吡喃糖氧化酶及其表達純化方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種吡喃糖氧化酶，利用基因工程技術(shù)制備吡喃糖氧化酶多肽鏈，構(gòu)建重組質(zhì)粒、重組表達并且純化，測定吡喃糖氧化酶的活性，然后配置試劑盒檢測人血清中的葡萄糖含量，試劑盒包括試劑Ⅰ和試劑Ⅱ兩部分。本發(fā)明的有益效果是：通過基因工程重組表達吡喃糖氧化酶，該酶產(chǎn)量高、工藝簡單、穩(wěn)定性好、成本低；利用計算機軟件分析了吡喃糖氧化酶的氨基酸序列，并根據(jù)大量文獻研究，選用了不同種屬的吡喃糖氧化酶中同源性高的多肽鏈，表達了有功能性的多肽，既保證了吡喃糖氧化酶的活性，又保證重組蛋白的可溶性表達，較容易表達純化和使用，過程簡單；吡喃糖氧化酶法檢測血糖的方法簡單、穩(wěn)定、準確，能較好地抗VC、溶血、乳糜、黃疸的干擾。
【專利說明】
吡喃糖氧化酶及其表達純化方法和應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種吡喃糖氧化酶及其表達純化方法和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血清中檢測葡萄糖含量的方法主要包括葡萄糖氧化酶法和己糖激酶法。葡萄糖氧 化酶法是利用葡萄糖氧化酶(GOD)催化D-葡萄糖的第一個碳原子形成葡萄糖酸內(nèi)酯，己糖 激酶法是利用己糖激酶(HK)催化葡萄糖和ATP發(fā)生磷酸化反應，生成葡萄糖-6-磷酸與ADP。 這是目前臨床上測定血清中葡萄糖含量的應用較多的方法。吡喃糖氧化酶（P R 〇 D，E C 1.3.10)能催化一類碳水化合物在第二個碳原子上發(fā)生反應生成2-酮基類衍生物和過氧化 氫。D-葡萄糖是吡喃糖氧化酶高度特異的底物，具有較小的Km值(0.83mM-3. ImM)，但是葡萄 糖氧化酶的Km值是33mM。而且葡萄糖氧化酶和己糖激酶只能作用于β-D-葡萄糖，而吡喃糖 氧化酶能作用于α-和β-D-葡萄糖，這些特性使得吡喃糖氧化酶可直接可測定血清中或事物 中的葡萄糖，不需要變旋酶的作用。
[0003] 近年來大量研究表明，吡喃糖氧化酶能催化血清中的1，5-脫水-D-山梨醇（1，5_ anhydro-D-glucitol，I，5-AG)，這是一個新的用于糖尿病診斷和監(jiān)控的客觀指標。I，5-AG 水平的下降與血液中葡萄糖濃度存在密切關(guān)系。目前我們通常采用空腹血糖、糖化血紅蛋 白、果糖胺等葡萄糖相關(guān)物質(zhì)作為代謝指標?？崭寡欠从沉思磿r的血糖水平。果糖胺 (FMN)反映近2-3周的平均血糖水平，糖化血紅蛋白（HbAlc)反映2-3個月平均血糖水平，1， 5-AG恰恰能反映近期內(nèi)（1-數(shù)日）的平均血糖值，特別是最近的尿糖排泄情況。單獨使用各 項指標時糖尿病的靈敏度是I，5-AG>HbAl c >空腹血糖>FMN，可見用一項指標診斷糖代謝 異常，I，5-AG效果最好。由此可見，吡喃糖氧化酶在糖尿病診斷中的應用前景廣闊。
[0004] 吡喃糖氧化酶是由擔子菌綱的微生物產(chǎn)生的一類葡萄糖2位氧化酶，在以D-葡萄 糖為底物，分子氧作為電子受體時呈現(xiàn)最高活性，在pH 6.2和50°C時表現(xiàn)最大活性;在pH 5.0-7.4之間穩(wěn)定，大于70°C時完全失去活性。Ag+、Cu2+和對氯高汞苯甲酸(PCMB)能抑制活 性。PROD是已知酶中較大的含黃素蛋白的酶，由623個氨基酸殘基構(gòu)成，由共價結(jié)合的黃素 腺嘌呤二核苷酸(FAD)形成多肽鏈，由相對分子質(zhì)量為65X IO3的相同的4個亞單位組成，總 的相對分子質(zhì)量為290 X IO3。
[0005] 目前吡喃糖氧化酶主要是通過真菌類微生物的提取獲得，但產(chǎn)量低、純化工藝繁 雜，因此用基因工程方法構(gòu)建更優(yōu)良的PROD生產(chǎn)菌株一直受到高度重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:基于上述問題，本發(fā)明提供一種吡喃糖氧化酶及其 表達純化方法和應用。利用基因工程技術(shù)制備吡喃糖氧化酶多肽鏈，構(gòu)建重組質(zhì)粒、重組表 達并且純化，測定吡喃糖氧化酶的活性，然后配置試劑盒，檢測人血清中的葡萄糖含量。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的一個技術(shù)方案是：一種吡喃糖氧化酶，吡喃糖氧 化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示;編碼吡喃糖氧化酶的基因如SEQ ID N0:2所示的核 苷酸序列。
[0008] 吡喃糖氧化酶的表達方法是:通過表達載體質(zhì)粒在大腸桿菌菌株BL21中采用IPTG 進行誘導表達，采用裂解法釋放吡喃糖氧化酶后得到重組吡喃糖氧化酶。
[0009] 吡喃糖氧化酶的純化方法是:采用HiS-Trap FF crude柱純化吡喃糖氧化酶，平衡 柱子后加入蛋白粗提物，洗脫吡喃糖氧化酶，收集各步洗脫液，SDS-PAGE電泳分析蛋白純化 情況;采用Sephadex G-25脫鹽柱脫鹽，平衡柱子后加入純化的蛋白，脫鹽液脫鹽，收集各步 洗脫液，SDS-PAGE電泳分析蛋白純化情況，Bradf ord法測定蛋白濃度后備用。
[0010] 進一步地，吡喃糖氧化酶的純化過程中添加與吡喃糖氧化酶共價結(jié)合的輔助因子 黃素腺嘌呤二核苷酸。
[0011] 純化的吡喃糖氧化酶檢測人血清中的葡萄糖，檢測方法是:利用吡喃糖氧化酶將 人血清中葡萄糖氧化生成過氧化氫，過氧化氫與4-氨基安替吡啉和苯酚類顯色系統(tǒng)在過氧 化酶催化下生成有色物質(zhì)，進行比色分析從而測定人血清中葡萄糖的含量。
[0012] 吡喃糖氧化酶制備測定人血清中葡萄糖的含量的試劑盒，試劑盒包括試劑I和試 劑Π 兩部分，其中試劑I含有4-氨基安替吡啉、過氧化氫酶、抗壞血酸氧化酶、表面活性劑、 緩沖液、防腐劑和穩(wěn)定劑;試劑Π 含有吡喃糖氧化酶、2-羥基-3-間苯胺丙磺酸鈉、亞鐵氰化 鉀、牛血清白蛋白、緩沖液、防腐劑和穩(wěn)定劑。
[0013] 進一步地，每升試劑I溶液中各組分的含量為： 4-氨基安替吡啉 d 1~IOmmol 過氧化氫酶 1~50KI 抗壞血酸氧化酶 1~20KI:
[0014] 表面活性劑 Q. 01~10% 緩沖液 1~50(M[ 防腐劑 0.01~10%
[0015]穩(wěn)記劑 0. 0卜H0%;
[0016]每升試劑Π 溶液中各組分的含量為： 吡喃糖氧化酶 1~50KU 2-經(jīng)基-3-間苯胺丙磺酸鈉 1~50皿11〇1. 亞鐵氰化鉀 0.01~10%
[0017] 牛血清白蛋白 0·〗~10% 緩沖液 1~50(M丨 防腐劑 0.01~10% 穩(wěn)定劑 0,01~10:1。
[0018] 進一步地，每升試劑I溶液中各組分的含量為： 4-氨基安替吡啉 Immol 過氧化氫酶 2KU 抗壞血酸氧化酶 IIU
[0019] 表面活性劑 〇, 0:1% 緩沖液 50mM 防腐劑 〇 OA 穩(wěn)定劑 0.0S%·，
[0020] 每升試劑Π 溶液中各組分的含量為： 吡喃糖氧化酶 10KI; 2-羥基-3-間苯胺丙磺酸鈉 2mmol
[0021] 亞鐵氰化鉀 0.01% 牛血清白蛋白 1% 緩沖液 SOmM 防腐劑 0, 1%
[0022] 穩(wěn)定劑 0.75%。
[0023] 進一步地，表面活性劑為曲拉通X-100、B66、吐溫20、十二烷基苯磺酸鈉、甜菜堿、 十六烷基三甲基溴化銨中的一種或幾種。
[0024] 進一步地，穩(wěn)定劑與防腐劑為疊氮鈉、疊氮鋰、PC300、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、對羥基 苯甲酸丙酯、聚乙二醇、聚乙烯醇、乙二胺四乙酸二鈉中的一種或幾種。
[0025] 本發(fā)明的有益效果是：（1)本發(fā)明通過基因工程重組表達吡喃糖氧化酶，該酶產(chǎn)量 高、工藝簡單、穩(wěn)定性好、成本低；
[0026] (2)本發(fā)明利用計算機軟件分析了吡喃糖氧化酶的氨基酸序列，并根據(jù)大量文獻 研究，選用了不同種屬的吡喃糖氧化酶中同源性高的多肽鏈，表達了有功能性的多肽，既保 證了吡喃糖氧化酶的活性，又保證重組蛋白的可溶性表達，較容易表達純化和使用，過程簡 單；
[0027] (3)本發(fā)明對吡喃糖氧化酶進行了表達和純化，破碎后上清液經(jīng)一步親和層析純 化得到蛋白，可溶性蛋白占總蛋白量超過50%，PROD的表達量達200mg/L;使用Ni2+親和層析 柱對重組蛋白進行純化，再通過Sephadex G-25脫鹽柱脫鹽后，蛋白純度達到95 %以上;在 整個純化過程中通過添加與PROD共價結(jié)合的輔助因子黃素腺嘌呤二核苷酸，保證了 PROD的 良好活性；
[0028] (4)建立了基于PROD催化反應產(chǎn)物葡萄糖生成過氧化氫反應測定PROD酶活性的方 法，純化后的PROD單位酶活為50U/mg;
[0029] (5)吡喃糖氧化酶法檢測血糖的方法簡單、穩(wěn)定、準確，能較好地抗VC、溶血、乳糜、 黃疸的干擾。
【附圖說明】
[0030] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進一步說明。
[0031] 圖1是本發(fā)明的吡喃糖氧化酶的重組質(zhì)粒的測序結(jié)果圖；
[0032]圖2是本發(fā)明的試劑盒線性范圍圖；
[0033] 圖3是本發(fā)明的試劑盒與血糖氧化酶法檢測臨床樣本的相關(guān)性圖；
[0034] 圖4是本發(fā)明的試劑盒與血糖己糖激酶法檢測臨床樣本的相關(guān)性圖。
【具體實施方式】
[0035]現(xiàn)在結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，以下實施例旨在說明本發(fā)明而不是 對本發(fā)明的進一步限定。
[0036] -、吡喃糖氧化酶及其表達純化
[0037] (1)吡喃糖氧化酶氨基酸序列的篩選
[0038] 利用DNAT00LS、ANTHEPR0T等生物信息軟件，通過計算機分析比對不同種屬的吡喃 糖氧化酶的氨基酸序列，得到同源性高的氨基酸序列。再結(jié)合大量文獻資料，篩選得到以下 穩(wěn)定性好、酶活性高的吡喃糖氧化酶的氨基酸序列為： MSTSSSDPFFNFAKSSFRSAAAQKASASSLPPLPGPDKKVPGMDIKYDVVIVGSGPIGCTYARELVGAGYKVAMFDI GEIDSGLKIGAHKKNTVEYQKNIDKFVNVIQGQLVSVSVPVNTLVVDTLSPTSWQASTFFVRNGSNPEQDPLRNLSG QAVTRVVGGMSTHWTCATPRFDREQRPLLVKDDADADDAEWDRLYTKAESYFQTGTDQFKESIRHNLVLNKLAEEYK GQRDFQQIPLAATRRSPTFVEWSSANTVFDLQNRPNTDAPEERFNLFPAVACERVVRNASNSEIESLHIHDLISGDR FEIKADVYVLTAGAVHNTQLLVNSGFGQLMRPNPTNPPELLPSLGSYITEQSLVFCQTVMSTELIDSVKSDMTIRGT PGELTYSVTYTPGASTNKHPDWWNEKVKNHMMQHQEDPLPIPFEDPEPQVTTLFQPSHPWHTQIHRDAFSYGAVQQS IDSRLIVDWRFFGRTEPKEENKLWFSDKITDAYNMPQPTFDFRFPAGRTSKEAEDMMTDMCVMSAKIGGFLPGSLPQ FMEPGLVLHLGGTHRMGFDEKEDSCCVNTDSRVFGFKNLFLGGCGNIPTAYGANPTLTAMSLAIKSCEYIKQNFTPS PFTSEAQ
[0039] 相對應的吡喃糖氧化酶的DNA序列為：
[0040] ATG TGT ACT AGC TCG TCA GAT CCG TTC TTT MG TTC GCC MG TCG TCT TTT CGC AGC GCT GCG GCC CAA AAG GCG AGC GCT TCC TCC TTG CCA CCC TTA CCC GGC CCT GAT AAA AAA GTA CCA. GGG ATG GAC： ATC AAA TAT GAC GTG GTG ATC GTT GGC TCA GGG CCA ATC GGT TGT ACG TAC GCC CGT GAA CTT GTA GGC GCG GGC TAC AAA GTT GCA ATG TTT GAC ATC GGT GAA ATT GAC AGC GGA CTT AAG ATC GGC GCA CAC AAG AAG AAT ACG GTC GAA TAT CAA AAG AAC ATC GAT MG TTC GTC AAT GTG ATT CAG GGG CAG TTG GTG TCC GTG AGC GTC CCC GTC AAC ACA TTA GTT GTA GAT ACG CTG TCT CCT ACT TCT TGG CAA GCA AGT ACG TTC TTT GTA CGC MT GGC TCT AAT CCC GAG CAG GAT CCT CTT AGA AAT TTG TCG GGA CAG GCT GTA ACC AGA GTT GTT GGA GGA. MG TCC ACG CAT TGG ACA TGT GCA ACC CCG CGC TH GAT CG丁 GAA CAG CGC CCA TTG TTG GTA AAA GAT GAT GCG GAT GCT GAC GAT GCA GAA TGG GAC CGG TTA TAT ACG AAA GCA GkG TCA TAC TTT CAA ACA GGA ACC GAC CAA TTC AAA GAA TGT ATA CGG CAC AAT TTG GTC TTG AAC AAA CTT GCA GAG GM TAT AAG GGG CAG CGC GAT TTC CAA CAG ATT CCG CTT GCG GCT ACC AGA AGA AGT CCA ACC TTC GTA GAG TGG TCC AGC GCC MT ACA GTT TTT GAC TTG CAG AAT CGG CCG AAC ACA GAT GCG CCT GAA GAG CGG TTC AAT TTG TTC CCA GCC GTT GCG TGC GAG CGC GTC GTT CGC AAT GCG AGT AAC TCT GAG ATT GAG TCA CTT CAC ATA CAT GAT CTG ATC TCA GGA GAT AGA TTT GAG ATC AAA GCG GAC GTT TAT GTT TTA ACG GCA GGG GCG GTT CAC AAT ACG CAG CTT CU GTA AAC TCT GGT TTC GGC CAA TTA ATG CGC CCC AAT CGT ACC AAC CCG CCG GAG GTT TTG CGA AGT CTG GGA XGA TAT ATC ACA GAA CAG TCA
[0041] TTA GTC TTT TGT CAA ACA GTT ATG TCA ACA GAA TTG ATT GAC TGC GTC AM TCA GAC ATG ACC ATC AGA GGG ACC CCC GGA GAG CTT ACG TAT TCG GTT AGG TAT ACT CCG GGG GCT TCC ACG AAC AAA CAT CCA GAC TGG TGG AAC GAA AAG GTA AAG AAT CAT ATG ATG CAG CAT CAA GAG GAT Cd TTA tX'C ATT CCC TTT GAA GAT CCA GAG CCA CAG GTT ACC ACA TTA TTT CAG CCG TCC CAT CCT TGG CAC ACA CAA ATC CAC AGA GAC GCT TTT TCG TAT GGC GCG GTG CAA CAA TCC ATC GAT TCG CGC TTA ATC GTA GAT TGG CGC TTC TTC GGA CGT ACA GAA CCT AAA GAG： GAG AAC AAG TTA TGG TTC TCA GAT AAG ATA ACT GAT GCT TAC AAT ATG CCA CAG CCA ACA TTC GAC TTT AGA TTC CCC GCA GGA AGA ACC TCA AAA GAA GOT GAA GAC ATG ATG ACC GAC ATG TGT GTT ATG TCG GCA AM ATT GGC GGG TTC CTT CCA GGG TCG TTG CCA CAA TTC ATG GAG CCC GGC CTT GTG TTA CAC CTG GGC GGA ACT CAC CGC ATG GGC TTT GAC GAG AAA GAA QAC AGC TGT TGC GTG AAC AGT GAT TCG CGT GTT TTC GGT TTT AAG AAT CTG TTC CTG GGC GGC TGT GGA AAC ATT CCG ACA GCG TAC GGA GCA AAC CCC ACA CTG ACT GCG ATG TCA TTA GCT ATA AAA TCT ieT GAG TAT ATT AAA CAG MT TTT ACT CCA AGC CCC TTT ACA TCC GAA GCG CAA
[0042] (2)吡喃糖氧化酶的蛋白序列的基因克隆、重組質(zhì)粒的構(gòu)建、重組質(zhì)粒的篩選與鑒 定均委托公司完成。測序結(jié)果見圖1。
[0043] (3)融合蛋白的表達
[0044]將由公司構(gòu)建好而且鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，轉(zhuǎn)化子接 種至含5mL LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50yg/mL)的試管內(nèi)，37°C250rpm搖床培養(yǎng)過夜。將過夜 培養(yǎng)的菌體按照1 %的比例轉(zhuǎn)種于250ml LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素50yg/mL)。37°(：搖床培養(yǎng) 至0D600到0.6-0.8。從重組菌中取IOmL培養(yǎng)液作為未誘導對照，在剩下的培養(yǎng)液中加 IPTG 至終濃度0. lmmol/L，37°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導3h，離心收集菌體進行SDS-PAGE檢測，重組子 表達分子量為大約71kD的融合蛋白，蛋白純度達到90%以上，而對照菌無此蛋白帶。
[0045] (4)表達融合蛋白的純化和脫鹽
[0046] His-Trap FF crude柱、Sephadex G-25柱由GE Healthcare公司產(chǎn)品，其余試劑均 為國產(chǎn)或進口分析純試劑。
[0047] 1、將250ml誘導表達融合蛋白的工程菌離心（8000印111、101^11、4°(：)收菌，菌體重懸 于原培養(yǎng)液1/10體積的裂解液(PBS PH7.4、500mmol/L NaCl、20mmol/L咪唑、50ymol/L黃素 腺嘌呤二核苷酸(FAD))內(nèi)，冰浴超聲破菌lOmin，離心（12000印111、101^11、4°(：)，收集上清。
[0048] 2、His_Trap FF crude柱純化蛋白
[0049] 將His-Trap FF crude柱連接到蠕動栗，先用平衡液PBS pH7.4、500mmol/L NaCl、 20mmol/L咪唑沖洗平衡，然后將上步獲得的裂解緩沖液經(jīng)0.22微米濾器過濾后上樣，上樣 流速為lmL/min。上樣結(jié)束后再用10倍柱床體積平衡液（PBS pH7.4、500mmol/L NaCU 20mmo 1/L咪唑）平衡，流速為1.5ml/min，最后用5倍柱床體積洗脫緩沖液（500mM咪唑、PBS pH7.4、500mmol/L NaCl pH 8.0)，每管Iml收集洗脫液，然后每管取15微升進行SDS-PAGE電 泳，取含分子量為71kD目的蛋白量較多、較純的管，備用。
[0050] 3、Sephadex G-25脫鹽柱脫鹽
[0051 ] 將5ml Sephadex G-25S脫鹽柱連接到蠕動栗，先用平衡液50mmolTris-HCl、 150mmol/L NaCl、50ymol/L FAD沖洗2-3倍柱體積平衡，然后將上步純化的蛋白經(jīng)0.22微米 濾器過濾后上樣1-1.5mL，上樣流速為lmL/min。上樣結(jié)束后再用2-3倍柱床體積脫鹽液 (50mmolTris_HCl、150mmol/L NaCl、50ymol/L FAD)脫鹽，流速為lmL/min，用試管收集前2-2.5ml的目的蛋白。然后取15微升進行SDS-PAGE電泳。用Bradf ord法測定蛋白濃度后備用。 [0052] (5)吡喃糖氧化酶活性的測定
[0053] 酶的活性檢測在反應體系為3mL lOOmmol/L MES緩沖液，pH 6.0中進行，包含 131mmol/L D-葡萄糖、0.2mmol/L 4-氨基安替比林(4AA)、0.3mmol/L 2-羥基-3-間甲苯胺 丙磺酸鈉(TOOS)和過氧化物酶(POD)JTcC預孵育5min后，加入適量酶液，在546nm波長下連 續(xù)測定2-3分鐘的吸光度值，得到酶的每分鐘吸光度值的變化(A0D樣本），以不加酶液的反 應液為對照，得到空白樣本的每分鐘吸光度值的變化(A0D空白）。
[0054] 按照計算公式:酶活(U/ml) = A0D/min(A0D樣本-AOD空白）X I ·89Χ稀釋倍數(shù) (df)，得到吡喃糖氧化酶(PROD)的酶活力。
[0055] 二、吡喃糖氧化酶的應用
[0056] (1)純化的吡喃糖氧化酶檢測人血清中的葡萄糖
[0057]通過吡喃糖氧化酶(PROD)將樣本中葡萄糖(GLU)氧化生成過氧化氫(H2O2)，過氧化 氫再在過氧化酶(POD)催化下，借4-氨基安替吡啉(4AA)和苯酚類顯色系統(tǒng)，生成有色物質(zhì)， 在特定的波長下檢測吸光度，從而測定出樣本中葡萄糖的含量。
[0058] (2)制備測定人血清中葡萄糖的含量的試劑盒
[0059] 1、檢測試劑盒的用法：
[0060] Rl試劑:在50mM PH8.0的TRIS-HCL緩沖液中，添加 lmmol/L 4-AA、2KU/L P0D、1KU/ L抗壞血酸氧化酶(ASOD)、0.01 %曲拉通X-100、0.1 %疊氮鈉，攪拌均勻即為Rl試劑。
[0061 ] R2試劑：在50mM ρΗ8·0的TRIS-HCL緩沖液中，添加 10KU/L PR0D、2mmol/L 2-羥基- 3_間苯胺丙磺酸鈉(T00S)、0.01 %亞鐵氰化鉀、1 %BSA、0.75 %EDTA、0.1 %疊氮鈉，攪拌均 勻即為R2試劑。
[0062]葡萄糖校準品:在12mmol/L的苯甲酸溶液中，加入5mmol/L的葡萄糖。
[0063]檢測方法：
[0064]以日立7080生化分析儀為例：測定波長是546nm，測定方法是2點終點法。樣品量 3uL，R1試劑21 OuL，R2試劑70u 1，校準方式是線性測定，反應方向是向上。校準品與R1混合 后，在反應第16點讀取吸光度值A(chǔ)l，加入R2,在31點讀取吸光度值A(chǔ)2,計算吸光度差值δΑ = A 2 - A 1。取待測樣本，同法測定樣本的吸光度差值，將其代入公式 GUJ含量（mmol/L) = χ校準品中葡碰的含量，即可計算得出 ?ΚΗΕΙΗΚηΒΚιΚΙΒ 待測樣本中的GLU的含量。
[0065] 2、靈敏度檢測：以蒸餾水作樣本連續(xù)檢測20次，取其均值+3s作為最低檢測限，即 為該方法的靈敏度。試驗所得本法的靈敏度為:0. 〇54mmo 1/L。
[0066] 3、線性范圍檢測：取臨床高值混合血清(39mmol/)用生理鹽水進行倍比稀釋，得到 9個濃度的稀釋血清，每個濃度的稀釋血清重復檢測3次，取其均值，將實測值與理論值進行 直線回歸分析。如圖2統(tǒng)計分析顯示該方法的回歸方程為：y = 0.99lx+0.177R2 = 0.999P〈 0.05，該方法在0.61~39mmol/L內(nèi)線性較好(見表1)。
[0067]表1本發(fā)明試劑盒線性范圍
[0070] 4、重復性檢測：批內(nèi)重復性試驗：取三份高（19.82mmol/L)、中（7.61mmol/L)、低 (3.02mmol/L)臨床樣本混合血清連續(xù)檢測20次，則其變異系數(shù)分別為0.55 %、1 %、0.87% (見表2);日間重復性試驗：每日檢測臨床生化高（21.6mmol/L)、中（12.2mmol/L)、低 (2.4111111〇1/1)質(zhì)控血清一次，連續(xù)檢測20天，則其變異系數(shù)分別為1.04%、2.16%、2.21% (見表3)。
[0071] 表2本發(fā)明試劑盒批內(nèi)重復性檢測(mmol/L) luu/oj d、IHiH乂IA1iH: I口JU ·ym丄I「由/7MK1 且懺奪 ·丄m丄土;tt￡：s￡7JM卞；整wn懺奪，I口JU ·ym丄 臨床低值樣本中分別加入0.1ml臨床高、中、低值樣本作為回收樣本，經(jīng)該方法檢測后計算 其回收率分別為102·4%、104·9%、97·1%。
[0076] 6、干擾試驗:基礎(chǔ)樣本：向0.9ml臨床中值樣本中加入0.1 ml生理鹽水;干擾樣本： 向0.9ml臨床中值樣本中分別加入0.1 ml系列稀釋的干擾物VC(最大100mg/L)、血紅蛋白（最 大14.2g/L)、脂肪乳(最大14g/L)及膽紅素(最大14g/L)。用本法分別測定基礎(chǔ)樣本及各干 擾樣本，可見在Vc含量100mg/dL時，其干擾率為正干擾0.66% (見表4);血紅蛋白含量為 14.2g/L時，其干擾率為正干擾1.45 % (見表5);甘油三脂在51.56mmol/L時，其干擾率是負 干擾0.4%(見表6);膽紅素在545以111〇1/1時，其干擾率是負干擾2.7%(見表7)。
[0077]表4本發(fā)明試劑盒維生素 C干擾實驗結(jié)果(mmol/L)
[0085] 7、本發(fā)明試劑盒與血糖氧化酶法和己糖激酶法試劑盒臨床樣本的相關(guān)性檢測
[0086] 在0.61~39mmol/L內(nèi)選擇50例臨床樣本，分別用本法、已糖激酶法(羅氏醫(yī)學診斷 公司）及葡萄糖氧化酶法(羅氏醫(yī)學診斷公司）檢測，得到本法與氧化酶法的回歸方程為:y =0.984x-0.06IR2 = 0.996P〈0.05 (見圖3)，本法與已糖激酶法的回歸方程為:7 = 0.970叉-0.138R2 = 0.997P〈0.05(見圖 4)。
[0087]我國目前血清中檢測葡萄糖含量的方法主要包括葡萄糖氧化酶法和己糖激酶法。 這兩種酶原料的生產(chǎn)主要是天然純化，產(chǎn)量低、工藝繁雜、穩(wěn)定性差，而且主要依賴進口廠 家生產(chǎn)。吡喃糖氧化酶與葡萄糖氧化酶、己糖激酶法相比，對底物D-葡萄糖親和力更高，反 應速率更快。而且吡喃糖氧化酶能作用于α-和β-D-葡萄糖，不需要另加變旋酶。同時，本發(fā) 明通過基因工程重組表達吡喃糖氧化酶，該酶產(chǎn)量高、工藝簡單、穩(wěn)定性好、成本低。
[0088] 本發(fā)明利用計算機軟件分析了吡喃糖氧化酶的氨基酸序列，并根據(jù)大量文獻研 究，選用了不同種屬的吡喃糖氧化酶中同源性高的多肽鏈，表達了有功能性的多肽，既保證 了吡喃糖氧化酶的活性，又保證重組蛋白的可溶性表達，較容易表達純化和使用，過程簡 單。
[0089] 本發(fā)明對吡喃糖氧化酶(PROD)進行了表達和純化，破碎后上清液經(jīng)一步親和層析 純化得到蛋白，可溶性蛋白占總蛋白量超過50%，PROD的表達量達200mg/L。使用Ni2+親和層 析柱對重組蛋白進行純化，再通過Sephadex G-25脫鹽柱脫鹽后，蛋白純度達到95 %以上。 在整個純化過程中通過添加與PROD共價結(jié)合的輔助因子黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，保證 了 PROD的良好活性。建立了基于PROD催化反應產(chǎn)物葡萄糖生成過氧化氫反應測定PROD酶活 性的方法，純化后的PROD單位酶活為50U/mg。
[0090] PROD配置的檢測人血清中葡萄糖含量的試劑盒檢測限是0.039mmol/L。線性范圍 0.61~39mmol/L。批內(nèi)重復性變異系數(shù)CV ^ 5%，日間重復性變異系數(shù)CV < 5%，平均回收率 是101 %，維生素 C 100mg/dL以下，血紅蛋白14.2g/L以下，甘油三酯51.56mmol/L以下，膽紅 素545ymol/L以下無顯著性干擾。該方法與葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法相關(guān)性良好。由此 可見，吡喃糖氧化酶法檢測血糖的方法簡單、穩(wěn)定、準確，能較好地抗VC、溶血、乳糜、黃疸的 干擾。
[0091] 以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完 全可以在不偏離本項發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進行多樣的變更以及修改。本項發(fā)明的技術(shù) 性范圍并不局限于說明書上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來確定其技術(shù)性范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種吡喃糖氧化酶，其特征是:所述的吡喃糖氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 示;編碼吡喃糖氧化酶的基因如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。2. 權(quán)利要求1所述的吡喃糖氧化酶的表達純化方法，其特征是:所述的吡喃糖氧化酶的 表達方法是:通過表達載體質(zhì)粒在大腸桿菌菌株BL21中采用IPTG進行誘導表達，采用裂解 法釋放吡喃糖氧化酶后得到重組吡喃糖氧化酶。3. 權(quán)利要求1所述的吡喃糖氧化酶的表達純化方法，其特征是:所述的吡喃糖氧化酶的 純化方法是:采用His-Trap FF crude柱純化吡喃糖氧化酶，平衡柱子后加入蛋白粗提物， 洗脫P比喃糖氧化酶，收集各步洗脫液，SDS-PAGE電泳分析蛋白純化情況;采用Sephadex G-25脫鹽柱脫鹽，平衡柱子后加入純化的蛋白，脫鹽液脫鹽，收集各步洗脫液，SDS-PAGE電泳 分析蛋白純化情況，Bradford法測定蛋白濃度后備用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的吡喃糖氧化酶的表達純化方法，其特征是:所述的吡喃糖氧化 酶的純化過程中添加與吡喃糖氧化酶共價結(jié)合的輔助因子黃素腺嘌呤二核苷酸。5. 權(quán)利要求1所述的吡喃糖氧化酶的應用，其特征是:純化的吡喃糖氧化酶檢測人血清 中的葡萄糖，檢測方法是:利用吡喃糖氧化酶將人血清中葡萄糖氧化生成過氧化氫，過氧化 氫與4-氨基安替吡啉和苯酚類顯色系統(tǒng)在過氧化酶催化下生成有色物質(zhì)，進行比色分析從 而測定人血清中葡萄糖的含量。6. 權(quán)利要求1所述的吡喃糖氧化酶的應用，其特征是：制備測定人血清中葡萄糖的含量 的試劑盒，試劑盒包括試劑I和試劑Π 兩部分，其中試劑I含有4-氨基安替吡啉、過氧化氫 酶、抗壞血酸氧化酶、表面活性劑、緩沖液、防腐劑和穩(wěn)定劑;試劑Π 含有吡喃糖氧化酶、2-羥基-3-間苯胺丙磺酸鈉、亞鐵氰化鉀、牛血清白蛋白、緩沖液、防腐劑和穩(wěn)定劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的吡喃糖氧化酶的應用，其特征是： 每升試劑I溶液中各組分的含量為： 4-氨基安替吡啉 0:. 1~1 Ommol 過氧化氫酶 1~50KI: 抗壞血酸氧化酶 1~20KU 表面活性劑 0.01~10% 緩沖液 〗~500mM 防腐劑 0.01~10% 穩(wěn)定劑 0.01~10%; 每升試劑Π 溶液中各組分的含量為： 吡喃糖氧化酶 1~? 2-羥基-3-間苯胺丙磺酸鈉 1 1 亞鐵氰化鉀 0.01~10% 牛血清白蛋白 Q. 1~10% 緩沖液 1~,500mM 防腐劑 0.01~10% 穩(wěn)定劑 0.01~10%。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的吡喃糖氧化酶的應用，其特征是： 每升試劑I溶液中各組分的含量為： 4_氦基安替如:啉 Immol 過氧化氫酶 2HJ 抗壞血酸氧化酶 1KU 表面話性劑 0. 01% 緩沖液 SOmM 防腐劑 05% 穩(wěn)定劑 0.0；5%; 每升試劑Π 溶液中各組分的含量為： 吡喃糖氧化酶 ιοκυ 2_經(jīng)基_3_間苯胺丙橫酸納 2minol 亞鐵氰化鉀 0. 01% 牛血清白蛋白 1% 緩沖液 SOrnM 防腐劑 〇. 1% 穩(wěn)定劑 0.75%。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的吡喃糖氧化酶的應用，其特征是:所述的表面活性劑為曲拉通 x-l 00、B66、吐溫20、十二烷基苯磺酸鈉、甜菜堿、十六烷基三甲基溴化銨中的一種或幾種。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的吡喃糖氧化酶的應用，其特征是:所述的穩(wěn)定劑與防腐劑為 疊氮鈉、疊氮鋰、PC300、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、對羥基苯甲酸丙酯、聚乙二醇、聚乙烯醇、乙二 胺四乙酸二鈉中的一種或幾種。
【文檔編號】C12N15/53GK105861456SQ201610311783
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】周亞萍, 于海燕, 朱鈺峰, 曹利民
【申請人】常州英贊美科生物科技有限公司