專利名稱：：結(jié)膜組織系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明公開涉及組織系統(tǒng)、產(chǎn)生組織系統(tǒng)的方法和使用包含結(jié)膜細(xì)胞的組織系統(tǒng)恢復(fù)受損或患病的眼表面的治療方法。本發(fā)明公開的組織系統(tǒng)包括哺乳動(dòng)物結(jié)膜細(xì)胞，優(yōu)選地是來(lái)源于結(jié)膜的穹窿區(qū)域的祖結(jié)膜細(xì)胞(progenitorconjunctivalcell)。本發(fā)明特別涉及在受控的培養(yǎng)條件下在合適的支持材料例如羊膜上培養(yǎng)祖結(jié)膜細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：干細(xì)胞負(fù)責(zé)生物體一生中的細(xì)胞替代和組織再生。干細(xì)胞是產(chǎn)生特化細(xì)胞的非特化細(xì)胞，并且具有廣泛的增殖潛能。取決于干細(xì)胞的類型，這些細(xì)胞可以分化成多種細(xì)胞譜系(celllineage)和/或在移植中重構(gòu)組織。胚胎干(ES)細(xì)胞是具有無(wú)限自我更新和多能性的典型干細(xì)胞，來(lái)自囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。成體干細(xì)胞是特化的未分化干細(xì)胞，在出生后的成體階段保持在生物體內(nèi)替換細(xì)胞和再生細(xì)胞的能力。通常認(rèn)為，與ES細(xì)胞相比，成體干細(xì)胞的自我更新能力較低，盡管它們可以分化成多種細(xì)胞譜系，但不是通常所說(shuō)的多能性。細(xì)胞治療有可能用于治療與細(xì)胞功能失?；驌p傷相關(guān)的任何疾病，其包括但不局限于操作干細(xì)胞(無(wú)論是ES細(xì)胞或者成體干細(xì)胞)的潛能以修復(fù)或者替代患病的或者受損的組織。這種潛能極大地振奮了科學(xué)、醫(yī)療和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。已經(jīng)在成體的多種組織中發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞(也稱為"組織特異干細(xì)胞")，包括骨髓(Weissman,Science287:1442-1446,2000)、神經(jīng)組織(Gage，Science287:1433-1438,2000)、胃腸組織(Potten,PhilTransRSocLond.B.353:821-830，1998)、表皮組織(Watt,PhilTransRSocLond.B,353:831，1997)、肝臟組織(AlisonandSarraf，JHepatol.29:678-683，1998)以及間充組織(Pittengeretal.,Science284:143-147，1999)。在哺乳動(dòng)物眼睛的角鞏膜緣中發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞是維持健康眼表面所必需的，并且其參與健康眼和角膜表面的動(dòng)態(tài)平衡。眼睛的表面由角膜、結(jié)膜和兩者之間的邊緣構(gòu)成，該邊緣稱為角鞏膜連接或膜緣。視覺表面具有兩個(gè)基本的上皮表面，即角膜上皮和結(jié)膜上皮。結(jié)膜是從粘膜皮膚連接延伸的2-3層的上皮，開始于眼瞼內(nèi)表面的睫毛，覆蓋于眼睛周圍而終止于膜緣。己經(jīng)發(fā)現(xiàn)連續(xù)替換結(jié)膜上皮的干細(xì)胞位于結(jié)膜穹窿中。Weietal.,InvestOphthalmolVisSci.34:1814-28,1993。己知位于鞏膜和眼瞼之間的穹窿連接處的結(jié)膜的最上端和最下端區(qū)域的干細(xì)胞是結(jié)膜干細(xì)胞或祖結(jié)膜細(xì)胞。結(jié)膜的一個(gè)主要功能是通過產(chǎn)粘蛋白的杯狀細(xì)胞所產(chǎn)生的淚液提供眼表面的水化和潤(rùn)滑，所述產(chǎn)粘蛋白杯狀細(xì)胞是高度特化的上皮細(xì)胞，其散布在結(jié)膜上皮細(xì)胞之間。粘蛋白是主要由結(jié)膜中的杯狀細(xì)胞分泌的高度糖基化的蛋白質(zhì)。由杯狀細(xì)胞分泌的眼粘蛋白的水平影響結(jié)膜表面的完整性。產(chǎn)生粘蛋白是結(jié)膜細(xì)胞的主要特性。多層的成層結(jié)膜上皮和散布的杯狀細(xì)胞的連續(xù)再生，維持了眼表面的功能完整性(Kessing,SV，ActaOphthalmol44:439-453，1996;Lemp,etal.,ArchOphthalmol.83:89-94,1970)。在堿灼傷(alkalibums)、化學(xué)和熱灼傷(chemicalandthermalbums)、斯-約綜合征(Stevens-Johnsonsyndrome,SJS)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性角膜炎(neurotrophickeratitis)和眼瘢痕性類天皰瘡(OcularCicatricialPemphigoid,OCP)中檢測(cè)到粘蛋白的缺損(deficiency)。參見GilbardandRossi,Ophthalmol.97:308-312,1990;Lemp，IntOphthalmolClin.13:185-189,1973;Tsengetal"Ophthalmol.91:545-552,1984。結(jié)膜也提供了光滑濕潤(rùn)的細(xì)胞表面以支持角膜表面上的淚膜，該淚膜轉(zhuǎn)而產(chǎn)生了光學(xué)澄清的視覺表面和清晰的視野。因此，結(jié)膜維持角膜上皮的健康。因?yàn)榻悄ど掀ぞS持清晰的視野依賴于健康的結(jié)膜上皮，因此許多眼表面疾病都伴隨結(jié)膜損傷開始，然后繼發(fā)次生膜緣角膜損傷。成層的上皮是自我更新的組織，處于持續(xù)的重構(gòu)，是終末分化的表層細(xì)胞的連續(xù)損失所必需的，并由基底細(xì)胞增生所平衡。因此，為了維持健康的上皮結(jié)構(gòu)，必須始終維持細(xì)胞增生和分化之間的關(guān)鍵性平衡。組織培養(yǎng)技術(shù)己經(jīng)被廣泛應(yīng)用于成層的上皮(如表皮和角膜)以開始鑒定那些在角化細(xì)胞增殖和成熟期間十分重要的因子。該領(lǐng)域中的研究者們使用培養(yǎng)的兔和牛結(jié)膜上皮細(xì)胞，并且開發(fā)出幾種用于正常人結(jié)膜角化細(xì)胞培養(yǎng)的模型。使用含培養(yǎng)基的血清(有時(shí)還含成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層)，已在來(lái)自尸體眼睛的長(zhǎng)期培養(yǎng)物中繁殖出初級(jí)人結(jié)膜角化細(xì)胞。(LindbergK,BrownME，ChavesHV,KenyonKR,Rhei證aldJG.Invitropropagationofhumanocularsurfaceepithelialcellsfortransplantation.InvestOpthalmolVisSci.1993;34:2672-2679.TsaiRJ，HoYS,ChenJK.Theeffectsoffibroblastsonthegrowthanddifferentiationofhumanbulbarconjunctivalepithelialcellsinaninvitroconjunctivalequivalent.InvestOpthalmolVisSci.1994;35:2865-2875)。在眼損傷的臨床實(shí)踐中，通過將球結(jié)膜和穹窿結(jié)膜劃分成象限并確定有關(guān)的區(qū)域來(lái)確定結(jié)膜損害。球結(jié)膜和穹窿結(jié)膜的損傷被認(rèn)為對(duì)眼損傷或眼疾病后的最終結(jié)果很重要。Arguesoetal.，InvestOphthalmolVisSci.43:1004-1011，2002;Dimetal.,BrJOphthalmol.845:1379-1383,2001;Pfister,Ophalmology90:1246-53,1983。例如在4、5和6級(jí)眼灼傷中，其中存活的角膜和結(jié)膜上皮薄到完全為零，理想的眼處理是通過接連重建角膜和結(jié)膜上皮兩者來(lái)嘗試可恢復(fù)的、重建式的干預(yù)(參見Dua,BrJOphthalmol.82:1407-11，1998)。在Nakamuraetal.,InvestOphthamolVisSci44(1):106-116,2003中，通過將培養(yǎng)的緣干細(xì)胞轉(zhuǎn)移到具有良好預(yù)后的人羊膜(humanamnioticmembrane,HAM)上來(lái)試圖重構(gòu)角膜環(huán)境(mileu)。也參見Shimazakietal.,Ophthalmology109(7):1285-1290，2003;Tsengetal.，ArchOphthalmol.116:431-41，1998;Koizumietal.，Ophthalmology108(9):1569-1574,2001。文獻(xiàn)中也有報(bào)道關(guān)于結(jié)膜自體移植和在HAM中培養(yǎng)球和穹窿區(qū)域的祖細(xì)胞(參見Grueteterichetal.，SurvOphthalmol.48(6):631-46,2003;Weietal.,InvestOphthalmolVisSci34:1814-1828,1993)。對(duì)于結(jié)膜組織的替代物(conjunctivaltissueequivalents),美國(guó)專利號(hào)7,049,139公開了使用3種不同的培養(yǎng)基以多步驟程序(multiple-stepprocess)在HAM上培養(yǎng)結(jié)膜細(xì)胞，來(lái)產(chǎn)生結(jié)膜組織的替代物。用于產(chǎn)生該組織替代物的3個(gè)不同的步驟包括在初級(jí)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)膜細(xì)胞。所公開的3種培養(yǎng)基類型中的2種包括霍亂毒素作為培養(yǎng)基的成分之一。作為有效的致癌物，霍亂毒素能引起對(duì)眼睛的刺激。多步驟程序用以增強(qiáng)該組織替代物用于臨床移植的穩(wěn)定性。研究了移植體在移植到幾個(gè)具有不同結(jié)膜表面病癥的患者之后，在無(wú)血清條件下培養(yǎng)HAM上的結(jié)膜組織替代物的功效。研究了上皮形成和移植體的完整性。Tanetal.，Transplantation77(11):1729-1734,2004。也可參見Angetal.,(2004)InvestOphthalmolVisSci45(6):1789-1795。該專利描述了3個(gè)步驟，即培養(yǎng)、增殖和分化，并且每一步使用了不同的培養(yǎng)基。用于分化的培養(yǎng)基包括高濃度鈣和霍亂毒素。多數(shù)對(duì)組織替代物或組織系統(tǒng)的研究集中在重構(gòu)產(chǎn)生原組織的結(jié)構(gòu)和功能特性的組織替代物的能力。其已通過分化培養(yǎng)細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)，例如通過改良培養(yǎng)條件和氣升(air-lifting)。終末分化的細(xì)胞具有有限的長(zhǎng)期增殖能力，然而其在移植后產(chǎn)生更低的再生潛能。另外，使用上皮組織結(jié)構(gòu)體用于眼表面移植需要細(xì)胞充分粘附到下層基質(zhì)(substrate)上，使得這些細(xì)胞在外科移植期間或之后不被直接的機(jī)械或剪切力所蛻去。因此，需要一種精細(xì)的平衡以保護(hù)移植細(xì)胞的增殖潛能，而同時(shí)確保移植細(xì)胞具有組織器官的必要功能性特征。理想的組織結(jié)構(gòu)體是其轉(zhuǎn)移的細(xì)胞具有用于細(xì)胞更新和組織替換的長(zhǎng)期再生能力的組織結(jié)構(gòu)體。盡管可通過常規(guī)方法來(lái)移植已開發(fā)的組織替代物，例如將移植體縫合到眼睛上，但這會(huì)引起受者的不適。而且，縫合需要比縫合少的方法有更高的精確度，因?yàn)榛疾』蚴軗p眼睛的位點(diǎn)不是清晰可視的。另外，此類移植經(jīng)常在位點(diǎn)留下疤痕。因此，少量縫合的移植相對(duì)傳統(tǒng)方法是優(yōu)選的，需要其他技術(shù)或者能夠粘附到移植位點(diǎn)而不需要縫合的基于細(xì)胞的膜遞送系統(tǒng)。PfisterandSommers,Cornea24(5):593-598,2005,發(fā)現(xiàn)血纖蛋白粘合劑單獨(dú)可將角膜干細(xì)胞移植體黏附于膜緣壁上。對(duì)于更合適的結(jié)膜組織替代物的需求，本發(fā)明所公開的內(nèi)容描述了具有長(zhǎng)期再生能力的組織系統(tǒng)，用于眼表面受損或患病組織的細(xì)胞更新和替換。本發(fā)明所公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)的具體優(yōu)點(diǎn)是其包括比較簡(jiǎn)便的培養(yǎng)方案，其中其使用了單一培養(yǎng)基用于培養(yǎng)、擴(kuò)展和分化，并且其避免使用毒素，例如霍亂毒素和高濃度鈣。培養(yǎng)單一階段的細(xì)胞是容易的，并且可在人臨床試驗(yàn)前，在CGMP設(shè)備中將污染問題最小化，并且也可通過使用少量縫合方法而引入到眼表面。發(fā)明概述本發(fā)明描述了包括結(jié)膜細(xì)胞的組織系統(tǒng)以及用于制備這種結(jié)膜組織系統(tǒng)的方法，所述結(jié)膜細(xì)胞培養(yǎng)在合適的支持材料上，例如生物相容性膜或者胞外基質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述結(jié)膜細(xì)胞培養(yǎng)在羊膜上，例如人羊膜(HAM)，以產(chǎn)生所述結(jié)膜組織系統(tǒng)。優(yōu)選地，本文所公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)是眼表面上的結(jié)膜組織的替代物。令人吃驚的是，通過在單一培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)膜活組織而制備的本文所公開的結(jié)膜組織是十分穩(wěn)定的、成層的、粘附的，其可用于臨床移植。優(yōu)選地，所述穩(wěn)定的結(jié)膜組織系統(tǒng)在被引入到受者的眼睛后不太可能破裂分離，從而提高了該方法的臨床成功程度，并且減少了受者的恢復(fù)時(shí)間。制備結(jié)膜組織系統(tǒng)的方法包括單一培養(yǎng)基以培養(yǎng)結(jié)膜細(xì)胞，從而提供產(chǎn)生所需結(jié)膜組織系統(tǒng)的簡(jiǎn)便體系。在優(yōu)選實(shí)施方案中，單一步驟培養(yǎng)基能夠產(chǎn)生包含結(jié)膜細(xì)胞的多層組織系統(tǒng)。優(yōu)選地，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)具有成層的鱗狀上皮，其包括多層結(jié)膜細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)包括多層結(jié)膜細(xì)胞，由一個(gè)或多個(gè)在每一層的相鄰細(xì)胞之間形成的細(xì)胞橋粒所連接。所述結(jié)膜組織系統(tǒng)也可包含頂端微絨毛、細(xì)胞間連接和/或正常的細(xì)胞骨架。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，利用簡(jiǎn)便的培養(yǎng)方案，通過在支持材料(例如HAM)上，用載玻片培養(yǎng)結(jié)膜細(xì)胞，來(lái)產(chǎn)生所述結(jié)膜組織系統(tǒng)。如在本文中使用的，結(jié)膜細(xì)胞可以是祖結(jié)膜細(xì)胞、分化的結(jié)膜細(xì)胞或者這兩種細(xì)胞類型的任何組合。在某些實(shí)施方案中，所述組織系統(tǒng)包含祖結(jié)膜細(xì)胞，其中在組織系統(tǒng)中，至少約20-卯％的細(xì)胞是祖結(jié)膜細(xì)胞。優(yōu)選地，所述組織系統(tǒng)包含最多約20%的終末分化的細(xì)胞。在本發(fā)明所公開內(nèi)容的其他實(shí)施方案中，將所述結(jié)膜組織系統(tǒng)移植到眼表面的損傷或患病的位點(diǎn)，例如結(jié)膜，以治療和/或恢復(fù)該位點(diǎn)處的結(jié)膜表面。在某些實(shí)施方案中，被移植的細(xì)胞從移植位點(diǎn)遷移到受者的細(xì)胞表面，這有助于眼表面的治療和恢復(fù)。在其他實(shí)施方案中，使用結(jié)膜組織替代物的治療解決了潛在的疾病和/或維持了結(jié)膜的上皮形成，同時(shí)沒有顯著的并發(fā)癥。優(yōu)選地，根據(jù)需要維持所述結(jié)膜組織系統(tǒng)的完整性，并且在手術(shù)后保留完好的上皮形成。首選的臨床結(jié)果是被治療的眼睛有良好的功能性和美容性結(jié)果。在各種實(shí)施方案中，在所述組織系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)膜細(xì)胞表達(dá)一種或多種干細(xì)胞標(biāo)記基因，例如Oct-4。優(yōu)選地，在所述結(jié)膜組織系統(tǒng)中，約30-35%的細(xì)胞是Oct-4陽(yáng)性的。在其他實(shí)施方案中，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)包括對(duì)于細(xì)胞角蛋白標(biāo)記例如是AE1、AE3、細(xì)胞角蛋白-4(K4)、細(xì)胞角蛋白-7(K7)和細(xì)胞角蛋白-19(K19)是陽(yáng)性的結(jié)膜細(xì)胞。角蛋白是由上皮細(xì)胞表達(dá)的中間絲胞質(zhì)蛋白質(zhì)家族。細(xì)胞角蛋白AE-1和AE-3是上皮細(xì)胞的特征性中間絲蛋白質(zhì)的標(biāo)記。細(xì)胞角蛋白K4是非角化的、成層上皮的標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)包含對(duì)于粘蛋白標(biāo)記例如MUC5AC和MUC4是陽(yáng)性的結(jié)膜細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，在所述組織系統(tǒng)中的細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞特異的標(biāo)記，例如P63。使用一種或多種上述標(biāo)記，本發(fā)明所公開的內(nèi)容也提供了組織系統(tǒng)中結(jié)膜細(xì)胞的分子和細(xì)胞特性。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)膜系統(tǒng)組織中約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%的細(xì)胞表達(dá)AE1、AE3、K4、K7禾口/或K19。優(yōu)選地，本發(fā)明所公開內(nèi)容中的結(jié)膜組織系統(tǒng)也包含杯狀細(xì)胞。在所公開組織系統(tǒng)中的杯狀細(xì)胞密度可以是約2.5士1.1個(gè)杯狀細(xì)胞/100個(gè)細(xì)胞。在本發(fā)明公開內(nèi)容的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組織系統(tǒng)包含存活的祖結(jié)膜細(xì)胞，例如在所述組織系統(tǒng)中約2-2.5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。取決于受者的需求，可以增加或者減少組織系統(tǒng)中祖結(jié)膜細(xì)胞的數(shù)目。根據(jù)患者的需求，細(xì)胞密度范圍在lxl06、1.5xl06和2xlO、2.5xl()S個(gè)細(xì)胞每培養(yǎng)物之間變化。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開的內(nèi)容提供了包括用于遞送結(jié)膜細(xì)胞的支持材料的組織系統(tǒng)。所述支持材料也可包括合適的生物相容性膜，例如羊膜(如HAM)。本發(fā)明公開的組織系統(tǒng)優(yōu)選地包括在生物相容性膜上培養(yǎng)結(jié)膜細(xì)胞，所述生物相容性膜適用于眼睛，并且不干擾正常的創(chuàng)傷愈合過程。盡管使用本領(lǐng)域中熟知的方法可將本文公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)移植到眼睛的合適位點(diǎn)，但本發(fā)明所公開的內(nèi)容也描述了用于將組織系統(tǒng)遞送到受試者眼睛的非縫合方法。在本發(fā)明公開的內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)"受試者"、"患者"和"受者"可交換使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所公開的內(nèi)容提供了用于將結(jié)膜組織系統(tǒng)遞送到受試者眼睛的眼表面的非縫合遞送方法。在某些實(shí)施方案中，所述組織系統(tǒng)使用組織粘合劑或者生物相容性膠用于將本發(fā)明公開的組織系統(tǒng)粘合到受者的眼睛上。在一些實(shí)施方案中，生物相容性膠包括Amcrylate或血纖蛋白密封膠。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物相容性膠是無(wú)菌的組織粘合劑，其選自聚乳酸、聚乳酸乙醇酸(polylacticglycolicacid)、聚乳酸和丙烯酸酯的共聚物，以及它們的任何組合。在其他實(shí)施方案中，生物相容性膠包括對(duì)受試者的眼睛是生物相容性的任何粘合劑。生物相容性膠使用是干凈、輕便的，并且比縫合更安全，因此可以將培養(yǎng)的結(jié)膜移植體以對(duì)受者眼睛最小干擾的方式置于受傷處，同時(shí)保持至少一部分移植細(xì)胞的完整性。以下附圖構(gòu)成本發(fā)明的部分，并且并入本文以證實(shí)和表明本發(fā)明公開的重要方面。通過以下附圖結(jié)合本文中具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述能夠更好地理解本發(fā)明。圖l:在HAM上的結(jié)膜細(xì)胞培養(yǎng)物的表征。圖1A顯示了長(zhǎng)出HAM的結(jié)膜細(xì)胞的3天期培養(yǎng)物。圖1B顯示了HAM上的細(xì)胞的14天期匯合培養(yǎng)物。圖1C顯示了在培養(yǎng)物切片上用細(xì)胞角蛋白AE-1進(jìn)行的免疫熒光染色。圖ID顯示了在培養(yǎng)物切片上用細(xì)胞角蛋白AE-3進(jìn)行的免疫熒光染色。圖IE顯示了20天期培養(yǎng)物整體裝片的PAS染色。PAS將杯狀細(xì)胞染成洋紅色。圖2:MUC5AC和MUC4在結(jié)膜組織系統(tǒng)和結(jié)膜活檢中的表達(dá)。分別用MUC5AC(103bp)(第3、7泳道)和MUC4(102bp)(第4、8泳道)標(biāo)記對(duì)結(jié)膜培養(yǎng)的細(xì)胞和結(jié)膜活檢進(jìn)行RT-PCR分析。泳道1是1Kb的DNA長(zhǎng)度標(biāo)記；泳道2和6分別是培養(yǎng)的結(jié)膜細(xì)胞和結(jié)膜活檢的GAPDH(管家基因)。泳道5是反應(yīng)混合物中無(wú)cDNA添加的陰性對(duì)照。圖3:化學(xué)損傷產(chǎn)生和移植的兔模型，顯示受損、移植和愈合。圖3A顯示了兔的正常眼睛。圖3B顯示了置于兔的結(jié)膜上的飽和的NaOH濾紙。圖3C顯示了就在移植前的損傷位點(diǎn)。圖3D和3E顯示了移植后的位點(diǎn)。圖3F顯示了產(chǎn)生并損傷的對(duì)照眼睛，顯示了受傷的蹤跡。圖3G顯示了愈合的損傷處。圖4:評(píng)估移植對(duì)損傷的作用，并檢測(cè)體內(nèi)保留的和存活的人細(xì)胞。圖4A顯示了用PAS染色的正常兔結(jié)膜切片(以檢測(cè)杯狀細(xì)胞)。杯狀細(xì)胞染為洋紅色。圖4B顯示了損傷位點(diǎn)，其顯示沒有杯狀細(xì)胞并且上皮蛻去。圖4C顯示了當(dāng)僅將HAM移植到眼睛上時(shí)，沒有眼睛上皮的創(chuàng)傷愈合。圖4D顯示了只有損傷處但沒有移植體的眼睛的創(chuàng)傷愈合。圖4E顯示了在移植了具有經(jīng)培養(yǎng)的結(jié)膜細(xì)胞的組織系統(tǒng)后，損傷位點(diǎn)的蘇木精和伊紅(H&E)染色。圖4F顯示在移植位點(diǎn)移植的人和兔細(xì)胞的PAS染色。圖4G和4H顯示在移植位點(diǎn)檢測(cè)到的抗人線粒體抗體陽(yáng)性的褐色人細(xì)胞。圖41表示遷移至兔結(jié)膜上皮下區(qū)域的人細(xì)胞。發(fā)明詳述本發(fā)明所公開的內(nèi)容針對(duì)治療由受損或者疾病造成的結(jié)膜上皮破壞的新型方法，該方法通過使用包含結(jié)膜細(xì)胞的組織系統(tǒng)來(lái)治療，所述結(jié)膜細(xì)胞是祖結(jié)膜細(xì)胞、分化的結(jié)膜細(xì)胞或其組合。優(yōu)選地，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)也包括杯狀細(xì)胞，其特征在于形狀為橢球形并且包含含有粘蛋白的大分泌顆粒。本發(fā)明所公開的內(nèi)容特別描述了結(jié)膜組織系統(tǒng)的分離、擴(kuò)展和產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)恢復(fù)受者結(jié)膜組織系統(tǒng)的功能完整性。優(yōu)選地，本文所公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)是使用簡(jiǎn)便的單一步驟方法，從包含結(jié)膜細(xì)胞(例如活檢或外植體)的組織中培養(yǎng)的，其中離體擴(kuò)展所述細(xì)胞以形成結(jié)膜組織替代物。令人驚奇的是，該方法能夠產(chǎn)生具有臨床移植體所需穩(wěn)定性的組織培養(yǎng)物。例如，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)包含細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)(cell-to-substmte)的粘合結(jié)構(gòu)，其保證了在手術(shù)操作和移植后的結(jié)構(gòu)完整性。所述單一步驟方法優(yōu)選使用能夠支持細(xì)胞在結(jié)膜活檢或外植體中長(zhǎng)出、結(jié)膜細(xì)胞(包括祖結(jié)膜細(xì)胞)的擴(kuò)展以及可用于治療患病或受損結(jié)膜的組織系統(tǒng)的形成的培養(yǎng)基。在某些實(shí)施方案中，所述單一步驟方法也支持組織系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞的適當(dāng)水平的終末分化。另外，本發(fā)明公開描述了使用組織粘合劑或生物相容性膠將結(jié)膜組織系統(tǒng)遞送至患者眼表面的新型方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)用于治療性處理具有眼受損或疾病特別是結(jié)膜的眼表面損害的受試者。對(duì)眼睛的受損可以是由受傷或外傷所造成的。如在本文中所用的，"結(jié)膜組織系統(tǒng)"是包含在合適支持材料上的結(jié)膜細(xì)胞的細(xì)胞群，優(yōu)選適用于移植至哺乳動(dòng)物受試者。優(yōu)選地，本文所公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)是眼表面結(jié)膜組織的替代物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組織系統(tǒng)是具有細(xì)胞的多層集合體的移植體，例如手術(shù)移植體或合成移植體。術(shù)語(yǔ)"移植體"、"移植的"、"經(jīng)移植的"或"移植"在本文中與術(shù)語(yǔ)"植入體"、"植入的"、"經(jīng)植入的"、"植入"、"嫁接"、"經(jīng)嫁接的"或"嫁接的"可交換使用。盡管結(jié)膜細(xì)胞，無(wú)論是祖細(xì)胞還是分化的細(xì)胞，可從任何合適的哺乳動(dòng)物中獲得，但人組織是特別優(yōu)選的來(lái)源。本文所公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)可用于治療具有結(jié)膜受損或疾病的受試者，例如通過恢復(fù)眼表面的水化和潤(rùn)滑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)恢復(fù)受傷或患病位點(diǎn)處產(chǎn)生粘蛋白的杯狀細(xì)胞，從而通過流淚改善潤(rùn)滑。優(yōu)選地，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)可在受試者中發(fā)揮作用從而恢復(fù)光滑而濕潤(rùn)的細(xì)胞表面，以支持角膜表面的淚液膜，從而改善視力。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)能夠恢復(fù)支持角膜上皮的健康結(jié)膜。因此，本文所公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)不僅能夠用于治療受損或患病的結(jié)膜上皮，也能夠預(yù)防繼發(fā)的角膜和膜緣受損，從而有力地預(yù)防繼發(fā)性膜緣干細(xì)胞缺損(deficiency)。使用本文所公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)的治療優(yōu)選產(chǎn)生很小或者沒有新血管形成、慢性炎癥、復(fù)發(fā)性上皮缺損或間質(zhì)結(jié)疤。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)能夠用于治療堿灼傷、化學(xué)和熱灼傷、斯-約綜合征(SJS)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)角膜炎、眼瘢痕性類天皰瘡(OCP)、眼睛外科手術(shù)例如翼狀息肉切除(pterygiumexcision)、青光眼手術(shù)(例如小梁切除術(shù)(trabeculectomysurgery)和切割術(shù)(sectionsurgery))、視網(wǎng)膜脫落(retinaldetachment)和斜視手術(shù)(squintsurgery)之后的結(jié)膜重建、結(jié)膜痣(conjunctivalnevus)、永久性泄漏小梁皰疹(persistentleakingtrabeculectomyblebs)、前膜緣角膜結(jié)膜炎(superiorlimbickeratoconjunctivitis),以及其他結(jié)膜受損的眼表面病況或受傷。所述結(jié)膜組織系統(tǒng)也用于治療粘蛋白缺損的位點(diǎn)。在特定的實(shí)施方案中，本文所公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)用于質(zhì)粒眼表面病況的治療性應(yīng)用可與第二種治療性處理相結(jié)合，以治療角膜受損和/或膜緣干細(xì)胞缺損，例如在U.S.No11/043,019所公開的內(nèi)容，其通過引用將其全文并入本文。通過改變時(shí)間周期，如日、星期、月或年，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)的治療性應(yīng)用可先于膜緣干細(xì)胞缺損的任何治療性處理。"結(jié)膜祖細(xì)胞"、"祖結(jié)膜細(xì)胞"和"結(jié)膜干細(xì)胞"在本文中可交換使用，并且是眼結(jié)膜的祖細(xì)胞和干細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)膜祖細(xì)胞的定位和分布是在小鼠和兔的結(jié)膜穹隆區(qū)域(Dieboldetal.,GraefesArchClinExpOpthalmol235:268-276，1997;Pellegrinietal.,JCellBiol145(4):769-782,1999)。這些祖細(xì)胞似乎主要發(fā)現(xiàn)于鞏膜和眼瞼之間的彎曲連接處的結(jié)膜的最頂端和最低端區(qū)域。也認(rèn)為散布于結(jié)膜表面上結(jié)膜上皮細(xì)胞之間的生產(chǎn)粘蛋白的杯狀細(xì)胞也來(lái)自于結(jié)膜祖細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)膜組織系統(tǒng)包含祖結(jié)膜細(xì)胞，其中在所述組織系統(tǒng)中至少約20%-90%的細(xì)胞是祖結(jié)膜細(xì)胞。優(yōu)選地，所述祖結(jié)膜細(xì)胞包含至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的組織系統(tǒng)中的細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，結(jié)膜組織系統(tǒng)包括不多于約20%的終末分化的細(xì)胞。優(yōu)選地，結(jié)膜組織系統(tǒng)包含最多約50%、40%、30%、20%、15%、10%或5%的終末分化的細(xì)胞，其包括但不限于分化了的結(jié)膜細(xì)胞。在各種實(shí)施方案中，在組織系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)膜細(xì)胞表達(dá)一種或多種干細(xì)胞標(biāo)記基因，例如Oct-4、p63、連接蛋白43(Connexin43)。優(yōu)選地，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)包含約10-20%、20-30%、30-35%、40-45%或45-50%的Oct-4陽(yáng)性細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，組織系統(tǒng)中的結(jié)膜細(xì)胞是角蛋白標(biāo)記(如AE1、AE3、K4、K7和K19)陽(yáng)性細(xì)胞和粘蛋白標(biāo)記(如MUC5AC和MUC4)陽(yáng)性細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，結(jié)膜組織系統(tǒng)中約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%的細(xì)胞是AE1陽(yáng)性細(xì)胞、AE3陽(yáng)性細(xì)胞、K4陽(yáng)性細(xì)胞、K7陽(yáng)性細(xì)胞、K19陽(yáng)性細(xì)胞、MUC5AC陽(yáng)性細(xì)胞、和/或MUC4陽(yáng)性細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)膜組織細(xì)胞包含約75-80%的P63陽(yáng)性細(xì)胞，以及約30-35y。的Oct-4陽(yáng)性細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，組織系統(tǒng)中的細(xì)胞表達(dá)一種或多種細(xì)胞特異的標(biāo)記，例如P63、oct-4、連接蛋白43、ABCG2(BudakMT,AlpdoganOS,ZhouM,LavkerRM,AkindMA,WolosinJM.OcularsurfaceepitheliacontainABCG2-dependentsidepopulationcellsexhibitingfeaturesassociatedwithstemcells.JCellSci.2005Apr15;118(Pt8):1715-24)。優(yōu)選地，結(jié)膜組織系統(tǒng)包含約40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-650/。、65-70%、75-80%、80-85%、85-90%或90-95%的P63陽(yáng)性細(xì)胞。P63和Oct-4是祖結(jié)膜細(xì)胞的標(biāo)記，這些標(biāo)記在培養(yǎng)的細(xì)胞中出現(xiàn)表明是祖細(xì)胞和分化細(xì)胞的混合群體，其在優(yōu)選的范圍內(nèi)，在組織系統(tǒng)中產(chǎn)生不多于約20%的終末分化的細(xì)胞。在本發(fā)明公開的優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)膜組織系統(tǒng)包含杯狀細(xì)胞。杯狀細(xì)胞在所公開的組織系統(tǒng)中的密度是每100個(gè)細(xì)胞有約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5個(gè)杯狀細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，組織系統(tǒng)包含約0.5%、1%、2%、3%、4°/。、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%或更多的杯狀細(xì)胞。在本發(fā)明公開的優(yōu)選實(shí)施方案中，組織系統(tǒng)包含存活的祖結(jié)膜細(xì)胞，例如在組織系統(tǒng)中約2.0-2.5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的范圍內(nèi)。在其他實(shí)施方案中，組織系統(tǒng)中祖結(jié)膜細(xì)胞的范圍是約0.5-1.0百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞、1.0-1.5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞、1.5-2.0百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞、2.5-3.0百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或者3.0-3.5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。在組織細(xì)胞中存在的祖細(xì)胞結(jié)膜細(xì)胞的數(shù)量依賴于受者的需求而升高或者降低。優(yōu)選地，組織系統(tǒng)包含約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80°/。、85%、90%或95%的存活的祖結(jié)膜細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，結(jié)膜組織系統(tǒng)包含約1-5%、5-10%、10-15%、15-20%、20-25%、25-30%、30-35%、35-40%、40-45%、45-50%或50-55%的&4陽(yáng)性細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，結(jié)膜組織系統(tǒng)包含約1陽(yáng)5%、5-10%、10-15%、15-20%、20-25%、25-30%、30-35%、35-40%、40-45%、45-50%或50-55%的K7陽(yáng)性細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)包含約1-5%、5-10%、10-15%、15-20%、20-25%、25-30%、30-35%、35-40%、40-45%、45-50%或50-55%的〖19陽(yáng)性細(xì)胞。優(yōu)選地，結(jié)膜組織系統(tǒng)不包含或者只包含低百分比的表達(dá)角蛋白K12的細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，本文所公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)是透明的并且在其表面沒有角質(zhì)紋狀體(comifiedstriatum)。優(yōu)選地，結(jié)膜組織系統(tǒng)如果包含表達(dá)細(xì)胞角蛋白K3的細(xì)胞，也是少量包含，細(xì)胞角蛋白K3是角膜特異的細(xì)胞角蛋白(Schermeretal.,JCellBiol103:49-62,1986)。在所述組織系統(tǒng)中存在大量或者高百分比的結(jié)膜組細(xì)胞明顯有助于所述組織系統(tǒng)在移植至哺乳動(dòng)物受試者之后恢復(fù)受損或患病眼表面的能力。另外，組織系統(tǒng)中高比例的結(jié)膜祖細(xì)胞通過用存活的結(jié)膜袓細(xì)胞連續(xù)重構(gòu)眼表面使得該系統(tǒng)在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)是穩(wěn)定的，所述存活的結(jié)膜袓細(xì)胞對(duì)于眼表面的健康機(jī)能是必須的。在某些實(shí)施方案中，組織系統(tǒng)是包含胞外基質(zhì)例如羊膜(例如HAM)的復(fù)合移植體，其具有大量的結(jié)膜祖細(xì)胞和終末分化細(xì)胞，其中在胞外基質(zhì)上離體培養(yǎng)大量的結(jié)膜祖細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述組織系統(tǒng)包含生物相容性多聚體上的結(jié)膜細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，使所述結(jié)膜細(xì)胞在能夠支持上皮組織的人工基質(zhì)上生長(zhǎng)。優(yōu)選地，所述基質(zhì)用于支持結(jié)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)和所述組織系統(tǒng)的形成，促進(jìn)組織成層。在某些實(shí)施方案中，所述基質(zhì)也支持終末分化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生膜組織系統(tǒng)的結(jié)膜細(xì)胞供體也可以是組織系統(tǒng)移植體的受者(即，自體組織系統(tǒng))。可選地，所述結(jié)膜組織活檢供體可以不是結(jié)膜組織系統(tǒng)的受者(即異源組織系統(tǒng))。在異源組織系統(tǒng)中，優(yōu)選的供體是生物相容性供體，例如是受者的近親，或者所述活檢也可來(lái)自生物相容性(例如組織相容性)尸體(即，同種異源組織系統(tǒng))。為了避免組織排斥的問題，通常需要移植的細(xì)胞或組織與移植體的受者是遺傳上相同的。為了產(chǎn)生本文所公開的組織系統(tǒng)，首先必須收集或分離包含結(jié)膜細(xì)胞的活檢，可選地，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法分離結(jié)膜細(xì)胞。用于產(chǎn)生組織系統(tǒng)的結(jié)膜組織分離自任何合適的哺乳動(dòng)物，其中人組織是特別優(yōu)選的來(lái)源。例如，結(jié)膜組織分離自人眼的穹窿區(qū)域，例如穹窿結(jié)膜。優(yōu)選地，從這種分離的組織中培養(yǎng)結(jié)膜祖細(xì)胞。根據(jù)本文所公開的方法產(chǎn)生的組織系統(tǒng)適用于移植至受者，特別是1只或兩只眼睛中具有粘蛋白缺損或者其他受傷或疾病的受者。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，受者和供體是同一個(gè)。使用結(jié)膜組織作為產(chǎn)生本文所公開的組織系統(tǒng)的來(lái)源的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是從供體獲得結(jié)膜組織是相對(duì)容易的。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是活檢的獲取會(huì)對(duì)造成任何后續(xù)角膜或膜緣受損的風(fēng)險(xiǎn)最小。該過程只需要少量的手術(shù)，并且是安全、簡(jiǎn)便而有效的，并且只需要少量的結(jié)膜組織活檢。在無(wú)菌和經(jīng)局部麻醉?xiàng)l件下進(jìn)行該過程。優(yōu)選地，所述活檢分離自高至結(jié)膜上穹或低至結(jié)膜下穹。這些位置提供了最大密度的祖結(jié)膜細(xì)胞。從例如進(jìn)行鼻翼狀息肉(Girolamoetal.,BrOphthalmol.83:1077-1082,1999)或白內(nèi)障的常規(guī)手術(shù)的患者獲得人結(jié)膜活檢樣品。為獲得活檢，從距離膜緣10-15mm處的前球體區(qū)域摘取小塊正常結(jié)膜(例如lx3mm大小)。也可得到另一個(gè)相似體積的活檢以提供另外的、備選的結(jié)膜細(xì)胞來(lái)源。例如在移植至所述組織系統(tǒng)之前的2周或2周以上，收集結(jié)膜活檢以產(chǎn)生所述結(jié)膜組織系統(tǒng)。分離活檢之后，將下面的基質(zhì)切除，然后將活檢置于轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中，送到制備組織系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室。從供體除去包含結(jié)膜細(xì)胞的組織后，必須將其轉(zhuǎn)移到例如設(shè)備中，使得所述活檢能夠經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生本文所公開的組織系統(tǒng)。重要的是在轉(zhuǎn)移期間保持足夠比例的活檢存活，從而能從其中得到組織系統(tǒng)。經(jīng)設(shè)計(jì)用于維持細(xì)胞生存力的轉(zhuǎn)移裝置的實(shí)例公開于美國(guó)申請(qǐng)11/385,017中，通過引用將其并入本文。優(yōu)選地，將所述活檢轉(zhuǎn)移或保存在支持該活檢生存力的培養(yǎng)基中。應(yīng)當(dāng)在收集后盡快處理所述結(jié)膜組織活檢。所述活檢可以以完整的外植體來(lái)培養(yǎng)，或者在置于培養(yǎng)基之前切成幾個(gè)小片或小塊。在優(yōu)選實(shí)施方案中，合適的支持材料有助于所述組織活檢中的結(jié)膜細(xì)胞的結(jié)合，從而有助于所述結(jié)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將活檢從轉(zhuǎn)移容器中移取后，置于PBS中。使用精制的鑷子和解剖刀，將所述結(jié)膜活檢切成多個(gè)小片(例如外植體)，例如大小為0.5mm。隨后將外植體置于支持材料上進(jìn)行培養(yǎng)，并小心地浸入培養(yǎng)基中。當(dāng)用羊膜例如HAM作為支持材料時(shí)，將外植體置于羊膜的基膜這一面。隨后定期更換培養(yǎng)基，小心不要移出外植體。使來(lái)自所述外植體的細(xì)胞生長(zhǎng)，直到在支持材料上匯合，這通常是在培養(yǎng)幾天之后。在產(chǎn)生組織系統(tǒng)的上述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，將結(jié)膜組織培養(yǎng)于支持結(jié)膜細(xì)胞優(yōu)選結(jié)膜祖細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將分離的結(jié)膜細(xì)胞在單一培養(yǎng)基中培養(yǎng)、擴(kuò)展并分化，從而避免了復(fù)雜的培養(yǎng)基成分和涉及培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移的步驟。優(yōu)選地，培養(yǎng)基使用非致癌、非刺激性成分。培養(yǎng)基優(yōu)選維持所述活檢中結(jié)膜細(xì)胞的生存力和增殖，以及祖結(jié)膜細(xì)胞的分化能力。培養(yǎng)基也優(yōu)選支持結(jié)膜細(xì)胞例如祖結(jié)膜細(xì)胞的優(yōu)先生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基也可包含促進(jìn)細(xì)胞分化以表達(dá)上皮細(xì)胞表型的因子。本文所公開的、用于制備結(jié)膜組織系統(tǒng)的培養(yǎng)方法避免使用任何飼養(yǎng)細(xì)胞或飼養(yǎng)層。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過用于培養(yǎng)、擴(kuò)展和分化結(jié)膜細(xì)胞的單一培養(yǎng)基來(lái)獲得本發(fā)明公開的組織系統(tǒng)。本文公開的、用于產(chǎn)生所述結(jié)膜組織系統(tǒng)的程序優(yōu)選產(chǎn)生適宜移植的組織系統(tǒng)形式的大量結(jié)膜細(xì)胞。所述結(jié)構(gòu)有序的結(jié)膜組織替代物通常包含多層排列的結(jié)膜細(xì)胞，優(yōu)選具有散布在所述結(jié)膜細(xì)胞中的杯狀細(xì)胞?？墒褂萌魏伪绢I(lǐng)域技術(shù)人員己知的適宜基礎(chǔ)培養(yǎng)基來(lái)生成培養(yǎng)所述結(jié)膜組織系統(tǒng)的培養(yǎng)基。用于培養(yǎng)所述結(jié)膜組織的優(yōu)選培養(yǎng)基是達(dá)爾伯克改良必需培養(yǎng)基(Dulbecco，sModifiedEssentialMedium,DMEM)、DMEM:F-12(1:1)培養(yǎng)基或者Ham'sF-12(l:1)培養(yǎng)基(Ham'sF-12(l:l)medium),優(yōu)選地補(bǔ)充了營(yíng)養(yǎng)血清，例如提供有效維持細(xì)胞生長(zhǎng)和生存力的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的血清或基于血清的溶液(例如敲除血清(knock-outserum)、熱滅活人血清、人臍帶血血清、人血清白蛋白)。培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)血清的優(yōu)選百分比是約0.5%-25%，更優(yōu)選約15%-20%。也可向培養(yǎng)基中補(bǔ)充生長(zhǎng)因子。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"生長(zhǎng)因子"是指與細(xì)胞表面的受體結(jié)合其主要結(jié)果是活化細(xì)胞增殖和分化的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，用于在任何階段培養(yǎng)所述結(jié)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)試劑是人來(lái)源的或人重組來(lái)源的。用于培養(yǎng)結(jié)膜組織的優(yōu)選生長(zhǎng)因子選自表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowthfactor,EGF)(例如，人EGF、重組人EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)、胰島素、亞硒酸鈉或人運(yùn)鐵蛋白，及其組合。各種生長(zhǎng)因子的優(yōu)選濃度如下(l)約5-15ng/mlEGF，更優(yōu)選約10ng/mlEGF，(2)約2-10ng/mlbFGF，更優(yōu)選約4ng/mlbFGF，(3)約1-10嗎/ml胰島素，更優(yōu)選約5pg/ml胰島素，(4)約1-10pg/ml運(yùn)鐵蛋白，更優(yōu)選約5!ig/ml運(yùn)鐵蛋白，(5)約1-10pg/ml亞硒酸鈉，更優(yōu)選約5(ig/ml亞硒酸鈉，以及(6)約1-10pg/ml氫化可的松，更優(yōu)選約0.5pg/ml氫化可的松。優(yōu)選地，培養(yǎng)基還包含抗生素，例如青霉素、鏈霉素或其組合。對(duì)于在所述培養(yǎng)基中所用的抗生素，抗生素或多種抗生素的混合物優(yōu)選地包含約40-60IU/ml的青霉素、約40-60fig/ml的鏈霉素、約40-60(ig/ml的慶大霉素、和/或約40-60ng/ml的兩性霉素B。在某些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含50U/ml的青霉素_鏈霉素。在其他實(shí)施方案中，組織系統(tǒng)使用不包括致癌物質(zhì)的培養(yǎng)基成分，例如霍亂毒素等等，其可導(dǎo)致眼睛刺激。在某些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基可包含DMEM或DMEM:F-12，還添加有營(yíng)養(yǎng)血清，例如胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)、人血清白蛋白或人臍帶血血清。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基添加有一種或多種可溶解因子，例如0.1%二甲基亞砜(dimethylsulphoxide，DMSO)、10ng/ml重組人表皮生長(zhǎng)因子(rhEGF)、5pg/ml胰島素、5嗎/ml亞硒酸鈉、5(ig/ml運(yùn)鐵蛋白、5嗎/ml氫化可的松、4ng/mlbFGF和一種或多種抗生素。在其他實(shí)施方案中，用于制備組織系統(tǒng)的培養(yǎng)基，包括用于轉(zhuǎn)移結(jié)膜組織活檢的培養(yǎng)基、用于培養(yǎng)活檢的培養(yǎng)基和用于轉(zhuǎn)移組織系統(tǒng)的培養(yǎng)基，不包含非人類動(dòng)物來(lái)源的任何血清或其他因子。這有助于使異種組分污染所述組織系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)最小化，從而使所述組織系統(tǒng)對(duì)人類施用更安全。在某些實(shí)施方案中，將結(jié)膜組織培養(yǎng)于合適的支持材料上，例如胞外基質(zhì)或其他生物相容性多聚物，其可具有生物涂敷的表面，例如胞外基質(zhì)載體或生物涂敷的皮氏培養(yǎng)皿(Petridishes)。優(yōu)選地，所述胞外基質(zhì)是羊膜，更優(yōu)選地是HAM。支持材料涂敷有一種或多種粘附因子，包括但不局限于纖維蛋白原、層粘連蛋白、膠原蛋白IV、腱生蛋白、纖連蛋白、膠原、牛垂體抽提物、EGF、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、氫化可的松或其任意組合。在其他實(shí)施方案中，將支持材料置于硝酸纖維素濾紙上以促進(jìn)產(chǎn)生結(jié)膜組織系統(tǒng)自身。硝酸纖維素薄膜也對(duì)所述結(jié)膜組織系統(tǒng)提供了另外的支持。當(dāng)所述支持材料是羊膜時(shí)，可將其置于基膜一面朝上的硝酸纖維素濾紙上。在使用前，將所述膜與分散酶(dispase)—起溫育，以協(xié)助除去任何羊膜上皮細(xì)胞，該上皮細(xì)胞能夠干擾隨后的結(jié)膜細(xì)胞生長(zhǎng)。優(yōu)選地，支持材料具有近似天然眼表面的特性，這些特性包括但不局限于清晰、薄、有彈性、生物相容性、無(wú)血管和/或無(wú)抗原性。另外，支持材料優(yōu)選支持結(jié)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)，無(wú)論是祖結(jié)膜細(xì)胞或分化的結(jié)膜細(xì)胞，并支持移植后的正常分化和/或整合。在其他的優(yōu)選實(shí)施方案中，支持材料在組織系統(tǒng)移植之后，將在體內(nèi)逐漸地被吸收。另外，支持材料優(yōu)選是無(wú)抗原性的。羊膜，特別是HAM，對(duì)于培養(yǎng)活檢的結(jié)膜組織和產(chǎn)生本文所公開的組織系統(tǒng)是優(yōu)選的。制備人羊膜的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參閱例如美國(guó)專利號(hào)6,152,142，和Tsengetal.,(1997)Am.J.Ophthalmol.124:765-774，通過引用將每一篇并入本文)。所述羊膜可使用完整的上皮表面，或者剝離的上皮細(xì)胞。例如，以如下方法制備羊膜以增強(qiáng)結(jié)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)，通過凍融、酶促消化和/或機(jī)械刮擦來(lái)去除內(nèi)源羊膜上皮細(xì)胞，其后用生長(zhǎng)因子、胞外基質(zhì)混合物和/或粘附增強(qiáng)分子來(lái)處理表面。羊膜是產(chǎn)生組織系統(tǒng)的優(yōu)選基質(zhì)，因?yàn)槠涫怯兄诮Y(jié)膜細(xì)胞生存力和生長(zhǎng)的天然基質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將基膜或間質(zhì)這一面向上的羊膜光滑地附著在用于培養(yǎng)結(jié)膜細(xì)胞的培養(yǎng)平板上。從能夠粘附眼睛和協(xié)助呈現(xiàn)經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞的材料中選擇生物相容性膜。在其他實(shí)施方案中，將所述結(jié)膜組織系統(tǒng)培養(yǎng)在合適的支持材料，例如組織基質(zhì)(tissuebase)上，以產(chǎn)生組織系統(tǒng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組織基質(zhì)是哺乳動(dòng)物羊膜、MatrigelTM、層粘連蛋白、膠原蛋白IV或膠原蛋白IV片層、健生蛋白、纖維蛋白原、纖連蛋白和凝血酶片層(FibrinSealant,Reliseal)或其任意組合。組織基質(zhì)也可用支持材料生物涂敷，包括但不局限于人羊膜、層粘連蛋白、膠原蛋白IV、健生蛋白、纖維蛋白原、凝血酶、纖連蛋白或其任意組合。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，組織基質(zhì)是人羊膜，更優(yōu)選是生物涂敷的人羊膜。結(jié)膜組織優(yōu)選地培養(yǎng)于使細(xì)胞擴(kuò)展而基本沒有分化的培養(yǎng)基中，例如在補(bǔ)充了營(yíng)養(yǎng)血清和/或一種或多種可溶性生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中。在一些實(shí)施方案中，將培養(yǎng)于合適的支持材料上的結(jié)膜細(xì)胞從所述支持材料上解離以分離祖結(jié)膜細(xì)胞。在其他的實(shí)施方案中，在合適的支持材料上培養(yǎng)之前或之后，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法分選結(jié)膜細(xì)胞，例如磁-親和性細(xì)胞分選(magnetic-affmitycellsorting,MACS),或熒光-激活細(xì)胞分選(fluorescence-activatedcellsorting,FACS)，或者免疫t示i己或免疫熒光染色技術(shù)(例如固相吸收)，以分離結(jié)膜祖細(xì)胞群和/或分化的結(jié)膜細(xì)胞群。在分離使用上述方法之一而富集的結(jié)膜細(xì)胞群的實(shí)施方案中，優(yōu)選在支持祖細(xì)胞生長(zhǎng)和支持用于移植到受損或患病的眼睛的組織系統(tǒng)發(fā)育的條件和培養(yǎng)基中，培養(yǎng)分離的細(xì)胞。優(yōu)選地，將包含結(jié)膜細(xì)胞的組織培養(yǎng)10-20天，更優(yōu)選12-14天以產(chǎn)生結(jié)膜組織系統(tǒng)。在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，例如在浸沒式或氣升式條件下。優(yōu)選地，在這些條件下培養(yǎng)的組織系統(tǒng)包含至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的祖結(jié)膜細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在存在用于發(fā)育具有祖結(jié)膜細(xì)胞的組織系統(tǒng)的富集培養(yǎng)基的情況下，將分離的祖結(jié)膜細(xì)胞培養(yǎng)于支持材料上。優(yōu)選地，支持材料具有與天然結(jié)膜組織相似的特性，并且也能夠支持祖結(jié)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)以及移植后的正常分化。在產(chǎn)生本文公開的組織系統(tǒng)之后，應(yīng)當(dāng)將其轉(zhuǎn)移到接受者的移植位置處。優(yōu)選地，用于轉(zhuǎn)移組織系統(tǒng)的方法維持了組織系統(tǒng)的足夠生存力，從而其在移植后仍可用作移植體。優(yōu)選地，所述組織系統(tǒng)被移植到受損或患病的眼睛中，并能夠修復(fù)眼表面損傷，特別是患有嚴(yán)重結(jié)膜受損或疾病的受試者。如在本文中使用的，患有嚴(yán)重結(jié)膜受損或疾病的受試者在受損或患病的眼睛中，完全沒有結(jié)膜祖細(xì)胞?？梢浦步Y(jié)膜組織系統(tǒng)以在任何位置替代或支持眼表面，所述位置包括與角膜鄰近的區(qū)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述結(jié)膜組織系統(tǒng)移植到服表面的鞏膜、穹窿或瞼板區(qū)域。也可將所述結(jié)膜組織系統(tǒng)與服瞼內(nèi)表面上已存在的結(jié)膜放置在一起。已經(jīng)研發(fā)出多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的手術(shù)方法來(lái)選擇、獲取并轉(zhuǎn)移眼組織替代物至其在接受者眼睛的適當(dāng)、天然解剖位置處。在移植前，可切去患病的或者受損的結(jié)膜，將自體的或異源的結(jié)膜組織系統(tǒng)置于所述結(jié)膜缺損處。在無(wú)菌條件以及局部麻醉下，進(jìn)行結(jié)膜組織系統(tǒng)的移植。其他移植體例如其他羊膜片移植體可置于所述結(jié)膜組織系統(tǒng)上，以作為保護(hù)片。在其他實(shí)施方案中，將隱形眼鏡置于所述組織系統(tǒng)上以保護(hù)移植體。將組織系統(tǒng)移植至受者眼睛的手術(shù)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(NguyenDQ,HaleJ,VonLanyH,HarradRA.Releasableconjunctivalsutureforadjustablesuturesurgery.JPediatrOphthalmolStrabismus.2007Jan-Feb;44(1):35-8.禾口BaharI，WeinbergerD，DanG,AvisarR.Pterygiumsurgery:fibringlueversusVicrylsutrresforconjunctivalclosure.Cornea.2006Dec;25(10》1168-72)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多縫合線和縫合技術(shù)可用于將移植體固定到眼表面。盡管通常是成功的，但將細(xì)薄組織縫合到眼組織導(dǎo)致有關(guān)組織與組織的接合(tissue隱to-tissueapposition)、出血、炎癥、明顯可見(visualization)的具體難題以及由于眼表面上暴露的縫合而導(dǎo)致患者的不舒服。使用合適的生物相容性產(chǎn)品而不是縫合來(lái)實(shí)現(xiàn)最佳組織接合是十分需要的。另外，縮短的手術(shù)時(shí)間轉(zhuǎn)化為低廉的設(shè)備費(fèi)用。盡管需要合適的組織系統(tǒng)協(xié)助修復(fù)眼受傷或病況，但也需要減少或替代多種眼科處理中的縫合以改善結(jié)果、使并發(fā)癥最小化、使患者舒服，并縮短處理時(shí)間。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組織系統(tǒng)至患者眼睛的少量縫合遞送(suture-lessdelivery)。該過程包括使用生物相容性粘合劑，例如膠，例如amcrylate或纖維蛋白密封劑(fibrinsealant),它們可以用作組織粘合劑。該技術(shù)可以用于將角膜以及結(jié)膜細(xì)胞遞送至受損的或患病的眼睛。本文公開的組織系統(tǒng)的少量縫合遞送也可與包含來(lái)自角膜膜緣的未分化干細(xì)胞的組織系統(tǒng)一起使用，如在美國(guó)序列號(hào)11/043,019中公開的，通過引用將其全文并入本文。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明公開提供了使用amcrylate遞送包含結(jié)膜細(xì)胞的組織系統(tǒng)。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，所述生物相容性粘合劑是無(wú)菌的組織粘合劑，其選自聚乳酸、聚乳酸乙醇酸(polylacticglycolicacid)、聚乳酸和丙烯酸的共聚物，以及它們的任何組合。在其他實(shí)施方案中，生物相容性粘合劑包含與眼睛生物相容并且比縫合更整潔、安全及方便的任意粘合劑，從而可以將培養(yǎng)的組織系統(tǒng)置于受傷處并且對(duì)接受者眼睛的擾動(dòng)最小化。優(yōu)選地，對(duì)所述組織系統(tǒng)使用粘合劑有利于移植的細(xì)胞與受損和患病眼睛的整合。本文所公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)可用于治療性應(yīng)用，例如作為需要治療的受試者的移植體。本發(fā)明公開的組織系統(tǒng)可用于治療任何需要治療的受試者，包括但不局限于人、靈長(zhǎng)類和家畜(domesticanimals)、牲畜(farmanimals)、寵物動(dòng)物(petanimals)或運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(sportsanimals),例如犬(dogs)、馬(horses)、貓(cats)、綿羊(sheep)、豬(pigs)、牛(cattle)、大鼠(rates)、小鼠(mice)等。如在本文中所用的，術(shù)語(yǔ)"治療性的"、"治療性地"、"以治療"、"處理"或"治療"是指治療性處理和預(yù)防性或防止性措施。治療性處理包括但不局限于減少或消除特定疾病、病況、受損、受傷或病癥的癥狀，或者減緩或緩解已有的疾病、病況、受損、受傷或病癥的發(fā)展，或者將其治愈。優(yōu)選地，用治療有效量的結(jié)膜組織系治療需要此種治療的受試者以恢復(fù)或再生功能。如在本文中所用的，所述結(jié)膜組織系統(tǒng)的"治療性有效量"是足以抑制或改善由結(jié)膜細(xì)胞或組織的損失、受損、功能障礙或退化而造成的受試者體內(nèi)的生理作用。所用的組織系統(tǒng)的治療有效量依賴于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種因素，例如受試者的需求、受試者的年齡、生理狀況和健康狀況、所需的治療效果、靶向治療的組織區(qū)域的大小、移植的位點(diǎn)、病理學(xué)程度、所選擇的遞送途徑和處理策略。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠利用這些因素以確定治療患者所需的、本發(fā)明公開的組織系統(tǒng)的治療有效量。組織系統(tǒng)優(yōu)選地以如下方式施用至患者，該方式使得所述組織系統(tǒng)移植至既定位點(diǎn)并重建或再生功能性缺損區(qū)域。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用載玻片，以非典型的、簡(jiǎn)便培養(yǎng)方案，在HAM上培養(yǎng)人穹隆結(jié)膜祖細(xì)胞和/或分化的細(xì)胞。針對(duì)眼結(jié)膜灼傷兔模型來(lái)表征并評(píng)估制備的組織系統(tǒng)的安全性，其中不涉及縫合。在此兔模型中跟蹤來(lái)自結(jié)膜的、存活的、功能性移植的人細(xì)胞。參閱實(shí)施例1和2。如在本文中所述的，根據(jù)移植體下面異常血管的形成和多形核白細(xì)胞(PMN)的滲透，將所述組織系統(tǒng)的安全性與對(duì)照進(jìn)行平行比較。通過移植具有從結(jié)2膜穹隆和其他區(qū)域繁殖的杯狀細(xì)胞的結(jié)膜上皮的培養(yǎng)物來(lái)治療結(jié)膜上皮的嚴(yán)重雙面破壞。Shatosetal.,IOVS44(6):2477-2486,2003;Zieske,Eye8:163-169,1994;Tsaietal"ProgRetinalEyeRes16:227-241,1997。以下實(shí)施例示例本公開的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到實(shí)施例所公開的技術(shù)在下文中描繪了發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的、在本發(fā)明實(shí)施中良好地發(fā)揮功能的技術(shù)，并從而視為構(gòu)成其實(shí)施的優(yōu)選方式。然而，在本發(fā)明公開的啟示下，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)可對(duì)己經(jīng)公開的具體實(shí)施方案做許多變化，并且仍能夠獲得相似或類似的結(jié)果，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例h結(jié)膜組織系統(tǒng)的產(chǎn)生如本實(shí)施例所公開的，從組織活檢中培養(yǎng)結(jié)膜細(xì)胞的過程是非常簡(jiǎn)便的，并且不同于已有的插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿方法(millicellmethod)。參閱Pellegrinietal.,J.CellBiol145(4):769-7821999;Belyakovetal.,ProcNatlAcad.SciUSA102(40):14203-208,2005。經(jīng)倫理委員會(huì)的許可，在每一個(gè)患者和供體事先知情同意的情況下，收集所述結(jié)膜活檢。以下規(guī)程依據(jù)赫爾辛基宣言(DeclamtionofHelsinki)的原則，并獲得RelianceLifeSciences(RLS)倫理委員會(huì)的許可。在印度Mumbar，Bandra的Zee眼科診所內(nèi)進(jìn)行眼周手術(shù)的過程中，從穹隆處手術(shù)取下約2mn^的人結(jié)膜組織。只從眼球周圍和眼瞼的內(nèi)表面上仔細(xì)地收集結(jié)膜。隨后立即將切下的組織置于由達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco，sModifiedEaglesMedium,DMEM)、5%熱滅活胎牛血清(Hyclone,USA)和50pg/ml青霉素-鏈霉素組成的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中。所述轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的PH范圍為7-7.4。將所述活檢儲(chǔ)存在4°C，直至進(jìn)行培養(yǎng)。收集來(lái)自提供所述組織活檢的同一個(gè)患者的約2-5ml血液樣品，并與各自的結(jié)膜活檢一起運(yùn)送到集中安置的cGMP設(shè)備。直接檢測(cè)血液樣品的感染性疾病，包括乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)、丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)、梅毒(Syphilis)和CMV。隨后將所述活檢置于合適的基質(zhì)中以培養(yǎng)活檢中的結(jié)膜細(xì)胞。以如下描述制備基質(zhì)人羊膜(HAM)。在供給者事先知情同意的情況下，依據(jù)赫爾辛基宣言的原則，在剖腹產(chǎn)時(shí)從血清陰性供體中獲得人胎盤。用于分離HAM的方法與Tsengetal"ArchOphthalmol.1]6:431-41，1998中描述的相似，其通過引用的方式并入本文。在分布于滅菌的硝酸纖維素膜上之后，將處理過的HAM切成5x5cm2。將切成的小片在-7(TC儲(chǔ)存于含有甘油和FBS的DMEM中，直到使用。在制備當(dāng)日和冷藏的第14天檢查儲(chǔ)存培養(yǎng)基的無(wú)菌狀況。使用前，將HAM解凍，并用0.5。/。的胰蛋白酶-EDTA溶液處理以進(jìn)行剝離，并在5x5cn^的滅菌玻璃載玻片上拉伸，所述滅菌玻璃載玻片保存在添加了足夠培養(yǎng)基的滅菌皮氏培養(yǎng)皿中。為培養(yǎng)和擴(kuò)展結(jié)膜祖細(xì)胞，首先在立體顯微鏡下，從下層間質(zhì)(幾乎完全地)分離所述結(jié)膜活檢組織的上皮。仔細(xì)地將上皮片斷切成10個(gè)小塊，用PBS禾口25U/mlPen-Strep(Gibco-BRL，USA)預(yù)溫育之后，置于剝離的、拉伸的HAM上。將包含結(jié)膜細(xì)胞的活檢小塊以同心環(huán)的形式置于HAM上，以使細(xì)胞通過接觸抑制而分層。在第0天，用750pl由以下組成的培養(yǎng)基覆蓋所述活檢組織DMEM:F12(1:1)、20%胎牛血清(hyclone，LoganUT)、0.1%DMSO(SigmaUSA)、10ng/ml人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)(SigmaUSA)、4ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)(R&DMN)、5pg/ml胰島素(SigmaUSA)，5嗎/ml運(yùn)鐵蛋白(Gibco-BRL，USA)和5pg/ml亞硒酸鈉(SigmaUSA)，0.5jig/ml氫化可的松和50U/mlPen-Strep。在第2天，向組成中添加2.5ml所述培養(yǎng)基，并其后每隔一天更換培養(yǎng)基，直至準(zhǔn)備移植。細(xì)胞生長(zhǎng)在37C和5%co2中。使用該單一培養(yǎng)基制備所述組織系統(tǒng)。令^J驚奇的是，只要結(jié)構(gòu)特征是該組織系統(tǒng)所需的，使用同一種單一步驟培養(yǎng)基增殖和分化結(jié)膜細(xì)胞的方法能夠成功地產(chǎn)生用于移植的組織系統(tǒng)。該培養(yǎng)基與單一步驟培養(yǎng)基相組合維持了增殖和分化。本發(fā)明在同一個(gè)培養(yǎng)物中獲得了增殖的和分化的細(xì)胞。胰島素、hEGF和氫化可的松在培養(yǎng)過程中都起促進(jìn)結(jié)膜上皮細(xì)胞在纖維原細(xì)胞上生長(zhǎng)的作用。培養(yǎng)14天后，羊膜整個(gè)片層上覆蓋并匯合了細(xì)胞。在培養(yǎng)結(jié)膜組織系統(tǒng)的5x5cn^片層中，一半如實(shí)施例2中描述的在結(jié)膜受傷的兔模型上用做異體移植體，將另一半切成3片。一片用來(lái)收集細(xì)胞的RNA以進(jìn)行RT-PCR，從而可以測(cè)量和評(píng)估特定標(biāo)記的表達(dá)。第二片用來(lái)在石蠟塊中切片。最后一片用做整體裝片(wholemoimt)。RNA分離和RT-PCR:通過TRlzol方法(Invitrogen,USA)分離培養(yǎng)的結(jié)膜細(xì)胞的總RNA，用RNase-OUT核糖核酸酶抑制劑(Irwitrogen，USA)處理1Jig分離的RNA以進(jìn)行cDNA合成。使用Superscript逆轉(zhuǎn)錄酶II(Invitrogen，USA)和OligodT(Invitrogen，USA)起始逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用MUC5AC和MUC4基因進(jìn)行細(xì)胞的RT-PCR以證實(shí)粘蛋白的表達(dá)。使用Abgene2xPCR反應(yīng)母液(Abgene，USA)和合適的引物(Shatosetal.，IOVS42(7):1455-1464，2001;Shatosetal.,IVOS44(6):2477-2486,2003;通過引用將每一個(gè)并入本文)，通過30個(gè)循環(huán)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增2pl的cDNA。該反應(yīng)中使用的引物序列顯示于下面表1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>結(jié)膜培養(yǎng)物整體裝片的制備在載玻片上拉伸包含經(jīng)培養(yǎng)的結(jié)膜細(xì)胞的組織系統(tǒng)小片，而不破壞該表面。去除痕量的培養(yǎng)基，室溫下在甲醛中固定樣品30分鐘。其后，完全風(fēng)干固定的培養(yǎng)物并染色。組織標(biāo)記和組織病理為確定所述組織系統(tǒng)的特征，將復(fù)合的細(xì)胞培養(yǎng)物于室溫下，在4%多聚甲醛中固定10分鐘，并脫水、石蠟包埋。制備約3pm的石蠟切片。對(duì)于免疫熒光而言，脫蠟后，對(duì)切片進(jìn)行抗原恢復(fù)的微波方法，并用lxPBS預(yù)溫育10分鐘。切片用0.2%TritonX-100處理5分鐘，并用1%BSA封閉1小時(shí)，期間用PBS洗滌15分鐘。向切片中添加一抗AE-1(1:500)和AE-3(l:500)(Chemicon，CA)，并于4。C溫育過夜。在室溫下，切片用各自的二抗溫育1小時(shí)。用封片培養(yǎng)基(SigmaUS)對(duì)切片進(jìn)行封片，并用熒光顯微鏡進(jìn)行檢查。對(duì)于高碘酸希夫(PeriodicAcidSchiff，PAS)染色，脫蠟的切片與整體裝片一起在室溫下用0.5%高碘酸處理5分鐘，用Schiff試劑處理30分鐘。用蘇木精復(fù)染。表征剝離羊膜上培養(yǎng)的結(jié)膜細(xì)胞如本文所示，經(jīng)鑒定細(xì)胞角蛋白和特定粘蛋白類型的標(biāo)記(Ohno-Matsuietal.,MolecularVision11:1-10，2005)由培養(yǎng)的角膜細(xì)胞表達(dá)。在移植之前，將結(jié)膜組織系統(tǒng)進(jìn)行體外分層。在將活檢置于HAM上后，初始培養(yǎng)物在3天期的培養(yǎng)物中顯示出初始生長(zhǎng)，并伴有從羊膜上的外植體中長(zhǎng)出的大細(xì)胞(圖1A)。培養(yǎng)14天后，HAM的整個(gè)片層上覆蓋并匯合了細(xì)胞(圖1B)。培養(yǎng)20天后，培養(yǎng)切片的免疫熒光染色證實(shí)了AE-1和AE-3的胞質(zhì)表達(dá)(圖1C和1D)。在20天結(jié)束時(shí)制備的結(jié)膜組織系統(tǒng)整體裝片的PAS染色顯示了杯狀細(xì)胞的生長(zhǎng)和分布，其在組織系統(tǒng)中不是均一的(圖1E)。檢測(cè)MUC5AC和MUC4在結(jié)膜組織系統(tǒng)中表達(dá)的互補(bǔ)RT-PCR分析證實(shí)了這兩個(gè)標(biāo)記在所述組織系統(tǒng)以及在所述結(jié)膜活檢中的表達(dá)。如在下述實(shí)施例2中所述，移植的結(jié)膜組織系統(tǒng)能夠治療結(jié)膜損傷。實(shí)施例2本實(shí)施例檢驗(yàn)了使用實(shí)施例1所述的簡(jiǎn)便培養(yǎng)方案制備的結(jié)膜組織系統(tǒng)治療兔模型受傷眼睛的能力，所述兔模型是用所述組織系統(tǒng)異種移植的眼結(jié)膜灼傷模型。使用組織粘合劑在兔模型中移植結(jié)膜組織系統(tǒng)。移植后，使用組織病理學(xué)和免疫染色跟隨和評(píng)估人細(xì)胞的存活和整合。根據(jù)移植體下異常血管形成和多形核白細(xì)胞(PMN)滲透，與對(duì)照并行檢查結(jié)膜組織系統(tǒng)的安全性。按如下制備化學(xué)損傷的兔模型。從內(nèi)部評(píng)審委員會(huì)(intemalreviewboard,IRB)、動(dòng)物倫理委員會(huì)(InstitutionalAnimalEthicsCommittee,IAEC)和控制和監(jiān)督動(dòng)物實(shí)驗(yàn)宗旨委員會(huì)(PurposeofControlandSupervisionofExperimentsonAnimals,CPCSEA)得到對(duì)于本文所描述的動(dòng)物規(guī)程的在先許可。用氯胺酮(35mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉6只新西蘭白兔(重1.5kg;年齡6個(gè)月)，應(yīng)用支座縫合(staysutures)來(lái)收縮眼瞼。圖3A顯示了兔的正常眼睛。通過在眼睛的眼球-眼瞼結(jié)膜處放置INNaOH飽和的無(wú)菌濾紙(60mm勺40秒鐘，在該位置產(chǎn)生損傷(圖3B)。移除濾紙后，使用外科手術(shù)刀去除損傷區(qū)域處的殘留上皮，用PBS大面積沖洗創(chuàng)傷位點(diǎn)。在動(dòng)物的一只眼睛上產(chǎn)生損傷。15天后在相同的區(qū)域再次實(shí)施產(chǎn)生所述損傷的方法，其后如前再進(jìn)行10天。對(duì)于異體移植實(shí)驗(yàn)，有兩種類型的對(duì)照。一種對(duì)照是眼睛受傷并跟蹤45天(11=2)的動(dòng)物。第二種對(duì)照是眼睛受傷(圖3C)，其后用其上沒有培養(yǎng)的結(jié)膜細(xì)胞的HAM覆蓋的動(dòng)物(11=2)。所述測(cè)試實(shí)驗(yàn)將本文所述的人結(jié)膜組織系統(tǒng)移植至損傷處(圖3D和3E)。受傷處用培養(yǎng)細(xì)胞向上的結(jié)膜組織系統(tǒng)20mm2小片來(lái)覆蓋，并且使用稱為Amcrylate(由ConcordDrugsLtd,AndhraPradesh在印度制造)的無(wú)菌組織粘合劑固定邊緣。這種多聚體是單體2-氰基丙烯酸異戊酯(isoamyl2-cyanoacrylate)與水汽接觸時(shí)發(fā)生聚合而產(chǎn)生，該聚合物是無(wú)毒、生物相容的惰性材料。該組織粘合劑用于將移植體粘附于裸露的結(jié)膜組織上。將4滴每滴5pl的所述組織粘合劑置于所述損傷的4個(gè)邊緣上，并按使HAM與膠接觸并且細(xì)胞向上的方式放置所述移植體。在產(chǎn)生損傷后，每個(gè)眼睛每天用地塞米松(dexamethazone)/慶大霉素溶液處理2次，共15天。手術(shù)后，將0.5%環(huán)孢菌素A和0.05%地塞米松-慶大霉素溶液作為滴眼液，在第一周每天給藥3次，其后每天給藥2次。跟蹤動(dòng)物一個(gè)月。通過受傷位點(diǎn)處的杯狀細(xì)胞的再上皮形成和再現(xiàn)，與對(duì)照動(dòng)物比較來(lái)定量移植體的功效。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死兔子，并移除具有結(jié)膜組織的整個(gè)眼球，并在10%甲醛中固定。通過心內(nèi)注射定量的硫噴妥鈉溶液處死兔子。對(duì)于組織病理學(xué)評(píng)估，常規(guī)處理來(lái)自對(duì)照和處理位點(diǎn)的結(jié)膜組織，其中5微米的薄切片用蘇木精和伊紅染色，并用顯微鏡觀察修復(fù)的程度。對(duì)于免疫組織化學(xué)，在將切片進(jìn)行抗原回收后，用含3%H202的水對(duì)其處理15分鐘。在4"C過夜溫育一抗抗人線粒體抗體(Chemicon,CA)。根據(jù)所用的VectaStainEliteABC試劑盒(VectorLaboratories,Brulingame,CA)的說(shuō)明書進(jìn)行剩余的染色過程。所使用的底物是二氨基聯(lián)苯胺(DAB)。通過光學(xué)顯微鏡(NikonE600)可視化人細(xì)胞胞質(zhì)中褐色意大利面條樣(spaghetti-like)陽(yáng)性染色。對(duì)于高碘酸Schiff染色，將脫蠟切片和整體裝片一起在室溫下用0.5%高碘酸處理5分鐘，并用Schiff試劑處理30分鐘。對(duì)所述切片用蘇木精進(jìn)行復(fù)染。損傷和移植后的臨床觀察損傷后24小時(shí)，所有的眼睛在受傷位點(diǎn)周圍顯示了輕度充血，以及損傷位點(diǎn)處的血塊。48小時(shí)之后，血塊的大小縮小了(未顯示數(shù)據(jù))，充血減少，且受傷的位點(diǎn)可劃界。移植結(jié)膜組織系統(tǒng)后，沒有觀察到過敏反應(yīng)和排斥的跡象。眼睛是平靜的，并且在其后沒有觀察到異常的血管生成。跟蹤只有損傷的眼睛，直到所述實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)日，呈現(xiàn)出2/3的最初損傷(圖3F)。在處死動(dòng)物進(jìn)行切片之前，用包含人結(jié)膜細(xì)胞的組織系統(tǒng)抑制的眼睛在表面完整性和所述位點(diǎn)處血管生成方面看上去是健康的(圖3G)。為評(píng)估結(jié)膜組織系統(tǒng)治愈兔模型中眼睛損傷的能力，將所述眼睛與正常兔結(jié)膜切片比較，所述正常兔結(jié)膜切片具有健康的杯狀細(xì)胞群，如圖4A所示。損傷后，在損傷視野內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)杯狀細(xì)胞，并且上皮是蛻去的(圖4B)。另外，來(lái)自只有損傷的對(duì)照動(dòng)物的切片顯示出破壞的上皮細(xì)胞和具有中度PMN滲透的充血血管。在對(duì)照兔子中，其中只有剝離HAM被移植到受傷位點(diǎn)，上皮沒有再生，并且在大部分區(qū)域蛻去(圖4C)。在所述位點(diǎn)處沒有杯狀細(xì)胞的痕跡，并且血管是充盈的，在許多位置觀察到溢出的RBCs。在未接受移植體的對(duì)照兔子中，也在許多位置觀察到溢出的RBCs(圖4D)。在移植前，顯示結(jié)膜組織系統(tǒng)是體外成層的。在將所述組織系統(tǒng)移植到所述兔模型之后1個(gè)月，發(fā)現(xiàn)所述細(xì)胞在應(yīng)用位點(diǎn)處是完整的，但不是連續(xù)的(圖4E和4F)。來(lái)自測(cè)試眼睛的切片，其中移植了所述的結(jié)膜組織系統(tǒng)，展現(xiàn)出散布有人和兔細(xì)胞兩者的多層上皮。杯狀細(xì)胞和散布的內(nèi)皮細(xì)胞的再現(xiàn)說(shuō)明在受傷位點(diǎn)處細(xì)胞的再生和愈合。檢測(cè)體內(nèi)殘留和存活的人細(xì)胞在以下兩者中鑒定出經(jīng)移植的人細(xì)胞原位組織系統(tǒng)的HAM上和嵌入移植了結(jié)膜組織系統(tǒng)的大鼠模型的表皮下區(qū)域(圖41)。觀察到在移植位點(diǎn)處散布的人細(xì)胞，以及在動(dòng)物組織內(nèi)的細(xì)胞遠(yuǎn)離HMA的遷移，說(shuō)明其在治愈損傷中具有重要作用?；谟每谷司€粒體一抗進(jìn)行的人線粒體棕褐色意大利面條樣染色，檢測(cè)人細(xì)胞。遷移細(xì)胞的百分比在動(dòng)物間變動(dòng)，沒有觀察到固定的遷移水平。殘留的人細(xì)胞被延長(zhǎng)，并且比動(dòng)物細(xì)胞大，而且非常明顯。使用無(wú)菌組織粘合劑Amcrylate進(jìn)行的組織系統(tǒng)的少量縫合遞送證明此方法是安全方便的。這種無(wú)菌組織粘合劑不被吸收到血液中，并且被用于替代或補(bǔ)充美容手術(shù)中的補(bǔ)充縫合以再結(jié)合靜脈和動(dòng)脈。移植之后，顯微鏡下的檢查顯示，兔結(jié)膜切片中HAM片段下沒有膠的痕跡，說(shuō)明所述膠在所述移植體的整合期間已被清洗掉。通過觀察移植后PMN滲透和任何誘導(dǎo)的異常血管形成，檢査所述移植體和組織粘合劑的安全性。從分離的組織制作的切片的組織病理學(xué)評(píng)估結(jié)果顯示于如下的表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>盡管已經(jīng)描述了本文所公開的結(jié)膜組織系統(tǒng)的基本新特性，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在未脫離本發(fā)明公開的精神的情況下，在形式和細(xì)節(jié)上的各種省略、取代和改變是可行的。例如，以基本上相同的方式執(zhí)行基本上相同的功能而實(shí)現(xiàn)相同的結(jié)果的那些元素和/或方法步驟的任何組合都明顯在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)。在本發(fā)明公開的啟示下不需要過多的實(shí)驗(yàn)，能夠制作和實(shí)施在本文中公開并要求保護(hù)的所有構(gòu)成和方法。盡管對(duì)本發(fā)明的構(gòu)成和方法以優(yōu)選實(shí)施方案的形式進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然明白，可改變本文描述的構(gòu)成和/或方法以及步驟或步驟的次序，而不脫離本發(fā)明的概念、精神和范圍。具體來(lái)說(shuō)，明顯可知化學(xué)或生理學(xué)相關(guān)的特定試劑可替代本文描述的試劑，而得到相同或相似的結(jié)果。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯可知的所有這些相似的替代和修飾都在所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。權(quán)利要求1.產(chǎn)生結(jié)膜組織系統(tǒng)的方法，其包括在支持材料上于單一培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)含有結(jié)膜祖細(xì)胞的組織細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含(a)達(dá)爾伯克改良必須培養(yǎng)基(DMEM)、DMEMF-12(1∶1)培養(yǎng)基或者Ham’sF-12(1∶1)培養(yǎng)基；(b)營(yíng)養(yǎng)血清，選自以下組成的組敲除血清、熱滅活人血清、人臍帶血血清、人血清白蛋白和胎牛血清；(c)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；(d)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)；(e)胰島素；(f)亞硒酸鈉；(g)運(yùn)鐵蛋白；以及(h)抗生素或多種抗生素的混合物，其中所述單一培養(yǎng)基支持所述結(jié)膜祖細(xì)胞在所述支持材料上的增殖和擴(kuò)展以形成結(jié)膜組織系統(tǒng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)血清是敲除血清。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)血清是熱滅活人血清。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)血清是人臍帶血血清。5.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)血清是人血清白蛋白。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)血清是胎牛血清。7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的EGF是人EGF或重組人EGF。8.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述的運(yùn)鐵蛋白是人運(yùn)鐵蛋白。9.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述的單一培養(yǎng)基還包含二甲基亞砜。10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的抗生素或多種抗生素的混合物選自以下組成的組青霉素、鏈霉素、慶大霉素、兩性霉素B、及其組合。11.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述的單一培養(yǎng)基包含(a)15%-20%營(yíng)養(yǎng)血清；0)5-15ng/mlEGF;(c)2-10ng/mlbFGF;(d)l-10嗎/ml胰島素；(e)l-10嗎/ml亞硒酸鈉；以及(f)l-10ng/ml運(yùn)鐵蛋白。12.根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其中所述的單一培養(yǎng)基包含(a)20%營(yíng)養(yǎng)血清；(b)10ng/mlEGF;(c)4ng/mlbFGF;(d)5pg/ml胰島素；(e)5(ig/ml亞硒酸鈉；以及(f)5(ig/ml運(yùn)鐵蛋白。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的單一培養(yǎng)基還包含0.1%二甲基亞砜。14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的支持材料是生物相容性膜。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的生物相容性材料是羊膜。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的羊膜是人羊膜。17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的培養(yǎng)步驟在所述羊膜的基底膜一面的表面上進(jìn)行。18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的培養(yǎng)步驟在沒有詞養(yǎng)細(xì)胞的情況下進(jìn)行。19.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述含有結(jié)膜祖細(xì)胞的組織是通過來(lái)自結(jié)膜穹窿區(qū)域的組織活檢而分離的。20.治療患者眼睛受損或患病的眼表面的方法，其包括將通過權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的結(jié)膜組織系統(tǒng)移植至所述眼表面。21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述受損或患病的眼表面產(chǎn)生自堿灼傷、化學(xué)灼傷、熱灼傷、斯-約綜合征(SJS)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性角膜炎、眼瘢痕性類天皰瘡(OCP)、翼狀息肉切除、青光眼手術(shù)、小梁切除術(shù)、切割術(shù)、視網(wǎng)膜脫落、斜視手術(shù)、結(jié)膜痣、永久性泄漏小梁皰疹或前膜緣角膜結(jié)膜炎。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中將所述結(jié)膜組織系統(tǒng)移植到角膜或角膜鄰近區(qū)域。23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中使用無(wú)菌組織粘合劑將所述移植的結(jié)膜組織系統(tǒng)粘合到所述患者的眼睛上。24.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的無(wú)菌組織粘合劑是2-氰基丙烯酸異戊酯。25.治療患者眼睛受損或患病的眼表面的方法，其包括(i)分離含有結(jié)膜祖細(xì)胞的組織活檢；(ii)在單一培養(yǎng)基中，于支持材料上培養(yǎng)所述組織，所述單一培養(yǎng)基包括:(a)達(dá)爾伯克改良必須培養(yǎng)基(DMEM)、DMEM:F-12(1:1)培養(yǎng)基或者Ham，sF-12(l:l)培養(yǎng)基；(b)營(yíng)養(yǎng)血清，其選自以下組成的組敲除血清、熱滅活人血清、人臍帶血血清、人血清白蛋白和胎牛血清；(c)表皮生長(zhǎng)因子(EGF);(d)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF);(e)胰島素；(f)亞硒酸鈉；(g)運(yùn)鐵蛋白；以及(h)抗生素或多種抗生素的混合物，其中所述單一培養(yǎng)基支持所述結(jié)膜祖細(xì)胞在所述支持材料上的增殖和擴(kuò)展以形成結(jié)膜組織系統(tǒng)；以及(iii)將所述結(jié)膜組織系統(tǒng)移植至所述患者眼睛的所述受損或患病的眼表面。26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)血清是敲除血清。27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)血清是人血清白蛋白。28.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述的EGF是人EGF或重組人EGF。29.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述的運(yùn)鐵蛋白是人運(yùn)鐵蛋白。30.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述的單一培養(yǎng)基還包含二甲基亞砜。31.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述的抗生素或多種抗生素的混合物選自由以下組成的組青霉素、鏈霉素、慶大霉素、兩性霉素B、及其組合。32.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述的單一培養(yǎng)基包含(a)15%-20%營(yíng)養(yǎng)血清；(b)5-15ng/mlEGF;(c)2-10ng/mlbFGF;(d)MO嗎/ml胰島素；(e)l-10嗎/ml亞硒酸鈉；以及(f)1-10嗎/ml運(yùn)鐵蛋白。33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，(a)20%營(yíng)養(yǎng)血清(b)10ng/mlEGF(c)4ng/mlbFGF(d)5嗎/ml胰島素；(e)5嗎/ml亞硒酸鈉；以及(f)5pg/ml運(yùn)鐵蛋白。34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，亞砜。35.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，38.根據(jù)權(quán)利要求36的方法膜一面的表面上進(jìn)行的。39.根據(jù)權(quán)利要求25的方法離的。40.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，41.根據(jù)權(quán)利要求25的方法其中所述的單一培養(yǎng)基包含:其中所述的單一培養(yǎng)基還包含0.1%二甲基其中所述的支持材料是生物相容性膜。其中所述的生物相容性材料是羊膜。其中所述的羊膜是人羊膜。其中所述的培養(yǎng)步驟是在所述羊膜的基底其中所述組織活檢是從結(jié)膜的穹窿區(qū)域分其中所述組織活檢是從所述患者分離的。其中所述受損或患病的眼表面產(chǎn)生自堿灼傷、化學(xué)灼傷、熱灼傷、斯-約綜合征(SJS)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性角膜炎、眼瘢痕性類天皰瘡(OCP)、翼狀息肉切除、青光眼手術(shù)、小梁切除術(shù)、切割術(shù)、視網(wǎng)膜脫落、斜視手術(shù)、結(jié)膜痣、永久性泄漏小梁皰疹或前膜緣角膜結(jié)膜炎。42.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中將所述結(jié)膜組織系統(tǒng)移植到角膜或角膜鄰近區(qū)域。43.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中使用無(wú)菌組織粘合劑將所述移植的結(jié)膜組織系統(tǒng)粘合到所述受損或患病的眼表面上。44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述的無(wú)菌組織粘合劑是2-氰基丙烯酸異戊酯。45.治療患者眼睛受損或患病的眼表面的方法，其包括(i)分離含有結(jié)膜祖細(xì)胞的組織活檢；(ii)在單一培養(yǎng)基中，于支持材料上培養(yǎng)所述組織，其中所述單一培養(yǎng)基支持所述結(jié)膜祖細(xì)胞在所述支持材料上的增殖和擴(kuò)展以形成結(jié)膜組織細(xì)胞，以及(iii)將所述結(jié)膜組織系統(tǒng)移植到所述患者眼睛的所述受損或患病的眼表面上，其中使用無(wú)菌組織粘合劑將所述移植的結(jié)膜組織系統(tǒng)粘合到所述受損或患病的眼表面上。46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述單一培養(yǎng)基包含(a)達(dá)爾伯克改良必須培養(yǎng)基(DMEM)、DMEM:F-12(1:1)培養(yǎng)基或者Ham，sF-12(l:l)培養(yǎng)基；(b)營(yíng)養(yǎng)血清，其選自以下組成的組敲除血清、熱滅活人血清、人臍帶血血清、人血清白蛋白和胎牛血清；(C)表皮生長(zhǎng)因子(EGF);(d)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF);(e)胰島素；(f)亞硒酸鈉；(g)運(yùn)鐵蛋白；以及(h)抗生素或多種抗生素的混合物。47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)血清是敲除血清。48.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)血清是人血清白蛋白。49.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述的單一培養(yǎng)基還包含二甲基亞砜。50.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述的單一培養(yǎng)基包含(a)15%-20%營(yíng)養(yǎng)血清；(b)5-15ng/mlEGF;(c)2-10ng/mlbFGF;(d)1-10(ig/ml胰島素；(e)l-10[ig/ml亞硒酸鈉；以及(f)1-10嗎/ml運(yùn)鐵蛋白。51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，(a)20。/。營(yíng)養(yǎng)血清；(b)10ng/mlEGF;(c)4ng/mlbFGF;(d)5pg/ml胰島素；(e)5嗎/ml亞硒酸鈉；以及(f)5pg/ml運(yùn)鐵蛋白。52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，亞砜。53.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，54.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，56.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，膜一面的表面上進(jìn)行的。57.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，離的。58.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，59.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述的單一培養(yǎng)基包含:其中所述的單一培養(yǎng)基還包含0.1%二甲基其中所述的支持材料是生物相容性膜。其中所述的生物相容性材料是羊膜。其中所述的羊膜是人羊膜。其中所述的培養(yǎng)步驟是在所述羊膜的基底其中所述組織活檢是從結(jié)膜的穹窿區(qū)域分其中所述組織活檢是從所述患者分離的。其中所述受損或患病的眼表面產(chǎn)生自堿灼傷、化學(xué)灼傷、熱灼傷、斯-約綜合征(SJS)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性角膜炎、眼瘢痕性類天皰瘡(OCP)、翼狀息肉切除、青光眼手術(shù)、小梁切除術(shù)、切割術(shù)、視網(wǎng)膜脫落、斜視手術(shù)、結(jié)膜痣、永久性泄漏小梁皰疹或前膜緣角膜結(jié)膜炎。60.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中將所述結(jié)膜組織系統(tǒng)移植到所述眼表面的角膜或角膜鄰近區(qū)域。61.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述的無(wú)菌組織粘合劑是2-氰基丙烯酸異戊酯。62.治療患者眼睛受損或患病的眼表面的方法，其包括將結(jié)膜組織系統(tǒng)移植至所述眼表面，其中使用無(wú)菌組織粘合劑將所述移植的結(jié)膜組織系統(tǒng)粘合到所述受損或患病的眼表面上。63.根據(jù)上述權(quán)利要求所述的產(chǎn)生結(jié)膜組織系統(tǒng)的方法，其基本上參照實(shí)全文摘要本發(fā)明公開描述了具有結(jié)膜細(xì)胞包括結(jié)膜干細(xì)胞的組織系統(tǒng)。所述結(jié)膜組織系統(tǒng)來(lái)自包含結(jié)膜細(xì)胞的分離組織，并且適于恢復(fù)眼表面損傷，特別是由受損或患病結(jié)膜所導(dǎo)致的損傷。所述組織系統(tǒng)是使用簡(jiǎn)便的單一培養(yǎng)基培養(yǎng)方案和支持材料例如人羊膜而產(chǎn)生的。產(chǎn)生的結(jié)膜組織系統(tǒng)適用于移植以治療受試者受損或患病的眼睛的眼表面。文檔編號(hào)A61L27/60GK101432031SQ200780014814公開日2009年5月13日申請(qǐng)日期2007年2月23日優(yōu)先權(quán)日2006年2月24日發(fā)明者蘇巴德拉·德維·卡什亞帕,薩姆·瓦薩尼亞·維拉夫,雷迪·基肖爾申請(qǐng)人:利萊恩斯生命科學(xué)有限公司