一種制備高支化多糖-絲素水凝膠支架的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備高支化多糖-絲素水凝膠支架的方法。屬于天然高分子材料
技術領域，該種高支化多糖-絲素水凝膠H維貫通多孔支架可廣泛應用于組織工程材料和 生物醫(yī)用藥物可控釋放等行業(yè)。
【背景技術】
[0002] 高分子水凝膠具有一定彈性、H維貫通多孔結構，適合模擬細胞外基質、提供適 合細胞生長所需的H維微環(huán)境及細胞和細胞外基質之間的生物物理信號，維持細胞正常表 型與生理功能。多糖是一類可降解天然高分子，來源豐富，在組織工程及藥物控制釋放材料 中應用廣泛。天然多糖可W與蛋白質、其他多糖或其他生物大分子通過氨鍵或靜電引力進 行絡合，或通過化學修飾后交聯(lián)形成水凝膠。多糖水凝膠作為一種良好的支架材料，不僅僅 取決于它的生物相容性，更重要的是它的獨特化學結構、可生物降解性、低毒等特性，而且 該些特性可被反復重新設計及改造，因此優(yōu)于合成高分子水凝膠。研究證實，天然多糖及其 衍生物水凝膠已可W成功將細胞植入其中，為細胞增殖及組織再生提供生長條件。目前，研 制理想的人工支架材料代替器官移植手術修復組織缺損或病變，是生物材料科學和醫(yī)學領 域的重要課題之一。然而，在人工支架材料中，隨著細胞不斷生長和分化，邊界處的細胞將 耗盡氧氣和營養(yǎng)物質，使得支架內部細胞壞死，從而限制均一性人工骨組織的形成。由于缺 乏必要的血管組織導致較大尺寸人工組織內部得不到營養(yǎng)供應而壞死，因此無法滿足移植 手術之所需。血管化組織工程材料可維持細胞增殖、分化所需的營養(yǎng)物質、氧氣持續(xù)供應及 代謝產物的及時排出，W期滿足臨床應用的實際需要。值得注意的是：多糖水凝膠不僅在結 構上與細胞外基質相似，更重要的是，其易于靈活調控物理性能或攜帶各種化學信號分子， 從而誘導細胞特定的分化行為。多糖水凝膠在組織工程、藥物控制釋放、化妝品及日用護膚 等領域具有廣闊的應用前景。
[0003] 正因為天然多糖水凝膠存在極大的應用價值，因此其制備及應用開發(fā)成為目前國 內、外研究熱點之一。目前多糖水凝膠制備主要采用海藻酸軸、殼聚糖、普魯蘭等作原料。例 女口；在海藻酸軸水凝膠中包埋血管內皮細胞生長因子（VEGF)可促使內皮細胞增殖和分化 成毛細血管網絡。中國專利公開號為CN102600493 A，公開日為2012年7月25日，發(fā)明名 稱為"天然普魯蘭多糖水凝膠傷口敷料及其制備方法"的申請案。該申請案公開了將天然 普魯蘭多糖駿甲基化，用1- (3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞胺鹽酸鹽將駿甲基化普魯 蘭多糖與脫或二元胺交聯(lián)制備天然普魯蘭多糖水凝膠傷口敷料。該方法的缺點在于：所采 用的普魯蘭多糖是線性多糖，因此在藥物控制釋放過程中，藥物在水凝膠中釋放迅速，而且 有機原料二元胺或脫用量很大，存在細胞毒性等問題。中國專利公開號為CN101920045A， 公開日2010年12月22日，發(fā)明名稱為"一種明膠-殼聚糖-透明質酸-硫酸肝素復合支 架及其制備方法"申請案。該申請案公開了采用明膠、殼聚糖、透明質酸及硫酸肝素四中材 料，W不同配比混合得到不同濃度的混合物，通過冷凍干燥法制取復合支架，支架成型后再 用碳二亞胺，N-輕基玻巧醜亞胺和己醇等交聯(lián)、清洗，冷凍干燥后得復合H維支架。該方法 的不足在于；由于采用冷凍成型后再交聯(lián)，交聯(lián)劑難w擴散到支架內部，，導致交聯(lián)可能只 發(fā)生在支架表面，支架內部和表面交聯(lián)不均勻。上述方法的共同缺點是；該些多糖呈線性鏈 構象或支化度不高，所得水凝膠支架的強度較弱，藥物在水凝膠中釋放迅速，因此，作為生 物醫(yī)用材料應用或作為藥物載體時，難W支撐細胞粘附和增殖生長，并且藥物釋放過快，達 不到預期的效果。因此急需尋求更好的制備方法或者利用其它獨特結構的天然多糖作為水 凝膠原料。

【發(fā)明內容】

[0004] 針對上述技術存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種工藝簡便，污染小，所得產品 具有很好的力學性能、藥物可控性釋放、良好的生物相容性和生物降解性的水凝膠支架制 備方法。
[0005] 為實現上述目的，本發(fā)明提供的技術方案是： 一種制備高支化多糖-絲素水凝膠支架的方法，所述的制備方法包括W下步驟： a將干燥的虎奶茹菌核粉碎，依次用己酸己醋、丙麗進行索氏提取去除脂肪，然后將去 脂肪后的虎奶茹菌核浸泡在生理鹽水中，在高壓120 C溫度下提取，離也得提取液，冷卻提 取液后再離也且收集殘渣；殘渣用去離子水離也清洗且冷凍干燥得到高支化虎奶茹多糖。
[0006] b在冰水浴條件下，將虎奶茹高支化多糖分散在20 wt%化0H和異丙醇混合溶液 中，攬拌2 h后形成虎奶茹高支化多糖-NaOH-異丙醇均勻息浮液，其中虎奶茹高支化多糖 與異丙醇的質量體積比為；60:l，20wt%化0H與異丙醇的體積比為1:2. 5。
[0007] C將氯己酸溶于異丙醇中，并緩緩逐滴到經b步驟得到的虎奶茹高支化多 糖-NaOH-異丙醇均勻息浮液中，在60 C溫度下反應3 h，停止反應后冷卻至室溫，然后用 0.5 M己酸溶液中和至抑=7,將經上述反應所得的產物用蒸觸水透析，旋轉蒸發(fā)濃縮，冷 凍干燥即得駿甲基化高支化多糖，其中，高支化多糖輕基與氯己酸的摩爾比為1:5,氯己酸 與異丙醇的質量體積比為2. 63:5。
[000引 d將蠶絲在0. 5 wt%的Na2C03水溶液中煮沸40 min,用去離子水清洗甩干后得到 絲素蛋白纖維，真空干燥，干燥溫度為50 C，干燥時間為12 h，將干燥后的絲素蛋白纖維磨 制成平均粒徑￡3 mm的絲素粉體。
[0009] e將經d步驟得到的平均粒徑￡3 mm的絲素粉體分散在9. 3 mol/血的Li化水溶 液中，在60 C溫度下攬拌6 h配成絲素溶液，所得絲素溶液的濃度為5%。
[0010] f將經e步驟得到的絲素溶液在去離子水中透析3?7天，去除絲素溶液中的 LiBr，然后在20%的聚己二醇水溶液中透析，濃縮得濃度為15%的絲素溶液。
[0011] g將經C步驟得到的駿甲基化高支化多糖溶解在抑=7. 4的磯酸緩沖鹽溶液中得 20?60%的溶液，將100 mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞胺鹽酸鹽和150 mg/血的N-輕基玻巧醜亞胺加入到上述溶液中，攬拌15 min?4 h得活化體系，將活化體 系加入到經f步驟得到濃度為15%的絲素溶液中，在4?37 C溫度下交聯(lián)反應6?48 h， 得高支化多糖-絲素水凝膠支架。
[0012] 由于采用了 W上技術方案，本發(fā)明的技術方案針對高支化多糖和絲素粉體的結構 特點，制備藥物可控釋放且力學性能良好的高支化多糖-絲素水凝膠支架，將藥物或細胞 生長因子包埋在該水凝膠支架中，利用絲素蛋白與高支化多糖的含量比例來調節(jié)水凝膠的 力學性能。高支化多糖的高支化結構形成的"小內腔"與水凝膠交聯(lián)網絡形成的貫通性"大 孔腔"可調控藥物或細胞生長因子W不同的速率釋放，從而模擬生長因子在細胞外基質中 的控制釋放行為及可控誘導細胞增殖分化。此外，絲素是由結構排列規(guī)整的結晶區(qū)和疏松 的非結晶區(qū)組成，其中結晶區(qū)中的有序排列的納米纖維和短程有序排列的聚合物鏈性質穩(wěn) 定，對水凝膠的強度有良好的增強效果，而絲素蛋白中的非結晶區(qū)對水凝膠的初性起重要 作用。
[0013] 本發(fā)明制備高支化多糖-絲素水凝膠支架的方法與已有技術相比具有W下優(yōu)點： 本發(fā)明制備方法具有操作簡單，成本低廉，可在適合細胞生長的生理條件下原位制備 水凝膠，由此制備方法得到的高支化多糖-絲素水凝膠支架，用作藥物載體時可控制藥物 緩慢釋放，提高藥效；作為組織工程支架材料時可裝載細胞生長因子且模擬細胞外基質控 制細胞生長因子緩慢釋放的功能，從而誘導細胞增殖分化成再生組織，并且絲素蛋白的存 在，可大大提高水凝膠支架的力學性能。實驗表明，本方法所得的高支化多糖-絲素水凝膠 支架具有H維貫通的多孔結構，模型分子牛血清蛋白在該水凝膠中包埋量大，且具有良好 的可控釋放行為，冷凍干燥后所得的高支化多糖-絲素支架具有良好的力學性能及較高的 溶脹性能。因此，該方法可廣泛應用于制備人工組織支架材料，而且在藥物控制釋放及食品 等領域也具有廣闊的應用前景。