專利名稱：：黑骨藤的多糖提取物、含有它的藥物組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從植物黑骨藤中提取得到的多糖提取物、其提取方法、含有該多糖提取物的藥物組合物以及該多糖提取物或其藥物組合物作為免疫抑制劑或抗炎、鎮(zhèn)痛藥物的用途。
背景技術(shù)：
：黑骨藤學(xué)名為西南杠柳(Periplocaforrestii5Wi/化)，是蘿摩科(/^'c7e/7/tff/"(^"e)杠柳屬(尸^7》/oc")植物，在我國(guó)西南地區(qū)稱之為黑骨藤。黑骨藤全林供藥用，可舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)除濕，治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、胃痛、消化不良、閉經(jīng)、痢疾等111。根據(jù)民間用藥經(jīng)驗(yàn)，其根或全林藥用，具有通經(jīng)絡(luò)、祛風(fēng)濕、活血、消炎等功能，可用于治療跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、月經(jīng)不調(diào)、口腔炎、乳腺炎等疾病121。既可單獨(dú)使用，也可入復(fù)方。在苗藥爹拉槍中，黑骨藤與大風(fēng)藤、追風(fēng)傘配伍，主治風(fēng)寒濕痹，肩臂腰腿疼痛。杠柳屬植物為藤狀灌木，具乳汁，分布于亞洲溫帶地區(qū)、歐洲南部和非洲熱帶地區(qū)。全世界約有12種，我國(guó)產(chǎn)4種，分布于東北、華北、西北、西南及廣西、湖南、湖北、河南和江西等省區(qū)。我國(guó)產(chǎn)杠柳屬植物大部分為藥用植物，例如杠柳(Pc//7/tfcflw尸/w附的根皮為著名的"北五加皮"，能祛風(fēng)濕、壯筋骨、強(qiáng)腰膝，治風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、筋骨痛等。青蛇藤l尸eW/7/oc'fl('tf/o/7/y;〃fl("W/g/^jF"/c.l莖藥用，治腰痛、風(fēng)濕麻木、跌打損傷及蛇咬傷等111。對(duì)杠柳屬植物的研究始于19世紀(jì)末，1896年俄國(guó)學(xué)者對(duì)希臘杠柳進(jìn)行了研究，從中得到強(qiáng)心苷periplocin并經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證明它有強(qiáng)心作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，到目前為止，杠柳屬植物中共發(fā)現(xiàn)38個(gè)C2,甾類成分，其中苷28個(gè)，苷元10個(gè)，均為孕甾蹄醇類化合物；18個(gè)強(qiáng)心苷類成分，其中苷元10個(gè)，苷8個(gè)|31;此外還有薛類成分如3|5,601-二羥基羽扇豆-20(29)-烯，6a-羥基羽扇豆-20(29)-烯-3(i-十八烷酸酯，羽扇烷醇141，p-香樹脂醇，a-香樹脂醇乙酸酯，Pl、P2、P3(均為三萜類化合物)15、periplocadiol161，熊果酸|7|,以及由2-去氧糖組成的低聚糖如4-0-(2-0-乙基-(3-D-毛地黃糖基)-D-磁麻糖，曱基4-0-(2-0-乙基-p-D-毛地黃糖基)-D-磁麻糖苷181，d、D2、F,、F2(均為低聚糖)|9|,(J-谷甾醇，胡蘿卜苷等間。藥理研究表明，杠柳1111、黑骨藤1121及青蛇藤|(zhì)131莖皮或根皮中的總皂苷均具有強(qiáng)心作用；杠柳皮的氯仿提取物有抗癌活性|14|;除此之外，從杠柳屬植物中分得的單體cx-和(3-香樹酯醇乙酸酯具有抗炎作用同；甾體苷GlyocosideK、H。112具有神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)劑的作用1161;從杠柳根皮曱醇提取物中分得的兩類9個(gè)單體化合物均具有細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑的作用，且強(qiáng)心苷的誘導(dǎo)活性小于C21甾體苷1]7'。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果，目前尚無(wú)杠柳屬植物中多糖類化學(xué)成分的研究報(bào)道，更未見(jiàn)有關(guān)于其免疫抑制活性的研究報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供從黑骨藤中提取得到的多糖提取物，該多糖提取物具有多種生物活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該多糖提取物的制備方法。在免疫抑制和抗炎、鎮(zhèn)痛活性的導(dǎo)向下，本發(fā)明人通過(guò)一系列深入研究，發(fā)現(xiàn)并提取得到了黑骨藤的活性部位一多糖部位，即多糖提取物，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)研究，得到了系列均一分子量的多糖，從而實(shí)現(xiàn)了上述目的。在上述基礎(chǔ)上，我們對(duì)所述多糖部位的制備工藝、質(zhì)量控制和生物活性進(jìn)行了深入研究。一方面，本發(fā)明提供從黑骨藤中提取得到的多糖提取物，其主要成分為由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸以不同摩爾比組成的多種均一分子量多糖，其分子量分布為4x1032.7x105,包括0.41xl04、1.06x104、0.64x104、0.56xl04、1.36x104和1.54x104的多糖。根據(jù)本發(fā)明的黑骨藤多糖提取物，其中通過(guò)聯(lián)用間羥基聯(lián)苯法與苯酚-硫酸法測(cè)定時(shí)，所述多糖以葡萄糖計(jì)占該提取物重量的47.0549.23%。另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，它包含本發(fā)明的多糖提取物及藥用載體。藥物制劑領(lǐng)域中普通技術(shù)人員可以使用已知的技術(shù)，根據(jù)需要選擇所述的藥用栽體，并將本發(fā)明的藥物組合物配制成適合的劑型，例如片劑、膠嚢和顆粒劑等。再一方面，本發(fā)明提供一種制備黑骨藤多糖提取物的方法，它包括如下步驟i)將黑骨藤藥材用低級(jí)醇提取一次或多次；ii)在所得藥渣中加水，例如蒸餾水提取一次或多次；iii)將所得水提液(上述步驟進(jìn)行多次時(shí)，合并所有的水提液)濃縮至適當(dāng)體積后釆用低級(jí)醇沉淀一次或多次；并且iv)將沉淀部分加水溶解并濃縮除醇，冷凍干燥即得到本發(fā)明的多糖提取物。還可以根據(jù)需要，在上述步驟iv)后再用低級(jí)醇沉淀處理所得多糖提取物。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的黑骨藤多糖提取物可按說(shuō)明書附圖7所示的工藝流程提取得到。將新鮮采集的黑骨藤晾干，破碎。該破碎藥材用低級(jí)醇提取，過(guò)濾，所得藥渣用水提取，合并水提液并且濃縮后冷凍干燥，所得棕黃色粉末再經(jīng)低級(jí)醇沉淀處理，將沉淀物加水溶解并濃縮除醇后冷凍干燥，即得到本發(fā)明的黑骨藤多糖提取物。上述提取制備方法中提取所用的低級(jí)醇可為任何適合的低級(jí)鏈烷醇，例如甲醇、乙醇等，其中醇的濃度范圍為60%-100v/v%;沉淀所用的低級(jí)醇可為任何低級(jí)鏈烷醇，其中醇的濃度范圍為60%-100v/v%。所用醇及其濃度的選擇完全在所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。所得到的黑骨藤多糖提取物經(jīng)DEAE纖維素柱層析及SephadexG-100凝膠柱層析分離后可以得到均一分子量的多糖。本發(fā)明多糖提取物的主要成分為由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸以不同摩爾比組成的多種均一分子量的多糖，其分子量分布為4xl032.7xl05,包括分子量0.41xio4、1.06xl04、0.64xl04、0.56x104、1.36x104和1.54xl04。其中，所述多糖含量以葡萄糖計(jì)占多糖提取物重量的48.14±1，09%,即47.0549.23。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛深入的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)本文中描述的方法得到的黑骨藤多糖提取物，體外應(yīng)用可以明顯降低脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，降低脾細(xì)胞分泌IgG水平；體內(nèi)應(yīng)用對(duì)巴豆油誘發(fā)的小鼠急性耳腫脹及2,4-二硝基氯苯(DNCB)謙導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)均有明顯的抑制作用；對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)模型大鼠具有明顯的治療作用，顯示出良好的抗炎和免疫抑制作用，具有廣闊的治療自身免疫性疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、腎病綜合征、橋本氏甲狀腺炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼疳、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病以及炎性疾病)的潛在應(yīng)用前景。因此，預(yù)期本發(fā)明的多糖提取物或其藥物組合物可以用于治療炎性疾病、疼痛或自身免疫性疾病。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，本發(fā)明還提供所述的多糖提取物或其藥物組合物在制備用于治療炎性疾病、疼痛或自身免疫性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、腎病綜合征、橋本氏甲狀腺炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白塞氏病、自身免疫性肝炎或免疫性血管病的藥物中的用途。本發(fā)明的黑骨藤多糖提取物可單獨(dú)或以藥物組合物形式使用，其給藥方式可根據(jù)具體情況而定，可通過(guò)口服、非腸道或局部給藥，給藥劑型可以是例如片劑，膠嚢，骨劑，貼劑，注射劑等。圖1為黑骨藤多糖提取物的纖維素薄層層析圖謙。圖2為黑骨藤多糖提取物的"C-NMR譜。圖3為由黑骨藤多糖提取物中分離得到的各均一分子量多糖的常壓凝膠色鐠圖(左側(cè)依次為HPl-l、HPl-3、HPl-4，右側(cè)依次為HP2-2、HP2-3、HP2醫(yī)4)。圖4為由黑骨藤多糖提取物中分離得到的各均一分子量多糖的乙?；苌餁庀嗌Z(yǔ)圖(左側(cè)依次為HP1-1、HPl-3、HPl-4，右側(cè)依次為HP2-2、HP2-3、HP2-4)。圖5為由黑骨藤多糖提取物中分離得到的均一分子量多糖的紅外光語(yǔ)圖(橫向依次為HP1-1、HP2-2、HP2-3)。圖6為由黑骨藤多糖提取物中分離得到的均一分子量多糖的'H-NMR譜(依次為HP1-1、HP2-2)。圖7為提取黑骨藤多糖提取物的工藝流程圖。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例和生物活性實(shí)驗(yàn)，是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例l:黑骨藤多糖提取物的制備將黑骨藤(購(gòu)自云南省大理州巍山縣醫(yī)藥有限責(zé)任公司)晾干，破碎。該黑骨藤破碎物30公斤，加8倍量95%乙醇回流提取，過(guò)濾，同法再提取一次，將所得藥渣加8倍量蒸餾水提取兩次，合并提取液，濃縮后冷凍干燥，得到2.1公斤棕黃色粉末，再經(jīng)過(guò)兩次80。/。乙醇沉淀處理后，將沉淀加水溶解并除醇后冷凍干燥，得到840克棕黃色粉末，即為黑骨藤多糖提取物。其具有下述的定性反應(yīng)特征。按按照下述方法測(cè)定本實(shí)施例所得提取物中多糖含量以葡萄糖計(jì)為(48.14±1.09)%(n=3)。實(shí)施例2:黑骨藤多糖提取物的定性鑒別按照如下方法，定性鑒別本發(fā)明的黑骨藤多糖提取物。(1)a-萘酚反應(yīng)(Molish反應(yīng))黑骨藤多糖提取物以適量水溶解，加10。/。a-萘酚乙醇溶液三滴，然后沿試管壁緩緩加入濃硫酸，使形成上下兩層，稍后在兩層界面處可見(jiàn)紫色環(huán)，表示有多糖存在。(2)纖維素薄層層析取黑骨藤多糖提取物，經(jīng)三氟乙酸水解后，與標(biāo)準(zhǔn)單糖共薄層，以吡啶乙酸乙酯乙酸水(5:5:i:3)系統(tǒng)展開(kāi)，以苯胺-鄰苯二曱酸顯色劑顯色，提取物水解液中含多種單糖，表示有多糖存在，結(jié)果見(jiàn)圖i。(3)'H-NMR及13C-NMR鐠取黑骨藤多糖提取物，加重水溶解后，測(cè)定其'H-NMR及。C-NMR譜，端基氫、端基碳信號(hào)以及糖上的其他氬和碳信號(hào)均顯示出多糖的特征，表明此部位為多糖部位，結(jié)果見(jiàn)圖2。(4)由黑骨藤多糖提取物中分離得到的各均一分子量多糖的純度檢測(cè)及分子量測(cè)定黑骨藤多糖提取物經(jīng)DEAE纖維素柱層析及SephadexG-100凝膠柱層析分離后得到系列均一分子量多糖，采用常壓凝膠色譜法測(cè)定其純度及分子量。色鐠條件填料SephacryiS-300HR流動(dòng)相0.15mol/LNaCl溶液上樣量2毫克流速1毫升/20分鐘，每毫升收集一個(gè)流份。結(jié)果見(jiàn)圖3及表1。表l、黑骨藤多糖提取物中分離得到的各均一分子量多糖的分子量均一老f量多糖HP1-1HP1誦3HP1-4HP2-2HP2-3HP2-4分子量(x104)0.411.060.640.561.361.54(5)由黑骨藤多糖提取物中分離得到的各均一分子量多糖的糖組成取各均一分子量多糖分別制備糖醇乙酸酯，GC檢測(cè)。儀器島津GC-17A型氣相色譜儀，SHC-II型高純氬氣發(fā)生器，GCsolution數(shù)據(jù)處理軟件色傳條件色譜柱EC-5(30mx0.25mmx0.25nm)進(jìn)樣口溫度250°C檢測(cè)器溫度280°C氮?dú)饬魉?.6毫升/分鐘升溫程序200。C保持2分鐘，以3。C/分鐘的速率升至245。C，保持4分鐘，再以10。C/分鐘的速率升至270。C，保持2分鐘。結(jié)果見(jiàn)圖4及表2。表2、由黑骨藤多糖提取物中分離得到的各均一分子量多糖中所含各種單糖的摩爾比趕一—3f3manglugalglu-AHP1-10.182.541.001.584.381.39\0.45HP1-31.9315.411.001.913.1011,580.552.12HP1-40.5610.231.001.623.956.412.490.46HP2-22.442.751.001.045.832.041.0227.31HP2-311.1214.021.000.953.969.351.9117.20HP2-47.6212.811.000.612.169.091.4211.39(6)由黑骨藤多糖提取物中分離得到的均一分子量多糖的紅外光鐠KBr壓片，紅外掃描，結(jié)果見(jiàn)圖5。(7)由黑骨藤多糖提取物中分離得到的均一多糖的^-NMR語(yǔ)取均一分子量多糖，加重水溶解后，測(cè)定其iH-NMR,結(jié)果見(jiàn)圖6。實(shí)施例3:黑骨藤多糖提取物的定量鑒別按照如下方法，定量鑒別本發(fā)明的黑骨藤多糖提取物。一.儀器與試劑1.試劑間羥基聯(lián)苯(AR.)，以0.5%氬氧化鈉配制成質(zhì)量比為0.15%的溶液，冰箱保存一月內(nèi)有效；四硼酸鈉(AR.)-硫酸試液，0.0125mol/L四硼酸鈉的濃硫酸溶液；半乳糖醛酸(GalA)標(biāo)準(zhǔn)液，Sigma公司，8(TC干燥至恒重后配制成濃度為60ng/mL的溶液，冰箱保存?zhèn)溆茫涣蛩釣榉治黾?；苯酚為分析純，重蒸后水箱保存，用前加水配制?%的水溶液；葡萄糖(Glu，AR.)備用液，105。C干燥至恒重后配成濃度為0.3mg/mL的溶液，冰箱保存?zhèn)溆谩?.儀器cintra-20(澳大利亞)紫外分光光度儀二.實(shí)驗(yàn)方法1.間羥基聯(lián)苯法1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取GalA標(biāo)準(zhǔn)液O,0.3，0.6，0.9,1.2，1.5mL分別置于6個(gè)25mL的容量瓶中，各補(bǔ)加水至1.5mL,搖勻，冰浴冷卻，迅速加入四硼酸鈉-濃硫酸9.0mL搖勻，沸水浴5分鐘，取出水浴冷卻，加入間羥聯(lián)苯溶液0,15mL，搖勻，放置半小時(shí)后，于525nm下測(cè)定吸收值。1.2精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取GalA標(biāo)準(zhǔn)液0.9mL共6份，余操作同上，在同樣條件下考察儀器的精密度。1.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)稱取樣品配制一定濃度的溶液，吸取l.OmL,余按第一項(xiàng)下操作，在0,20分鐘，40分鐘，1小時(shí)，3小時(shí)，5小時(shí)，8h測(cè)定吸光度值，考察樣品及與反應(yīng)試劑生成有色物的穩(wěn)定性。1.4樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)按工藝處理方法在同樣條件下同時(shí)制備黑骨藤多糖提取物3份，按樣品測(cè)定項(xiàng)下配制溶液，吸取1.0mL，同上操作，測(cè)定吸光度，考察此制備方法的穩(wěn)定性。1.5樣品測(cè)定稱取同一樣品6份，配制成濃度為0.4mg/mL的水溶液，吸取1.0mL，將其分為兩組，按第一項(xiàng)操作，第一組加顯色劑，第二組加同等量的0.5。/。氫氧化鈉溶液，第一組測(cè)得吸光度值扣除第二組后，計(jì)算酸性多糖的含量。1.6加樣回收率精密稱取樣品五份，每份依次精密加入GalA標(biāo)準(zhǔn)液l.O，2.0，3.0，4.0，5.0mL，加水定容，搖勻后，吸取l.OmL按第一項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度值，計(jì)算回收率，考察此定量方法的準(zhǔn)確度。2.苯酚-硫酸法2,1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別吸取Glu備用液l.O，2.0,3.0，4.0，5.0，6.0mL置于50mL的容量瓶中，加水定容至刻度搖勻，配成Glu標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各2.0mL置于25mL量瓶中，加入5%(g/v)苯酚溶液1.8mL，混勻，迅速加入濃硫酸7.5mL(10~20s)，混勻，置沸水浴中加熱20分鐘，取出后冷水浴中冷卻30分鐘，另以2.0mL蒸餾水同上平行操作為空白對(duì)照，于490nm下測(cè)定吸光度值。2.2校正曲線的制備精密稱取80。C烘干至恒重的半乳糖醛酸60mg置于100mL的容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻后，從中分別取出1.0，2.0，3.0，4.0，5.0,6.0mL置于6個(gè)50mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻后，分別從中取2.0mL，置于6個(gè)25mL容量瓶中，余操作同第一項(xiàng)。2.3精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一Glu標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0mL共6份，按第一項(xiàng)下操作，測(cè)定吸收值A(chǔ)，在同樣條件下考察儀器的精密度。2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取樣品溶液2.0mL,按第一項(xiàng)下操作，在0，10分4中，30分4中，1.0小時(shí)，1.5小時(shí)，2.5小時(shí)，4.0h時(shí)間點(diǎn)測(cè)吸收值，考察樣品及與反應(yīng)試劑生成有色物的穩(wěn)定性。2.5才羊品測(cè)定稱、取同一沖羊品3份，配制成濃度為0.4mg/mL的溶液，從中吸取溶液2.0mL,置于25mL容量瓶中定容，再?gòu)南♂屢褐形∪芤?.0mL,置于25mL容量瓶中，余操作按第一項(xiàng)，測(cè)定吸光度值，計(jì)算中性多糖的含量。2.6樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)按工藝處理方法在同樣條件下同時(shí)制備黑骨藤多糖提取物3份，按樣品測(cè)定項(xiàng)下配制溶液，吸取2.0mL置于25mL容量瓶，余同上操作，測(cè)定吸光度，考察此制備方法的穩(wěn)定性。2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取樣品5份，每份依次精密加入同一Glu標(biāo)準(zhǔn)溶液l.O，2.0，3.0,4.0，5.0mL，加水定容，搖勻后，分別吸取2.0mL按第一項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度值，計(jì)算回收率，考察此定量方法的準(zhǔn)確度。三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用間羥基聯(lián)苯法與苯酚-硫酸法聯(lián)用，測(cè)定黑骨藤多糖部位中多糖的含量。先用間羥基聯(lián)苯法測(cè)定糖醛酸的含量，可靠準(zhǔn)確；然后用苯酚-硫酸法測(cè)定糖的含量，同時(shí)將糖醛酸做對(duì)照品，按此法做校正曲線，將第一步測(cè)得的糖醛酸含量帶入校正曲線進(jìn)行校正，得到計(jì)算吸光度值。從該法測(cè)得的吸光度值中扣除計(jì)算值后，帶入該法標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得到中性糖的含量，中性糖與酸性糖醛酸加和即得總多糖的含量，再根據(jù)原樣品的重量折算出總多糖在樣品中的含量。測(cè)定結(jié)果表明，提取物中總多糖的含量以葡萄糖計(jì)在(47.0549.23)%范圍之間。表3、間羥基聯(lián)苯法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品NO.123樣品質(zhì)量(g)0.01040.01050.0104吸光度值(A)0.60780.62540.6126含量(％)19.1319.6919.29平均含量19.37%RSD1.49%表4、苯酚-石充酸法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例4:黑骨藤多糖提取物的生物活性實(shí)驗(yàn)一.黑骨藤多糖提取物對(duì)細(xì)胞和體液免疫功能的影響1、對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響B(tài)alb/c小鼠麻醉后斷頭處死，無(wú)菌取脾臟，盛于100目濾網(wǎng)中，采用玻璃棒碾磨的方法制備脾細(xì)胞懸液，并用含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5xl06cells/mL。實(shí)驗(yàn)用黑骨藤多糖提取物為棕黃色粉末，用RPMI-1640培養(yǎng)液溶解后過(guò)濾除菌，調(diào)整為l、10、50、100、250、500ng/mL濃度后采用3H-TdR摻入法觀察其對(duì)經(jīng)ConA和LPS刺激脾細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響(181。表5所示結(jié)果表明，黑骨藤多糖提取物對(duì)未經(jīng)ConA刺激的脾細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯影響，經(jīng)ConA和LPS刺激后，黑骨藤多糖提取物在l500ng/mL范圍內(nèi)可以濃度依賴性的抑制脾細(xì)胞增殖反應(yīng)，在50(nig/mL時(shí)幾乎全部抑制了脾細(xì)胞增殖。結(jié)果提示其對(duì)細(xì)胞和體液免疫功能均有明顯抑制作用。表5、黑骨藤多糖提,體外應(yīng)用對(duì)小E^細(xì)I^歹JL^的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素多水平一元方差分析，*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組比較；均值土標(biāo)準(zhǔn)差，n=4。ConA，刀豆蛋白A;LPS,脂多糖。2、對(duì)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IgG水平的影響同上制備好脾細(xì)胞懸液備用。采用間接ELISA法觀察黑骨藤多糖提取物對(duì)LPS刺激的脾臟淋巴細(xì)胞分泌IgG的影響。實(shí)驗(yàn)用黑骨藤多糖提取物形式及配置方法同上。表6所示結(jié)果表明，經(jīng)LPS刺激后，黑骨藤多糖提取物l100ng/mL對(duì)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IgG水平?jīng)]有明顯影響，在200500ng/mL濃度依賴性的降低脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IgG水平，表明黑骨藤多糖提取物體外應(yīng)用可抑制脾細(xì)胞IgG的生成。提示其對(duì)體液免疫功能有明顯抑制作用。表6、黑骨藤多糖提取物體外應(yīng)用對(duì)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IgG的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*0.028±0.020*本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素多水平一元方差分析，*P<0.05，**P<0.01與對(duì)照組比較；均值士標(biāo)準(zhǔn)差，n=6。3、黑骨藤多糖提取物對(duì)DNCB誘導(dǎo)的小鼠耳DTH的影響1191雄性Balb/c小鼠，(18士2)g，實(shí)驗(yàn)第1天按體重隨機(jī)分組，腹部剃毛發(fā)，用配好的濃度為5%的DNCB-丙酮-花生油溶液20nL涂小鼠腹部皮膚以誘導(dǎo)DTH反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)第8天，再次用濃度為2.5%的DNCB-丙酮-花生油溶液lOpL攻擊小鼠右側(cè)耳部雙側(cè)，對(duì)側(cè)涂相同劑量丙酮-花生油溶液；實(shí)驗(yàn)第11天處死小鼠，用直徑為7mm的打孔器于固體石蠟板上取耳片并稱重。實(shí)驗(yàn)用黑骨藤多糖提取物為棕黃色粉末，用純凈水液溶解后，調(diào)整劑量為10、50、100、250、500mg/kg后備用。表7所示結(jié)果表明，模型組小鼠耳腫脹度較正常對(duì)照組小鼠明顯增加，黑骨藤多糖提取物灌胃給藥8天后，在50mg/kg劑量時(shí)具有明顯的抑制的作用，在100mg/kg劑量時(shí)作用也較明顯。該結(jié)果說(shuō)明黑骨藤多糖提取物具有抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用。表7、黑骨藤多糖提取物對(duì)DNCB誘導(dǎo)小鼠耳DTH的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用成組設(shè)計(jì)T檢驗(yàn)及單因素多水平一元方差分析，**P<0.01，與正常對(duì)^、纟且t匕較；#P<0.05，##P<0.01，與才莫型對(duì)^、纟且t匕較；均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=10。肺脹抑制率=(模型組腫脹度均值-給藥組腫脹度均值)/模型組腫脹度均值《100%。二.黑骨藤多糖提取物對(duì)急性炎癥反應(yīng)的影響,雄性KM小鼠，(18±2)g，按體重隨機(jī)分組，自由取食、水，后連續(xù)三天灌胃給藥，1次/天；末次給藥后l小時(shí)，于小鼠右耳兩側(cè)分別涂濃度為1%的丙酮巴豆油溶液1OnL致炎，對(duì)側(cè)涂相同劑量的丙酮溶液；致炎后4小時(shí)脫臼處死小鼠并剪下雙側(cè)耳片，后用直徑為7mm的打孔器于固體石蠟板上取耳片并稱重。實(shí)驗(yàn)用黑骨藤多糖提取物為棕黃色粉末，用純凈水液溶解后，調(diào)整劑量為10、50、100、250、500mg/kg后備用。表8所示結(jié)杲表明，模型組小鼠耳肺脹度較正常對(duì)照組小鼠明顯增加，黑骨藤多糖提取物灌胃給藥3天后，在100mg/kg劑量時(shí)即具有明顯的抑制作用，在500mg/kg劑量時(shí)其抑制作用更明顯，且呈劑量依賴性。該結(jié)果表明其對(duì)急性炎癥反應(yīng)有明顯抑制作用。表8、黑骨藤多糖提取物對(duì)巴豆油誘導(dǎo)小鼠耳急性炎癥反應(yīng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用成組設(shè)計(jì)T檢驗(yàn)及單因素多水平一元方差分析，**P<0.01，與正常對(duì)照組比較；#P<0.05，##P<0.01，與模型對(duì)照組比較；均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差，n=10。腫脹抑制率=(模型組腫脹度均值-給藥組肺脹度均值)/模型組腫脹度均值xl00。/。。三.黑骨藤多糖提取物的鎮(zhèn)痛作用選擇醋酸扭體實(shí)驗(yàn)觀察黑骨藤多糖提取物的鎮(zhèn)痛作用1211。雄性KM小鼠，(18士2)g，按體重隨機(jī)分組，自由取食、水，連續(xù)三天灌胃給藥，1次/天；末次給藥45分鐘后腹腔注射0.6%冰醋酸，0.2mL/只，并控制室溫在2426。C范圍內(nèi)。注射醋酸5分鐘后開(kāi)始觀察扭體次數(shù)，連續(xù)觀察15分鐘。實(shí)驗(yàn)用黑骨藤多糖提取物為棕黃色粉末，用生理鹽水液溶解后，調(diào)整劑量為50、100、250mg/kg后備用。表9所示結(jié)果表明，腹腔給予醋酸后小鼠出現(xiàn)明顯的扭體反應(yīng)；給予100mg/kg阿司匹林后小鼠扭體反應(yīng)受到明顯抑制，與對(duì)照組相比，扭體次數(shù)明顯減少(P<0,01);黑骨藤多糖提取低、中、高(50，100,250mg/kg)三個(gè)劑量對(duì)小鼠扭體反應(yīng)均具有明顯抑制作用，其中100mg/kg劑量時(shí)作用最為明顯。該結(jié)果表明其具有一定鎮(zhèn)痛作用。表9、黑骨藤多糖提取物對(duì)小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素多水平一元方差分析，與模型對(duì)照組比較；*P<0.05，**P<0.01;均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差，n=10。四.黑骨藤多糖提取物對(duì)AA(佐劑型關(guān)節(jié)炎)模型大鼠足爪肺脹的影響采用Wistar大鼠右足墊內(nèi)注射CFA的方法(O.lmL/只)致敏大鼠，原發(fā)病變表現(xiàn)為致炎側(cè)的關(guān)節(jié)腫脹，致敏后即可出現(xiàn)，繼發(fā)病變一般于致炎后1218天出現(xiàn)，表現(xiàn)為非致炎側(cè)及雙前肢的關(guān)節(jié)腫脹[221。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致炎后1周開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥23周，末次給藥后l小時(shí)測(cè)量足爪腫脹體積。實(shí)驗(yàn)用黑骨藤多糖提取物為棕黃色粉末，用純凈水液溶解后，調(diào)整劑量為15、30、60mg/kg后備用。表10所示結(jié)果表明，模型組AA大鼠原發(fā)側(cè)足爪體積隨時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增加；雷公藤多苷在30mg/kg劑量時(shí)對(duì)AA大鼠原發(fā)足爪肺脹有明顯的抑制作用；黑骨藤多糖提取物15mg/kg、30mg/kg劑量連續(xù)給藥lw后對(duì)AA大鼠原發(fā)足爪腫脹即具有明顯抑制作用，連續(xù)給藥2周后抑制作用更為明顯；黑骨藤多糖提取物60mg/kg劑量連續(xù)給藥1周后對(duì)AA大鼠原發(fā)足爪腫脹抑制作用不明顯，連續(xù)給藥2周后具有明顯的抑制作用。表U所示結(jié)杲表明，模型組AA大鼠繼發(fā)側(cè)足爪體積在造模2周后隨時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增加；雷公藤多苷在30mg/kg劑量時(shí)對(duì)AA大鼠繼發(fā)足爪腫脹抑制作用不明顯；黑骨藤多糖提取物15mg/kg、60mg/kg劑量連續(xù)給藥2周對(duì)AA大鼠繼發(fā)足爪腫脹抑制作用不明顯，而黑骨藤多糖提取物在30mg/kg劑量時(shí)連續(xù)給藥2周后對(duì)AA大鼠繼發(fā)足爪肺脹抑制作用明顯，說(shuō)明黑骨藤多糖提取物30mg/kg劑量對(duì)AA大鼠繼發(fā)足爪腫脹具有明顯的抑制作用。該部分結(jié)果提示其可能具有明顯抗風(fēng)濕作用。表10、黑骨藤多糖提取物對(duì)AA模型大鼠原發(fā)側(cè)足爪肺脹的影響劑量造模前足造模后足爪體積(mL)組別(mg/爪體積kg)(mL)1周2周3周4周正常對(duì)照組\1.59±0.121.66±0.101.59±0.261.87±0.181.86±0.07模型對(duì)照組\1.52士0.063.02±0.92**3.16±0.53"3.36±0.57**3.73±0.67**雷公藤多香301.69±0.122.92±0.402.64±0.402.84士0.55#3.08±0.70##黑骨藤多糖151.54±0.063.06±0.362.70±0.423.07±0.65#3.01±1.雨#提取物301.63±0.053.08±0.202.54±0.272.66±0.28##2.86±0.37##601.61±0.043.16±0.412.66±0.333.15±0.673.38±0.78##本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用具有一個(gè)重復(fù)測(cè)量的三因素定量資料的一元協(xié)方差分析，**P<0.01，與正常對(duì)照組比較；#P<0.05,##P<0.01，與模型對(duì)照組比較；均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差，n=6。表11、黑骨藤多糖提取物對(duì)AA沖莫型大鼠繼發(fā)側(cè)足爪腫脹的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)釆用具有一個(gè)重復(fù)測(cè)量的三因素定量資料的一元協(xié)方差分析，**P<0.01，與正常對(duì)照組比較；#P<0.05，##P<0.01,與模型對(duì)照組比較；均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=6。五.黑骨藤多糖提取物對(duì)II型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠踝關(guān)節(jié)直徑的影響采用DBA/1小鼠皮內(nèi)多點(diǎn)注射的方法造模。將ClI溶于0.02mol/L的醋酸中，濃度為2mg/mL，過(guò)夜，將溶解的CII與CFA等體積混和充分乳化，于DBA/1小鼠皮內(nèi)多點(diǎn)注射100nLCn與CFA的混合乳劑(含CII0.1pg)免疫1231。繼發(fā)病變于免疫后第20-28天出現(xiàn)，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)及尾、耳、鼻的腫脹，免疫后第20天開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥40天，每次給藥后l小時(shí)測(cè)量左、右側(cè)踝關(guān)節(jié)直徑。實(shí)驗(yàn)用黑骨藤多糖提取物為棕黃色粉末，用純凈水液溶解后，調(diào)整劑量為50、100、250mg/kg后備用。表12所示結(jié)果表明，模型組DBA/1小鼠左側(cè)足爪體積隨時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增加；來(lái)氟米特在15mg/kg劑量時(shí)連續(xù)給藥20天即對(duì)DBA/1小鼠左側(cè)足爪腫脹有明顯的抑制作用；黑骨藤多糖提取物在250mg/kg劑量連續(xù)給藥20天后對(duì)左側(cè)足爪腫脹具有明顯抑制作用，而連續(xù)給藥40天后，黑骨藤多糖提取物50mg/kg、100mg/kg、250mg/kg各劑量均具有明顯抑制左側(cè)踝關(guān)節(jié)直徑的作用。表13所示結(jié)果表明，模型組DBA/1小鼠右側(cè)足爪體積也隨時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增加；來(lái)氟米特在15mg/kg劑量時(shí)連續(xù)給藥40天時(shí)才對(duì)DBA/1小鼠右側(cè)足爪肺脹有明顯的抑制作用；而黑骨藤多糖提取物在250mg/kg劑量連續(xù)給藥20天后即對(duì)右側(cè)足爪胂脹具有明顯抑制作用，連續(xù)給藥40天后對(duì)右側(cè)踝關(guān)節(jié)直徑具有更明顯抑制的作用。該部分結(jié)果進(jìn)一步提示其可能具有明顯抗風(fēng)濕作用。表12、黑骨藤多糖提取物對(duì)CIA小鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)直徑的影響劑量造模前踝造模后踝關(guān)節(jié)直徑(mm)組別關(guān)節(jié)直徑(mg/kg)(mm)20天40天60天正常對(duì)照組\39.6±0.940.3±1.339.5±0.5化5±1.2模型對(duì)照組\40.5±1.040.4±0.944.4士1.6"50.0±5.3**來(lái)氣米特1540.4±1.540.5±0.840.2±0.6#43.0±4.5##黑骨藤多5040.2±0.640.6±0.944.1±4.945.3±4.0#糖提取物10040.2±0.840.4±0.642.0±3.945.2±4.8#25040.0±0.840.7±0.640.8±1.1#44.0±5.0##本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用具有一個(gè)重復(fù)測(cè)量的三因素定量資料的一元協(xié)方差分析，**P<0.01，與正常對(duì)照組比較；#P<0.05,##P<0.01,與模型對(duì)照組比較；均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差，n=6。表13、黑骨藤多糖提取物對(duì)CIA小鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)直徑的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用具有一個(gè)重復(fù)測(cè)量的三因素定量資料的一元協(xié)方差分析，*P<0.05，**P<0.01，與正常對(duì)照組比較；#P<0.05，##P<0.01,與模型對(duì)照組比較；均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差，n=6。參考文獻(xiàn)111中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)編.中國(guó)植物志.北京科學(xué)出版社，1977,63:272|21江蘇新醫(yī)學(xué)院編.中藥大辭典.上?？茖W(xué)出版社，1986，2388m張?jiān)ⅲ蹁h鵬.杠柳屬植物化學(xué)成分研究進(jìn)展.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā).2003，15(2):157-161|4jGhulamMustafa,ErumAnis，SaeedAhmed,etal.Lupene-TypeTriterpenesfrom/VW//oca/)/^〃fl,JNatProd,2000，63(10):881|5jOmp.Srivastava,AnakshiKhare，Mahesshwarip.khare.Triterpenoidsof尸m沙cflc"/o尸卸〃tf.JNatProd,1983，46(4):458|6|MoheddineAskri,ZineMighri.MedicinalplantsofTunisia.T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