專利名稱：Ppd用于佐劑化核酸疫苗的用途的制作方法
PPD用于佐劑化核酸疫苗的用途
本發(fā)明提供了核酸疫苗的新的佐劑，具體地，本發(fā)明提供了核酸疫苗，其包含PPD或者與PPD聯(lián)合施用。本發(fā)明還提供了提高核酸疫苗的治療功效的方法。
更具體地，本發(fā)明提供了 PPD在生產(chǎn)核酸疫苗組合物的用途，用于增強針對該核酸疫苗編碼的特定抗原的免疫應(yīng)答的目的。提供了疫苗組合物、包含單獨的核酸組合物和用于單獨施用的包含PPD的組合物的藥盒，生產(chǎn)所述疫苗和藥盒的方法，和用本發(fā)明的疫苗組合物治療個體的方法。
多年來，疫苗接種技術(shù)基本上在于向動物中引入抗原(例如，蛋白質(zhì)、被殺滅或減毒的病毒)以便引起針對感染性生物的免疫應(yīng)答。自從上世紀(jì)80年代末期以來，已經(jīng)出現(xiàn)了新的疫苗接種技術(shù)，其在于向動物中引入包含編碼抗原的核酸序列的載體。例如，編碼狂犬病糖蛋白的活的痘苗病毒已經(jīng)被成功地用于清除西歐國家中的陸地狂犬病(Cliquet等人，Dev Biol(Basel)., 2004,119,185-204)。核酸免疫的主要優(yōu)點是可以誘導(dǎo)細(xì)胞(包括CD4+和CD8+T細(xì)胞)和體液免疫應(yīng)答，因為所編碼的抗原通過內(nèi)源和外源途徑被加工，肽表位通過主要組織相容性復(fù)合體(MHC ) I類和II類復(fù)合體呈遞(Haupt等人，Exp Biol Med (Maywood)， 2002， 227,227-37)。
CTL應(yīng)答的有效產(chǎn)生已經(jīng)為通過核酸接種預(yù)防性或治療性治療癌癥鋪平了道路。許多腫瘤細(xì)胞表達被稱作TAA (腫瘤相關(guān)抗原)的特定抗原，但是這些抗原不能被免疫系統(tǒng)充分識別，所述免疫系統(tǒng)被腫瘤外周的因子下調(diào)。用編碼TAA的核酸接種患者導(dǎo)致TAA在如下環(huán)境中的表達，所述環(huán)境中，免疫系統(tǒng)是完全有效的并且產(chǎn)生特別針對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
對于每種治療，總是需要提高核酸接種的功效。因此，定量提高免疫應(yīng)答或者改變對疾病適應(yīng)癥最有效的應(yīng)答類型的方法可以是有用的。
5然而，適于核酸接種的佐劑的鑒定不是直接的，因為針對常規(guī)疫苗或 核酸疫苗的免疫應(yīng)答中相關(guān)的機理不是相同的。例如，申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)常
規(guī)疫苗的有效佐劑如BCG、 montanide、 levimazole或氯會不能增加針對 核酸編碼的抗原的免疫應(yīng)答。
PPD(純化的蛋白質(zhì)衍生物)是從結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )提取的化合物的混合物。PPD ^皮用作檢測結(jié)核菌素反應(yīng)性的 試驗。PPD的皮內(nèi)注射后，特征為增大的腫塊的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的產(chǎn)生是 結(jié)核感染的病征。
PPD作為典型抗原載體的用途已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中公開。例如，Perraut 等人(Clin. Exp. Immunol" 1993， 93， 382畫6)描述了包含綴合到PPD的合成 的瘧疾肽的疫苗。Ohno等人(US20060008478)公開了包含PPD和抗原的復(fù) 合體，其中這兩種組分是共同沉淀物。整個現(xiàn)有技術(shù)公開了 PPD和抗原的 同時注射。
申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PPD是核酸疫苗的非常有效的佐劑并且更具體地涉 及使用重組病毒作為載體的核酸疫苗。該發(fā)現(xiàn)尤其令人驚奇，因為認(rèn)為在 病毒表面存在的或者在病毒感染期間表達的多種病毒抗原足夠作為針對所 述抗原的免疫應(yīng)答的佐劑(J Immunol., 2005， 175， 599-606)。
發(fā)明概述
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供了包含(i)PPD和(ii)編碼抗原的核 酸序列的疫苗。
另一方面，本發(fā)明提供了藥盒，其包含(i)PPD，和(ii)編碼抗原的
核酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了增加對抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包 括順序或同時施用編碼抗原和PPD的核酸。
在另一實施方案中，提供了 PPD在生產(chǎn)藥物中的用途，所述藥物用 于增強對核酸序列編碼的抗原的免疫應(yīng)答，所述核酸序列與所迷衍生物順 序或者同時施用。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了包含PPD衍生物的藥物組合物， 其用于增強對核酸序列編碼的抗原的免疫應(yīng)答。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中產(chǎn)生針對疾病狀態(tài)的 免疫應(yīng)答的方法，包括對所述哺乳動物施用編碼與所述疾病狀態(tài)有關(guān)的抗 原肽的核酸序列；額外對所述哺乳動物施用PPD以引起所述免疫應(yīng)答。
還提供了增強哺乳動物對免疫原的免疫應(yīng)答的方法，包括對所述哺乳 動物施用編碼所述免疫原的核酸序列，額外對所述哺乳動物以有效增強所 述免疫應(yīng)答的量施用PPD的步驟。
發(fā)明詳述
如本申請全文所用，術(shù)語"一個，，以它們指"至少一個"、"至少第一 個"、"一個或多個"或"多個"所提及組分或步驟的含義使用，除非上下文明 確指出相反。例如，術(shù)語"一個細(xì)胞"包括多個細(xì)胞，包括其混合物。
術(shù)語"和/或"無論用于本文何處指"和"、"或"和"通過所述術(shù)語連接的 成分的所有或任何其他組合"。
術(shù)語"約"或"大約"在本文中用于指在給定值或范圍的20%以內(nèi)，優(yōu) 選10%以內(nèi)，更優(yōu)選5 0/。以內(nèi)。
如本文所用，術(shù)語"包含"意指產(chǎn)品、組合物和方法包括所引用的組分 或步驟，但是不排除其他的組分或步驟。"基本上由.，.組成"當(dāng)用于定義產(chǎn) 品、組合物和方法時，將意在排除任何基本重要性的其他組分或步驟。從 而，基本上由所引用的組分組成的組合物將不排除微量污染物和可藥用栽 體。"由...組成"將意在排除微量元素或其他組分或步驟。
如本文所用，術(shù)語疫苗組合物指編碼抗原的核酸序列和PPD的組合。 該組合為例如單個可藥用制劑中兩種組分的混合物的形式或者單獨的各自 組分的形式，例如，包含編碼抗原的核酸序列和PPD的藥盒的形式，其中 兩種組分用于單獨的、順序的或者同時施用。優(yōu)選地，基本上同時施用兩 種組分。
7如本文所用，術(shù)語"PPD"、"純化的蛋白質(zhì)衍生物"或者"結(jié)核菌素"(其 可以互換使用)指通過Seibert方法(Seibert等人Am. Rev. Tuberc.， 1934， 30， 713-720和Seibert等人Am. Rev. Tuberc.， 1941， 44， 9-23)得到的蛋白質(zhì)。 PPD也指包含通過Seibert方法得到的蛋白質(zhì)的組合物。此類組合物可以 伊J:i口以applisol (Parkedale Pharmaceuticals, Rochester, USA), PPD Tine Test (Lederlele Pharmaceutical, Pearl River, USA), Tubertest (Sanofi Pasteur Msd)， Tubersol (Aventis Pasteur)， Aplitest , Sclavo Test-PPD (Sclavo Laboratories, Italy),或Mono-Vacc Test (O.T.)商標(biāo)通過商業(yè)途徑
獲得。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，PPD組合物選自tubertest和tubersol。 根據(jù)本申請的接種方法和組合物可能被修改用于保護或治療哺乳動
物抵抗多種疾病狀態(tài)，如病毒、細(xì)菌或者寄生蟲感染、癌癥、變態(tài)反應(yīng)和
自身免疫疾病。
術(shù)語"抗原"指能夠被選擇性結(jié)合劑如抗體結(jié)合的分子或分子部分，并 且所述分子或分子部分還能夠用于動物中產(chǎn)生能夠結(jié)合到該抗原的表位的 抗體?？乖梢跃哂幸粋€或多個表位。
在一個實施方案中，抗原是腫瘤相關(guān)抗原(TAA) 。 TAA指一種分 子，其在腫瘤細(xì)胞中比在相同組織類型的非腫瘤細(xì)胞中以更高頻率或密度 被檢測到。TAA的實例包括但不限于CEA、MART國l、MAGE-l、MAGE-3、 GP-IOO、 MUC-1、 MUC-2、點突變的ras癌基因、正?；螯c突變的p53、 過表達的p53、 CA-125、 PSA、 C畫erb/B2、 BRCAI、 BRCAII、 PSMA、 酪氨酸酶、TRP-1、 TRP-2、 NY-ESO畫l、 TAG72、 KSA、 HER-2/neu、 bcr-abl、 pax3-fkhr、 ews-fli-l、存活蛋白和LRP。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，TAA是 MUC1。
在本發(fā)明的另一實施方案中，抗原是微生物抗原。如本文所用的^L生 物抗原是微生物(包括但不限于病毒、細(xì)菌、寄生蟲和真菌)的抗原。
病毒包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒科、小RNA病毒科(例如，脊髓灰質(zhì) 炎病毒、甲型肝炎病毒；腸病毒、人類柯薩奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)； Calciviridae (例如，引起胃腸炎的毒抹)；披膜病毒科(例如，馬腦炎病毒、風(fēng)滲病毒)；Flaviridae (例如，登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病毒)； 冠狀病毒科(Coronoviridae)(例^口，冠狀病毒)；Rhabdoviradae(例:ft口， 水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；絲狀病毒科(例如，埃波拉病毒)；副粘 液病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻瘆病毒、呼吸道合胞病毒)； 正粘病毒考牛(例々口， it感病毒)；布尼亞病毒科(Bungaviridae)(例:ft口， 漢坦病毒、bunga病毒、白蛉病毒和Nairo病毒)；砂粒病毒賴Arenaviridae) (出血熱病毒)；呼腸病毒科(例如，呼腸病毒、環(huán)狀病毒和輪狀病毒)； 雙RNA病毒科；嗜肝病毒科(乙型肝炎病毒)；Parvovirida (細(xì)小病毒 屬)；乳多空病毒科(乳頭瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(多數(shù)腺病毒)； 皰滲病毒科(單純皰滲病毒(HSV) 1和2、水痘帶狀皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒
(CMV)、皰滲病毒；Poxyiridae (天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和 虹膜病毒科(例如，非洲豬疰病毒)。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，所述抗原是人乳頭瘤病毒(HPV)的抗 原。才艮據(jù)優(yōu)選的實施方案，所述HPV抗原來自HPV-16和/或HPV-18。
才艮據(jù)甚至更優(yōu)選的實施方案，所述HPV抗原選自HPV的E6早期編 碼區(qū)、HPV的E7早期編碼區(qū)和其部分或組合。
本發(fā)明包括與p53的結(jié)合被改變或者至少顯著減小的任何HPV E6多 肽的用途和/或與Rb的結(jié)合被改變或者至少顯著減小的任何HPV E7多肽 的用途(Munger等人，1989， EMBO J. 8, 4099-4105; Crook等人，1991， Cell 67， 547-556; Heck等人，1992， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 4442-4446; Phelps等人,1992， J. Virol. 66， 2148-2427)。適于本發(fā)明目的的非致癌的 HPV-16 E6變體纟皮缺失位于約118位到約122位的一個或多個氨基酸殘基
(+1代表天然HPV-16 E6多肽的第一個甲硫氨酸殘基)，特別優(yōu)選完全 缺失殘基118到122(CPEEK)。適于本發(fā)明目的的非致癌的HPV-16 E7變 體被缺失位于約21位到約26位的一個或多個氨基酸殘基(+1代表天然 HPV-16 E7多肽的第一個氨基酸)，特別優(yōu)選完全缺失殘基21到 26(DLYCYE)。才艮據(jù)優(yōu)選的實施方案，用于本發(fā)明的一種或多種HPV-16 早期多肽被進一步修飾以便改善I類MHC和/或II類MHC呈遞，和/或刺激抗HPV免疫力。HPV E6和E7多肽是核蛋白并且以前已經(jīng)表明膜呈 遞允許提高它們的治療功效(見例如WO99/03885)。從而，適當(dāng)?shù)氖切揎?至少一種HPV早期多肽以便被錨定到細(xì)胞膜。膜錨定可以通過在HPV早 期多肽中摻入膜錨定序列容易地實現(xiàn)并且如果天然多肽缺少它，那么為分 泌序列(即，信號肽)。膜錨定和分泌序列是本領(lǐng)域已知的。筒言之，分 泌序列存在于膜存在的或分泌的多肽的N-末端并且啟動它們進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER )。它們通常包含15到35個基本上疏水的氨基酸，其然后被特定的 位于ER的內(nèi)肽酶除去而得到成熟多肽。膜錨定序列通常是高度疏水性質(zhì) 的并且用于在細(xì)胞膜中錨定多肽(見例如Branden和Tooze， 1991， in Introduction to Protein Structure p. 202-214， NY Garland》
可用于本發(fā)明上下文中的膜錨定和分泌序列的選擇是多種多樣的。它 們可以從包含它的任何膜錨定的和/或分泌的多肽得到(例如，細(xì)胞或病毒 多肽)，如狂犬病糖蛋白、HIV病毒外殼糖蛋白、或者麻滲病毒F蛋白或 者可以是合成的。插入每種本發(fā)明所用的早期HPV-16多肽的膜錨定的和/ 或分泌序列可以具有相同或不同的來源。分泌序列的優(yōu)選插入位點是用于 啟動翻譯的密碼子下游的N-末端并且膜錨定序列的優(yōu)選插入位點是C-末 端，例如，終止密碼子的立即下游。
優(yōu)選通過插入麻瘆F蛋白的分泌和膜錨定信號來修飾本發(fā)明中使用 的HPVE6多肽。任選地或組合地，優(yōu)選通過插入狂犬病糖蛋白的分泌和 膜錨定信號修飾本發(fā)明中所用的HPV E7多肽。
細(xì)菌包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。此類革蘭氏陽性細(xì)菌包括， 但不限于，巴斯德菌屬(Pasteurella)的種、葡萄球菌屬(Staphylococci) 的種，和鏈球菌屬(Streptococcus)的種。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于， 大腸桿菌(Escherichia coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas )的種、和沙門 氏菌屬(Salmonella)的種。感染性細(xì)菌的特定實例包括但不限于，幽門 蟲累桿菌(Helicobacter pyloris)、 Borelia burgdorferi 、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、分枝桿菌(Mycobacteria sps )(例如結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis )、鳥分枝桿菌(M. avium )、胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare )、M. kansaii、 戈登分枝桿菌(M. gordonae ))、金黃色葡萄球菌
(Staphylococcus aureus )、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae )、 腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌
(Listeria monocytogenes )、酉良腺鏈球菌(Streptococcus pyogenes ) (A 組鏈球菌)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae) (B組鏈球菌)、鏈球菌屬 (Streptococcus) (viridans組)、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)、牛鏈 球菌(Streptococcus bovis)、鏈球菌屬(Streptococcus)(厭氧的種)、肺炎鏈球 菌(Streptococcus pneumoniae)、致病性彎曲軒菌屬(Campylobacter sp.)、 腸球菌屬(Enterococcus sp.)、 流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、 Bacillus antracis、 白喉棒軒菌(corynebacterium diphtheriae)、棒軒菌屬屬
(corynebacterium sp.)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae )、 產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)、 產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、 Pasturella multocida、擬桿菌屬(Bacteroides sp.)、具核梭桿 菌(Fusobacterium nucleatum)、 念珠狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis)、 蒼白密螺旋體(Treponema palladium)、 細(xì)弱密螺旋體 (Treponema pertenue)、 鉤端蟲累旋體屬(Leptospira)、 立克次氏體屬
(Rickettsia)、和衣氏放線菌(Actinomyces israelii)。
真菌顯然包4舌新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans )、夾膜組織 胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮 炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、 白假絲酵母(Candida albicans)。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，抗原是感染性生物的抗原，所述生物包 4舌癡原蟲，長口惡性癡原蟲(Plasmodium falciparum)，三日癡原蟲
(Plasmodium malariae)，卵形癡原蟲(Plasmodium ovale)，和間日痗 原蟲(Plasmodium vivax )和鼠弓形蟲(Toxoplasma gondii)。 血'液傳染和/ 或組織寄生蟲包括癡原蟲屬(Plasmodium spp.)、果氏巴貝蟲(Babesia microti)、分歧巴貝蟲(Babesia divergens)、熱帶利什曼原蟲(Leishmania
iitropica)、利4十曼原蟲屬(Leishmania spp.)、 巴西利4十曼原蟲(Leishmania braziliensis) 、 4土氏禾'H十曼原蟲(Leishmania donovani)、 岡比亞錐蟲 (Trypanosoma gambiense)和羅德西亞錐蟲(Trypanosoma rhodesiense) (非洲昏睡病)、克魯斯錐蟲(Trypanosoma cruzi)(查加斯病)，和鼠弓形蟲。 根據(jù)另一實施方案，抗原是變應(yīng)原。變應(yīng)原指可以在敏感受試者中誘 導(dǎo)變應(yīng)性或哮喘反應(yīng)的物質(zhì)。變應(yīng)原的列表是巨大的并且可以包括花粉、 昆蟲毒液、動物毛屑、真菌孢子和藥物(例如，青霉素)。天然的動物和 植物變應(yīng)原的實例包括但不限于下列屬特有的蛋白質(zhì)犬科動物(家犬 (Canis familiaris ));表皮螨屬(Dermatophagoides )(例i口，粉塵螨 (Dermatophagoides farinae ));貓屬(Felis )(家貓(Fdis domesticus )); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia;黑麥草屬(Lolium)(例如，多年生黑 麥草(Lolium perenne )或多花黑麥草 (Lolium multiflorum ));杉p杉屬 (Cryptomeria )(日本柳杉 (Cryptomeria japonica ));鏈格孢屬 (Alternaria)(鏈格孢(Alternaria alternata ));赤楊；榿木屬(歐洲榿木 (Alnus gultinoasa ));樺木屬(Betula verrucosa);櫟屬(Quercus )(白櫟 (Quercus alba));木犀欖屬(Olea )(油橄欖(Olea europa ));蒿屬 (Artemisia)(艾蒿(Artemisia vulgaris));車前草屬(Plantago )(例 力口長葉車前(Plantago lanceolata ));墻草屬(Parietaria )(例:i口 Parietaria officinalis或Parietaria judaica);蜚蠊(Blattdla )(例如德國小蠊(Blattella
germanica )); 蜜蜂屬 (Apis ) (，J長口 Apis multiflorum); ;^白木屬 (Cupressus )(例^口地中海柏木(Cupressus sempervirens )，綠干柏 (Cupressus arizonica )和大果柏木(Cupressus macrocarpa ));刺柏屬 (Juniperus )(例如Jimipems sabinoides、 Jimipems virginiana、歐洲糸'J 柏(Juniperus communis)和阿希刺柏(Jimipems ashei) ); Thuya (例如 Thuya orientalis); 扁柏屬 (Chamaecyparis ) (例如日本扁柏 (Chamaecyparis obtusa )); 大蠊屬(Periplaneta )(例如美洲大蠊 (Periplaneta americana ));》K草屬 (Agropyron ) (例如寸S麥草 (Agropyron repens ));黑麥屬(Secale )(例如黑麥(Secale cereale ));小麥屬(Triticum)(例如普通小麥(Triticimi aestivum ));鴨茅屬(Dactylis ) (例如鴨茅(Dactylis glomerata ));羊茅屬(Festuca )(例如牛尾草(Festuca elatior));早熟禾屬(Poa )(例如草地早熟禾(Poa pratensis )或加拿大 早熟禾(Poa compressa ));燕麥屬(Avena )(例如燕麥(Avena sativa )); 絨毛草屬(Holcus )(例如絨毛草(Holcus lanatus ));黃花茅屬 (Anthoxanthum )(例如黃花茅(Anthoxanthum odoratum));燕麥草屬 (Arrhenatherum )(例如燕麥草(Arrhenatherum elatius ));剪股穎屬 (Agrostis)(例如小糠草(Agrostis alba));梯牧草屬(Phleum )(例如 梯牧草(Phleum pratense));草,屬(Phalaris )(例如草蘆(Phalaris arundinacea ));雀稗屬(Paspalum )(例如Paspalum notatum);蜀黍?qū)?例 如石茅高粱(Sorghum halepensis ));和雀麥屬(Bromus )(例如無芒雀麥 (Bromus inermis ))。
如本文所用，術(shù)語"免疫應(yīng)答"包括B細(xì)胞介導(dǎo)的、T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答 或者B和T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的組合。
術(shù)語"核M列"指核苷酸的線性序列。核苷酸為多聚核糖核苷酸或者 多聚脫氧核糖核苷酸的線性序列或者兩者的混合物。在本發(fā)明上下文中多 核苷酸的實例包括單鏈和雙鏈的DNA、單鏈和雙鏈RNA，和具有單鏈和 雙鏈DNA和RNA的兩種混合物的雜種分子。此外，本發(fā)明的多核普酸可 以具有一個或多個經(jīng)修飾的核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，編碼抗原的核酸序列被包含在載體中。 栽體可以為質(zhì)?；蛘卟《緛碓椿蛘哌m當(dāng)時可以與提高載體的轉(zhuǎn)染效 率和/或穩(wěn)定性的一種或多種物質(zhì)組合。這些物質(zhì)在技術(shù)人員可得到的文獻 中廣泛記栽(見例如，F(xiàn)eigner等人，1987， Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson和Solaiman， 1996, Nature Biotechnology 14， 339-342; Remy等人，1994， Bioconjugate Chemistry,. 5， 647-654)。作為非限制性說 明，所述物質(zhì)可以是聚合物、脂類，尤其陽離子脂類、脂質(zhì)體、核蛋白或 中性脂類。這些物質(zhì)可以單獨或組合使用?？梢栽O(shè)想的組合為重組質(zhì)粒載體與陽離子脂類(DOGS、 DC-CHOL、精胺-chol、亞精胺-chol等等)、 溶血磷脂(例如，十六烷基磷酸膽堿)和中性脂類(DOPE)的組合。
根據(jù)優(yōu)選實施方案，可以用于本發(fā)明的陽離子脂類為EP901463B1中 描述的陽離子脂類，更優(yōu)選為pcTG90。
可以用于本發(fā)明上下文的質(zhì)粒的選擇是多種多樣的。它們可以是克隆 載體和/或表達載體。以通常的方式，它們是技術(shù)人員已知的并且盡管它們 中許多可通過商業(yè)途徑獲得，但是也可以使用遺傳操作技術(shù)構(gòu)建它們或者 》務(wù)飾它們。可以提及的實例是衍生自pBR322 (Gibco BRL)、 pUC (Gibco BRL)、 pBluescript (Stratagene)、 pREP4、 pCEP4 (Invitrogene)或p Poly (Lathe等人，1987， Gene 57， 193-201)的質(zhì)粒。優(yōu)選地，用于本發(fā)明上下文 中的質(zhì)粒含有復(fù)制起點，其確保復(fù)制在生產(chǎn)細(xì)胞和/或宿主細(xì)胞中啟動(例 如，將為意在大腸桿菌中產(chǎn)生的質(zhì)粒選擇ColEl原點并且如果希望，該質(zhì) 粒將在哺乳動物宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，那么將選擇oriP/EBNAl系統(tǒng)， Lupton和Levine， 1985， Mol. Cell. Biol. 5， 2533-2542; Yates等人，Nature 313， 812-815)。質(zhì)?？梢灶~外包含選擇基因，其使得可以選擇或鑒定被轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞(營養(yǎng)缺陷型突變的互補，編碼對抗生素抗性的基因，等等)。 質(zhì)粒自然可以含有提高它在給定細(xì)胞中的維持和/或其穩(wěn)定性的額外元件 (cer序列，其促進質(zhì)粒以單體形式保持(Summers和Sherrat， 1984, Cell 36， 1097-1103， sequences for integration into the cell genome)。
關(guān)于病毒載體，可能設(shè)想來自痘病毒(痘苗病毒，尤其MVA、金絲 雀痘病毒等等)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰瘆病毒、曱病毒、泡沫病毒或 腺病毒伴隨病毒的載體?？赡苁褂每蓮?fù)制型或復(fù)制缺陷病毒載體。優(yōu)選使 用不整合的載體。在這方面，腺病毒載體和來自痘病毒、更優(yōu)選痘苗病毒 和MVA的載體尤其適于實現(xiàn)本發(fā)明。
根據(jù)優(yōu)選的實施方案，根據(jù)本發(fā)明的病毒載體衍生自改良的痘苗病毒 Ankara(MVA)。 MVA載體和產(chǎn)生此類載體的方法在歐洲專利EP83286和 EP206920,以及在Mayr等人(1975， Infection 3， 6-14)和Sutter et Moss (1992， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 10847-10851)中充分描述。根據(jù)更優(yōu)選
14的實施方案，根據(jù)本發(fā)明的核酸序列可以被插入MVA載體的缺失I、 II、 III、 IV、 V和VI中并且甚至更優(yōu)選被插入在缺失III中(Meyer等人，1991， 丄Gen. Virol. 72,1031-1038 ; Sutter等人，1994， Vaccine 12， 1032-1040)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒具有感染性質(zhì)，在多數(shù)情況中，整合到正分裂的細(xì)胞并且 在這方面尤其適用于癌癥。根據(jù)本發(fā)明的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒通常含有LTR序 列、殼體化區(qū)和根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列，其被置于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR或內(nèi) 部啟動子(如本文所述的那些)的控制下。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒可以衍生自任 何來源(鼠、靈長類、貓科、人類等等)的逆轉(zhuǎn)錄病毒，尤其來自MOMuLV (Moloney小鼠白血病病毒)、MVS (鼠肉瘤病毒)或Friend鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒 (Fb29)。它在殼體化細(xì)胞系中增殖，所述細(xì)胞系能夠以反式提供病毒多肽 gag、 pol和/或env，其是構(gòu)建病毒顆粒所需的。此類細(xì)胞系描述于文獻中 (PA317, Psi CRIP GP + Am-12等等)。根據(jù)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以 含有修飾，尤其在LTR中(用真核啟動子置換啟動子區(qū))或殼體化區(qū)中的 ^f務(wù)飾(用異源殼體化區(qū)如VL30型殼體化區(qū)替換)(見法國申請94 08300 和97 05203)。
優(yōu)選使用腺病毒載體，其缺少復(fù)制所必需的至少 一個區(qū)的全部或部分 并且選自El、 E2、 E4和L1-L5區(qū)以^更避免載體在宿主生物或環(huán)境中增殖。 優(yōu)選缺失E1區(qū)。然而，它可以與其他修飾/缺失組合，所述修飾/缺失尤其 影響E2、E4和/或Ll-L5區(qū)的全部或部分至通過互補細(xì)胞系和/或輔助病毒 以反式互補有缺陷的疾病功能的程度。在這方面，可能使用本領(lǐng)域的第二 代載體(見例如，國際申請WO-A-94/28152和WO-A-97/04119)。作為闡 明，El區(qū)和E4轉(zhuǎn)錄單位的主要部分的缺失是尤其有利的。為了增加克隆 能力的目的，腺病毒載體可以額外缺少全部或部分非必需E3區(qū)。根據(jù)另 一備選方案，可能利用最小腺病毒載體，其保留殼體化所需的序列，即5， 和3，ITR(反向末端重復(fù))，和殼體化區(qū)。多種腺病毒載體，和制備它們的技 術(shù)是已#口的(見伊j長口， Graham和Prevect， 1991, in Methods in Molecular Biology, Vol 7, p 109-128; Ed: E.J. Murey， The Human Press mc)。
15此夕卜，根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體的來源可以在物種的觀點和血清型的 觀點兩方面不同。載體可以來自人或動物(犬科動物、鳥類、牛、鼠、羊、 豬、猿猴等等)來源的腺病毒的基因組或者來自雜種，所述雜種包含至少 兩種不同來源的腺病毒基因組片段。更具體地可以提及犬科動物來源的
CAV-1或CAV-2腺病毒、鳥類來源的DAV腺病毒或者牛來源的Bad 3型 腺病毒(Zakharchuk等人，Arch. Virol" 1993， 128: 171-176; Spibey和 Cavanagh， J. Gen. Virol. 1989， 70: 165-172; Jouvenne等人，Gene， 1987， 60: 21-28; Mittal等人，J. Gen. Virol" 1995， 76: 93-102)。然而，優(yōu)選人類來源 的腺病毒載體，其優(yōu)選來自血清型C-腺病毒，尤其2或5型血清型C腺病 毒。
如本文所用的術(shù)語"可復(fù)制型"指不存在任何反式互補時，能夠在宿主 細(xì)胞中復(fù)制的病毒載體。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，可復(fù)制型載體是可復(fù)制型腺病毒載體。 這些可復(fù)制型腺病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。其中，尤其優(yōu)選在編 碼55kD P53抑制劑的Elb區(qū)中缺失的腺病毒載體，如在ONYX-015病毒 中(Bischoff et al， 1996; Heise等人，2000; WO 94/18992)。因此，該病毒可 以用于選擇性感染和殺死p53缺陷的贅生細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根 據(jù)成熟技術(shù)突變和破壞腺病毒5或者其他病毒中的p53抑制基因。在EIA Rb結(jié)合區(qū)中缺失的腺病毒載體也可以用于本發(fā)明。例如，Delta24病毒， 其是在EIA區(qū)中攜帶24個堿基對缺失的突變腺病毒(Fueyo等人，2000)。 Ddta24在Rb結(jié)合區(qū)中具有缺失并且不結(jié)合到Rb。因此，突變病毒的復(fù) 制被正常細(xì)胞中Rb抑制。然而，如果Rb被失活并且細(xì)胞變成癌性的，那 么Delta24不再被抑制。相反，突變的病毒有效復(fù)制并裂解Rb缺陷的細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體可以通過連接或同源重組(見例如國際申請 WO-A-96/17070 )在大腸桿菌中在體外產(chǎn)生或者通過在互補細(xì)胞系中重組 來產(chǎn)生。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，載體還包含抗原表達必需的元件。表達必需的元件由能夠使得核酸序列被轉(zhuǎn)錄成RN A和mRNA被翻譯 成多肽的所有元件組成。這些元件具體包含能夠被調(diào)節(jié)的或組成型啟動子。 自然地，啟動子適于所選的載體和宿主細(xì)胞?？梢蕴峒暗膶嵗荘KG (磷 酸甘油酸激酶)、MT(金屬硫蛋白；Mclvor等人，1987， Mol. Cell Biol. 7, 838-848)、 -l抗胰蛋白酶、CFTR、表面活性劑、免疫球蛋白、肌動蛋白 (Tabin等人，1982， Mol. Cell Biol. 2， 426-436)和SRa (Takebe等人，1988， Mol. Cell Biol. 8， 466-472)基因的真核生物啟動子、SV40病毒(猿猴病毒) 的早期啟動子、RSV(勞斯肉瘤病毒)的LTR、 HSV-1TK啟動子、CMV 病毒(巨細(xì)胞病毒)的早期啟動子、痘苗病毒的p7.5KpH5R、 pKlL、 p28 和pll啟動子、和E1A和MLP腺病毒啟動子。啟動子也可以是刺激在腫 瘤或癌細(xì)胞中表達的啟動子。尤其可以提及在乳腺癌和前列腺癌中過表達 的MUC-1基因的啟動子(Chen等人，1995， J.. Clin. Invest. 96， 2775-2782)， 在結(jié)腸癌中過表達的CEA (表示癌胚抗原)基因的啟動子(Schrewe等人， 19卯，Mol. Cell. Biol. 10， 2738-2748)，在黑素瘤中過表達的酪氨酸酶基因的 啟動子(Vile等人，1993， Cancer Res. 53， 3860-3864)，在乳腺癌和胰腺癌中過 表達的ERBB-2基因的啟動子(Harris等人，1994， Gene Therapy 1， 170-175) 和在肝癌中過表達的甲胎蛋白基因的啟動子(Kanai等人，1997， Cancer Res. 57， 461-465)。巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動子是非常優(yōu)選的。
然而，當(dāng)使用來自痘苗病毒的載體(如MVA載體)時，尤其優(yōu)選胸 苷激酶7.5K基因的啟動子。
必需的元件可以還包括額外元件，這些額外元件改善本發(fā)明的核M 列的表達或者其在宿主細(xì)胞中的維持。尤其可以提及內(nèi)含子序列、分泌信 號序列、核定位序列、IRES型翻譯再起始的內(nèi)部位點、轉(zhuǎn)錄終止多聚A 序列、三聯(lián)前導(dǎo)序列和復(fù)制起點。這些元件是技術(shù)人員已知的。
根據(jù)本發(fā)明的重組載體可以還包含一種或多種額外的目的基因，這些 基因可以被置于相同的調(diào)節(jié)元件的控制下(多順反子盒)或獨立元件的控 制下。尤其可提及的基因是編碼白介素IL-2、 IL-4、 IL-7、 IL-10、 IL-12、 IL畫15、 IL-18、趨化因子如CCL19、 CCL20、 CCL21、 CXCL畫14、干擾素、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)，尤其GM-CSF、作用于 先天性免疫和血管發(fā)生的因子(例如，PA1-1，代表纖溶酶原激活物抑制劑) 的基因。在一個具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組載體包含編碼IL-2 的目的基因。
本發(fā)明還提供了包含疫苗組合物的藥物組合物，根據(jù)本發(fā)明的藥盒， 和可藥用載體。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)疫苗組合物的方法，其包括將PPD與編碼抗原 的核酸混合。
在進一步的實施方案中，所述方法還提供了將疫苗組合物摻入可藥用載體。
可藥用載體優(yōu)選是等滲的、低滲的或輕微高滲的，并且具有相對低的 離子強度，如蔗糖溶液。此外，這種載體可以含有任何溶劑，或者水性或 部分水性液體，如無致熱原的無菌水。此外，調(diào)節(jié)和緩沖藥物組合物的pH 以滿足體內(nèi)使用的要求。藥物組合物也可以包括可藥用稀釋劑、佐劑或賦 形劑以及增溶、穩(wěn)定和防腐劑。對于注射施用，優(yōu)選水性、非水性或等滲 溶液中的制劑。它可以以單次劑量或者多劑量以液體或干燥(粉劑、凍干 物等等)形式提供，所述干燥形式可以在使用時用合適的稀釋劑重構(gòu)。
當(dāng)編碼抗原的核^列是質(zhì)粒來源時，可藥用載體優(yōu)選是可用于基因 槍施用的顆粒。例如，所述載體可以是金珠。
本發(fā)明還提供了通過施用疫苗組合物、根據(jù)本發(fā)明的藥盒或藥物組合 物治療患有腫瘤或易患腫瘤的患者的方法。待治療的腫瘤可以是乳腺癌； 肺癌，包括小細(xì)胞肺癌；或者前列腺癌、胃癌和其他胃腸癌。
本發(fā)明還提供了通過施用如本文所述的疫苗組合物、藥盒或藥物組合 物治療患有或易患感染性疾病的患者的方法。如本文所用的術(shù)語"感染性疾 病"包括但不限于感染性生物引起的任何疾病。感染性生物可以包括病毒 (例如，單鏈RNA病毒、單鏈DNA病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、甲 型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、和丙型肝炎病毒、單純皰滲病毒(HSV)、 巨細(xì)胞病毒(CMV) 、 EB病毒(EBV)、人乳頭瘤病毒(HPV))、寄生蟲(例如，原生動物和后生動物病原體，如癡原蟲屬的種、利什曼原蟲屬的 種、血吸蟲屬的種、錐蟲屬的種)、細(xì)菌(例如，分枝桿菌，尤其結(jié)核分 枝桿菌、沙門氏菌屬、鏈球菌屬、大腸桿菌、葡萄3求菌屬)、真菌(例如，
假絲酵母屬的種、曲霉屬的種)、卡氏肺嚢蟲(Pneumocystis carinii)和
朊病毒。
本發(fā)明還提供了通過施用如本文所述的疫苗組合物、藥盒或藥物組合 物治療患有或易患變態(tài)反應(yīng)的患者的方法。
本發(fā)明還提供了增強哺乳動物對抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括 對哺乳動物施用下面的組分(i) PPD， (ii)編碼抗原的核酸序列。在一個實 施方案中，該方法包括同時施用任意兩種組分(i)和(ii)。備選地，該方法 包括順序施用組分(i)和(ii)。
如本文所用，術(shù)語"順序"指所述組分在一個時間范圍內(nèi)相繼施用于受 試者。從而，順序施用可以允許一種組分在另一種組分施用后的5分鐘內(nèi)、 IO分鐘或幾個小時內(nèi)施用。
本發(fā)明還提供了在哺乳動物中產(chǎn)生對疾病狀態(tài)的免疫應(yīng)答的方法，包
哺乳動物施用PPD以引起免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還提供了增加哺乳動物對抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括對該哺 乳動物施用編碼所述抗原的核酸序列并進一步對該哺乳動物施用PPD。
本發(fā)明還提供了 PPD用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于增強抗原 啟動的免疫應(yīng)答，其中由于對哺乳動物施用編碼該抗原的核^列而引起 所述抗原被束達。
本發(fā)明還提供了 PPD用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于相伴或順 序施用于哺乳動物以增強對核酸序列編碼的抗原的免疫應(yīng)答，其中所述核 酸序列被配制到單獨的藥物中。
通過技術(shù)人員已知的任何方法可以完成施用本發(fā)明的疫苗組合物、藥 盒或者藥物組合物。優(yōu)選的施用途徑包括但不限于皮內(nèi)、皮下、經(jīng)口、腸 胃外、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、舌下、氣管內(nèi)、吸入、眼、陰道和直腸施用途徑。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，皮下或皮內(nèi)遞送本發(fā)明的疫苗組合物、藥盒或者藥物
組合物。根據(jù)本發(fā)明的甚至更優(yōu)選的實施方案，在相同部位施用PPD和編 碼抗原的核酸。
施用可以以單次劑量發(fā)生或者在一定時間間隔后重復(fù)一次或幾次的 劑量發(fā)生。希望以每周的間隔施用所述疫苗組合物、藥盒或藥物組合物1 到10次。
PPD的施用劑量可以改變，但是可以為0.1 UI到50 UI，有利地1 UI 到10 UI，甚至更有利地約5 UI。
編碼抗原的核酸序列的施用劑量也可以改變，并且可以按照多種參 數(shù)，尤其施用方式、使用的組合物、宿主生物的年齡、健康和體重、癥狀 的性質(zhì)和程度、當(dāng)前治療的類型、治療頻率，和/或?qū)︻A(yù)防或治療的需要而 進行調(diào)整。從業(yè)醫(yī)生根據(jù)相關(guān)環(huán)境可以對確定治療的合適劑量必需的計算 進行常規(guī)的進一步改進。對于一般教導(dǎo)，含有MVA的組合物的合適劑量 為約104到101G pfu (噬菌斑形成單位)，希望從約105到108 pfu改變， 而含有腺病毒的組合物從105到10"iu(感染單位)，希望從約107到1012 iu改變?；谳d體質(zhì)粒的組合物可以以10 |iig到20 mg,有利地100 pg到 2 mg的劑量施用。優(yōu)選地，以包含5 105 pfu到5 107 pfu的MVA牛痘載 體的劑量施用組合物。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的用途或方法用于治療癌癥時，本發(fā)明的方法或用途可 以與一種或多種常規(guī)治療方式(例如，放射、化學(xué)療法和/或手術(shù))結(jié)合進 行。多種治療方法的使用為患者提供了基礎(chǔ)更廣泛的干預(yù)。在一個實施方 案中，本發(fā)明的方法可以在外科手術(shù)之前或之后。在另一實施方案中，它 可以在放射療法(例如，y放射)之前或之后。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易 地制定合適的放射療法方案和可使用的參數(shù)(見例如，Perez和Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 2nd Ed. JB Lippincott Co;使用合適的改變和修改將是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的)。
20本發(fā)明還涉及改善癌癥患者治療的方法，其中所述癌癥患者正經(jīng)歷用 化學(xué)治療劑的化學(xué)治療性治療，所述方法包括與上述公開的方法一起共同 治療所述患者。
本發(fā)明還涉及提高細(xì)胞毒性藥物或放射療法的細(xì)胞毒性有效性的方 法，其包括與上述討論的方法一起共同治療需要此類治療的患者。
當(dāng)本發(fā)明的用途或方法用于治療感染性疾病時，本發(fā)明的用途或方法 可以與另一治療化合物如抗生素、抗真菌化合物和/或抗病毒化合物的用途 一起進行。
本發(fā)明還涉及提高抗生物、抗病毒或抗真菌藥物的治療功效的方法， 其包括與上述公幵的方法一起共同治療需要此類治療的患者。
在另一實施方案中，根據(jù)引發(fā)加強治療方式進行本發(fā)明的方法或用 途，所述方式包括順序施用一種或多種引發(fā)組合物和一種或多種加強組合 物。通常，引發(fā)和加強組合物使用不同的載體，其包含或編碼至少一個共 同的抗原結(jié)構(gòu)域。引發(fā)組合物最初被施用于宿主生物并且加強組合物在一 天到十二個月的時間后隨后被施用于相同的宿主生物。本發(fā)明的方法可以 包括一到十次順序施用引發(fā)組合物，接著一到十次順序施用加強組合物。 希望注射間隔為一周到六個月。此外，可以通過相同或不同的施用途徑在 相同部位或備選部位施用引發(fā)和加強組合物。
下面的實施例意在闡明本發(fā)明的多個方面并且因此在特征上不是限 定性的。
將所有上面引用的專利、出版物和數(shù)據(jù)庫條目的公開特別地以相同程 度完整引入本文作為參考，就好像每個專利、出版物或條目被特別和單獨 指出被引入作為參考一樣。


圖1描繪了注射表達HPV16的E6和E7蛋白的TC1肺瘤細(xì)胞后無 腫瘤小鼠的百分?jǐn)?shù)。注射TC1細(xì)胞后，用表達E6/E7抗原的MVA載體以 及PPD、活的BCG或者左旋咪唑接種小鼠三次(以每周的間隔)。僅注 射空的MVA和編碼E6/E7抗原的MVA被用作對照。圖2描繪了用編碼E6/E7抗原的MVA栽體與皮下注射左旋咪唑、活 的BCG或PPD免疫小鼠后，對E6/E7表位特異的T細(xì)胞的數(shù)目。
圖3描繪了用編碼E6/E7抗原的MVA載體與皮下注射左旋咪唑、活 的BCG或PPD免疫小鼠后，對E7肽(R9F)特異的CD8+ T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
實施例
測試物品
a.每種載體構(gòu)建的命名和簡述
病毒命名批次濃度 (pfu/ml)E6tm/E7 tm promhlL畫2 prom轉(zhuǎn)基因
MVA賜4.5xl09 pfu/ml■
MVATG80423.1 xl09 pfu/mlP7.5PH5RE6/E7; hlL畫2
b.保存條件
病毒從分子免疫學(xué)部門(Molecular Immunology Department)接受
然后在-80。C保存直到注射當(dāng)天。病毒懸浮液在臨稀釋和施用前立即快速 解凍。
2.動物模型
a.物種/林系/供應(yīng)商 SPF健康雌性C57B1/6小鼠從Charles River (Les Oncins，法國)得到。
說明動物在到達時為6周齡。在實驗開始時，它們?yōu)?周齡。 環(huán)境將動物圏在單個專用房屋中，用空調(diào)提供每小時最小11次換
氣。溫度和相對濕度范圍分別為在20。C到24。C內(nèi)和40到70%。自動控制
光照以得到12小時光照和12小時黑暗的循環(huán)。
通過警哨動物的規(guī)則控制檢查無特定病原體的狀態(tài)。
飲食在整個研究中，動物無限制地獲得消毒的RM1型飲食(Dietex
France, Saint Gratien)。通過并瓦子無限制地提供無菌水。
223. 細(xì)力包描述
a.細(xì)胞特征/使用條件 TC1腫瘤細(xì)胞這些細(xì)胞得自C57B16小鼠肺，已經(jīng)用如下2種逆轉(zhuǎn) 錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)表達來自HPV16的E6和E7的LXSN16E6E7和表達ras基 因的pVEJB。這些由TC Wu博士(The Johns Hopkins University, Baltimore, USA)友情贈送。將這些細(xì)胞培養(yǎng)在含有0.5 mg/ml G418和0.2 mg/ml潮霉素的DMEM中。通過胰蛋白酶處理除去貼壁細(xì)胞并且在洗滌 3次后，用2.105TC1活細(xì)胞皮下進行肺瘤攻擊。
4. 方案
a.免疫方案
對于免疫治療實驗，在Dl用2.105個TCI細(xì)胞在右側(cè)腹皮下攻擊15 只C57B16雌性小鼠。在D8、 15和22用5.106 pfu的痘病毒(表達HPV16 的E6/E7蛋白質(zhì)的MVA毒林)在三個遠距離的部位皮下治療小鼠三次。 每次免疫前在注射部位對小鼠的被剃毛的皮膚(約10 cm"皮下注射0.5 UI 的tubertest、 5 106 cfu的BCG或0.5%的左旋咪唑。在80天內(nèi)用卡尺每 周兩次監(jiān)測肺瘤生長。當(dāng)它們的腫瘤大小超過25mm直徑或者即使胂瘤較 小，但當(dāng)它們顯示出疼痛時由于倫理原因?qū)π∈髮嵤┌矘匪馈?br> 對于免疫原性研究，在D1、 8和15用5.1(fpfu的痘病毒(MVA毒 林)在三個遠距離部位皮下接種3只C57B16雌性小鼠。用該劑量優(yōu)化對 HPV特異抗原的細(xì)胞免疫的檢測。在每次免疫前在小鼠的剃毛的皮膚(約 10 cm2)皮下注射0.5 UI tubertest、 5 106 cfu BCG或0.5%左旋咪喳。在 D22除去脾臟和血清用于免疫學(xué)分析。
1.通過Elispot測量分泌IFNy的細(xì)胞的數(shù)目/頻率
用Lympholite純化緩沖液制備新鮮脾臟細(xì)胞。所有肽都由Neosystem 以免疫級水平合成(10mg)。將每種肽以10 mg/ml溶解在DMSO中并在 4。C保存。將96孔硝酸纖維素平板用溶于碳酸鈉緩沖液中的3照/ml單克隆 大鼠抗小鼠IFNy抗體(克隆R4畫6A2; Pharmingen， cat. nr551216， Lot M072862 ; 100jd/孔)包被。將平板在4。C過夜溫育或者在37。C溫育1小時。用DMEM 10% FCS洗滌平板3次并用lOOjil DMEM 10% FCS/孔在37。C 飽和2小時。以106個細(xì)胞/100^11的濃度平板接種脾細(xì)胞。以6U/50inl/孔 (R&D Systems)lO ng/ml)的濃度向所有孔中加入白介素2。伴刀豆球蛋白A 用作陽性對照(5ing/ml)。 HPV特異性肽以5照/ml的濃度使用。將平板在 37。C， 5% C02下溫育48小時。將平板用PBS IX洗滌一次并用PBS-Tween 0.05%洗滌五次。生物素化的抗小鼠IFNy (克隆XMG1.2, Pharmingen)以 0.3照/100nl/孔的濃度加入并在室溫緩慢攪拌下溫育2小時。用PBS-Tween 0.05%洗滌平板5次。向孔中也加入用PBS-Tween0.05o/o-FCSlo/。以1/5000 稀釋的Extravidin AKP (Sigma, St. Louis， MO) (100|^1/孔)。將平板在室溫 溫育45分鐘然后用PBS-Tween 0.05%洗滌5次。用Biorad試劑盒揭示 IFNy分泌。每孔加入IOOjliI底物(NBT+BCIP)并將平板在室溫放置!/2小 時。用水洗滌平板并在室溫下過夜干燥。用解剖顯孩i鏡計數(shù)斑點。
2.測試的肽的列表 SCVYCKKEL (E6; Db): S9L肽 RCIICQRPL (E6; Db): R9L肽 SEYRHYQYS (E6; Kb) : S9S肽 ECVYCKQQL (E6; Db): E9L肽 TDLHCYEQL (E7; Kb) : T9L肽 RAHYNIVTF (E7; Db) : R9F肽 無關(guān)的肽(Flu特異性)
3. R9F四聚體特異性CD8+ T細(xì)胞頻率的測量 收獲并用BD特定篩(Cell Strainer)制備新鮮的脾細(xì)胞。在5天內(nèi)用 R9F肽(5 ng/ml)在24孔板中刺激脾細(xì)胞或?qū)⑵⒓?xì)胞直接用于特異性標(biāo)記。 在4。C下30分鐘內(nèi)用1^1 APC偶聯(lián)的小鼠CD8特異性抗體(BD Pharmingen 553035;克隆53-6.7; lot n。 32567)和10|iil R9F特異性 H-2Db 四聚體 (Beckman Coulter T20071 ; H國2Db/PE; 肽RAHYNIVTF; lot C507117 ; C602110)染色1.106個細(xì)胞。然后用 PBS/0.5% PFA洗滌細(xì)胞。
4.結(jié)果
用如方案章節(jié)中所述的TC1皮下模型進行治療實驗。我們已經(jīng)觀察到通過 皮下施用0.5UI PPD 5%的預(yù)處理在實驗結(jié)束時在無肺瘤小鼠中顯著增加 MVATG8042的治療功效45%到65% (見圖1)。使用Kaplan-Meier存 活曲線的Log Rank應(yīng)用(Statistica 5.1軟件，Statsoft Inc.)評估不同組之 間的體內(nèi)存活實驗的統(tǒng)計學(xué)差異。認(rèn)為P幼.05是統(tǒng)計學(xué)顯著的。已知有效 增加常規(guī)疫苗的以前描述的佐劑(即，左旋咪唑，活的BCG)不能增加核 酸疫苗MVATG8042的治療功效。
也平行地進行免疫原性研究以尋找針對E6和E7 HPV抗原的細(xì)胞應(yīng)答的 誘導(dǎo)。如方案章節(jié)所述的接種小鼠。
在第一組實驗(見圖2 )中，使用ELISPOT測定法計算分泌E6或E7特 異性IFNy的細(xì)胞的數(shù)目。E6和E7H-2Db限制的肽也用于監(jiān)測免疫后的 CD8 T細(xì)胞應(yīng)答。我們已經(jīng)觀察到皮下施用PPD的預(yù)處理顯著增加了所得
以相同方式，也在用E7特異性免疫顯性表位R9F進行體外刺激之前或之 后通過流式細(xì)胞術(shù)分析測量CD8+/R9F Tetramer十T細(xì)胞數(shù)目(圖3 )。 從而表明R9F免疫顯性表位的識別明顯被CD8特異性T細(xì)胞介導(dǎo)。該群 體在脾臟中相對較低并且流式細(xì)胞術(shù)分析需要用該肽進行體外刺激。用 PPD的預(yù)處理增加了針對該具體表位的特異性CD8 T細(xì)胞的數(shù)目，其中用 左旋咪唑和活的BCG的預(yù)處理不能夠達到這樣的目的(觀察到的差異不 是統(tǒng)計學(xué)顯著的)。
權(quán)利要求
1.包含(i)PPD和(ii)編碼抗原的核酸序列的疫苗組合物。
2. 藥盒，其包含(i) 編碼抗原的核酸序列；和(ii) PPD。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的疫苗組合物或藥盒，其中所述PPD是選自 tubertest和tubersol的組分。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1到3之一的疫苗組合物或藥盒，其中所述抗原是 腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1到3之一的疫苗組合物或藥盒，其中所述抗原是 微生物抗原。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗組合物或藥盒，其中所述微生物抗原是病 毒、細(xì)菌、寄生蟲或真菌的抗原。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1到6之一的疫苗組合物或藥盒，其中所述抗原是 感染性生物的抗原。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗組合物或藥盒，其中所述抗原選自HPV的 E6早期編碼區(qū)、HPV的E7早期編碼區(qū)和其部分或組合。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1到4之一的疫苗組合物或藥盒，其中所述抗原是 變應(yīng)原。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1到9之一的疫苗組合物或藥盒，其中所述核酸序 列包含在載體中。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的疫苗組合物或藥盒，其中所述栽體是質(zhì)?；?病毒來源的載體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的疫苗組合物或藥盒，其中所述載體來自痘病 毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰滲病毒、曱病毒、泡沫病毒或腺病毒伴隨病毒。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的疫苗組合物或藥盒,其中所述載體來自MVA。
14. 根據(jù)權(quán)利要求10到13之一的疫苗組合物或藥盒，其中所述載體 還包含抗原表達必需的元件。
15. 根據(jù)權(quán)利要求2到14之一的藥盒，其中所述組分用于基本上同 時施用。
16. 根據(jù)權(quán)利要求2到14之一的藥盒，其中所述組分在單一可藥用 制劑中。
17. 藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1到16之一的疫苗組合物或 藥盒和可藥用載體。
18. 生產(chǎn)疫苗組合物的方法，其包括將PPD與編碼抗原的核酸序列混合。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其還包括在可藥用載體中摻入疫苗組 合物的步驟。
20. 治療患有或易患腫瘤的患者的方法，其包括施用根據(jù)權(quán)利要求1 到16之一的疫苗組合物或藥盒或根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物。
21. 治療患有或易患感染性疾病的患者的方法，其包括施用根據(jù)權(quán)利 要求1到16之一的疫苗組合物或藥盒或根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物。
22. 治療患有或易患變態(tài)反應(yīng)的患者的方法，其包括施用根據(jù)權(quán)利要 求9的疫苗組合物、藥盒或藥物組合物。
23. 增加哺乳動物對抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對該哺乳 動物施用(i)PPD， (ii)編碼抗原的核酸序列。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中同時施用所述PPD和所述核酸。
25. 在哺乳動物中引起對疾病狀態(tài)的免疫應(yīng)答的方法，其包括對該哺 乳動物施用編碼抗原的核酸序列并進一步對該哺乳動物施用PPD以引起 免疫應(yīng)答。
26. 增加哺乳動物對抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括對所述哺乳 動物施用編碼所述抗原的核酸序列并進一步對所述哺乳動物施用PPD的 步驟。
27. 改善正經(jīng)歷用化學(xué)治療劑進行化學(xué)治療性治療的癌癥患者的治 療的方法，其包括與根據(jù)權(quán)利要求20的方法一起共同治療所述患者。
28. 提高細(xì)胞毒性藥物或放射性療法的細(xì)胞毒性有效性的方法，其包括與根據(jù)權(quán)利要求20的方法一起共同治療需要此類治療的患者。
29. PPD在生產(chǎn)增強免疫應(yīng)答的藥物中的用途，其中所述免疫應(yīng)答是 、，，_…—_ _______編媽的，
全文摘要
本發(fā)明提供了用于核酸疫苗的新的佐劑，本發(fā)明具體提供了核酸疫苗，其包含PPD或者與PPD結(jié)合施用。本發(fā)明還提供了提高核酸疫苗的治療功效的方法。
文檔編號A61K39/39GK101495140SQ200780022220
公開日2009年7月29日 申請日期2007年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月20日
發(fā)明者J-M·利馬譜, J-Y·博納富瓦, S·保羅 申請人:特朗斯吉有限公司