凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血酶時間(APTT)、纖維蛋白原測定(FBG)。(2)腦梗死面積的測定術(shù)后一定時間采血后處死，取一定量大鼠大腦，去掉小腦和腦干，冠狀切為0.3cm的腦片，觀察有無出血灶。將腦片浸入TTC中，恒溫后甲醛固定，利用圖像病理分析系統(tǒng)測定梗死面積。病理學(xué)檢測腦片經(jīng)染色后，在光鏡下觀察腦組織病理變化。2.4結(jié)果(1)凝血纖溶系統(tǒng)的檢測結(jié)果如下表3表3凝血纖溶系統(tǒng)的檢測結(jié)果(x士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)論復(fù)方葒草組和血塞通組給藥后可以看到TT、APTT、FBG含量較對照組高，當(dāng)雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎造成前腦缺血性損傷后，可使TT、APTT延長，且FBG的降低與對照組相比均有顯著差異性，但兩治療組相比無顯著差異性。表明復(fù)方葒草治療作用與血塞通相當(dāng)。(2)大鼠局灶性腦缺血一定時間后腦梗死面積及藥物的影響結(jié)果如下表4表4腦梗死范圍(x土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注治療組與對照組比較承P〈0.05結(jié)論兩個治療組的腦梗死面積明顯低于對照組，且組間無顯著差異性。證明復(fù)方葒草能減少腦缺血動物的腦梗死面積。(3)病理學(xué)改變對照組光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)組織間隙增寬，水腫，有空泡形成，神經(jīng)元細(xì)胞核縮小，甚至溶解消失。而治療組可以看到組織間隙水腫較對照組輕，細(xì)胞間隙改變不明顯，神經(jīng)元細(xì)胞核大小基本正常，核較深染，病灶中心區(qū)有少許空泡形成。試驗(yàn)3葒草和燈盞細(xì)辛組合物對體內(nèi)血小板血栓形成的影響3.1試驗(yàn)藥物復(fù)方荮草注射液，將按照實(shí)施例方法提取的葒草、燈盞細(xì)辛提取物合并，按照常規(guī)的方法制備成注射液。3.2試驗(yàn)動物Wistar大鼠，體重230-270g，貴陽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。3.3試驗(yàn)方法將大鼠隨機(jī)分為兩組，每組10只，給予復(fù)方葒草注射液60mg/kg。最后一次給藥1小時后麻醉，固定，分離氣管插入氣管導(dǎo)管，分離右頸總動脈和左頸外靜脈。在聚乙烯管仲放入一根已稱重的絲線，用含肝素的生理鹽水充滿聚乙烯管，將管的一端插入右頸總動脈，另一端插入左頸外靜脈。打開血流15min后中斷，取出絲線稱重，計(jì)算血栓重量。3.4試驗(yàn)結(jié)果對照組血栓重38.2士8.73mg，復(fù)方荮草治療組血栓中21.5±6.57mg(P〈0.05)。說明復(fù)方葒草可抑制體內(nèi)血栓的形成。試驗(yàn)4對大鼠局部腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響4.1實(shí)驗(yàn)材料動物雄性Wistar大鼠，體重280-350g，貴陽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。藥物復(fù)方葒草注射液，將按照實(shí)施例方法提取的葒草、燈盞細(xì)辛提取物合并，按照常規(guī)的方法制備成注射液；紅四氮唑美國Sigma公司產(chǎn)品，臨用前用生理鹽水配成4%溶液。4.2試驗(yàn)方法與結(jié)果動物隨機(jī)分為假手術(shù)組(等容量溶劑)，模型對照組(等容量溶劑)，尼莫地平組1.5mg/kg，復(fù)方葒草90mg/kg組，復(fù)方葒草60mg/kg組，復(fù)方葒草30mg/kg組，每組10只。禁食12小時后，水合氯醛(350mg/kg，靜注)麻醉，分離右側(cè)頸總動脈，夾閉頸內(nèi)、頸總動脈，頸外動脈近心端及遠(yuǎn)心端結(jié)扎，中間剪斷。將頸外動脈游離端拉至與頸內(nèi)動脈成一條直線，將栓線由頸外動脈插入至顱內(nèi)，遇輕微阻力時停止，插入深度約為2厘米。結(jié)扎頸外動脈開口，并打開頸總動脈動脈夾，消毒縫合傷口，造成左側(cè)大腦動脈缺血模型；假手術(shù)組僅進(jìn)行右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈的分離，術(shù)后各組動物靜脈注射相應(yīng)藥物(給藥體積lml/200g)。24小時后觀察并記錄大鼠行為障礙(A)提鼠尾觀察前肢屈曲情況，0分雙前肢對稱伸向地面，l分手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈曲，2分肘屈曲，3分肩內(nèi)旋，4分腕屈曲和/或肘屈曲、肩內(nèi)旋。(B)將動物置于平地上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動，檢査阻力。0分雙側(cè)阻力對等且有力，如向手術(shù)對側(cè)推動時，根據(jù)阻力下降程度不同分為輕、中、重度，計(jì)為l、2和3分。(C)將動物雙前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察雙前肢的肌張力。0分張力對等且有力，同樣根據(jù)手術(shù)對側(cè)肌張力下降程度不同計(jì)為1、2和3分。(D)動物有不停向一側(cè)轉(zhuǎn)圈者，計(jì)為1分。滿分11分，分?jǐn)?shù)越高，表示行為障礙越嚴(yán)重。行為評分后處死大鼠，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切為5片，腦片用紅四氮唑(TTC)染色，正常組織經(jīng)染色后呈紅色，梗塞組織呈白色，求梗塞面積比，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果如下表5:表5復(fù)方葒草對大鼠局部腦缺血損傷的影響(x土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與模型對照組比較林P〈0.01;與60mg/kg組比較，AP〈0.05，ttP〉0.05。結(jié)果如上表所示，缺血24小時后，大鼠表現(xiàn)出明顯的行為障礙，大鼠腦組織也明顯出現(xiàn)灶狀缺血區(qū)，達(dá)到全腦的25%左右；給予不同劑量的復(fù)方葒草注射液，動物行為障礙不同程度的減輕，大腦缺血區(qū)也有明顯好轉(zhuǎn)。其60mg/kg作用強(qiáng)于30mg/kg(P<0.05)，但是與90mg/kg比較無明顯差別(P>0.05)。提示當(dāng)劑量再增加時，藥效沒有繼續(xù)增加。試驗(yàn)5對N-甲基-D-門冬氨酸所致大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用5.1實(shí)驗(yàn)材料動物雄性SD大鼠，體重240-290g，貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。藥物復(fù)方荮草注射液，將按照實(shí)施例方法提取的葒草、燈盞細(xì)辛提取物合并，按照常規(guī)的方法制備成注射液。5.2試驗(yàn)方法5.2.1神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)懷孕15天大鼠水合氯醛麻醉，75%乙醇消毒胸腹，無菌條件下取出胎鼠，剝出后分離兩側(cè)皮層組織，用手術(shù)刀切成糜狀，移入含O.125y。胰蛋白酶的磷酸緩沖液中消化30min(37°C)后棄去消化液，加入含10%胎牛血清，10%馬血清，100u/ml青霉素，100ix/ml鏈霉素的DMED培養(yǎng)液，用小口徑吸管反復(fù)吹打分散，200目細(xì)胞篩過濾后，以DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至106個/ml，接種至預(yù)先涂有0.01。/。多賴聚氨酸的35mm培養(yǎng)皿中，每皿2ml，置C02培養(yǎng)箱中37。C孵育，于培養(yǎng)第3天在培養(yǎng)液中加入細(xì)胞分裂抑制劑阿糖胞普儲備液(6mm/皿)以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的過度增殖，左右48小時后換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液2次，每次半量。5.2.2麗DA誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷細(xì)胞培養(yǎng)到14天后，隨機(jī)分為正常對照組，麗DA50umol/L組，復(fù)方葒草30umol/L、90umol/L組；各組換以含不同藥物的低血清DMEM(5y。胎牛血清，5%馬血清，30國ol/LHEPES)繼續(xù)培養(yǎng)6小時，再加50mmol/L固DA，孵育12小時后觀察細(xì)胞形態(tài)，計(jì)算細(xì)胞死亡率。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。5.3結(jié)果5.3.1對培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化的影響正常對照組細(xì)胞生成良好，胞體呈錐形、梭形或三角形，突觸粗而長，呈樹根狀交織成網(wǎng)；50uraol/LNMDA組培養(yǎng)12小時后，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、輪廓模糊，神經(jīng)元突觸斷裂、消失、甚至細(xì)胞崩解；復(fù)方葒草組細(xì)胞損傷程度明顯減輕，形態(tài)基本保持完整，但細(xì)胞密度有所降低，仍可見突觸斷裂等現(xiàn)象。表明葒草和燈盞細(xì)辛組合物對麗DA誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用。5.3.2對培養(yǎng)細(xì)胞死亡率的影響NMDA50umol/L組孵育12小時后，苔酚藍(lán)染色著色細(xì)胞明顯增多(NMDA組8396;正常對照組9%，P〈0.001)'提示細(xì)胞死亡率增加;復(fù)方葒草30umol/L、90umol/L組分別為42%、23°/。，可明顯降低細(xì)胞死亡率，與NMDA50nmol/L組比較有顯著差異。試驗(yàn)6對大鼠腦缺血/再灌注導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響6.1實(shí)驗(yàn)材料動物雄性Wistar大鼠，體重280-350g，貴陽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。藥物復(fù)方葒草注射液，將按照實(shí)施例方法提取的葒草、燈盞細(xì)辛提取物合并，按照常規(guī)的方法制備成注射液。6.2試驗(yàn)方法與結(jié)果動物隨機(jī)分為假手術(shù)組(等容量溶劑)，模型對照組(等容量溶劑)，尼莫地平組1.5mg/kg，復(fù)方葒草90mg/kg組，復(fù)方葒草60mg/kg組，復(fù)方葒草30mg/kg組，每組10只。禁食12小時后，按試驗(yàn)4方法造成左側(cè)大腦中動脈缺血；術(shù)后10min各組動物靜脈注射相應(yīng)藥物(給藥體積lml/200g)。缺血2小時后，抽出尼龍線，造成大鼠腦缺血/再灌注損傷，再灌24小時后處死大鼠，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切為5片，腦片置10%福爾馬林中固定，經(jīng)脫水、浸臘、包埋、切片等步驟后，制成8nm厚的組織切片，甲苯胺藍(lán)染色，以相同切面的腦片半影區(qū)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞核消失、細(xì)胞體暗染作為神經(jīng)元壞死的指標(biāo)，計(jì)算壞死神經(jīng)元占總神經(jīng)元數(shù)的百分比。結(jié)果如下表6復(fù)方葒草對局部腦缺血大鼠神經(jīng)元壞死百分比的影響(x士s)組別神經(jīng)元壞死百分比(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與模型對照組比較率P〈0.05，林P〈0.01;與60mg/kg組比較，AP<0.05，#P〉0.05。結(jié)果顯示，模型對照組大鼠神經(jīng)元周圍間隙擴(kuò)大，出現(xiàn)散在的暗染神經(jīng)元，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的皺縮。給予復(fù)方葒草組動物有不同程度的減輕，不同劑量復(fù)方葒草治療組皮層、紋狀體神經(jīng)元壞死百分比明顯減少，與模型對照組比較差異顯著。復(fù)方葒草60mg/kg作用強(qiáng)于30mg/kg(P〈0.05)，但是與90mg/kg比較無明顯差別(P>0.05)。提示當(dāng)劑量再增加時，藥效沒有繼續(xù)增加。試驗(yàn)7葒草和燈盞細(xì)辛組合物對眩暈患者的治療作用7.1入組與試驗(yàn)61例病人隨機(jī)分成2組，治療組30例，其中腦動脈供血不足23例，梅尼埃病7例，合并高血壓性腦病7例，冠心病2例，椎一基底動脈供血不足3例；對照組32例，其中腦動脈供血不足23例，梅尼埃病9例，合并高血壓性腦病6例，冠心病3例，椎一基底動脈供血不足4例。治療組給予復(fù)方葒草注射液10ml靜注，每日兩次，連用3-7天。對照組給予利多卡因50mg靜注，每日一次，連用3-7天。療效標(biāo)準(zhǔn)(1)顯效眩暈及伴隨癥狀完全消失，觀察12小時未復(fù)發(fā)。(2)有效眩暈及主要癥狀體征明顯減輕。(3)無效癥狀無改善。7.2結(jié)果療效組總有效率86.7%，對照組為87.5%，差別無顯著性，說明二者對治療眩暈都有較好療效，因此，葒草和燈盞細(xì)辛組合物可以應(yīng)用于腦動脈供血不足等引起的眩暈。表7治療眩暈療效比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注經(jīng)X2檢驗(yàn)，P〉0.05試驗(yàn)8葒草和燈盞細(xì)辛組合物對早期高血壓腦出血患者的治療作用8.1入組與試驗(yàn)8.1.l入組高血壓腦出血(HICH)60例，有明確的高血壓病史，全部符合入選標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)分為復(fù)方葒草注射液治療組和對照組。其中治療組30例，男15例，女15例；平均年齡(65.4±10.2)歲；出血量1520ml5例，30ml13例，40ml12例，平均出血量(30.26±6.17)ml;平均血腫周圍面積(5.64士0.78)cm2，神經(jīng)功能缺損程度(30.45±4.25)。對照組30例，男16例，女14例；平均年齡(66.2±9.4)歲；出血量1520ml7例，30mlll例，40ml12例，平均出血量(28.63士6.88)ml;平均血腫周圍面積(5.41±0.92)cm2，神經(jīng)功能缺損程度(30.28±4.50)。兩組病例性別、年齡分布，治療前血腫量及血腫周圍面積，神經(jīng)功能缺損程度，既往史和伴發(fā)癥情況相近，具有可比性。8.1.2試驗(yàn)方法全部病例均采用心痛定控制過高血壓，意識障礙者鼻飼給藥，合理使用甘露醇降低顱內(nèi)壓，保持水-電解質(zhì)平衡和基本營養(yǎng)物質(zhì)以維持生命機(jī)能，加強(qiáng)護(hù)理，預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生。同時均采用紫外線輻射自血光量子療法，隔日1次，5次為1療程共2療程。治療組在此基礎(chǔ)上當(dāng)病程達(dá)24小時加用復(fù)方葒草注射液50ml+5^葡萄糖注射液500ml靜脈滴注(血糖高用等滲鹽水)，每日1次，連用3周。8.1.3觀察指標(biāo)試驗(yàn)過程觀察血壓、神志、精神、智力、語言、癱瘓肢體肌力變化；定期查血生化、血糖、出凝血時間、纖維蛋白原、血尿常規(guī)等；病情如有突然變化隨時復(fù)査頭顱CT;療程結(jié)束后復(fù)査頭顱CT，測量血腫及其周圍水腫面積。8.1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用x士s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)。8.2結(jié)果8.2.1綜合療效評定顯效意識轉(zhuǎn)清醒，精神改善，癱瘓肢體肌力提高II級，CT顯示血腫量減少15ml以上，血腫明顯液化，血腫周圍水腫面積減少50%以上；有效意識轉(zhuǎn)清醒、精神改善、癱瘓肢體肌力提高I級，CT顯示血腫量減少10ml以上，血腫周圍水腫面積減少30%以上；無變化治療前后癥狀、體征基本相同惡化病情加重。8.2.2兩組神經(jīng)功能缺損程度評分治療組為6.30士4.96，對照組12.58±6.80。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異明顯(代0.05)，顯示復(fù)方葒草組優(yōu)于對照組。8.2.3療效比較治療組與對照組治療前后血腫量及血腫周圍水腫面積變化比較，見表；兩組綜合療效比較，見表8、9。表8兩組治療前后血腫量、水腫面積比較(x士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注兩組療效比較，*代0.058.2.4副作用治療組無病情突然加重及再出血現(xiàn)象發(fā)生，無明顯毒副作用。8.3結(jié)論由以上數(shù)據(jù)可知，復(fù)方葒草注射液治療組血腫周圍水腫面積減少速度、血腫吸收速度比對照組明顯加快(代0.01)，治療組神經(jīng)功能缺失積分減少、綜合療效均優(yōu)于對照組(代0.05)，表明復(fù)方葒草早期應(yīng)用于治療HICH可以改善HICH后腦缺血損害，抑制腦出血后腦水腫形成，促進(jìn)血腫吸收，有利于神經(jīng)功能恢復(fù)。從而縮短療程，提高療效，降低致殘、致死率。試驗(yàn)9葒草和燈盞細(xì)辛組合物治療急性期腦出血療效觀察9.1入組與試驗(yàn)9.l.l入組腦出血病人60例，全部符合入選標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)分為復(fù)方葒草注射液治療組和對照組。其中治療組30例，男18例，女12例；平均年齡(59.7土9.4)歲；對照組30例，男20例，女10例。兩組病例在性別、年齡、既往史、入院時CT血腫量和神經(jīng)功能評分方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(，.05)，具有可比性。9.1.2試驗(yàn)方法對照組給予脫水、降顱壓、神經(jīng)營養(yǎng)藥物、對癥支持、預(yù)防感染、預(yù)防并發(fā)癥、針灸和康復(fù)治療等常規(guī)治療；治療組在對照組的基礎(chǔ)上，于發(fā)病24h起給予復(fù)方葒草注射液50mL加入生理鹽水500mL靜脈輸注，每日l次，連用21d。以多田公式(血腫量=Jt/6X長軸X短軸X層面)計(jì)算病人用藥前、用藥第21天頭顱CT血腫體積。9.L3判斷標(biāo)準(zhǔn)基本痊愈功能缺損評分減少91%100%;顯著進(jìn)步功能缺損評分減少46%90%;進(jìn)步功能缺損評分減少18%45%;無變化功能缺損評分減少不足17%或增加，包括死亡。于用藥前、用藥后第21天對兩組病人進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，并根據(jù)兩次評分判斷療效。9.1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用x土s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)。9.2結(jié)果9.2.1頭顱CT血腫量、神經(jīng)功能缺損評分比較兩組用藥前頭顱CT血腫量、神經(jīng)功能缺損評分無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05);治療組用藥后第21天，頭顱CT血腫量、神經(jīng)功能缺損評分13顯著降低(代O.Ol)。詳見下表10:表10兩組治療前后CT血腫量、神經(jīng)功能缺損評分比較(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注與對照組比較，**代0.019.2.2臨床療效治療組顯效率(基本痊愈+顯著進(jìn)步)為，總有效率為；對照組顯效率為，總有效率為。治療組顯著高于對照組(代O.Ol)。詳見下表ll:表ll兩組臨床療效比較[n(%)]<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注兩組總有效率比較，林代O.019.2.3不良反應(yīng)治療組無病情突然加重及再出血現(xiàn)象發(fā)生，無明顯毒副反應(yīng)。9.3結(jié)論以上數(shù)據(jù)可知，復(fù)方葒草注射液可降低血黏度、改善微循環(huán)，控制腦水腫和減輕繼發(fā)神經(jīng)功能缺血性損害。使用葒草和燈盞細(xì)辛組合物治療腦出血，可加快血腫吸收，對提高腦出血的治愈率，減少致殘率有較好療效。試驗(yàn)10葒草和燈盞細(xì)辛組合物對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響10.1材料和方法10.l.l動物及分組雄性SD大鼠，體重170-230g，2月-3月大，貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為A對照組、B模型組、C模型加復(fù)方葒草30mg/kg組、D模型加復(fù)方葒草60mg/kg組、E模型加復(fù)方葒草90mg/kg組。治療組每天腹腔注射復(fù)方葒草注射液，模型組和對照組大鼠為正常喂養(yǎng)，連續(xù)給藥20d后測定學(xué)習(xí)記憶行為。10.1.2試劑及儀器復(fù)方葒草注射液，將按照實(shí)施例方法提取的荮草、燈盞細(xì)辛提取物合并，按照常規(guī)的方法制備成注射液。鵝膏蕈氨酸(IBO):瑞士Alexis公司生產(chǎn)，批號L05308;大鼠腦立體定位儀(張家港市教學(xué)實(shí)驗(yàn)器械廠生產(chǎn))；Y型迷宮、MG-3迷宮刺激器(張家港市教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠)。10.1.3AD動物模型制備大鼠用l(W水合氯醛(0.4g/kg)腹腔麻醉后，固定于腦立體定位儀上。常規(guī)備皮消毒，于頭頂正中做一個1.5cm的矢狀切口，參照大鼠腦立體定位圖譜，Meynert核定位坐標(biāo)為(Ap:1.6mmLat±2.8mmDv.8.2mm)，于雙側(cè)顱骨各對應(yīng)點(diǎn)分別鉆一個直徑l咖的孔洞，用玻璃微量進(jìn)樣器進(jìn)行垂直注射。模型組和治療組雙側(cè)Meynert核每側(cè)一次性注射B05ng(以lPl生理鹽水溶解)。每針注射時間5min，留針10min,使BO充分?jǐn)U散。對照組同樣方法注入等容積的生理鹽水。術(shù)后肌注青霉素預(yù)防感染。10.1.4跳臺試驗(yàn)自制跳臺實(shí)驗(yàn)箱，箱底鋪有銅柵作為刺激電極，箱內(nèi)右后側(cè)放置一個橡皮墊作為大鼠逃避電擊的安全區(qū)。先放入大鼠適應(yīng)5min，隨后通入70V，0.5A0.7A電流，大鼠遭到電擊后正常反應(yīng)是跳上平臺以躲避傷害性刺激。記錄大鼠從開始通電到完全上臺所用的時間。24h后重測驗(yàn)一次以測記憶能力。10.1.5Y迷宮試驗(yàn)將大鼠放入Y型迷宮中適應(yīng)3min后開始實(shí)驗(yàn)，有燈光的支臂為不通電安全區(qū)，安全區(qū)燈亮10s后，另兩臂底部鋁柵同時通入70V，0.5A0.7A電流，大鼠受電擊后跑到有燈光的安全區(qū)后停止，燈光繼續(xù)作用30s，以大鼠所在的支臂作為下一次測試的起點(diǎn)，無規(guī)則隨機(jī)變換安全區(qū)。以大鼠一次性跑向安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯誤反應(yīng)。連續(xù)測試30次，記錄正確反應(yīng)次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績。次日重做進(jìn)行記憶能力測試。10.1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以(x士s)表示，以代0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10.2結(jié)果各組大鼠跳臺實(shí)驗(yàn)及迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)、記憶能力的比較，見表12、表13。與對照組相比模型組學(xué)習(xí)記憶能力有顯著性下降(代O.Ol)，說明模型建立成功；各治療組與模型組相比，學(xué)習(xí)能力均有顯著性差異，說明治療有效。表12跳臺實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶能力的比較(x土s)分組例數(shù)上臺潛伏期(s)學(xué)習(xí)能力記憶能力A829.74±10.0315.36±5.01B855.28±10.37**39.15±12.72**C837.61±13.28*28.22±10.85*D831.56±11.71**20.83±9.57**E830.13±11.06**18.62±7.69**:林尸<0.01;*尸<0.05表l3迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶能力的比較(;f±s)分組例數(shù)正確反應(yīng)次數(shù)(次)學(xué)習(xí)能力記憶能力A819.40±4.6224.66±2.1515<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>10.3結(jié)論阿爾茨海默病(Alzheimer'sDisease,AD)在臨床上首先表現(xiàn)為近期記憶力降低，繼而呈現(xiàn)持續(xù)性智能衰退，其中認(rèn)知功能障礙為其核心癥狀。通過回避性跳臺和Y迷宮試驗(yàn)，觀察復(fù)方葒草注射液對BO損傷雙側(cè)NBM造成的擬AD大鼠學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的影響，結(jié)果表明葒草和燈盞細(xì)辛組合物可提高AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，改善血管性癡呆患者的智能障礙。具體實(shí)施例方式需要說明的是，本制備實(shí)施例僅僅是介紹一種制備提取物的方法，是為了闡釋本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1、取50kg葒草加10倍水煎煮3次，每次l小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)65%，靜置12小時，抽濾，取上清液過濾，濾液用醋酸乙酯萃取3次，棄去醋酸乙酯液，合并水層液，用鹽酸調(diào)pH值3，用水飽和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，水洗，減壓回收正丁醇，殘留物加80%乙醇溶解，上聚酰胺柱(500g，08cm，徑高比1:6，吸附流速1.5BV/h)，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得荮草提取物；取燈盞細(xì)辛10kg加10倍水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)55%，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10，用鹽酸調(diào)pH值至2，55t:保溫6小時，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH3-4,微波真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物。實(shí)施例2、將實(shí)施例1得到的葒草提取物和燈盞細(xì)辛提取物混合，用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成注射用水針劑。實(shí)施例3、將實(shí)施例1得到的葒草提取物和燈盞細(xì)辛提取物混合，用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成片劑。實(shí)施例4、將實(shí)施例1得到的葒草提取物和燈盞細(xì)辛提取物混合，用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成膠囊劑。實(shí)施例5、將實(shí)施例1得到的葒草提取物和燈盞細(xì)辛提取物混合，用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成顆粒劑。16實(shí)施例6、將實(shí)施例1得到的葒草提取物和燈盞細(xì)辛提取物混合，用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成口服液。實(shí)施例7、將實(shí)施例1得到的葒草提取物和燈盞細(xì)辛提取物混合，用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成丸劑。實(shí)施例8、將實(shí)施例1得到的葒草提取物和燈盞細(xì)辛提取物混合，用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成滴丸劑。實(shí)施例9、將實(shí)施例1得到的葒草提取物和燈盞細(xì)辛提取物混合，用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成冷凍干燥注射劑。實(shí)施例10、將實(shí)施例1得到的葒草提取物和燈盞細(xì)辛提取物混合，用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成注射用粉劑。實(shí)施例11、將實(shí)施例1得到的葒草提取物和燈盞細(xì)辛提取物混合，用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成輸液劑。權(quán)利要求1、葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備以下方面作用的藥物中的應(yīng)用(1)腦中風(fēng)及后遺癥；(2)腦缺血、NMDA受體誘導(dǎo)腦神經(jīng)細(xì)胞損傷；(3)腦缺血/再灌注損傷；(4)腦血栓、腦梗塞。2、葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備治療腦出血包括急性期腦出血、高血壓腦出血、腦出血后水腫的藥物中的應(yīng)用。3、葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備治療阿爾茨海默氏病，改善大鼠記憶的藥物中的應(yīng)用。4、葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備治療各種原因引起的眩暈，如腦動脈供血不足、梅尼埃病、高血壓腦病、冠心病、椎-基底動脈供血不足等造成的眩暈的藥物中的應(yīng)用。5、按照權(quán)利要求l-4任一所述葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述葒草和燈盞細(xì)辛組合物是由中藥原料葒草和燈盞細(xì)辛合并后提取所得的提取物或分別提取后合并所得的提取物。6、按照權(quán)利要求5所述葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備藥物中的應(yīng)用，其特征在于生藥的重量配比葒草1-10份，燈盞細(xì)辛1-10份。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，生藥的重量配比為葒草3-8份燈盞細(xì)辛l-5份。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，生藥的重量配比為葒草5份燈盞細(xì)辛1份。9、按照權(quán)利要求l-4任一所述葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為注射制劑、片劑、丸劑、滴丸、膠囊劑、顆粒劑、口服液。10、按照權(quán)利要求8所述葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為注射制劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種葒草和燈盞細(xì)辛組合物在制備治療腦血管及相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用，所述腦血管疾病包括中風(fēng)、中風(fēng)后遺癥、局部缺血、出血、出血后水腫、再灌注損傷、血栓、血管收縮、梗塞和阿爾茨海默氏病，還包括各種原因引起的眩暈。其中，葒草和燈盞細(xì)辛組合物是由中藥原料葒草和燈盞細(xì)辛合并后提取或分別提取后合并所得的提取物組成。本發(fā)明提供了一種葒草和燈盞細(xì)辛組合物新的醫(yī)藥用途，即該組合物在制備治療腦血管及相關(guān)疾病藥物方面的應(yīng)用，并通過動物試驗(yàn)證實(shí)了葒草和燈盞細(xì)辛組合物對腦血管及相關(guān)疾病的治療具有確切的療效，為患者提供了一種新的用藥選擇。文檔編號A61K36/704GK101632724SQ20081006883公開日2010年1月27日申請日期2008年7月25日優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日發(fā)明者周黎亞,竇啟玲申請人:貴州益佰制藥股份有限公司