專利名稱：用于下調(diào)h19的核酸物質(zhì)及其使用方法
用于下調(diào)H19的核酸物質(zhì)及其使用方法技術(shù)領(lǐng)域及背景技術(shù)本發(fā)明涉及用于下調(diào)H19的核酸物質(zhì)及其用于治療癌癥的用途。H19是第 一種被鑒定為顯示僅表達母系等位基因的人類印跡非蛋白編 碼基因。它還在小鼠中印跡。H19的圖譜顯示位于人類11號染色體短臂， 15.5帶，與小鼠7號染色體的區(qū)域同源。它屬于一組極有可能不編碼蛋白 產(chǎn)物的基因。H19基因在胚胎發(fā)生中豐富表達，但出生后在大部分組織中 關(guān)閉。然而，不同腫瘤研究已經(jīng)顯示相對于健康組織H19基因的再表達或 超表達。另外，在不同病因和譜系的癌癥中，在某些情況中觀察到等位基 因的異常表達模式。盡管除在成熟的某階段胚胎細胞和在絨毛外滋養(yǎng)母細 胞以外，H19顯示在發(fā)育過程中于大部分組織中為單等位基因表達，但是 在越來越多的癌癥中，已發(fā)現(xiàn)被稱為"印跡松弛"或"印跡喪失(LOI)"的該 基因的雙等位基因表達，例如肝細胞癌，白蛋白SV40 T抗原轉(zhuǎn)基因大鼠 的肝新生物(neoplasm)，肺腺癌，食管癌，卵巢癌，橫紋肌肉瘤，宮頸鱗 狀細胞癌，膀胱鱗狀細胞癌，頭和頸鱗狀細胞癌，結(jié)腸直腸、子宮以及睪 丸生殖細胞胂瘤。目前，幾乎30種癌癥顯示相對于健康組織H19基因表 達失調(diào)，具有或無LOI。對于最近的評述，參見Matouk等(Matouk等，2005， GeneTher Mol Biol)。還顯示在軟瓊脂測定和一些組合的免疫缺陷(SCID)小鼠中異位來源 的H19超表達賦予了乳房上皮細胞的增殖優(yōu)勢(Lottin等，2002， Oncogene 21,1625- 1631)。在通過注射絨毛膜癌衍生的細胞系(JEG-3)和膀胱癌細 胞系(T24P)的細胞形成的腫瘤中，H19水平與注射前細胞中的H19水平 相比非常高(Rachmilewitz等，1995， Oncogene 11， 863-870 )。另外，某些已知的致癌物上調(diào)H19基因的表達。在無LOI的吸煙者的 氣道上皮中檢測到H19 RNA水平的顯著升高(Kaplan等，2003, Cancer Res63, 1475-1482)。在大鼠膀胱癌模型中，BBN (已知的膀胱的致癌物)也 誘導(dǎo)H19基因的表達(Ariel等，2004， MolCarcinog 41， 69-76 )。類似地， 在小鼠肝細胞癌模型中，二乙基亞硝胺(已知的肝臟的致癌物)誘導(dǎo)H19 基因的表達(Graveel等，2001， Oncogene 20, 2704-2712 )。所有這些觀察 結(jié)果和其他觀察結(jié)果與最初H19是肺瘤抑制基因的提議相矛盾。對兩種僅在存在或無H19 RNA的情況下不同的同源細胞群中的基因 表達模式進行比較，已經(jīng)鑒定了 H19 RNA的大量下游效應(yīng)因子，其中有 先前報道在腫瘤發(fā)生過程的某些方面起關(guān)鍵作用的一組基因。H19 RNA的 存在可通過上調(diào)在侵襲、遷移和生成血管的途徑中起作用的基因而提高細 胞的侵襲、遷移和生成血管的能力，并能因此至少導(dǎo)致轉(zhuǎn)移級聯(lián)的初始步 驟。其他研究顯示了 H19通過作為HGF/SF的應(yīng)答基因在促進癌癥進展和 腫瘤轉(zhuǎn)移中的潛在作用。癌細胞中H19基因的特異性表達促進了其在診斷癌癥的臨床應(yīng)用中的 用途。因此，本發(fā)明發(fā)明人的美國專利No. 5,955,273教導(dǎo)了 H19基因作為紳 瘤特異性標記物的用途。惡性腫瘤及其分級——用于4企測兒童維爾姆斯氏腫瘤(Wilms' Tumor)中 惡性腫瘤的存在/不存在。疾病，如癌癥。然而，H19的下調(diào)顯示不減小腫瘤大小或體積，所教導(dǎo)的 能夠下調(diào)H19的特異和有效的siRNA物質(zhì)也是如此。另外，PCT公布號 WO 0403159沒有教導(dǎo)抗H19物質(zhì)作為用于治療癌癥的耳關(guān)合療法的部分。因此，存在用于癌癥治療的下調(diào)H19的方法和組合物的公認需要，并 且具有它們是非常有利的。發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種選自SEQIDNO:l、 2、 3和4的分離的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種藥物組合物，其包含藥學上可接受的載體和作為活性成分的至少一種選自SEQ ID NO: 1、 2、 3和4的分離的寡核苦酸。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種選自SEQ ID NO: 1、 2、 3和4的分離的寡核苷酸用于制備治療癌癥的藥劑的用途。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種治療癌癥的方法，所述方法包括(a) 給藥于具有相應(yīng)需要的受治療者能夠下調(diào)H19mRNA水平和/或 活性的治療有效量的物質(zhì)或在具有相應(yīng)需要的受治療者的細胞中表達能 夠下調(diào)H19 mRNA水平和/或活性的治療有效量的物質(zhì)，以及(b) 提供給所述受治療者一種癌癥療法，由此治療癌癥。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種能夠下調(diào)H19 mRNA水平和/或 活性的物質(zhì)用于制備聯(lián)合一種癌癥療法而治療癌癥的藥劑的用途。才艮據(jù)本發(fā)明的又一方面，纟是供了一種治療癌癥的方法，所述方法包括 給藥于具有相應(yīng)需要的受治療者治療有效量的至少一種選自SEQ ID NO: 1、 2、 3和4的寡核苷酸或在具有相應(yīng)需要的受治療者的細胞中表達治療 有效量的至少一種選自SEQ ID NO: 1、 2、 3和4的寡核苷酸，由此治療癌癥。才艮據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了 一種制品，其包含能夠下調(diào)H19 mRNA 水平和/或活性的物質(zhì)和鑒定為用于治療癌癥的另 一種抗癌劑。才艮據(jù)本發(fā)明下文所述的優(yōu)選實施方案的其他特征，所述能夠下調(diào)H19 mRNA水平和/或活性的物質(zhì)是一種核酸物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明下文所述的優(yōu)選實施方案的另一些其他特征，所述核酸物 質(zhì)選自(a)用于抑制H19RNA從H19基因轉(zhuǎn)錄的單鏈多核苷酸；(b )用于與H19 mRNA雜交由此導(dǎo)致H19 mRNA活性減小的單鏈多 核苦酸；(c) 導(dǎo)致H19mRNA降解的雙鏈多核苷酸；(d) 用于剪切H19mRNA的形成三鏈體的多核苷酸；(e) 用于剪切H19mRNA的催化的多核苷酸；(f) 用于與H19mRNA雜交而導(dǎo)致其酶解的單鏈多核苷酸；(g) 編碼(a)至(f)任一者的核酸序列。根據(jù)所述的優(yōu)選實施方案的另一些其他特征，所述核酸物質(zhì)選自 siRNA、核酶和DNA酶(DNAzyme )。根據(jù)所述的優(yōu)選實施方案的另 一些其他特征，所述核酸物質(zhì)是siRNA。根據(jù)所述的優(yōu)選實施方案的另一些其他特征，所述siRNA包含選自 SEQIDNO: 1-4的核酸序列。根據(jù)所述的優(yōu)選實施方案的另一些其他特征，所述給藥在原位進行。才艮據(jù)所述的優(yōu)選實施方案的另一些其他特征，所述癌癥選自兒童實 體瘤、維爾姆斯氏腫瘤、肝母細胞瘤、胚胎性橫紋肌肉瘤、生殖細胞瘤、 滋養(yǎng)層細胞瘤、睪丸生殖細胞瘤、卵巢非成熟型畸胎瘤、骶尾瘤、絨毛膜 癌、胎盤部位滋養(yǎng)層細胞瘤、成人上皮細胞瘤、膀胱癌、肝細胞癌、卵巢 癌、宮頸癌、肺癌、乳腺癌、頭頸鱗狀上皮細胞癌、食道癌、神經(jīng)原性腫 瘤、星形細胞瘤、惡性神經(jīng)節(jié)瘤、神經(jīng)母細胞瘤。根據(jù)所述的優(yōu)選實施方案的另一些其他特征，所述癌癥是膀胱癌或肝 細胞癌。根據(jù)所述的優(yōu)選實施方案的另一些其他特征，所述能夠下調(diào)H19 mRNA水平和/或活性的物質(zhì)與其他抗癌劑 一起配制。本發(fā)明通過提供單獨或聯(lián)合用于治療癌癥的能夠下調(diào)H19 RNA的核 苷酸物質(zhì)成功解決了目前已知狀況的缺點。除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng) 域技術(shù)人員公知的相同含義。盡管在本發(fā)明的實踐或試驗中可使用與本文 所述的那些相似或等同的方法和材料，但下文描述了合適的方法和材料。 本文^是到的所有/>布、專利申請、專利和其他參考文獻通過引用完整并入本申請。在矛盾的情況中，專利說明書，包括定義可控制。另外，所述材 料、方法以及實施例僅用作說明而非意于限制。附圖簡述本文僅通過參考附圖的舉例方式描述了本發(fā)明?，F(xiàn)在具體提及附圖， 強調(diào)所示細節(jié)通過舉例說明，并且僅為了描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，而 且出于提供認為是本發(fā)明原理和概念方面最有用和容易理解的描述的內(nèi) 容的目的而提供。在這方面，沒有試圖以比本發(fā)明的基本理解所需的更詳 細的方式顯示本發(fā)明的結(jié)構(gòu)上的細節(jié)，對于附圖所作的描述使得本發(fā)明的 幾種形式如何在實踐中實施對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在附圖中

圖1A-F是描述在人類胚胎和胎盤樣品中H19的可選剪接變體的存在 的照片和示意圖。圖1A是顯示H19基因位置的11號染色體的示意圖，其 包括5個外顯子(El-5)(實心框)和4個短內(nèi)含子(框之間的線)。通過 水平箭頭標記在PCR反應(yīng)中使用的引物的位置，它們是轉(zhuǎn)錄起始位點下游 的117和816位堿基。缺少的剪接片段通過灰色框表示。圖1B-D是RT-PCR 反應(yīng)的溴化乙4t染色的凝月交照片。分析了下列細胞Hep3B和SKHepl (肝 細胞癌細胞系)；RT4和Umuc3 (膀胱癌細胞系)；胎盤樣品妊娠早期(151 trim);胎塊，水泡狀胎塊；妊娠晚期(3fdtrim); LG-BC,低度惡性膀胱癌； HG-BC,高度惡性膀胱癌；NB,正常膀胱；NC，正常結(jié)腸；CClym,轉(zhuǎn)移 至淋巴結(jié)的結(jié)腸癌；CCliv，轉(zhuǎn)移至肝臟的結(jié)腸癌；CC，結(jié)腸癌；在圖1B-D 中，由C標記的泳道是指陰性對照；M是指100bp梯標記。產(chǎn)物的大小 在右側(cè)顯示。圖1E是RNA酶保護測定的照片。箭頭表示可選的剪接變體 344個堿基在妊娠末三個月的胎盤組織中存在。還檢測了通過RT-PCR反 應(yīng)不能檢測到的表示另一可選的剪接變體存在的兩個其他的帶。圖1F是 可選的剪接變體的部分序列分析，揭示了從外顯子1開始的366個》咸基的 跳躍區(qū)(skipping region )。下劃線的序列表示剪接連接。(核苷酸編號在起 始密碼子開始)。圖2A-B是溴化乙錠染色凝膠的照片，描述了增加濃度的CoCl2對Hep3B細胞中H19RNA表達水平的影響。圖2A描述了 Hep3B細胞中H19 基因的RT-PCR產(chǎn)物。圖2B描述了 GADPH基因的RT-PCR產(chǎn)物作為Hep3B 細胞中RT-PCR完整性的陽性對照。對于圖2A和2B,分別為未處理的 Hep3B(泳道l); 50、 100、 200、 300和400 pM CoCl2處理的細胞(泳道 2、 3、 4、 5及6)。圖3A-F是描述使用本發(fā)明的siRNA體外下調(diào)H19的效果的條形圖和 照片。圖3A-C是溴化乙錠染色的凝膠，描述了通過RT-PCR分析檢測的 在正常培養(yǎng)條件(圖3A )和低氧模擬條件(圖3B )下不同H19 siRNA雙 鏈體對Hep3B細胞系中H19表達水平的影響。圖3A描述了使用非相關(guān)的 靶向熒光素酶基因的siRNA雙鏈體(泳道1 )和使用四種H19 siRNA雙鏈 體(泳道2-5 ) ( SEQ ID NO: 1-4 )和它們的等摩爾混合物(泳道6 )以及 無siRNA的lipofectamine 2000(Mock)(泳道7 )轉(zhuǎn)染的Hep3B細胞。注意， 所有受檢測的siRNA物質(zhì)(SEQ ID NO: 1-4)至少可以50%有效地降低 H19的mRNA水平。C二PCR空白。圖3B和3C描述了在正常培養(yǎng)基中使 用靶向熒光素酶基因的siRNA雙鏈體(SEQ ID NO: 5)(泳道1和5 )和使 用不同的H19 siRNA雙鏈體(SEQ ID NO: 1 、 3及4)(泳道2- 4)轉(zhuǎn)染的Hep3B 細胞。轉(zhuǎn)染后24小時，更換培養(yǎng)基，并且除了泳道5以外添加含有100 pM CoCl2的培養(yǎng)基，泳道5顯示了在正常培養(yǎng)基中繼續(xù)生長的細胞。再培養(yǎng) 22小時。顯示了 H19(圖3B )和作為RT-PCR完整性的陽性對照的GADPH (圖3C )基因的RT-PCR產(chǎn)物。圖3D-E為溴化乙錠染色的凝膠，描述了通過RT-PCR分析檢測的在 正常培養(yǎng)條件和低氧條件下H19 siRNA雙鏈體(SEQ ID NO:l)對UMUC3 細胞系中H19表達水平的影響。對于圖3F和3G,分別為在含氧量正常的 條件中的GFP siRNA轉(zhuǎn)染的UMUC3細胞(泳道1 )和H19 siRNA-SEQ ID NO: l(泳道2),以及在低氧條件中的GFP siRNA轉(zhuǎn)染的UMUC3細胞(泳 道3 )和H19 siRNA (泳道4)。圖3F是條形圖，描述了在H印3B細胞中H19 siRNA(SEQ ID NO:3) 轉(zhuǎn)染之后低氧恢復(fù)后的集落數(shù)相對于GFP siRNA對照處理的細胞減少。圖4A-D為條形圖和照片，描述了 Hep3B細胞中瞬時的H19 RNA下調(diào)抑制體內(nèi)腫瘤發(fā)生。使用H19 siRNA 3 (SEQ ID NO: 3)或抗-Luc siRNA (SEQ ID NO: 5)瞬時轉(zhuǎn)染Hep3B細胞。轉(zhuǎn)染后48小時，使用PBS洗滌細 胞兩次，使用胰蛋白酶消化并計數(shù)。將接受抗H19 siRNA和抗-Luc siRNA 的1.5xl0"田胞皮下注射至CD-l棵小鼠的背部(二者均為n = 7,對于轉(zhuǎn) 染的才莫擬物n=4 )。在使用抗-Luc siRNA瞬時轉(zhuǎn)染的Hep3B接種的小鼠中， 接種后15天，觀察到可觸及的肺瘤。隨訪腫瘤體積并使用測徑器測量， 直至接種后第30天，之后處死小鼠。觀察到平均腫瘤重量(A) (士標準差) 和平均腫瘤體積(p0.03) (B) (士標準差)顯著(p〈 0.03)減小約82%。數(shù)值表示 處死動物之前和之后的端點。還顯示了在腫瘤外科暴露之前(C)和它們 的體內(nèi)腫瘤暴露之后(D )各組的2只小鼠的腫瘤的典型特征(1號小鼠和 2號小鼠是H19 siRNA3 (SEQ ID NO:3)處理的動物，3和4號小鼠是抗-Luc siRNA (SEQ ID NO: 5)處理的動物)。圖5A-D是條形圖和照片，描述了 siRNA-H19對人類膀胱癌細胞 UMUC3的體內(nèi)作用。在使用siRNA瞬時轉(zhuǎn)染之后48小時，將1百萬個 UMUC3細胞皮下注射至無胸腺小鼠(對于GFP siRNA (SEQ ID NO:6)， n=3,對于siRNA H19 (SEQ ID No:l), n=5)。在2/3的接受抗GFP-siRNA 瞬時轉(zhuǎn)染的UMUC3的小鼠中，6周后觀察到可觸及的腫瘤，而在接受 siRNAH19(i^5)的那些小鼠中無一觀察到可觸及的肺瘤。接種后8周處死 小鼠。描述了平均的腫瘤體積(B，PO.05)和平均的肺瘤重量(A，pO.06)。數(shù) 值表示在處死動物之前和之后的端點。照片描述了Y吏用抗GFP siRNA (C) 和siRNAH19 ( D )轉(zhuǎn)染的UMUC3接種的小鼠腫瘤的外部特征。圖6是條形圖，描述了在正常培養(yǎng)條件下，Hep3B細胞中的H19siRNA (SEQ ID NO: 3)轉(zhuǎn)染對增殖的影響。圖7A-D是條形圖和線圖，描述了 H19 siRNA(SEQ ID NO:l; SEQ ID NO: 3)或抗GFP siRNA (SEQ ID NO: 6)的瘤內(nèi)給藥對CD-I棵小鼠的先前 注射的人類膀胱癌細胞UMUC3 (圖7A-B ) SEQ ID NO: 1和Hep3B細胞 SEQ ID NO: 3 (圖7C-D)的影響。圖7A是線圖，描述了在將siRNA-H19(SEQ ID NO: l)或抗GFP siRNA注射至UMUC-3處理的小鼠之后，肺瘤體積隨 時間改變。圖7B是條形圖，描述了在將siRNA-Hl9或抗GFP siRNA注射至UMUC-3處理的小鼠之后腫瘤重量的變化。圖7C是條形圖，描述了在 將siRNA-H19或抗GFP siRNA注射至Hep3B處理的小鼠之后的腫瘤體積。 圖7D是條形圖，描述了在將siRNA-H19 (SEQ ID NO: 3)或抗GFP siRNA 注射至Hep3B處理的小鼠之后腫瘤重量的變化。圖8A-D是條形圖和照片，描述了 H19的異位表達對人類膀胱癌細胞 TA11(H19陰性)和TA31(H19高表達)體內(nèi)生長的影響將等量(2xl0"的 TA31H19高表達細胞和TAllH19-陰性細胞皮下移植至CD-1小鼠(各自 n=5)。兩周后，出現(xiàn)可觸及的腫瘤，并使用測徑器測量另外2周的腫瘤體 積。顯示了兩組平均腫瘤體積的端點測量值(圖8A)，它們的平均肺瘤體 積動力學(圖8B)以及衍生自TAllH19-陰性(圖8C)和TA3 1H19高表達 細胞(圖8D)的腫瘤的典型總體形態(tài)學。圖9A-C為照片，描述了由Hep3B細胞系的低氧應(yīng)激誘導(dǎo)H19 RNA， 以及針對H19的siRNA非常有效地阻止其誘導(dǎo)。使用抗H19 siRNA或抗 luc-siRNA接種和轉(zhuǎn)染Hep3B細胞。轉(zhuǎn)染后24小時，將細胞放入Aneoropack 矩形瓶(Mitsubishi Chemical Company, Japan)以在1小時內(nèi)創(chuàng)造類似低氧 的條件，或?qū)⑵浞湃胝Ｑ鯘舛认?。培養(yǎng)持續(xù)24小時，然后進行RNA提 取。顯示了 H19RNA的RT-PCR分析。圖9A:分別使用抗luc siRNA (SEQ ID NO: 5)(泳道1 、 2)和抗H19 siRNA (SEQ ID NO: 3)(泳道3 、 4)在正常(泳 道1 、 3 )和低氧(泳道2、4 )培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)染Hep3B細胞。管家基因GAPDH(圖 9B)和uPAR (圖9C)的PCR分析。優(yōu)選實施方案的說明本發(fā)明涉及用于下調(diào)H19水平和/或活性的核酸物質(zhì)和藥物組合物及 其使用方法。特別地，本發(fā)明涉及用于治療癌癥的方法和組合物。在詳細解釋本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于其 應(yīng)用于下列說明中所述或通過實施例舉例說明的細節(jié)。本發(fā)明能夠是其他 實施方案或以不同方式實踐或?qū)嵤?。另外，?yīng)理解本文所使用的措辭和術(shù) 語是為了描述的目的而不應(yīng)視為是限制。H19是表現(xiàn)母源單等位基因表達的印跡基因，且很可能不編碼蛋白質(zhì)。 它在胚胎發(fā)生和胎兒發(fā)育過程中豐富表達，但通常在出生后于大部分組織 中關(guān)閉。然而，在越來越多的不同起源的癌癥中，H19RNA的表達上調(diào)， 并且在某些情況下觀察到異常的等位基因表達模式，表明H19在腫瘤發(fā)生 中起作用。在簡化實踐的本發(fā)明方法的同時，本發(fā)明的發(fā)明人通過努力的生物信 息學模擬設(shè)計了可有效下調(diào)H19 mRNA的特異性siRNA。使用了四種不同 檢索引擎選擇本發(fā)明的siRNA以確保選擇最佳siRNA。如圖3A所示，發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的所有siRNA可有效下調(diào)H19mRNA。另 外，本發(fā)明的發(fā)明人揭示這些siRNA能夠在正常和低氧條件下下調(diào)H19 mRNA(圖3B-E)。這是特別有關(guān)聯(lián)的，因為肺瘤生長與低氧有關(guān)，而低 氧又與H19 RNA的上調(diào)有關(guān)。本發(fā)明的siRNA能夠防止腫瘤形成并甚至通過減小先前建立的胂瘤 體積和重量而減輕發(fā)展中的疾病。如實施例4所述，將先前使用H19 siRNA轉(zhuǎn)染的人類癌細胞(Hep3B 和UMUC3)給藥于小鼠，較使用對照siRNA轉(zhuǎn)染的相同細胞給藥導(dǎo)致腫 瘤重量(圖4A和5A)和體積(圖4B和5B)非常顯著減小。另夕卜，如實施例6所述，將H19 siRNA直接注射至由UMUC3細胞誘 導(dǎo)的腫瘤，導(dǎo)致平均腫瘤體積非常顯著減小了約90%(圖7A)和平均胂瘤重 量減小了約88% (圖7B)。在Hep3B誘導(dǎo)的腫瘤中，觀察到在H19 siRNA的給藥后，腫瘤重量 約減小40% (圖7C)，胂瘤體積減小56% (圖7D)?？偠灾?，這些結(jié)果無疑確定了能夠下調(diào)H19的物質(zhì)作為用于預(yù)防性 和治療性治療癌癥的現(xiàn)實候選藥。另外，本發(fā)明還慮及在聯(lián)合療法中使用能夠下調(diào)H19mRNA的物質(zhì)。 非常確定實體瘤特別是遭遇低氧區(qū)域的那些對癌癥療法具有抗性。本發(fā)明 預(yù)期抗H19物質(zhì)可使患者對先前建立的癌癥療法(如放射療法，化學療法)敏感。因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種制品，其包含能夠下調(diào)H19mRNA的水平和/或活性的物質(zhì)和鑒定為用于癌癥療法的其他抗癌劑。如本文所使用，術(shù)語"治療"是指預(yù)防、緩解或減輕與癌癥疾病有關(guān)的 癥狀。優(yōu)選地，治療性治愈，如基本消除與癌癥有關(guān)的癥狀。根據(jù)本發(fā)明的該方面，可治療表達H19的任何癌癥。根據(jù)本發(fā)明的方 法治療的優(yōu)選癌癥為在腫瘤發(fā)病或進展過程中表達H19 mRNA的那些癌 癥。所述癌癥包括但不限于兒童實體瘤、維爾姆斯氏腫瘤、肝母細胞瘤、 胚胎性橫紋肌肉瘤、生殖細胞瘤、滋養(yǎng)層細胞瘤、睪丸生殖細胞瘤、卵巢 非成熟型畸胎瘤、骶尾瘤、絨毛膜癌、胎盤部位滋養(yǎng)層細胞瘤、成人上皮 細胞瘤、膀胱癌、肝細胞癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、乳腺癌、頭頸鱗狀 上皮細胞癌、食道癌、神經(jīng)原性腫瘤、星形細胞瘤、惡性神經(jīng)節(jié)瘤、神經(jīng) 母細胞瘤。優(yōu)選地，所述腫瘤為膀胱癌或肝細胞癌。如本文所使用，術(shù)語"受治療者"是指任何(如哺乳動物)受治療者， 優(yōu)選人類受治療者。如本文所使用，術(shù)語"H19 mRNA"是指H19基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(GenBank 登錄號M32053-SEQ ID NO: 7 )。本發(fā)明已經(jīng)通過RT-PCR分析(圖1B-D)和RNA酶保護測定(圖1E)鑒 定了 H19 RNA基因的新型剪接異構(gòu)體，其在胚胎組織中特異性表達并在 癌癥細胞中不表達。該新型的剪接異構(gòu)體顯示與SEQ ID NO: 7所列的已知 H19轉(zhuǎn)錄物相比，缺失從轉(zhuǎn)錄起始位點的252至588位核苷酸延伸的外顯 子1的部分。因此，本發(fā)明該方面的H19 RNA優(yōu)選包含H19轉(zhuǎn)錄物的外 顯子1,并甚至更優(yōu)選包含由SEQIDNO: 7的252至588位核酸序列等同 物表示的RNA序列。由于H19不編碼蛋白質(zhì)，下調(diào)H19 mRNA的水平或活性優(yōu)選在RNA 水平起作用。優(yōu)選地，被下調(diào)的H19的水平或活性大于10%,更優(yōu)選大于20%，更 優(yōu)選大于40%,更優(yōu)選大于60%，更優(yōu)選大于80%,甚至更優(yōu)選大于100%。優(yōu)選地，所述物質(zhì)為核酸物質(zhì)。更優(yōu)選地，所述物質(zhì)是寡核香酸，最優(yōu)選地為雙鏈寡核苷酸。H19 mRNA的水平的降低可通過下列幾種機制實現(xiàn)通過抑制從H19 基因至H19 RNA的轉(zhuǎn)錄；通過抑制hnRNA至mRNA的成熟過程；通過 酶促進細胞質(zhì)中mRNA的降解(通過形成RNA雙鏈體或三鏈體；以及通 過基于核酸的酶(DNA酶和RNA酶)的催化性剪切)。因此，才艮據(jù)本發(fā)明的抗H19mRNA物質(zhì)可選自下列1 )空間抑制H19RNA從其基因轉(zhuǎn)錄的單鏈核酸序列；2)與H19 RNA雜交而導(dǎo)致酶解(例如通過RNA酶)的單鏈核^/f列；3 )導(dǎo)致H19降解(通過形成siRNA)的雙鏈核酸序列；4) 剪切H19mRNA的催化核酸序列；5) 形成三鏈體的核苦酸；6 )與H19 mRNA雜交從而導(dǎo)致H19 mRNA活性減小的單鏈核S吏序列；以及7)編碼(1)至(Q任一者的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明該方面的一個實施方案，所述物質(zhì)是一種核酸物質(zhì)，其含 有如上所述能夠特異性與本發(fā)明的H19 RNA雜交(例如，生理條件下在 細胞中)的核酸序列。如本文所使用，術(shù)語"核酸物質(zhì)"是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核 酸(DNA)或其模擬物的單鏈或雙鏈寡聚物或聚合物。該術(shù)語包括由自然 存在的堿基、糖以及共價的核苦間鍵合(如骨架)組成的多核苦酸，以及 具有與各天然存在部分相似地起作用的非天然存在部分的多核苦酸。如本文所使用，術(shù)語"能夠雜交"是指堿基配對，其中所述核酸物質(zhì)的 至少一條《連至少部分與H19mRNA同源。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸物質(zhì)特異性與本發(fā)明的H19 RNA雜交，即與 非相關(guān)的RNA分子(如GAPDH)相比至少5倍優(yōu)先與H19 RNA雜交。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容設(shè)計的核酸物質(zhì)可根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何核酸合成方法產(chǎn)生，包括酶催化合成或固相合成。實施固相合成的設(shè)備和試劑可從例如Applied Biosystems商購獲得。所述合成的任何其他方法也可以 應(yīng)用，所述核酸物質(zhì)的實際合成很好地在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)， 并可經(jīng)由下列參考文獻詳細描述的確定的方法而實現(xiàn)例如，Sambrook,J. 和Russell, D. (2001)， "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; Ausubd, R. M.等，編輯(1994, 1989), "Current Protocols in Molecular Biology," I-III 巻，John Wiley和Sons, Baltimore, Maryland; Perbal, B. (1988)， "A Practical Guide to Molecular Cloning," John Wiley和Sons, New York;以及Gait, M. J.，編輯(1984), "Oligonucleotide Synthesis";還可以通過下述方法實現(xiàn)使 用固相化學，例如氰乙基亞磷酰胺，之后脫保護、脫鹽以及通過例如自動 的三苯曱基方法(trityl-on method)或HPLC來純化。應(yīng)知道本發(fā)明的核酸物質(zhì)還可使用下文進一步所述的表達載體產(chǎn)生。優(yōu)選地，對本發(fā)明的核酸物質(zhì)進行修飾，所述核酸物質(zhì)可^f吏用本領(lǐng)域 已知的多種方法進行修4牟。例如，本發(fā)明的核酸物質(zhì)可包含在3'-至-5'磷酸二酯鍵成鍵的雜環(huán)核 苦，所述雜環(huán)核苦包括。票呤和嘧咬堿基。優(yōu)選使用的核酸物質(zhì)為如下文廣泛描述的在骨架、核苦間鍵合或堿基 內(nèi)修飾的那些。根據(jù)本發(fā)明的該方面有用的優(yōu)選核酸物質(zhì)的具體實例包括含有修飾 的骨架或非天然核苷間鍵合的寡核苦酸或多核苷酸。具有修飾的骨架的寡 核苷酸或多核苷酸包括在骨架中保留磷原子的那些，如下述美國專利所公 開的No. 4,469,863; No. 4,476,301; No. 5,023,243; No. 5,177,196; No. 5,188,897; No. 5,264,423; No. 5,276,019; No. 5,278,302; No. 5,286,717; No. 5，321，131;No. 5，399,676;No. 5，405，939;No. 5,453,496; No. 5,455,233; No. 5,466,677; No. 5,476,925; No. 5,519,126; No. 5,536,821; No. 5,541,306; No. 5,550,111; No. 5,563,253; No.5,571,799; No. 5,587,361;以及No.5,625,050。優(yōu)選的修飾的寡核苷酸骨架包括，例如磷硫酰；手性磷硫酰；二硫 代磷酸酯；磷酸三酯；氨烷基磷酸三酯；曱基膦酸酯和其他烷基膦酸酯， 包括3'-烯基膦酸酯和手性膦酸酯；次磷酸酯；氨基磷酸酯，包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯；硫羰氨基磷酸酯；硫羰烷基氨基磷酸酯； 硫羰烷基磷酸三酯；以及具有正常^S'鍵的硼烷磷酸酯(boranophosphate)， 其2'-5'連接類似物，以及具有反向極性的那些，其中相鄰的核苷單元對為 3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'連接。還可以使用上述修飾的各種鹽、混合鹽和 自由酸形式?？蛇x地，其中不包括磷原子的修飾的寡核苦酸骨架具有通過短鏈烷基 或環(huán)烷基核苷間鍵合、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苦間鍵合或一個或 多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵合形成的骨架。這些包括具有嗎啉代鍵 (部分從核苷的糖部分形成)的骨架、硅氧烷骨架、硫化物、亞砜以及砜 骨架；曱?；?formacetyl)和硫代曱?；羌?；亞曱基曱?；土虼鷷貂?基骨架；含有烯烴的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞曱基亞胺基和亞曱基肼基骨架；磺酸酯和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其他具有混合的N、 O、 S以 及CH2構(gòu)成部分的那些，如下列美國專利所公開的No. 5,034,506; No. 5,166,315; No. 5,185,444; No. 5,214,134; No. 5,216,141; No. 5,235,033; No. 5,264,562; No. 5,264,564; No. 5,405,938; No. 5,434,257; No. 5,466,677; No. 5,470,967; No. 5,489,677; No. 5,541,307; No. 5,561,225; No. 5,596,086; No. 5,602,240; No. 5,610,289; No. 5,602,240; No. 5,608,046; No. 5,610,289; No. 5,618,704; No. 5,623,070; No. 5,663,312; No. 5,633,360; No. 5,677,437;以及 No.5,677,439。根據(jù)本發(fā)明可使用的其他核酸物質(zhì)為在糖和核香間鍵合中修飾的那 些，即核苷酸單位的骨架被新的基團代替。堿基單位被保留以用于與合適 的多核苷酸靶互補。所述寡核苦酸模擬物的實例包括肽核酸(PNA )。 PNA 寡核苷酸是指其中糖骨架被含有酰胺的骨架、特別是氨基乙基甘氨酸骨架 代替的寡核苷酸。堿基保留，并直接或間接與骨架的酰胺部分的氮雜氮原 子結(jié)合。教導(dǎo)PNA化合物的制備的美國專利包括但不限于美國專利No. 5,539,082; No. 5,714,331以及No. 5,719,262,這些美國專利各自通過引用并 入本申請?？捎糜诒景l(fā)明的其他骨架修飾在美國專利No. 6,303,374中 >開。本發(fā)明的核酸物質(zhì)還可包括堿基修飾或取代。如本文所使用，"未修飾 的"或"天然的"堿基包括噤呤堿基腺噤呤(A)和鳥噪呤(G)，和嘧咬堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧咬(C)以及尿嘧咬(U)。"修飾的"堿基包括但不限于其 他合成的和天然的堿基，例如5-曱基胞嘧咬(5-me-C); 5-羥曱基胞嘧啶； 黃噤呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺噤呤和鳥嘌呤的6-曱基和其他烷基 衍生物；腺嘌呤和鳥噪呤的2-丙基和其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶，2-硫 胸腺嘧。定以及2-硫胞嘧咬；5-卣代尿嘧啶和5-卣代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧 啶和5-丙炔基胞嗜啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧，定以及6-偶氮胸腺嘧啶； 5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卣代、8-氨基、8-巰基、8-硫烷基、 8-羥基以及其他8-取代的腺噤呤和鳥噪呤；5-卣代、特別是5-溴代、5-三 氟曱基以及其他5-取代的尿嘧咬和胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤； 8-氮雜鳥噤呤和8-氮雜腺噪呤；7-去氮雜鳥噤呤和7-去氮雜腺噤呤；以及 3-去氮雜鳥嘌呤和3-去氮雜腺噤呤。其他修飾的石咸基包括下列文獻/>開的 那些美國專利No. 3,687,808; Kroschwitz， J. L， ed. (1990),"The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,"第858-859頁,John Wiley和Sons; Englisch等(1991)， "Angewandte Chemie," International Edition, 30， 613;和Sanghvi, Y. S.， "Antisense Research and Applications,"第 15章，第289- 302頁，S. T. Crooke和B. Lebleu,編輯，CRC Press, 1993。這 些修飾的堿基特別用于增加本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力。這些包括 5-取代的嘧咬，6-氮雜嘧，定，以及N-2、 N-6和O-6-取代的噤呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧咬，以及5-丙炔基胞嘧啶。5-曱基胞嘧啶 取代顯示可增加核酸雙鏈體穩(wěn)定性0.6-1.2°C(Sanghvi, Y. S.等，(1993), "Antisense Research and Applications,"第276-278頁,CRC Press, Boca Raton)，并且是目前優(yōu)選的堿基取代，甚至更特別地當與2'-0-曱氧乙基糖 寸務(wù)飾結(jié)合時。本發(fā)明的核酸物質(zhì)為可特異性與H19RNA雜交的至少10、至少15或 至少17個堿基。如實施例1所述，本發(fā)明的siRNA為具有兩個3'懸突的 19個堿基。應(yīng)知道本發(fā)明還慮及能夠下調(diào)H19 RNA的除了核酸物質(zhì)以外的物質(zhì)， 例如敲除物質(zhì)。小干擾RNA ( siRNA )分子為能夠下調(diào)H19 RNA的核酸物質(zhì)的實例。RNA干擾為兩步驟過程。在被稱為起始步驟的第一步驟過程中，輸入的 dsRNA被消化成21-23個核苷酸(nt)的小干擾RNA ( siRNA ),這可能 是通過dsRNA特異性RNA酶的RNase III家族成員Dicer的作用，所述 Dicer以ATP依賴性方式剪切dsRNA (直接引入或經(jīng)由表達載體、表達盒 或病毒引入)。連續(xù)的剪切事件將RNA降解成19-21 bp雙鏈體(siRNA), 其中各鏈具有2-核苦酸3'懸突(Hutvagner和Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232 (2002);以及Bernstein Nature 409:363-366 (2001))。在效應(yīng)因子步驟中，siRNA雙鏈體與核酸酶復(fù)合物結(jié)合形成RNA誘 導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC )。需要siRNA雙鏈體的ATP依賴性解旋用于激活 RISC。然后，有活性的RISC通過堿基配對相互作用靶向同源轉(zhuǎn)錄物，并 從siRNA的3'末端將mRNA剪切成12個核苦酸片段(Hutvagner和Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232 (2002); Hammond等， (2001) Nat. Rev. Gen. 2:110-119 (2001);以及Sharp Genes. Dev. 15:485-90(2001) )。盡管剪切的機制仍有待于解釋，但研究表明各RISC含有單個的 siRNA 和 RNA 酶(Hutvagner 和 Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232 (2002))。通過提供前述的siRNA消除"起始步驟"是可能的。因為RNA干擾的顯著潛能，提議了在RNA干擾途徑中的擴增步驟。 擴增可通過可以產(chǎn)生更多的siRNA的輸入dsRNA的拷貝而發(fā)生，或通過 形成的siRNA的復(fù)制而發(fā)生?？蛇x地或另外地，擴增可通過RISC的多個 輪回事件而發(fā)生(Hammond等，Nat. Rev. Gen. 2:110-119 (2001), Sharp Genes. Dev. 15:485-90 (2001); Hutvagner和Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232 (2002))。對于關(guān)于RNA干擾(RNAi)的更多信 息，參見下列評述Tuschl ChemBiochem. 2:239-245 (2001); Cullen Nat. Immunol. 3:597-599 (2002);和Brantl Biochem. Biophys. Act. 1575:15-25(2002) 。適用于本發(fā)明的RNA干擾分子的合成可如下實現(xiàn)。首先，向下游掃 描H19核酸序列靶的AA 二核苷酸序列。將各AA和3'鄰近的19個核苷酸的存在記錄為潛在的siRNA耙位點。其次，使用任何序列比對軟件，例如NCBI服務(wù)器的BLAST軟件 (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),將潛在的耙位點與合適的基因組數(shù)據(jù)庫 (如人類、小鼠、大鼠等)進行比較。過濾出顯示與其他編碼序列具有顯 著同一性的推定的靶位點。將合格的耙序列選為siRNA合成的模板。優(yōu)選的序列為包括低G/C含 量的那些，這是因為這些已經(jīng)證明比具有高于55%的G/C含量的那些能更 有效介導(dǎo)基因沉默。沿著用于評價的靶基因的長度優(yōu)選選擇幾個靶位點。 為了更好地評價所選擇的siRNA，優(yōu)選結(jié)合使用陰性對照。陰性對照siRNA 優(yōu)選包括與siRNA相同但與基因組無顯著同一性的核苦酸組合物。因此， 優(yōu)選使用亂序的siRNA的核苷酸序列，條件是它不顯示與任何其他基因具 有顯著同一性。根據(jù)本發(fā)明的該方面可使用的能夠下調(diào)H19的siRNA的實例為SEQ ID NO: 1-4所列的那些。由于這些分子顯示為可有效減小肺瘤大小和體積，本發(fā)明還慮及單獨 和非必需地聯(lián)合使用這些分子治療癌癥。能夠下調(diào)H19 RNA表達的另一種物質(zhì)為能夠特異性剪切其編碼多核 苦酸的DNA酶分子。DNA酶為能夠剪切單鏈和雙鏈耙序列的單鏈核酸物 質(zhì)(Breaker, R. R.和Joyce, G. Chemistry and Biology 1995;2:655; Santoro, S.W.和Joyce, G.R Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997;94:4262 )。已經(jīng)提出了 DNA酶的普通模型("10-23"模型)。"10-23"DNA酶具有15個脫氧核糖核 苷酸的催化結(jié)構(gòu)域，其側(cè)鄰兩個各自具有7至9個脫氧核糖核普酸的底物 識別結(jié)構(gòu)域。該類型的DNA酶可有效在。票呤嘧咬連接處催化其底物 RNA(Santoro, S. W.和Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199;對于DNA 酶的評述，參見Khachigian, LM (Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002))。識別單鏈和雙鏈耙剪切位點的合成的工程DNA酶的構(gòu)建和擴增的實 例公開于授予Joyce等的美國專利No. 6,326,174。最近觀察到靶向人類尿 激酶的相似設(shè)計的DNA酶可以抑制尿激酶受體表達，并在體內(nèi)成功抑制 結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移(Itoh等，20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Therwww.asgt.org)。在另 一個應(yīng)用中，與bcr-abl癌基因互補的DNA酶可成功 抑制白血病細胞中的癌基因表達，并減小慢性髓細胞性白血病(CML)和急 性淋巴細胞性白血病(ALL)的自身骨髓移植術(shù)的復(fù)發(fā)率。能夠下調(diào)H19 RNA的另一種物質(zhì)是能夠特異性剪切其編碼多核苷酸 的核酶分子。核酶通過剪切編碼感興趣的蛋白的mRNA越來越多應(yīng)用于基 因表達的序列特異性抑制(Welch等，Curr Opin Biotechnol. 9:486-% (1998))。設(shè)計剪切任何特異性靶RNA的核酶的可能性使得它們成為在基 礎(chǔ)研究和治療應(yīng)用中有價值的工具。在治療領(lǐng)域中，核酶已經(jīng)被開發(fā)用于 靶向感染性疾病中的病毒RNA、癌癥中的顯性癌基因和遺傳性疾病中的特 異性體細胞突變(Welch等，CHnDiagn Virol. 10:163-71 (1998))。最值得注 意的是，用于HIV患者的幾種核酶基因療法方案已經(jīng)處于1期試驗。最近， 核酶已經(jīng)用于轉(zhuǎn)基因動物研究，基因靶確認和途徑說明。幾種核酶處于不 同階段的臨床試驗。ANGIOZYME是第一種在人類臨床試驗中研究的化學 合成的核酶。ANGIOZYME特異性抑制血管發(fā)生途徑中的關(guān)鍵成分 VEGF-r (血管內(nèi)皮生長因子受體)的形成。Ribozyme Pharmaceuticals公司 以及其他公司已經(jīng)證明了動物模型中抗血管生成治療的重要性。發(fā)現(xiàn)被設(shè) 計成選擇性破壞丙型肝炎病毒(HCV) RNA的核酶HEPTAZYME可有效 減少細胞培養(yǎng)測定中的丙型肝炎病毒RNA(Ribozyme Pharmaceuticals公 司，http:〃www.rpi.com/index.html)。下調(diào)H19 RNA的其他方法是經(jīng)由形成三鏈體的寡核苷酸(TFO )。在 最近十年中，研究顯示可設(shè)計可以以序列特異性方式識別和結(jié)合雙鏈螺旋 DNA中的多噤呤/多嘧咬區(qū)域的TFO。因此，可耙向編碼本發(fā)明的H19 RNA 的DNA序列，由此下調(diào)RNA分子。支配TFO的識別規(guī)則由下列文獻描述Maher III， L. J.，等，Science (1989) 245:725-730; Moser， H. E.,等，Science (1987)238:645-630; Beal, R A.: 等 ， Science (1991) 251:1360-1363; Cooney, M., 等 ， Science(1988)241:456-459;以及Hogan, M. E.，等，歐洲公布375408。寡核 苷酸的修飾，例如引入插入劑和骨架取代，以及結(jié)合條件的優(yōu)化(pH和陽 離子濃度)有助于克服TFO活性的固有障礙，例如電荷排斥和不穩(wěn)定性，并且最近顯示合成的寡核苷酸可靶向特異的序列(對于最近的評述，參見Seidman和Glazer (2003) J Clin Invest; 112:487-94)。 通常，形成三鏈體的寡核苷酸具有下列對應(yīng)序列 寡核苷酸3'—AGGT 二鏈體 5'—AGCT 二鏈體 3'—TCGA然而，已經(jīng)顯示A-AT和G-GC三聯(lián)體具有最大的三聯(lián)螺旋穩(wěn)定性 (Reither和Jeltsch (2002), BMC Biochem， ， Septl2, Epub)。相同的作者已經(jīng)聯(lián)體形成確實是序列特異性的。因此，對于調(diào)節(jié)區(qū)中的任何給定的序列，可設(shè)計形成三鏈體的序列。 形成三《連體的寡核香酸優(yōu)選至少15、更優(yōu)選25、更優(yōu)選30或更多核芬酸 長度，直至50或100 bp。使用TFO轉(zhuǎn)染細胞(例如經(jīng)由陽離子脂質(zhì)體)和隨后與靶DNA形成 三聯(lián)螺旋結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)了空間和功能變化，阻礙轉(zhuǎn)錄起始和延長，使得在內(nèi) 源性DNA中引入所需序列變化并導(dǎo)致基因表達的特異性下調(diào)。在使用TFOsupFGl和內(nèi)源性HPRT基因的敲除(Vasquez等，Nucl Acids Res. (1999) 27:1176-81,和Puri,等，J Biol Chem， (2001) 276:28991-98),和在胰腺癌病 因中重要的Ets2轉(zhuǎn)錄因子表達的序列特異性和靶特異性下調(diào)(Carbone等， Nucl Acid Res. (2003) 31:833-43)，以及前炎癥ICAM-1基因表達的序列特 異性和靶特異性下調(diào)(Besch等，J Biol Chem, (2002) 277:32473-79)。另夕卜， Vuyisich和Beal最近表明序列特異性TFO可結(jié)合dsRNA,抑制dsRNA依 賴性酶如RNA依賴性激酶的活性(Vuyisich和Beal, Nuc. Acids Res (2000) ;28:2369-74)。另夕卜，根據(jù)上述原理設(shè)計的TFO可誘導(dǎo)定向誘變，所述定向誘變能夠 產(chǎn)生DNA修復(fù)，因此提供內(nèi)源性基因表達的下調(diào)和上調(diào)(Seidman和Glazer， J Clin Invest (2003) 112:487-94)。有效TFO的設(shè)計、合成以及給藥的詳細說明可見于Froehler等的美國專利申請No. 2003 017068和2003 0096980， Emanuele等的美國專利申請No. 2002 0128218和2002 0123476, Lawn的 美國專利No. 5,721,138。應(yīng)知道能夠與H19 mRNA雜交的核酸物質(zhì)可以通過防止H19 mRNA 與其他下游物質(zhì)結(jié)合而下調(diào)其活性。如上所述，本發(fā)明的核酸物質(zhì)(例如siRNA分子，如SEQ ID NO: 1 、 2、 3或4所列的那些)可以在細胞中表達。應(yīng)該知道本發(fā)明物質(zhì)可以直接在受治療者中表達(如體內(nèi)基因療法) 或可以在細胞系統(tǒng)中活體外表達(自體或非自體)且然后給藥于受治療者。為了在哺乳動物細胞中表達這種物質(zhì)(即以產(chǎn)生RNA分子)，編碼本 發(fā)明物質(zhì)的核酸序列優(yōu)選與適于哺乳動物細胞表達的核酸構(gòu)建體連接。所 述核酸構(gòu)建體包括以組成型或誘導(dǎo)型引導(dǎo)細胞中的多核芬酸序列轉(zhuǎn)錄的 啟動子序列。適用于本發(fā)明的組成型啟動子是在大多數(shù)環(huán)境條件下和大多數(shù)類型 的細胞例如細胞巨化病毒(CMV)和魯斯氏肉瘤病毒(RSV)中具有活性的啟 動子序列。適用于本發(fā)明的誘導(dǎo)型啟動子包括例如四環(huán)素可誘導(dǎo)的啟動子 (Zabala M,等，Cancer Res. 2004， 64(8): 2799- 804)。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體(本文也稱為"表達載體")包括使得這種載體適 于在原核細胞、真核細胞或優(yōu)選二者中復(fù)制和整合的其他序列(如穿^f炎載 體)。另外，典型的克隆載體也可含有復(fù)制和翻譯起始序列、轉(zhuǎn)錄和翻譯 終止子和多聚腺苷酸化信號。真核細胞啟動子通常含有兩種識別序列，TATA盒和上游的啟動子元 件。認為位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游的25-30堿基對的TATA盒與引導(dǎo)RNA聚 合酶啟動RNA合成有關(guān)。其他上游啟動子元件決定轉(zhuǎn)錄起始的速率。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體使用的啟動子在所轉(zhuǎn)化的特異性細胞群 中具有活性。細胞類型特異性和/或組織特異性啟動子的實例包括例如肝臟 特異性的白蛋白啟動子(Pinkert等，(1987) Genes Dev. 1:268-277),淋巴細胞 特異性啟動子(Calame等，(1988) Adv. Immunol. 43:235-275)，特別是T細胞受體啟動子(Winoto等，(1989) EMBO J. 8:729-733)和免疫球蛋白啟動子 (Banerji等(1983) Cell 33729-740)，神經(jīng)元特異性啟動子例如神經(jīng)微絲啟 動子(Byrne等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473- 5477)，胰腺特異 性啟動子(Edlunch等(l兆5) Science 230:912-916)或乳腺特異性啟動子例 如乳清啟動子(美國專利No. 4,873,316和歐洲申請公布No. 264,166)。增強子元件可刺激從連接的同源性或異源性啟動子轉(zhuǎn)錄達1,000倍。 當增強子位于自轉(zhuǎn)錄起始位點的下游或上游時是具有活性的。許多衍生自 病毒的增強子元件具有廣泛的宿主范圍并且在多種組織中具有活性。例 如，SV40早期基因增強子適于許多細胞類型。適于本發(fā)明的其他增強子/ 啟動子組合包括衍生自多瘤病毒、人類或鼠巨細胞病毒(CMV)的那些，各 種逆轉(zhuǎn)錄病毒例如鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒或魯斯氏肉瘤病毒以及HIV 的長期復(fù)制子。參見，Enhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y 1983,該文獻通過引用并入本申請。在表達載體的構(gòu)建中，啟動子優(yōu)選位于約與自其天然配置中轉(zhuǎn)錄起始 位點的距離相同的自異源轉(zhuǎn)錄起始位點的距離。然而，如本領(lǐng)域已知的， 該距離中的一些變化可調(diào)節(jié)，而不喪失啟動子的功能。也可以將多聚腺苷酸序列添加至表達載體以增加RNA穩(wěn)定性(Soreq 等，1974; J. Mol Biol. 88: 233-45)。需要兩種不同的序列元件用于準確和有效的多聚腺苷酸化位于多聚 腺苷酸化位點下游的GU或U豐富的序列和位于上游11-30核芬酸的6個 核苷酸AAUAAA的高保守序列。適于本發(fā)明的終止和多聚腺苦酸化信號 包括衍生自SV40的那些。除了已描述的元件，本發(fā)明的表達載體通常含有其他特化的元件，所 述元件意于增加克隆的核酸的表達水平或促進攜帶重組DNA的細胞的鑒 定。例如，多種動物病毒含有促進容許細胞中病毒基因組的額外的染色體 復(fù)制的DNA序列。只要質(zhì)粒上攜帶或宿主細胞的基因組具有的基因提供 了合適的因子，攜帶這些病毒復(fù)制子的質(zhì)粒就游離復(fù)制。載體可包括或不包括真核復(fù)制子。如果真核復(fù)制子存在，那么使用合 適的可選擇標記，載體可在真核細胞中復(fù)制。如果載體不包含真核復(fù)制子，游離復(fù)制是不可能的。相反，重組DNA整合至工程細胞的基因組中，其中啟動子引導(dǎo)所需核酸的表達。哺乳動物表達載體的實例包括但不限于可從Invitrogen獲得的 pcDNA3、 pcDNA3.1 (+/-)、 pGL3、 pZeoSV2(+A) 、 pSecTag2、 pDisplay、 pEF/myc/cyto 、 pCMV/myc/cyto 、 pCR3.1 、 pSinRep5 、 DH26S 、 DHBB 、 p畫Tl 、 pNMT41、 pNMT81，可從Promega獲得的pCI，可從Strategene獲得的 pMbac、 pPbac、 pBK-RSV和pBK-CMV,可從Clontech獲得的pTRES， 以及它們的衍生物。還可以使用含有真核病毒例如逆轉(zhuǎn)錄病毒的調(diào)節(jié)元件的表達載體。 SV40載體包括pSVT7和pMT2。衍生自牛乳頭狀瘤病毒的載體包括pBV-IMTHA,衍生自EB病毒(Epstein Bar virus )的載體包4舌pHEBO禾口 p205。 其他實例性載體包括pMSG、 pAV009/A+、 pMTO10/A+、 pMAMneo-5、桿 狀病毒pDSVE,以及在SV-40早期啟動子、SV-40晚期啟動子、金屬硫蛋 白啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、魯斯氏肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白 啟動子或在真核細胞中顯示有效表達的其他啟動子的引導(dǎo)下使得蛋白質(zhì) 表達的任何其他載體。如上所述，病毒是進化成在許多情況下逃避宿主防御機制的非常特化 的感染因子。通常，病毒在特異的細胞類型中感染和繁殖。病毒載體的靶基因引入感染的細胞。因此，本發(fā)明使用的載體類型取決于所轉(zhuǎn)化的細胞 類型。根據(jù)所轉(zhuǎn)化的細胞類型選擇合適的載體的能力4艮好地在本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，本文不提供選擇考慮因素的一般描述。例如，骨 髓細胞可使用I型人類T細胞白血病病毒(HTLV-I)靶向，腎臟細胞可使用 存在于桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾(Autographa califomia)核型多角體病毒 (AcMNPV)中的異源啟動子耙向，如Liang CY等，2004 (Arch Virol. 149: 51-60)所述。由于重組病毒載體提供諸如橫向感染和靶向特異性的優(yōu)點，可用于本 發(fā)明的H19下調(diào)物質(zhì)的體內(nèi)表達。橫向感染是例如逆轉(zhuǎn)錄病毒的生命周期 中固有的，是單個感染的細胞產(chǎn)生許多萌芽的子代病毒顆粒并感染鄰近細胞的過程。結(jié)果是大面積迅速受感染，其中大部分不是由原始的病毒顆粒 起始感染的。這與其中感染因子近通過子代傳播的垂直型感染大不相同。 還可以制備不能橫向傳播的病毒載體。如果所需目的是將特定基因僅引入 局限數(shù)量的靶細胞中，這些特征是有用的。各種方法可用于將本發(fā)明的表達載體引入細胞。這些方法通常描述于Sambrook等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992); Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley和Sons, Baltimore, Md. (1989); Chang等， Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995); Vega等,Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995); Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988);以及Gilboa等，(Biotechniques 4 (6): 504-512， 1986),并且包括， 例如穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔和使用重組病毒載體感染。 另外，參見美國專利No. 5,464,764和5,487,992的陽性-陰性選擇方法。通過病毒感染引入核酸提供了優(yōu)于其他方法如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電穿孔 的幾種優(yōu)點，這是因為由于病毒的感染性質(zhì)，可獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括使用病毒或非病毒構(gòu)建體例如腺 病毒、慢病毒、I型單純皰滲病毒或腺病毒相關(guān)病毒(AAV)和基于脂質(zhì)的系 統(tǒng)的轉(zhuǎn)染。對于基因的脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移有用的脂質(zhì)為例如DOTMA、 DOPE 以及DC-Chol (Tonkinson等，Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996》。用 于基因療法的最優(yōu)選的構(gòu)建體為病毒，最優(yōu)選腺病毒、AAV、慢病毒或逆 轉(zhuǎn)錄病毒。病毒構(gòu)建體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體包括至少一個轉(zhuǎn)錄啟動子/ 增強子或基因座限定的元件，或通過其他方式例如交替剪接、核RNA輸 出或信使的翻譯后修飾來控制基因表達的其他元件。所述載體構(gòu)建體還包 括包裝信號，長末端重復(fù)(LTR)或其部分，以及適于所使用的病毒的正 鏈和負鏈引物結(jié)合位點，除非它已經(jīng)存在于病毒構(gòu)建體內(nèi)。任選地，構(gòu)建 體還可以包括引導(dǎo)多聚腺苷酸化的信號，以及一個或多個限制性位點。通 過舉例，所述構(gòu)建體通常包括5' LTR、 tRNA結(jié)合位點、包裝信號、第二 鏈DNA合成的起點，以及3'LTR或其部分。其他可使用的載體為非病毒載體，例如陽離子脂質(zhì)體，聚賴氨酸以及樹狀聚體。除了含有用于插入的編碼序列轉(zhuǎn)錄的必需元件外，本發(fā)明的表達構(gòu)建 體還可以包括被設(shè)計以增強表達的RNA的穩(wěn)定性、產(chǎn)生、純化、產(chǎn)率或 毒性的序列。如上所述，能夠下調(diào)H19 mRNA的物質(zhì)可用于單獨治療癌癥(如本發(fā) 明的siRNA)或聯(lián)合所述疾病的其他確立的或?qū)嶒炐灾委煼桨钢委煱┌Y。 本發(fā)明的發(fā)明人慮及能夠下調(diào)H19 mRNA的物質(zhì)可與其他治療方法或組 合物協(xié)同起作用，因此具有顯著減小所述治療的有效臨床劑量的潛能，由 此減輕通常具有破壞性的消極副作用，和治療的高代價。這可特別與治療 與低氧區(qū)有關(guān)的實體瘤相關(guān)，由此現(xiàn)有確立的化學療法和放射療法方案是 無效的。本發(fā)明物質(zhì)可在癌癥療法之前、同時或之后給藥。如本文所使用，術(shù)語"癌癥療法"是指可預(yù)防、緩解或減輕癌癥疾病相 關(guān)的癥狀的任何治療。適于與本發(fā)明物質(zhì)或編碼所述物質(zhì)的多核苷酸聯(lián)合用于治療癌癥的 治療方案包括但不限于化學療法、》欠射療法、光療和光動力療法、手術(shù)、 營養(yǎng)療法、燒蝕療法、放射療法和化學療法聯(lián)合、臂療法(brachiotherapy)、 質(zhì)子束療法、免疫療法、細胞療法和光子束》丈射手術(shù)療法。適于與本發(fā)明 物質(zhì)聯(lián)合用于治療癌癥的其他形式的治療方案是進行能夠調(diào)節(jié)已知與癌 癥調(diào)節(jié)或血管發(fā)生調(diào)節(jié)途徑有關(guān)的基因的核苷酸物質(zhì)的給藥?？膳c本發(fā)明化合物聯(lián)合給藥的抗癌藥物(即化學治療劑)包括但不限 于阿西維辛、阿柔比星、鹽酸阿考達唑、阿克羅寧、阿霉素、阿多來新、 阿地白介素、六曱密胺、安波霉素、醋酸雙氫胺蒽醌、氨魯米特、安吖啶、 阿那曲唑、安曲霉素、門冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、阿扎替派、固 氮霉素、巴馬司他、苯佐替派、比卡魯胺、鹽酸比生群、二曱磺酸雙奈法 德、比折來新、硫酸博來霉素、布查那鈉、溴匹立明、白消安、放線菌素 C、卡普睪酮、卡醋胺、卡貝替姆、卡鉑、卡莫司汀、鹽酸卡柔比星、卡 折來新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西羅里霉素、順鉑、克拉屈濱、磺酸克 立那托、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達卡巴。秦、放線菌素D、鹽酸柔紅霉素、地西他濱、右奧馬鉑、地扎胍寧、磺酸地扎胍寧、地吖醌、多西他奇、多 柔比星、鹽酸多柔比星、屈洛昔芬、檸檬酸屈洛昔芬、丙酸曱雄烷酮、偶 氮霉素、依達曲沙、鹽酸依氟鳥氨酸、依沙,星、恩洛鉑、恩普氨酯、依 匹哌啶、鹽酸表柔比星、厄布洛唑、鹽酸依索比星、雌莫司汀、雌莫司汀 磷酸鈉、依他硝唑、依托泊苷、磷酸依托泊苦、氯苯乙嘧胺、鹽酸法倔唑、 法扎拉濱、芬維A胺、氟脲苷、磷酸氟達拉濱、氟尿嘧啶、氟西他濱、磷 喹酮、福司曲星鈉、吉西他濱、鹽酸吉西他濱、羥基脲、鹽酸去曱氧基柔紅霉素、異環(huán)磷酰胺、伊莫福新、干擾素a-2a、干擾素a-2b、干擾素a-nl、 干擾素a-n3、干擾素p-Ia、干擾素y-Ib、異丙鉑、鹽S臾伊立替康、醋酸蘭 瑞肽、來曲唑、醋酸亮丙瑞林、鹽酸利阿唑、洛美曲索鈉、洛莫司汀、鹽 酸洛索蒽醌、馬索羅酚、美坦生、鹽酸氮芥、醋酸曱地孕酮、醋酸美侖孕 酮、美法侖、美諾立爾、巰嘌呤、曱氨蝶呤、甲氨蝶呤鈉、氯苯氨啶、美 妥替哌、米丁度胺、米托克星、絲裂紅素、絲裂吉菌素、絲裂馬菌素、絲 裂霉素C、米托司培、米托坦、鹽酸米托蒽醌、麥考酚酸、諾考達唑、諾 加霉素、奧馬鉑、亞磺酰吡啶、紫杉醇、培門冬酶、佩利霉素、奈莫司汀、 硫酸培來霉素、培磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、鹽酸吡羅蒽醌、光輝霉 素、普洛美坦、卟卩分姆鈉、羅邁新、潑尼莫司汀、鹽酸丙卡巴肼、博羅霉 素、鹽酸博羅霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、羅谷亞胺、沙芬戈、鹽酸 沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、磷乙酰天冬氨酸鈉、稀疏霉素、鹽酸鍺螺胺、 螺莫司汀、螺鉑、鏈黑菌素、鏈唑霉素、磺氯苯脲、他利霉索、紫杉酴、 替可加蘭鈉、喃氟啶、鹽酸替洛蒽醌、替莫泊芬、替尼泊苷、替羅昔隆、 睪內(nèi)酪、硫咪噤呤、硫鳥噤呤、塞替派、逸唑呔林、替拉扎明、鹽酸拓樸 替康、枸櫞酸托瑞米芬、曲托龍、磷酸曲西立濱、三曱曲沙、葡萄糖醛酸 三甲曲沙、曲普瑞林、鹽酸妥布氯唑、烏拉莫司汀、烏瑞替派、伐普肽、 維替泊芬、硫酸長春堿、硫酸長春新堿、長春地辛、硫酸長春地辛、硫酸 長春匹定、硫酸長春甘酯、硫酸長春羅新、酒石酸長春瑞濱、硫酸長春瑞 濱、硫酸長春利定、伏氯唑、折尼鉑、凈司他丁、鹽酸佐柔比星。其他抗 月中瘤物質(zhì)包括公開于Antineoplastic Agents (Paul Calabresi和Bruce A. Chabner)第52章，及其序^侖，1202-1263, Goodman和Gilman的"The Pharmacological Basis of Therapeutics",第八版，1990, McGraw-Hill公司(Health Professions Division)的那些。如果需要，本發(fā)明物質(zhì)可以以包含含有本發(fā)明物質(zhì)的一個或多個單位 劑型的包裝或M裝置提供，例如FDA批準的試劑盒。所述物質(zhì)可以單 包裝與另外的抗癌劑 一起配制，或者所述物質(zhì)可以以分開的包裝與另外的 抗癌劑分開配制。所述包裝可以包含例如金屬或塑料箔，例如泡罩包裝。 所述包裝或分散裝置可以附帶給藥的說明書。所述包裝或分散裝置還可以 以管理藥劑的制造、使用或銷售的政府機構(gòu)建議的形式附帶與容器相關(guān)的 通告，所述通告是由組合物或人類或獸醫(yī)給藥的形式的機構(gòu)批準的。所述 通告可以例如是美國食品藥品管理局批準用于處方藥而貼上標簽，或者是 批準的產(chǎn)品插入物。在相容的藥物載體中配制的包含本發(fā)明物質(zhì)的組合物 還可以制備、放置于合適的容器中，并被貼上標簽用于治療癌癥。本發(fā)明物質(zhì)可自身給藥于受治療者，或者于混合有合適的載體或賦形 劑的藥物組合物中給藥于受治療者。如本文所使用，"藥物組合物"是指本文所述的一種或多種活性成分與 其他化學成分例如生理學上合適的載體和賦形劑的制品。藥物組合物的目 的是便于化合物至生物體的給藥。本文中術(shù)語"活性成分"是指具有抗癌作用的物質(zhì)。下文中，可互換使用的術(shù)語"生理學上可接受的載體，，和"藥學上可接受 的載體"是指不會對生物體造成顯著刺激并且不消除所給藥的化合物的生 物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。助劑包括在這些術(shù)語中。本文中，術(shù)語"賦形劑"是指添加至藥物組合物以進一步便于活性成分 給藥的惰性物質(zhì)。非限制地，賦形劑的實例包括碳酸4丐、磷酸釣、各種糖 和多種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。藥物配制和給藥的^支術(shù)可見于"Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA,最新版，其內(nèi)容通過引用并入本申請。合適的給藥途徑可包括例如口服，直腸，經(jīng)粘膜，特別是經(jīng)鼻粘膜， 腸內(nèi)遞送，或胃腸外遞送，包括肌肉、皮下和髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)、直接 心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射?；蛘撸梢砸跃植慷侨淼姆绞竭M行所述藥物組合物的給藥，例如 通過直接將所述藥物組合物注射至腫瘤內(nèi)(即原位)。本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域/>知的方法制備，例如通過傳統(tǒng) 的混合、溶解、制粒、制糖衣、磨細、乳化、包膠、包埋或低壓凍干方法。根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的藥物組合物可通過傳統(tǒng)方法使用一種或多種生理 學上可接受的載體包括賦形劑和助劑來配制，它們可促進所述活性成分加 工成可在藥學上使用的物質(zhì)。合適的物質(zhì)取決于所選的給藥途徑。對于注射，所述藥學組合物的活性成分可以配制于水溶液，優(yōu)選生理 學上相容的緩沖劑，例如漢克氏溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖劑。對 于經(jīng)粘膜給藥，適于穿透屏障的穿透劑用于所述物質(zhì)。所述穿透劑為本領(lǐng) 域公知。對于口服給藥，可以通過將所述活性化合物與本領(lǐng)域公知的藥學上可 接受的載體組合而容易地配制所述藥物組合物。所述載體能夠使藥物組合 物配制成片劑、丸劑、錠劑、膠嚢、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮劑等，以用于患者口服攝取。用于口服的藥物物質(zhì)可使用固體賦形劑制備，任選 地，如需要，在添加合適的助劑之后研磨最終的混合物，并加工粒料的混合物，獲得片劑或錠劑核。合適的賦形劑，特別是填充劑，例如糖，包 括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖；纖維素物質(zhì)，例如玉米淀粉、小麥淀粉、 米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、曱基纖維素、羥丙曱基纖維素、 羧曱基纖維素鈉；和/或生理學上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯酮 (PVP)。如需要，可添加崩解劑，例如交聯(lián)的聚乙烯吡咯酮、瓊脂，或海 藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。錠劑核使用合適的包衣提供。為此目的，可使用濃縮的糖溶液，所述 糖溶液可任選含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯膠、聚乙 二醇、二氧化鈦、漆溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物?？商砑尤玖匣蚩煽诜褂玫乃幬锝M合物，包括明膠制成的推合(push-fit)式膠嚢以 及明膠和增塑劑如丙三醇或山梨糖醇制成的軟封裝膠嚢。推合式膠嚢可含有活性成分混合諸如乳糖的填充劑、諸如淀粉的粘合劑、諸如滑石或硬脂 酸鎂的潤滑劑，以及任選的穩(wěn)定劑。在軟膠嚢中，活性成分可溶解或懸浮 于合適的液體，如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。另外，可添加穩(wěn)定 劑。所有用于口服給藥的物質(zhì)可為適于所選給藥途徑的劑量。對于口腔含化給藥，所述組合物可采用以傳統(tǒng)方法配制的片劑或錠劑 的形式。對于通過鼻吸入給藥，根據(jù)本發(fā)明使用的活性成分可以以使用合適的 拋射劑的加壓包裝或噴霧器的氣霧劑噴霧提供形式來遞送，所述拋射劑例 如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加壓氣霧劑 的情況中，可通過提供遞送測定量的閥來確定劑量單位。可將如于分配器 中使用的明膠的膠嚢和藥筒配制成其含有所述化合物和合適的粉末基質(zhì) 如乳糖或淀粉的粉末混合物。本文所述的藥物組合物可配制用于胃腸外給藥，例如通過快速濃注或 持續(xù)輸注。用于注射的物質(zhì)可以以單劑型提供，例如在任選具有添加的防 腐劑的安瓿或多劑量容器中。所述組合物可以是于油載體或水載體中的懸 浮液、溶液或乳濁液，并且可含有配制物質(zhì)例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散 劑。胃腸外給藥的藥物組合物包括水溶形式的活性物質(zhì)的水溶液。另外， 可將活性成分的懸浮液配制為合適的基于油或水的注射懸浮液。合適的親 脂溶劑或載體包括脂肪油例如花生油或合成的脂肪酸酯例如油g吏乙酯、甘 油三酯或脂質(zhì)體。水注射懸浮液可含有增加所述懸浮液粘滯性的物質(zhì)，例 如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，所述懸浮液還可含有增加 所述活性成分的可溶性的合適的穩(wěn)定劑或試劑，以允許制備高濃溶液?？蛇x地，所述活性成分可為粉末形式，在使用前使用合適的載體如無 菌無熱原水重溶。本發(fā)明的藥物組合物還可以使用例如傳統(tǒng)的栓劑基質(zhì)(例如可可脂或 其他甘油酯)以直腸組合物形式配制，例如栓劑或保留灌腸劑。適用于本發(fā)明上下文的藥物組合物包括其中以獲得預(yù)期目的的有效量含有所述活性成分的組合物。更特別地，"治療有效量"意思是可有效預(yù) 防、延遲、減輕或緩解受治療者的疾病的癥狀(如局部缺血)或延長受治 療者生存的活性成分(核酸構(gòu)建體)的量。治療有效量的確定很好地在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，尤其是根 據(jù)本文提供的詳細內(nèi)容。對于用于本發(fā)明方法的任何物質(zhì)，治療有效量或劑量最初可從體外和 細胞培養(yǎng)測定來估計。例如，可以配制動物模型的劑量以實現(xiàn)所需的濃度 或滴度。該信息可用于較準確地確定人類的有用劑量。本文所述的活性成分的毒性和治療功效可通過在體外、細胞培養(yǎng)物或 實驗動物中的標準藥學程序來確定。從這些體外和細胞培養(yǎng)測定以及動物 研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制用于人的劑量范圍。所述劑量可根據(jù)所應(yīng)用的 劑型和使用的給藥途徑而不同。各醫(yī)師可根據(jù)患者的病癥選擇確切的物質(zhì)、給藥途徑和劑量(如Fingl等，1975， "The Pharmacological Basis of Therapeutics"中第1章第1頁)。給藥量和間隔時間可個別調(diào)整，以提供足夠誘導(dǎo)或抑制生物學作用的 活性成分的血漿濃度或腦水平(最低有效濃度，MEC)。各物質(zhì)的MEC 不同，但可從體外數(shù)據(jù)估計。獲得MEC所需的劑量取決于各自的特征和 給藥途徑。檢測分析可用于測定血漿濃度。根據(jù)待治療的病癥的嚴重性和反應(yīng)性，給藥還可以為單次或多次給 藥，療程持續(xù)幾天至幾周或直到實現(xiàn)治愈或獲得疾病狀態(tài)的減弱。當然，待給藥的組合物的量可取決于受治療者、疾病的嚴重性、給藥 方式、開處方的醫(yī)生的判斷等。如果需要，本發(fā)明組合物可以以包含含有本發(fā)明物質(zhì)的一個或多個單 位劑型的包裝或分散裝置^是供，例如FDA批準的試劑盒。所述包裝可以 包含例如金屬或塑料箔，例如泡罩包裝。所述包裝或M裝置可以附帶給 藥的說明書。所述包裝或M裝置還可以以管理藥劑的制造、使用或銷售 的政府機構(gòu)建議的形式裝有與容器相關(guān)的通告，所述通告是由組合物或人 類或獸醫(yī)給藥的形式的機構(gòu)批準的。所述通告可以例如是美國食品藥品管理局批準用于處方藥而貼上標簽，或者是批準的產(chǎn)品插入物。在相容的藥 物栽體中配制的包含本發(fā)明物質(zhì)的組合物還可以制備、放置于合適的容器中，并^:貼上標簽用于治療指定癌癥，如同上文進一步詳述。預(yù)期在本專利的有效期內(nèi)，許多相關(guān)的癌癥療法將得以開發(fā)，術(shù)語"癌 癥療法"的范圍意于包括所有在先的這些新技術(shù)。如本文所使用，術(shù)語"約，，是指士 io %。通過審查下列實施例，本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點和新穎性特征對于本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說將是顯而易見的，所述實施例并非意于限制。另夕卜， 上述和下文權(quán)利要求部分所主張權(quán)利的本發(fā)明的各實施方案和方面在下 列實施例中具有實驗性支持。實施例現(xiàn)在結(jié)合上述說明描述下列實施例，以非限制性方式描述本發(fā)明。 通常，本文所使用的術(shù)語和本發(fā)明所使用的實驗室程序包括分子、生物化學、微生物學和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在參考文獻中有充分解釋。 參見，例如，"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook等，(1989); "Current Protocols in Molecular Biology"巻I-III Ausubel, R. M.,編輯(1994); Ausubel等，"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley和Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley和Sons, New York (1988); Watson等，"Recombinant DNA"， Scientific American Books, New York; Birren等(編輯)"Genome Analysis: A Laboratory Manual Series",巻1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);美國專利No. 4,666,828、 4,683,202、 4,801,531、 5,192,659 以及5,272,057提出的方法；"Cell Biology: A Laboratory Handbook",巻 I畫III Cellis, J. E.，編輯(1994); "Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994),第三版；"Current Protocols in Immunology"巻I隱III Coligan J. E.,編輯(1994); Stites等(編輯)， "Basic and Clinical Immunology"(第8版)，Appleton和Lange, Norwalk, CT(1994); Mishell和Shiigi (編4辱)，"Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman和Co., New York (1980);可用的免疫測定在專利和科學文獻 中廣泛描述，參見，例如美國專利No. 3，791，932;No. 3,839，153;No. 3,850,752; No. 3,850,578; No. 3,853,987; No. 3,867,517; No. 3,879,262; No. 3,901,654; No. 3,935,074; No. 3,984,533; No. 3,996,345; No. 4,034,074; No. 4,098,876; No. 4,879,219; No.5,011,771以及No.5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J.,編輯(1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D.,和 Higgins S. J.，編輯(1985); "Transcription and Translation" Hames， B. D.,和 Higgins S. J.，編輯(1984); "Animal Cell Culture" Freshney， R. L，編輯(1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press， (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B.， (1984)和"Methods in Enzymology"巻1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak等,"Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996);前述所有參考文獻通過引用并入本申請，如同完整在本文描述一樣。 其他常見參考文獻在本文中有提供。認為其中的程序為本領(lǐng)域公知并且為 了方便讀者而提供。其中所包含的所有信息通過引用并入本申請。實施例1 人類胚胎和胎盤樣品中H19的可選剪接變體的檢測 進行下列實驗以確定H19的剪接變體是否限制于特定的細胞類型。 材料與方法細胞培養(yǎng)該研究中所使用的所有人類肺瘤細胞系均獲得自美國典型 培養(yǎng)物保藏中心(Manassas, VA),并維持在含有10 %胎牛血清(55。C滅活 30分鐘)、25 mMHEPES (pH 7.4)、青霉素(180單位/ml)、鏈霉素(100 |ig/ml) 以及兩性霉素B (0.2嗎/ml)的DMEM-F12 (l:l)培養(yǎng)基中。在聚苯乙烯培養(yǎng) 皿(NUNC)中鋪板4xl(^細胞/cm2。每4天，使用0.05 %胰蛋白酶-EDTA 溶液(BietHaemek)使得細胞受胰蛋白酶消化10分鐘，以相同的初始密度再 鋪板。逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR):根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用TRI REAGENT (Sigma)從組織和培養(yǎng)細胞系提取總RNA，并使用DNA酶I處 理去除前述的基因組DNA污染物(Ayesh和Matouk等，2002， Mol Ther 7， 535-541)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用p(dT)15引物(Roche, Germany)進行 cDNA合成，使用400單位逆轉(zhuǎn)錄酶(Gbico BRL )起始5 jig總RNA的逆 轉(zhuǎn)錄J吏用Taq聚合酶(Takara, Otsu, Japan)在Diaza dGTP (Roche, Germany) 存在下進行PCR反應(yīng)94。C5分鐘，之后40個循環(huán)(94。Cl分鐘，58°C30 秒，72 。C40秒)，最后在72。C延伸5分鐘。PCR反應(yīng)中所使用的引物為 (5'畫AGGAGCACCTTGGACATCTG-3')(SEQ ID NO:8) 和(5'-CCCCTGTGCCTGCTACTAAA-3') (SEQ ID NO: 9)，分別為所公布的 H19轉(zhuǎn)錄起始位點下游的117和816位堿基(Brannan等，1990， Mol Cell Biol 10,28-36)。引物的位置在圖1A中顯示。將PCR反應(yīng)的產(chǎn)物在溴化乙 錠染色的凝膠上電泳。探針合成通過GFX PCR， DNA和凝膠條帶純化試劑盒從凝膠純化 表現(xiàn)較小條帶的組織的PCR產(chǎn)物，并將其克隆至T-easy⑥載體(Promega， USA.)。通過限制酶分析確定插入的方向，并由此根據(jù)供應(yīng)商的說明書 (Roche, Germany)使用DigoxigeninUTP合成標記的反義鏈。所產(chǎn)生的探針 使用2單位的無RNA酶的DNA酶I處理，沉淀并以合適體積的DEPC處 理的雙蒸水再懸浮。在4 %變性的瓊脂糖微型凝膠上電泳來分析所合成的 探針的大小，使用地高辛(Digoxigenin)抗體通過斑點印跡分析測定其標 記效率(數(shù)據(jù)未顯示)。RNA酶保護測定在RNA酶保護測定中使用不同濃度的妊娠末三個 月胎盤的RNA (使用RT-PCR顯示可選的剪接變體存在)。根據(jù)試劑盒說 明書RPA II TM (Ambion),將600 pg地高辛標記的探針/10 (ig來自妊娠末 三個月胎盤的總RNA (DNA酶處理的)與等于最高濃度的所使用的RNA 的酵母RNA在42-C雜交16小時，并使用RNA酶A和RNA酶T1消化。 通過在5%的聚丙烯酰胺凝膠(含有8M尿素)上電泳分離被保護免受RNA 酶消化的RNA片段，并使用CDP Star檢測試劑盒(Roche, Germany)根據(jù)生 產(chǎn)商的說明書檢測。DNA測序使用ABI PRISM BigDye終止循環(huán)測序預(yù)備反應(yīng)試劑盒 (PE Applied Biosystem)進4亍測序反應(yīng)。結(jié)果通過RT-PCR分析(圖1B-D )和RNA酶保護測定(圖IE )證明H19 的可選剪接變體存在于胎盤和胚胎組織中，不存在于癌細胞系和癌癥患者 樣品中。測序研究顯示可選的剪接變體為344 bp長，并且與已知的H19 轉(zhuǎn)錄物(GenBank登記號No. M32053)相比缺少從轉(zhuǎn)錄起始位點的252至 588核苷酸延伸的外顯子1部分(圖IF)。實施例2 CoCl2對H19基因表達的中度上調(diào)幾種在H19 RNA存在下被上調(diào)的基因還已知受低氧誘導(dǎo)(Ayesh和 Matouk等，2002， Mol Carcinog 35, 63-74)。還據(jù)報道，在類風濕性關(guān)節(jié)炎 滑膜組織中4企測到H19 RNA (Stuhlmuller等，2003, Am J Pathol 163， 卯1-911)。由于低氧和氧化應(yīng)激，部分由于在受影響的區(qū)域中增加的炎癥 細胞滲出液的代謝活性，廣泛的血管發(fā)生的存在通常與類風濕性關(guān)節(jié)炎有 關(guān)。另外，蛋白質(zhì)組學方法已經(jīng)揭示在使用含有完整H19基因的基因組 DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人類癌癥乳房上皮細胞中的H19超表達導(dǎo)致以轉(zhuǎn)錄后水 平正性調(diào)節(jié)硫氧還蛋白基因，硫氧還蛋白是氧化應(yīng)激反應(yīng)和脫氧核苷酸生 物合成的關(guān)鍵蛋白質(zhì)(Lottin等，2002, Carcinogesis 23, 1885-1895)。另外，在氧減少的環(huán)境中，發(fā)生涉及細胞侵襲的許多過程，包括胚泡 植入和胎盤發(fā)育(Rodesch等，1992, Obstet Gynecol 80， 283-285)。這兩個生 理學過程顯示了 H19表達的強烈上調(diào)(Ariel等，1994, Gynecol Oncol 53, 212-219)?；谶@些推理，對H19基因進行分析，以確定它是否對低氧敏感。 材料與方法在正常培養(yǎng)基條件中培養(yǎng)Hep3B細胞24小時，然后進行CoCl2操作。將細胞與CoCl2 (Sigma, Aldrich)—起再培養(yǎng)22小時，然后進行RNA提取。如上文實施例1所述使用下列引物進行RT-PCR分析5'- CCG GCC TTC CTG AAC A-3'向前(SEQ ID NO: 10)和5'- TTC CGA TGG TGT CTT TGA TGT國31相反(SEQ ID NO: 11)。結(jié)果如RT-PCR分析所4企測的，對添加增加的濃度的CoCl2 (50-400 uM)作 出反應(yīng)，在Hep3B細胞中H19基因表達被中度上調(diào)(圖2A-B )。這種相 對于針對真實的低氧條件的強烈上調(diào)的中度上調(diào)表明HiF_a僅部分起作用。實施例3 H19 RNA于正常和類似低氧的培養(yǎng)條件中在體外被不同 siRNA雙鏈體有效下調(diào)材料與方法siRNA的制備合成四種耙向人類siRNA和一種陰性對照siRNA (耙 向熒光素酶pGL3 )(如下表1中所列)，備于通過Proligo使用雙鏈體并 將其設(shè)計成所推薦的在各鏈上帶有dTdT 3'懸突。使用國立衛(wèi)生研究院Blast 程序評價所有序列的基因特異性。表1siRNA 有義鏈 位置 SEQ名稱 IDNC>:H19 5'-UAAGUCAUUUGCACUGGUUdTdT-3' 夕卜顯 1si脂A陽l 子5H19 5'-GCAGGACAUGACAUGGUCCdTdT-3' 夕卜顯 2siRNA-2 子2H19 5'-CCAACAUCAAAGACACCAUdTdT-3' 夕卜顯 3siRNA-3 子5HI 9 5'-CCAGGCAGAAAGAGCAAGAdTdT-3' 夕卜顯 4siRNA-4 子1PG13 5'隱CUUACGCUGAGUZCUUCGAdTdT隱3' 外顯 5siRNA 子1GFP 5'陽GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU 6 siRNA當接收時，各冷凍干燥的siRNA使用無RNA酶水重溶以制備50 pmole/ul溶液，并作為等份在-80。C下儲存。細胞培養(yǎng)條件和siRNA的轉(zhuǎn)染使用lipofectamine 2000 (Invitrogen, US) 在12孔培養(yǎng)板中進行siRNA的轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前一天，使用胰蛋白酶消化 細胞，計數(shù)，并以60，000/孔接種，每孔含有1 ml無抗生素的DMEM培養(yǎng) 基，這樣它們在轉(zhuǎn)染當天將近50%融合。使用100 pl無血清OPTI-MEM 培養(yǎng)基(Invitrogen， US)溫育3 lipofectamine 2000 15分鐘。將其添加至使 用100nl無血清OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋的100 pmole dsRNA，該配制物維 持20分鐘。將195 pl的該混合物應(yīng)用于Hep3B細胞和UMUC3細胞，并 在不更換培養(yǎng)基的情況下再溫育48小時。對于低氧模擬條件，在轉(zhuǎn)染后 24小時，以100 )iM的終濃度添加新鮮配制的CoCl2,再培養(yǎng)細胞22小時， 然后進行RNA提取。RNA提取和RT-PCR條件(siRNA):如上文實施例1所述進行總RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄，除了使用1 jig的總RNA以外。在Taq聚合酶(Takara, Otsu, Japan)的存在下進行H19的PCR反應(yīng)94°C5分鐘，然后是34個循環(huán) (94°C30秒，58°C30秒，72°C30秒)，最后在72。C延伸5分鐘，并對于 GADPH和組蛋白也是如此。GAP的引物序列向前5'-GGC TCT CCA GAA CAT CAT CCC TGC-3' (SEQ ID NO: 12)和相反GGG TGT CGC TGT TGA AGT CAG AGG-31 (SEQ ID NO: 13)。結(jié)果Hep3B細胞檢測了 siRNA在正常(圖3A)或類似低氧的條件(圖 3B)下降低H19 RNA內(nèi)源性水平的能力。通過RT-PCR分析(轉(zhuǎn)染后48 小時)分別檢測到使用四種靶向H19的不同siRNA(l-4)(圖3A,泳道2-5 ) 或四種siRNA的等摩爾池(圖3A，泳道6 )對H19表達的顯著抑制，但 非相關(guān)的靶向熒光素酶的PG13雙鏈體(圖3A，泳道1)和模擬物(圖3A, 泳道7)對H19表達無顯著抑制。另外，檢測三種不同siRNA ( 1、 3和4) 在類似低氧的CoCl2模擬條件中抑制H19基因表達的能力(圖3B-C)。當 H19 RNA被CoCl2模擬條件中度誘導(dǎo)時(對比圖3B泳道1的低氧模擬條 件和泳道5的正常條件，二者均使用PG13雙鏈體轉(zhuǎn)染)，使用三種靶向 H19轉(zhuǎn)錄物的不同siRNA檢測到其顯著的降低(圖3B,泳道2-4 )。UMUC3細胞對于Hep3B細胞，低氧條件增加H19信使的表達，siRNA H19(SEQIDNO: l)非常顯著地降低了其表達(圖3D-E )。實施例4 H19 RNA在Hep3B和UMUC3細胞中的活體外下調(diào)減輕了 體內(nèi)的肺瘤發(fā)生材料與方法活體外腫瘤發(fā)生測定如上所示，分別通過針對H19 RNA的兩種不 同的雙鏈體(siRNA SEQ ID NO: 3用于Hep3B細胞，siRNA SEQ ID NO: 1 用于UMUC3細胞)和非相關(guān)的對照siRNA (靶向Luc或GFP )在體外轉(zhuǎn) 染Hep3B和UMUC3細胞。轉(zhuǎn)染后48小時，將細胞皮下注射至無胸腺棵 小鼠的背脅腹部。其他對照組無任何處理。使用胰蛋白酶消化細胞，計數(shù)， 離心并重懸于無菌的PBS ( IX )，這樣具有約5xl()S細胞/ml。將250 (il的 懸浮液注射至無胸腺小鼠的背脅腹部。注射后15天和30天，腫瘤開始發(fā) 展，使用測徑器測量它們的體積。使用lipofectamine 2000 (Invitrogen, US)在6孔板中進行siRNA轉(zhuǎn)染。 在轉(zhuǎn)染前一天，使用胰蛋白酶消化細胞，計數(shù)，以100,000/孔接種，每孔 含有2 ml無抗生素DMEM培養(yǎng)基，這樣它們在轉(zhuǎn)染當天將近50%融合。 使用250 |il無血清OPTI-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen, US)溫育5 pi lipofectamine 2000 15分鐘。將其添加至使用250 pi無血清OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋的100 pM dsRNA，該配制物維持20分鐘。將500 jil的該混合物 應(yīng)用于細胞，并在不更換培養(yǎng)基的情況下再溫育48小時。各處理組具有7 只小鼠。
結(jié)果
如圖4A-D所示，將先前使用H19 siRNA轉(zhuǎn)染的Hep3B細胞給藥于小 鼠，較使用Luc siRNA轉(zhuǎn)染的Hep3B細胞導(dǎo)致腫瘤重量(圖4A)和體積 (圖4B )非常顯著降低。如圖5A-D所示，使用H19 siRNA轉(zhuǎn)染的UMUC3 細胞也4交使用LucsiRNA轉(zhuǎn)染的UMUC3細胞導(dǎo)致小鼠肺瘤重量(圖5A ) 和體積(圖5B)非常顯著降低。
實施例5 H19 siRNA的致癌性質(zhì)
為了確定H19 RNA是否是腫瘤相關(guān)基因產(chǎn)物或者它自身是否隱含致 癌潛能，進行了下列實驗。 材料與方法
細胞增殖分析接種Hep3B細胞并使用抗Luc siRNA或H19 siRNA (SEQ ID NO: 3)于12孔板中轉(zhuǎn)染。24小時后，使用PBS洗滌細胞兩次， 使用胰蛋白酶消化細胞并計數(shù)。使用含有10 % FCS的DMEM培養(yǎng)基將 5乂103轉(zhuǎn)染的Hep3B細胞以四個復(fù)孔接種在96孔培養(yǎng)板，并再培養(yǎng)24小 時，然后進行MTS測定。根據(jù)供應(yīng)商(Promega,USA)提供的程序進行MTS 測定。使用ELISA讀板機記錄在940 nm處的吸光度。
結(jié)果
如圖6所示，siRNAH19未能誘導(dǎo)Hep3B細胞增殖的具有顯著統(tǒng)計學 意義的衰減。
另夕卜，還將低氧恢復(fù)后H19對軟瓊脂中不依賴貼壁的集落形成的抑制 作用作為體外腫瘤發(fā)生的另外的評價進行分析。如材料與方法部分所述，
轉(zhuǎn)染后4小時，將Hep3B細胞暴露于低氧應(yīng)激。低氧條件之后的24小時， 將細胞接種于軟瓊脂。低氧恢復(fù)后，H19siRNA顯著削弱了不依賴貼壁的 生長，其中集落數(shù)和大小非常顯著減小(圖3F)。實施例6 H19 siRNA雙鏈體的體內(nèi)瘤內(nèi)注射 材料與方法
H19 siRNA的制備所使用的轉(zhuǎn)染子為Polyplus的jetPEI TM (x4)濃縮 物。使用100 pi 5 %的葡萄糖溶液稀釋850 pmole ( 11嗎siRNA)和10 (il jetPEI (N/P=10)， 5分鐘后，將jetPEI溶液添加至siRNA溶液，該配制物 維持20分鐘，然后進行瘤內(nèi)(用于UMUC3)或初始的接種位點(用于 Hep3B)的注射。
實驗程序?qū)?xl(^膀胱癌細胞(UMUC3)和肝細胞癌(Hep3B)細胞 懸浮于100 plPBS,并將UMUC3皮下注射至IO只無胸腺雄性小鼠的背部， 將Hep3B細胞注射至8只無胸腺雄性小鼠的背部。
UMUC3細胞當UMUC3的肺瘤直徑達到約4-8 mm時，將小鼠分成 兩個均質(zhì)組(n=5),并使小鼠接受作為對照的非相關(guān)的GFP或H19 siRNA(H19 siRNA-3-SEQ ID NO: 3)的首次瘤內(nèi)siRNA注射。在首次瘤內(nèi) 注射之后間隔2天和5天進行總的3次注射的給藥，在最后一次注射之后 使小鼠6天無任何處理。1吏用測徑器測量兩個處理組的肺瘤體積，記錄它 們的最終腫瘤重量。
Hep3B細胞對于Hep3B細胞，在細胞接種之后的48小時后治療， 觀察可觸及的腫瘤。將小鼠分成兩組(每組11=4),在初始接種位點注射。 小鼠接受總共5次注射，每兩天一次，然后在最后一次注射之后保留一周， 然后處死。
通過下列方程式計算肺瘤體積V=(LxW2)x0.5(V,體積；L，長度；W，
寬度)。
結(jié)果
為了確定腫瘤生長中被敲除的H19的功能性結(jié)果，將H19 siRNA-PEI 復(fù)合物注射至膀胱癌UMUC3細胞系誘導(dǎo)的小腫瘤中，并且之前在棵小鼠 中沒有觀察到Hep3B癌細胞系的可觸及肺瘤。將使用PEI配制的靶向GFP 的合成對照siRNA用作對照。如圖7A-B所示，H19 siRNA3導(dǎo)致UMUC3細胞平均腫瘤體積非常顯著減小約90% (圖7A)，和平均肺瘤重量非常顯 著減小約88% (圖7B)。
在Hep3B誘導(dǎo)的腫瘤中，使用siRNAl,肺瘤體積和重量的減小的水 平不太顯著。觀察到腫瘤重量減小約40%(圖7C),肺瘤體積減小56%(圖 7D)。
實施例7 TA11和TA31細胞中H19的涉入
起源于相同的母源細胞系T24P的兩種人類膀胱癌細胞系TA11和 TA31顯示在正常培養(yǎng)條件下體外分別為陰性(TAllH19-ve)，或高表達 (TA31H19high)(Ayesh等，2002, Mol Carcinog 35, 63-74)。進行下列實驗以 確定H19信使是否影響這些其他細胞譜系的腫瘤生長。
材料與方法
將TA11和TA31 (約2xl06 )細胞皮下植入CD-1小鼠(每組n=5 )。在 植入后15天測量胂瘤體積。如圖8A-B所示，衍生自TAllH19-ve細胞的 腫瘤顯著小于衍生自TA31H19high細胞的腫瘤。另外，TA31H19high衍生 的腫瘤血管生成較顯著(圖8C-D)。獲得自TAllH19-ve細胞的肺瘤的 RT-PCR結(jié)果顯示在這些肺瘤中H19 RNA纟皮誘導(dǎo)，而相比之下H19 RNA 在這些細胞中無體外表達(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明H19RNA促進腫 瘤生長。
實施例8 Hep3B細胞系中H19 RNA被低氧應(yīng)激誘導(dǎo)以及針對H19 的siRNA非常有效地阻礙了其誘導(dǎo) 材料與方法
如上所述，接種Hep3B細胞并使用抗H19 siRNA或抗Luc siRNA轉(zhuǎn) 染。轉(zhuǎn)染后24小時，將細胞放入Aneoropack矩形瓶(Mitsubishi chemical company Japan)以在1小時內(nèi)創(chuàng)造低氧條件(1% 02, 20% C02),或維持于正 常氧濃度。培養(yǎng)持續(xù)24小時，然后進行RNA提取。如上文實施例l所述 進行RT-PCR分析。結(jié)果
如圖9A所示，H19 RNA分別在正常(圖9A,泳道3 )和低氧(圖 9A，泳道4)培養(yǎng)條件被特異性下調(diào)。管家基因(GAPDH)的PCR分析示于 圖9B。 uPAR的PCR分析示于圖9C。
應(yīng)知道為了清楚的目的在各實施方案內(nèi)容中描述的本發(fā)明的某些特 征還可結(jié)合單個的實施方案提供。相反，為了簡短的目的在單個實施方案
式提供。
盡管結(jié)合本發(fā)明的具體實施方案描述了本發(fā)明，顯而易見的是許多替 換、修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。因此，意于包括 落在附屬權(quán)利要求的精神和寬范圍之內(nèi)的所有這些替換、修改和變化。該 說明書中提及的所有公布、專利和專利申請通過引用完整并入本申請，達 到這樣一種程度，即如同各公布、專利或?qū)＠暾執(zhí)貏e和各自通過引用并 入一樣。另外，本申請中的任何參考文獻的引用或確認不應(yīng)理解為承認所 述參考文獻可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
權(quán)利要求
1. 一種選自SEQ ID NO1、2、3和4的分離的寡核苷酸。
2. —種藥物組合物，其包含藥學上可接受的載體和作為活性成分的至 少一種選自SEQIDNO:l、 2、 3和4的分離的寡核苦酸。
3. —種選自SEQIDNO:l、 2、 3和4的分離的寡核苷酸用于制備治療 癌癥的藥劑的用途。
4. 一種治療癌癥的方法，其包括(a) 為具有相應(yīng)需要的受治療者施用治療有效量的能夠下調(diào)H19 mRNA水平和/或活性的物質(zhì)，或在具有相應(yīng)需要的受治療者的細胞中表達 治療有效量的能夠下調(diào)H19 mRNA水平和/或活性的物質(zhì)，以及(b) 為所述受治療者提供癌癥療法，由此治療癌癥。
5. —種能夠下調(diào)H19 mRNA水平和/或活性的物質(zhì)用于制備與癌癥療 法聯(lián)合治療癌癥的藥劑的用途。
6. —種治療癌癥的方法，其包括為具有相應(yīng)需要的受治療者施用治 療有效量的至少一種選自SEQIDNO:l、 2、 3和4的寡核香酸，或在具有 相應(yīng)需要的受治療者的細胞中表達治療有效量的至少一種選自SEQ ID NO:l、 2、 3和4的寡核香酸，由此治療癌癥。
7. —種鑒定為用于治療癌癥的制品，其包含能夠下調(diào)H19 mRNA水 平和/或活性的物質(zhì)和其他的抗癌劑。
8. 如權(quán)利要求4、 5或7所述的制品、用途或方法，其中所述能夠下 調(diào)H19 mRNA水平和/或活性的物質(zhì)是核酸物質(zhì)。
9. 如權(quán)利要求8所述的制品、用途或方法，其中所述核酸物質(zhì)選自(a)用于抑制H19RNA從H19基因轉(zhuǎn)錄的單鏈多核苷酸；(b )用于與H19 mRNA雜交并由此導(dǎo)致H19 mRNA活性減小的單鏈 多核苷酸；(c) 導(dǎo)致H19mRNA降解的雙鏈多核苦酸；(d) 用于剪切H19mRNA的形成三鏈體的多核苷酸；(e) 用于剪切H19mRNA的催化的多核苷酸；(f) 用于與H19mRNA雜交而導(dǎo)致其酶解的單鏈多核苷酸；以及(g) 編碼(a)至(f)任一者的核酸序列。
10. 如權(quán)利要求8所述的制品、用途或方法，其中所述核酸物質(zhì)選自 siRNA、核酶和DNA酶。
11. 如權(quán)利要求10所述的制品、用途或方法，其中所述核酸物質(zhì)是 siRNA。
12. 如權(quán)利要求11所述的制品、用途或方法，其中所述siRNA包含 選自SEQ ID NO: 1-4的核酸序列。
13. 如權(quán)利要求4或6所述的方法，其中所述給藥在原位進行。
14. 如權(quán)利要求3、 4、 5、 6或7任一項所述的方法、用途或制品，其 中所述癌癥選自兒童實體瘤、維爾姆斯氏腫瘤、肝母細胞瘤、胚胎性橫 紋肌肉瘤、生殖細胞瘤和滋養(yǎng)層細胞瘤、睪丸生殖細胞瘤、卵巢非成熟型 畸胎瘤、骶尾瘤、絨毛膜癌、胎盤部位滋養(yǎng)層細胞瘤、成人上皮細胞瘤、 膀胱癌、肝細胞癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、乳腺癌、頭頸鱗狀上皮細胞 癌、食道癌、神經(jīng)原性腫瘤、星形細胞瘤、惡性神經(jīng)節(jié)瘤、神經(jīng)母細胞瘤。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法、制品或用途，其中所述癌癥是膀胱癌 或肝細胞癌。
16. 如權(quán)利要求7所述的制品，其中所述能夠下調(diào)H19 mRNA水平和 /或活性的物質(zhì)與所述其他抗癌劑 一起配制。
全文摘要
公開了能夠下調(diào)癌細胞中H19 mRNA水平的分離的寡核苷酸。公開了包含能夠聯(lián)合其他抗癌療法下調(diào)H19 mRNA的物質(zhì)的制品以及通過進行所述制品的給藥而治療癌癥的方法。
文檔編號A61K31/7088GK101273130SQ200680030278
公開日2008年9月24日 申請日期2006年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月7日
發(fā)明者亞弗拉罕·霍奇伯格, 伊麥德·麥托克 申請人:耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發(fā)展公司