專利名稱：葡萄糖酸改性殼聚糖親核no供體及其合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域的藥物及其合成方法，具體是一種葡萄糖 酸改性殼聚糖親核NO供體及其合成方法。
背景技術(shù)：
心血管疾病是威脅人類健康的首要疾病，而經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)后再狹窄是 仍然沒有解決的一個世界性的醫(yī)學(xué)難題。NO釋放材料被認(rèn)為是一種有效的抗再 狹窄藥物。能夠產(chǎn)生和釋放NO的材料目前被認(rèn)為是抗血栓凝結(jié)和抑制術(shù)后再狹 窄等臨床醫(yī)學(xué)難題最有希望的解決方案。含有[N(0)N0]—官能團(tuán)的化合物是近幾 年發(fā)展起來的一種最重要的NO供體藥物。它既可在生理?xiàng)l件下自發(fā)的釋放NO 分子，經(jīng)02取代后又可在耙器官和靶細(xì)胞中被特定酶脫離，具有靶向性的功能， 它還具有良好的可調(diào)控性，另外它可制備成各種形態(tài)，根據(jù)需要應(yīng)用于不同的醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域。雖然大量的體外試驗(yàn)已經(jīng)證明了它可有效的預(yù)防成型術(shù)后再狹窄，提高 醫(yī)療裝置的抗血栓性能，減輕肺部高壓和血管痙攣然等用途，但是這些合成產(chǎn)物 的NO供體再經(jīng)02取代，反應(yīng)較為復(fù)雜，經(jīng)過多次反應(yīng)，勢必使反應(yīng)率比一次反 應(yīng)更低，大大降低了NO的利用率。
在最近的十年中，國外對基于含有[N(0)NO]—官能團(tuán)的NO供體控釋材料進(jìn)行 了大量的研究。最初的研究集中于將離子型的親核NO供體N0N0ate分散于各種 疏水性聚合物中，通過NO的釋放增強(qiáng)這些材料的血液相容性。雖然這些研究取 得了相當(dāng)大的成功，但是將這類材料應(yīng)用于臨床，還必須考慮作為聚合物基體材 料的生物相容性和生物可降解性，親核試劑的細(xì)胞毒性和生物相容性。因此選用 無毒的有良好生物相容性的NO載體引起人們的關(guān)注。
殼聚糖(CS)及其衍生物由于其良好的生物相容性、可生物降解性、低的免 疫原性和生物學(xué)的性質(zhì)，使得殼聚糖及其衍生物的應(yīng)用受到廣泛的應(yīng)用。然而在 生理環(huán)境(pH7. 4)下的非溶解性卻限制了殼聚糖在很多領(lǐng)域的應(yīng)用，殼聚糖僅能 溶于pH<6. 5稀酸溶液，在這種酸性條件下，殼聚糖上2位胺基發(fā)生質(zhì)子化，破壞了殼聚糖結(jié)晶區(qū)形成的分子內(nèi)和分子間氫鍵，所以變得易溶于水。
為了提高殼聚糖的溶解性，在2位胺基上引入一些親水性基團(tuán)，如?；a(chǎn)物、 羧甲基和季胺鹽。最這些水溶性殼聚糖衍生物已經(jīng)作為生物醫(yī)學(xué)材料在體內(nèi)進(jìn)行 了研究，然而，為了制備能溶于水的殼聚糖，殼聚糖上的很多D-氨基葡萄糖單 元都得引入親水基團(tuán)。因?yàn)闅ぞ厶堑奈锢砘瘜W(xué)和生物化學(xué)活性來源于骨架上的胺 基，所以對D-氨基葡萄糖單元充分的改性將是不利的。所以既能提高殼聚糖的 水溶性又能不過分消耗D-氨基葡萄糖單元的改性是可取的。
細(xì)胞表面的糖類物質(zhì)來源于糖蛋白、糖脂和蛋白多糖，它們參與了很多重要 的生物活動，細(xì)胞表面的這些糖類物質(zhì)是細(xì)胞之間和細(xì)胞與胞外環(huán)境物質(zhì)之間相 互作用的媒介。將葡萄糖改性的殼聚糖作為一種無毒的NO藥物載體，可克服常 用殼聚糖改性產(chǎn)物的低物理化學(xué)和生物活性，還可克服一般殼聚糖改性產(chǎn)物負(fù)載 NO效率低的問題，發(fā)揮糖類物質(zhì)的特殊靶向作用。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，美國專利(USP6261594， Chitosan-based nitric oxide donor compositions, 2001; USP6451337， Chitosan-based nitric oxide donor compositions, 2002)提出了將改性殼聚糖作為親核NO載體，合
成出系列殼聚糖-N0加成物。殼聚糖的具體的改性分為兩類(l)親水基團(tuán)改性
N-羧丁基殼聚糖，N-羧乙基殼聚糖，N-羧甲基殼聚糖。(2)疏水性基團(tuán)改性N-丙基殼聚糖，N-羧乙基殼聚糖甲酯。其不足在于N0的負(fù)載程度較低，原因有兩 點(diǎn)(1)殼聚糖氨基改性(烷基化)的取代度一般只有25-27%，低的取代度導(dǎo) 致NO的負(fù)載量很低。(2)殼聚糖改性產(chǎn)物作為NO供體材料在釋放NO的時候由 于不具有特意靶向性使得N0的利用率不高。因此限制了其在醫(yī)學(xué)上的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種葡萄糖酸改性殼聚糖親核 NO供體及其合成方法，即葡萄糖酸(GA)改性殼聚糖(CS)或O-羧甲基殼聚糖 (O-CMCS)親核N0供體及其合成方法。本發(fā)明通過對殼聚糖或O-羧甲基殼聚糖 進(jìn)行葡萄糖酸改性，產(chǎn)生仲胺(NH)親核位點(diǎn)，同N0反應(yīng)后，得到一系列以葡 萄糖酸改性殼聚糖或0-羧甲基殼聚糖為載體的含有[N(0)N0]—官能團(tuán)的新型的 N0供體，解決了目前此類親核NO供體應(yīng)用于臨床時存在的問題(負(fù)載量較小， 耙向性差)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明涉及的葡萄糖酸改性殼聚糖親核NO供體，用殼聚糖或0-羧甲基殼聚 糖作為基體材料，采用葡萄糖酸改性產(chǎn)生仲胺親核位點(diǎn)(NH基團(tuán))，與N0反應(yīng) 產(chǎn)生[N(0)N0]—官能團(tuán)，分子結(jié)構(gòu)式如下<formula>complex formula see original document page 6</formula>
其中N [N (0) NO]—基團(tuán)為NH基團(tuán)同NO反應(yīng)形成。而NH基團(tuán)來自于葡萄糖酸 改性的殼聚糖或O-羧甲基殼聚糖；
殼聚糖或0-羧甲基殼聚糖分子量大小是40萬-188萬，NH基團(tuán)是由殼聚糖 或0-羧甲基殼聚糖上的NH2基團(tuán)和葡萄糖酸上的羧基-C00H基團(tuán)發(fā)生羧化反應(yīng)得 到的。
本發(fā)明所涉及的葡萄糖酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，是對殼聚糖或 0-羧甲基殼聚糖分子上的NH2基團(tuán)進(jìn)行羧基化改性，使其產(chǎn)生能夠與NO反應(yīng)的 親核NH基團(tuán)，羧基改性殼聚糖或O-羧甲基殼聚糖分子上的仲胺NH基團(tuán)同NO氣 體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行反應(yīng)，其中，Na7NH=2，壓力為5-lOatm，室 溫反應(yīng)3-7天，產(chǎn)生[N(0)NO]—基團(tuán)，得到含有[N(0)N0]—基團(tuán)的親核NO供體。將 合成產(chǎn)物用甲醇乙醚分別清洗多次，室溫真空干燥，儲存于-20'C的干燥器內(nèi)。
所述對殼聚糖或0-羧甲基殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行羧基化改性，是通過葡萄 糖酸分子上的-COOH羧基基團(tuán)跟殼聚糖或0-羧甲基殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行縮聚 脫水制得。其產(chǎn)物在超純水中透析，除去未反應(yīng)得小分子物質(zhì)，然后烘干。
本發(fā)明得到的葡萄糖酸改性殼聚糖或O-羧甲基殼聚糖親核NO供體分別為無 色和白色膜狀物質(zhì)或粉紅色粉末，儲存于-2(TC的干燥器內(nèi)。在室溫下能夠穩(wěn)定 存在，在酸性或中性水溶液中能夠自發(fā)分解釋放出NO和N-葡萄糖酸殼聚糖(SBC) 分子或N-葡萄糖酸-0-羧甲基殼聚糖(SBCS)分子。
本發(fā)明制備的葡萄糖酸改性殼聚糖或O-羧甲基殼聚糖親核NO供體，具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)和較大的負(fù)載量，可廣泛的應(yīng)用于治療心血管系統(tǒng)疾病，肺部高壓， 促進(jìn)傷口愈合，有效的預(yù)防成型術(shù)后再狹窄，提高醫(yī)療裝置的抗血栓性能。對于 葡萄糖酸改性40萬分子量殼聚糖制得的N-葡萄糖酸殼聚糖(SBC)，負(fù)載N0后 所得N0供體40SBC-N0，釋放總量達(dá)到了 334nmol/mg，半衰期1:1/2是0. 235h。


圖1殼聚糖跟葡萄糖酸的合成(SBC)反應(yīng)路線圖
圖2 O-羧甲基殼聚糖跟葡萄糖酸的合成(SBCS)反應(yīng)路線圖
圖3 SBC/N0和SBCS/N0負(fù)載反應(yīng)路線圖
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案 為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù) 范圍不限于下述的實(shí)施例。
如圖1、 2所示，本發(fā)明對殼聚糖或0-羧甲基殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行葡萄 糖酸改性，通過以下方法進(jìn)行將殼聚糖或0-羧甲基殼聚糖0.01moL和葡萄糖 酸0. 002moL溶于0. 1NHC1鹽酸溶液中100ml，然后向溶液中加入EDC 0. 003 moL 和NHS 0. 00075 moL，之后用lmoL/L NaOH和lmoL/L的HC1溶液調(diào)溶液的pH=5， 反應(yīng)液在室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用lNNaOH溶液調(diào)制pf^9，反應(yīng) 液在透析袋中用蒸餾水透析5天，烘干后分別得到葡萄糖酸改性殼聚糖的產(chǎn)物 N-葡萄糖酸殼聚糖(SBC)和葡萄糖酸改性0-羧甲基殼聚糖的產(chǎn)物N-葡萄糖酸-O-羧甲基殼聚糖(SBCS)。
如圖3所示，SBC/N0和SBCS/N0負(fù)載反應(yīng)路線圖，將得到的葡萄糖酸改性殼 聚糖或0-羧甲基殼聚糖后的產(chǎn)物同N0氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行反 應(yīng)，其中Na7NH=l-3，壓力為5-10atm，室溫反應(yīng)3-7天，得到含有[N(0)N0]— 基團(tuán)的親核NO供體，具體結(jié)構(gòu)式如下
<formula>complex formula see original document page 7</formula>
實(shí)施例1:葡萄糖酸改性40萬分子量殼聚糖/N0的合成 40萬分子量的殼聚糖(lg)和葡萄糖酸(0. 1或0. 2等份/[-NH2])溶于0. 1N HC1鹽酸溶液中(100ml)，然后向溶液中加入EDC (1.5等份/葡萄糖酸)和NHS (0. 25等份/EDC)，之后用IN NaOH/lN HC1的溶液調(diào)溶液的pH=5，反應(yīng)液在室 溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用lNNaOH溶液調(diào)制pH:9，反應(yīng)液在透析袋 中用蒸餾水透析5天，烘干后得產(chǎn)物，為無色透明膜狀物質(zhì)SBC G.44g)。
將上述反應(yīng)產(chǎn)物0.23g (0.001mol)加入到含有0.22g (0.002mol)甲醇鈉的 100ml無水甲醇溶液中，在高壓釜中與NO反應(yīng)，維持壓力5atm，反應(yīng)3天，反 應(yīng)結(jié)束后分別用無水甲醇和乙醚洗滌，室溫真空干燥，得到無色透明膜狀物質(zhì)約 0. 32g?！倌軋F(tuán)最直觀和有效地表征方法是在230-280處的紫外特征吸收， 合成產(chǎn)物SBC/NO中[N(0)NO]—官能團(tuán)的特征吸收在258nm，測定了在PBS緩沖液 中其吸光率隨時間的變化，通過釋放曲線的函數(shù)擬合求出其半衰期(t1/2)。對于 40SBC-N0，釋放總量為334nmol/mg，半衰期11/2是0. 235h。
實(shí)施例2:葡萄糖酸改性124萬分子量0-羧甲基殼聚糖/N0的合成
124萬分子量的0-羧甲基殼聚糖(lg)和葡萄糖酸(0. 1或0. 2等份/[-NH2]) 溶于0. IN HC1鹽酸溶液中(100ml)，然后向溶液中加入EDC (1. 5等份/葡萄糖 酸)和NHS (0. 25等份/EDC)，之后用IN NaOH/lN HC1的溶液調(diào)溶液的pH=5， 反應(yīng)液在室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用1NNaOH溶液調(diào)制p^9，反應(yīng) 液在透析袋中用蒸餾水透析5天，烘干后得產(chǎn)物，為粉色細(xì)粉末狀物質(zhì)N-葡萄 糖酸-O-羧甲基殼聚糖SBCS (1.33g)。
將上述反應(yīng)產(chǎn)物SBCS 0. 32g (O.OOlmol)加入到含有0.22g (0. 002mol)甲 醇鈉的100ml無水甲醇溶液中，在高壓釜中與NO反應(yīng)，維持壓力7atm，反應(yīng)5 天，反應(yīng)結(jié)束后分別用無水甲醇和乙醚洗滌，室溫真空干燥，得到粉紅色粉末狀 物質(zhì)約0. 44g。—官能團(tuán)最直觀和有效地表征方法是在230-280處的紫外特征吸收， 合成產(chǎn)物SBCS/NO中[N(0)N0]—官能團(tuán)的特征吸收在258nm，測定了在PBS緩沖 液中其吸光率隨時間的變化，通過釋放曲線的函數(shù)擬合求出其半衰期(W2)。對 于124SBCS-NO'釋放總量為238. 2nmol/mg，半衰期1:1/2為0. 365h。
實(shí)施例3葡萄糖酸改性188萬分子量殼聚糖/N0的合成 188萬分子量的殼聚糖(lg)和葡萄糖酸(0. 1或0.2等份/[-NH2])溶于 0. IN HC1鹽酸溶液中(100ml)，然后向溶液中加入EDC (1.5等份/葡萄糖酸) 和NHS (0.25等份/EDC)，之后用IN NaOH/lN HC1的溶液調(diào)溶液的pH=5，反應(yīng) 液在室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用1N NaOH溶液調(diào)制pH=9，反應(yīng)液在 透析袋中用蒸餾水透析5天，烘干后得產(chǎn)物，得白色不透明膜狀物質(zhì)SBC( 1. 20g)。 將上述反應(yīng)產(chǎn)物0.20g (0.001mol)加入到含有0.22g (0.002mol)甲醇鈉的 100ml無水甲醇溶液中，在高壓釜中與NO反應(yīng)，維持壓力10atm，反應(yīng)7天，反 應(yīng)結(jié)束后分別用無水甲醇和乙醚洗漆，室溫真空干燥，得到藍(lán)白色不透明膜狀物 質(zhì)約0. 25g?！倌軋F(tuán)最直觀和有效地表征方法是在230-280處的紫外特征吸收， 合成產(chǎn)物N-葡萄糖酸殼聚糖/NO (SBC/NO)中[N(O)NO]-官能團(tuán)的特征吸收在 258nm，測定了在PBS緩沖液中其吸光率隨時間的變化，通過釋放曲線的函數(shù)擬 合求出其半衰期(tl/2)。對于188SBC-NO，釋放總量為124nmol/mg，半衰期t1/2 為0.323h。
權(quán)利要求
1、一種葡萄糖酸改性殼聚糖親核NO供體，其特征在于分子結(jié)構(gòu)式如下其中一氧化氮供體結(jié)構(gòu)N[N(O)NO]-基團(tuán)為NH基團(tuán)同NO反應(yīng)形成，而仲胺NH基團(tuán)來自于羧化反應(yīng)改性的殼聚糖或O-羧甲基殼聚糖；R為-H或-CH2COONa，它來自于殼聚糖或O-羧甲基殼聚糖。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖酸改性殼聚糖親核N0供體，其特征是，所 述親核N0供體，是在酸性和中性水溶液中能夠自發(fā)的釋放NO分子，R取代基和 殼聚糖或0-羧甲基殼聚糖分子量大小決定了它們的釋放半衰期和釋放速率。
3、 一種如權(quán)利要求1所述的葡萄糖酸改性殼聚糖親核NO供體的制備方法， 其特征在于對殼聚糖或0-羧甲基殼聚糖分子上的NH2基團(tuán)進(jìn)行羧基化改性，使 其產(chǎn)生能夠與NO反應(yīng)的親核NH基團(tuán)，羧基改性殼聚糖或0-羧甲基殼聚糖分子 上的仲胺NH基團(tuán)同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行反應(yīng)，其中， Na7NH=2，產(chǎn)生[N(0)N0]—基團(tuán)，得到含有[N(0)N0]—基團(tuán)的親核NO供體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的葡萄糖酸改性殼聚糖親核N0供體的制備方法，其 特征是，所述反應(yīng)，其溫度為室溫，時間為3天-7天。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的葡萄糖酸改性殼聚糖親核NO供體的制備方法， 其特征是，所述反應(yīng)，其壓力為5atm-10atm。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的葡萄糖酸改性殼聚糖親核N0供體的制備方法，其 特征是，所述對殼聚糖或0-羧甲基殼聚糖上的NH2基團(tuán)進(jìn)行羧基化改性，是通過 葡萄糖酸分子上的-C00H羧基基團(tuán)跟殼聚糖或0-羧甲基殼聚糖上的麗2基團(tuán)進(jìn)行 縮聚脫水制得。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的葡萄糖酸改性殼聚糖親核NO供體的制備方法， 其特征是，所述殼聚糖或0-羧甲基殼聚糖的NH2基團(tuán)進(jìn)行羧基化改性后，其產(chǎn)物 在超純水中透析，除去未反應(yīng)得小分子物質(zhì)，然后烘干。
8、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的葡萄糖酸改性殼聚糖親核N0供體的制備方法，其 特征是，所得到的親核NO供體為無色和白色膜狀或粉紅色粉末狀物質(zhì)，儲存于 -2(TC的干燥器內(nèi)。
全文摘要
一種葡萄糖酸改性殼聚糖親核NO供體及其合成方法，屬于醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明對殼聚糖或O-羧甲基殼聚糖上的NH₂基團(tuán)進(jìn)行羧化反應(yīng)改性，使其產(chǎn)生能夠與NO反應(yīng)的親核NH基團(tuán)。葡萄糖酸改性殼聚糖或O-羧甲基殼聚糖分子上的仲胺NH基團(tuán)同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行反應(yīng)，其中Na⁺/NH＝2，產(chǎn)生[N(O)NO]^-基團(tuán)，所得到的葡萄糖酸改性殼聚糖或O-羧甲基殼聚糖親核NO供體分子結(jié)構(gòu)式如下。本發(fā)明親核NO供體具有不同的NO釋放速率和較大的負(fù)載量，同時能夠克服親核試劑(多胺)的細(xì)胞毒性和避免致癌性副產(chǎn)物亞硝胺的生成，并且有一定的靶向能力。R＝H，CH₂COONa
文檔編號A61K47/48GK101195031SQ200710172590
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者萬錒俊, 燕 孫, 張隱西, 李慧麗 申請人:上海交通大學(xué)