專利名稱：一種核酸物質(zhì)與蛋白質(zhì)類組合物及其生產(chǎn)方法和在免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸物質(zhì)與蛋白質(zhì)類組合物及其生產(chǎn)方法和其在制備免疫制劑中的應(yīng)用，特別是用DNA與蛋白質(zhì)或滅活的微生物體混合而生成的核酸與蛋白質(zhì)的組合物及其生產(chǎn)方法和在免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
機(jī)體的免疫系統(tǒng)始終處在一種復(fù)雜調(diào)節(jié)過程中。免疫調(diào)節(jié)是指免疫應(yīng)答過程中免疫系統(tǒng)內(nèi)部各細(xì)胞之間、免疫細(xì)胞與免疫分子之間以及免疫系統(tǒng)與其他系統(tǒng)之間的相互作用，構(gòu)成一個相互協(xié)調(diào)、相互制約的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使免疫應(yīng)答維持合適的強(qiáng)度，從而保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在外來病原物入侵后，免疫系統(tǒng)可以根據(jù)病原物的特點激活需要的免疫反應(yīng)來抵御和清除病原物。免疫反應(yīng)又分為體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。其中體液免疫反應(yīng)是以產(chǎn)生特異性抗體的反應(yīng)，而細(xì)胞免疫反應(yīng)是激活T細(xì)胞為主的免疫反應(yīng)。提高機(jī)體免疫力的最主要的手段是接種疫苗。目前已有多種方法用來生產(chǎn)抗傳染性病原體的疫苗，如滅活疫苗，減毒活疫苗、重組疫苗，亞單位疫苗和DNA疫苗等，它們的基本作用原理是相同的，即借助病原體的抗原物質(zhì)在體內(nèi)被免疫細(xì)胞識別而激發(fā)免疫反應(yīng)，達(dá)到免疫個體不被傳染性病原體感染的目的。但是，機(jī)體免疫力過強(qiáng)，也會產(chǎn)生副作用，如自身免疫疾病等。所以在外來抗原物質(zhì)入侵時，機(jī)體會利用一整套免疫調(diào)節(jié)機(jī)制平衡免疫反應(yīng)。人為的抑制免疫反應(yīng)可是用于治療自身免疫疾病的手段之一。T細(xì)胞免疫抑制是機(jī)體免疫功能的一個重要環(huán)節(jié)，比如限制自身免疫疾病發(fā)生和機(jī)能性下調(diào)免疫反應(yīng)。T細(xì)胞可以以通過無共刺激分子存在情況下、通過T細(xì)胞為APC細(xì)胞刺激下或最近證明的胸腺來源的CD4+CD25+細(xì)胞與新生T細(xì)胞相互作用來實現(xiàn)。多數(shù)自身免疫疾病均存在特異性的抗原受體，如系統(tǒng)紅斑狼瘡病人血液中，臨床檢查發(fā)現(xiàn)存在著抗DNA抗體，這種抗全與抗原形成了免疫復(fù)合物，沉淀在組織中引起周期性的炎癥。又如類風(fēng)濕病(RA)在患者的關(guān)節(jié)組織中，含有自身免疫反應(yīng)性T-細(xì)胞，它能與某種未知抗原發(fā)生反應(yīng)，這類T細(xì)胞通過T細(xì)胞抗原受體(TCRs)不僅可識別特定的抗原，也可識別主要組織相溶性分子(MHC)。因此，自身免疫反應(yīng)的抗原受體通過早期識別，引發(fā)炎癥，導(dǎo)致臨床上系統(tǒng)紅斑狼瘡，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等嚴(yán)重的自身免疫性疾病。
實驗研究已確定了某些自身免疫疾病的抗原受體，如小鼠和大鼠動物模型中發(fā)生的NEB/NEW小鼠的紅斑狼瘡，實驗性接種髓磷脂堿性蛋白(MBP)，過敏性腦脊髓炎(EAE)。
在小鼠紅班狼瘡中，采用抗特異性抗體(anti-Ids)去除產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)的B細(xì)胞，達(dá)到治療的目的，部分臨床病例表明抗特異性抗體能明顯緩病癥(B.Hahn 1983)，但有些病例表明抗特異性抗體使病情惡化(R.Schwartz 1983)。同樣在腦脊髓炎的治療中，利用免疫TCR-衍生肽類對抗自身免疫反應(yīng)的TCRs，結(jié)果有些病情得到了緩解，有些病情則進(jìn)一步惡化(Heber-Katz 1990)。
因此，利用免疫接種來治療某些自身免疫疾病時，病人的免疫反應(yīng)直接影響治療的臨床效果。若免疫接種導(dǎo)致產(chǎn)生抗體反應(yīng)并形成抗Ids抗體，這些抗Ids可能會結(jié)合自身免疫反應(yīng)中的B細(xì)胞或T細(xì)胞，引起體外調(diào)節(jié)性的溶解反應(yīng)，達(dá)到臨床上病情緩解的效果，相反，如果免疫反應(yīng)導(dǎo)致體內(nèi)清除抗-Ids，免疫反應(yīng)物就會和自身免疫反應(yīng)中的B-細(xì)胞或T-細(xì)胞結(jié)合，同時又交叉性地與它們的抗原受體結(jié)合，進(jìn)一步激發(fā)免疫細(xì)胞產(chǎn)生更多的自身免疫反應(yīng)抗體(Abs)或T-細(xì)胞，使臨床病情惡化，免疫接種激發(fā)的大多數(shù)T-細(xì)胞，使臨床病情惡化，免疫接種激發(fā)的大我數(shù)T-細(xì)胞反應(yīng)，會同時引起輔助T-細(xì)胞反應(yīng)病情惡化或殺傷抑制細(xì)胞反應(yīng)病情緩解。因此，有效地治療自身免疫疾病的免疫學(xué)方法尚需深入研究。
在臨床上通常使用的免疫抑制劑和方法有如下幾個方面利用化學(xué)藥品如普樂可復(fù)(FK506)，環(huán)孢素A(CsA)，驍悉(MMF)，硫唑嘌呤(Aza)，強(qiáng)的松(Pred)，早基強(qiáng)的松龍(MP)；利用抗體如抗淋巴細(xì)胞球蛋白(ALG)，抗CD4單克隆抗體(OKT4)；但以上的免疫抑制劑都有其毒副作用，若使用不當(dāng)，一方面可因過度抑制機(jī)體免疫反應(yīng)性而引發(fā)多種并發(fā)癥，另一方面也可因其自身的毒副作用導(dǎo)致抑制器官功能衰竭。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有免疫抑制技術(shù)存在的上述問題，提供一種可以用于制備各種免疫抑制制劑的核酸類和蛋白質(zhì)類組合物及其制備方法，其特征在于使用DNA片段或質(zhì)粒與蛋白質(zhì)類物質(zhì)或與滅活的病原體抗原物質(zhì)通過簡單混合后生成的組合物直接注入機(jī)體，而產(chǎn)生其機(jī)體的免疫抑制反應(yīng)。利用本發(fā)明組合物制備的抑制機(jī)體免疫力的免疫制劑，不僅可以降低副作用，而且可以有效的降低和抑制機(jī)體的細(xì)胞為主的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明核酸物質(zhì)和蛋白質(zhì)類組合物是由DNA片段或DNA質(zhì)粒與蛋白質(zhì)或與滅活的病原體抗原物質(zhì)通過簡單混合后生成的組合物，具有如下通式DNA+蛋白質(zhì)，或DNA+滅活病原體抗原一種核酸物質(zhì)和蛋白質(zhì)類組合物，其特征在于該組合物含有DNA片段或DNA質(zhì)粒與蛋白質(zhì)或DNA和滅活病原體抗原物質(zhì)的組合物。
上述DNA是人工合成的或者通過從微生物、真核及植物細(xì)胞或組織提取而來的雙鏈DNA或質(zhì)粒。
上述的蛋白質(zhì)類為人工合成的或者通過生物體生產(chǎn)而成的蛋白質(zhì)或多肽或病原體經(jīng)公知的方法滅活后的抗原物質(zhì)。
上述生物體為大腸桿菌或芽孢桿菌或酵母菌或真核細(xì)胞等在人工培養(yǎng)條件下可用于生產(chǎn)放大的生物體。
上述的滅活病原體通過生物體分離和生產(chǎn)的病毒、菌、寄生蟲及過敏物質(zhì)經(jīng)公知的方法滅活后而得到的無感染性病原體，其特征在于該滅活病原體直接與DNA混合或滅活病原體經(jīng)與礦物油乳化后再與DNA混合。
上述抑制免疫反應(yīng)的脫氧核糖核酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)的組合物通過以下方法得到將DNA與蛋白質(zhì)或DNA與滅活病原體抗原物質(zhì)溶于生理鹽水中混合后，制得本發(fā)明的組合物。其中DNA與蛋白質(zhì)或DNA與滅活病原體抗原的質(zhì)量比值為0.1∶1～1∶10。
上述抑制免疫反應(yīng)的DNA與含礦物油的滅活疫苗的組合物通過以下方法得到將DNA溶于生理鹽水中后再溶于含礦物油的滅活疫苗乳劑中混合后，制備本發(fā)明的組合物。其中DNA與含礦物油的滅活疫苗的質(zhì)量比值為0.1∶1～1∶10。
上述抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)的核酸物質(zhì)與蛋白質(zhì)類的免疫組合物的使用方法是通過注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法使上述組合物進(jìn)入機(jī)體。
通過試驗，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生正常的特異性抗體免疫反應(yīng)，但是抑制特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，特別是Th1型免疫反應(yīng)。試驗已經(jīng)證明使用本發(fā)明組合物的免疫方法產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫抑制反應(yīng)是通過增強(qiáng)白介素10水平和抑制伽馬干擾素(IFN-γ)水平介導(dǎo)的。增強(qiáng)白介素10水平是機(jī)體免疫系統(tǒng)抑制過強(qiáng)的免疫反應(yīng)而進(jìn)行的有效調(diào)節(jié)作用。防止機(jī)體中不必要的免疫損傷而重要手段之一。本發(fā)明正是利用了這一調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)了使用本發(fā)明的核酸類和蛋白質(zhì)類組合物及免疫機(jī)體后能有效地抑制特異性細(xì)胞反應(yīng)，并可廣泛地應(yīng)用于制備各種免疫抑制制劑。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點1、本發(fā)明組合物比化學(xué)藥品如普樂可復(fù)(FK506)，環(huán)孢素A(CsA)，驍悉(MMF)，硫唑嘌呤(Aza)，強(qiáng)的松(Pred)，早基強(qiáng)的松龍(MP)，和抗體如OKT4等更為安全，有選擇性的抑制機(jī)體T細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而可以有效的應(yīng)用于治療自身免疫疾病、器官移植、控制T細(xì)胞水平的治療等方面；2、本發(fā)明組合物能夠有效地激發(fā)機(jī)體特異性的體液免疫反應(yīng)，抑制機(jī)體特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，所以可以特異性地用于抑制特定病原物引起的免疫損傷。而本發(fā)明組合物能有效地克服免疫抑制方法不特異的不足；3、本發(fā)明組合物不要求特殊的反應(yīng)條件，一般藥廠的普通設(shè)備即可生產(chǎn)，生產(chǎn)方法簡單，提純?nèi)菀?，易于工業(yè)化生產(chǎn)；4、本發(fā)明組合物用途廣泛，可以用于致病病原體有病毒、原核細(xì)胞、真核細(xì)胞，真核細(xì)胞病原體包括細(xì)胞致病病原體和多細(xì)胞寄生蟲類。
5、本發(fā)明組合物用途廣泛，可以用于自身免疫反應(yīng)病原有系統(tǒng)紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性淋巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)、胰島素依賴型糖尿病、重癥肌無力、慢性潰瘍性結(jié)腸炎、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、肺出血腎炎綜合征、尋常天齙瘡、類天齙瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬變、多發(fā)性腦脊髓硬化癥、急性多發(fā)性多神經(jīng)炎等嚴(yán)重的自身免疫性疾病。
6、本發(fā)明組合物用途廣泛，可以用于器官移植中的免疫排斥反應(yīng)。
四

圖1.SuperY/VP1重組質(zhì)粒的酶切鑒定用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I酶切口蹄疫VP1 cDNA產(chǎn)物，純化回收后，將VP1基因片段克隆入穿梭質(zhì)粒SuperY。
APCR擴(kuò)增FMDV vp1基因的電泳結(jié)果；B重組質(zhì)粒SuperY/VP1的酶切鑒定.
泳道1和3DNA Marker；泳道2VP1基因片段；泳道4SuperY/VP1經(jīng)EcoRI/Xba I酶切后的結(jié)果。從圖中可以看出，進(jìn)行雙酶切(EcoR I/Xba I)鑒定，得到到泳道4下方639bp左右有一條帶，證明VP1已克隆至SuperY上，命名為SuperY/VP1。經(jīng)序列分析驗證無誤。VP1基因成功克隆于SuperY質(zhì)粒中。
圖2.SuperY/VP1重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE樣品加熱變性后，經(jīng)SDS-PAGE電泳并卡馬氏亮蘭G250染色。
泳道1酵母SMD1168上清；泳道2SuperY的酵母表達(dá)上清；泳道3SuperY/VP1的酵母表達(dá)上清；泳道4低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)。從圖中可以看出，SuperY/VP1中的VP1基因在酵母細(xì)胞中表達(dá)。
圖3.重組質(zhì)粒VP1表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting分析。
樣品加熱變性后，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，再于?？箍谔阋吒呙庋搴投狗磻?yīng)后，顯色。
泳道1低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；泳道2SuperY/VP1的酵母表達(dá)上清；泳道3酵母SMD1168上清；泳道4SuperY的酵母表達(dá)上清。
泳道2在66kD和43kD附近出現(xiàn)了特異性的顯色帶，而其它泳道中均未出現(xiàn)條帶，表明表達(dá)的重組蛋白能與抗FMDV血清特異性反應(yīng)帶，證明表達(dá)產(chǎn)物具有FMDV的免疫原性。
圖4.比較DNA與146s的樣品混合后性質(zhì)的變化為證明核酸物質(zhì)與蛋白類物質(zhì)在混合后無性質(zhì)上的改變，將DNA與146S抗原混合后置于37℃孵育24小時，經(jīng)瓊脂糖電泳，比較變化情況。圖中顯示，泳道1和2是未經(jīng)混合的DNA樣品，3和4是混合的DNA與146s的樣品在電泳后的情況，泳道5、6是混合的DNA和146s樣品經(jīng)37℃孵育24小時后的情況。結(jié)果說明混合的DNA與146s的樣品混合前后無變化。
圖5.比較DNA與蛋白質(zhì)或DNA與滅活病毒抗原組合后后免疫小鼠產(chǎn)生抗體滴度變化及影響為驗證DNA與蛋白質(zhì)或DNA與滅活病毒抗原組合物免疫小鼠后對免疫系統(tǒng)中抗體免疫水平的影響，在小白鼠肌肉注射本發(fā)明提到各種組合物后，比較免疫效果，在第二周再重復(fù)注射同等劑量各種組合物一次，每兩周后取取血清測定其抗體變化結(jié)果如圖。
從圖中可以看出，當(dāng)DNA與蛋白質(zhì)VP1或DNA與滅活病毒抗原146S組合物免疫小鼠時，特異性抗體水平與其它組合物免疫后組比較無明顯變化。說明其DNA與蛋白質(zhì)或DNA與滅活病毒抗原組合后免疫動物，在激活特異性抗體水平是無特別變化。
圖6.比較DNA與蛋白質(zhì)組合后免疫小鼠對T細(xì)胞特異性擴(kuò)增的影響為說明DNA與蛋白質(zhì)VP1組合物組合物免疫小鼠后對免疫系統(tǒng)中細(xì)胞免疫水平的影響，在小白鼠肌肉注射本發(fā)明提到各種組合物后，比較免疫效果，在第二周再重復(fù)注射同等劑量各種組合物一次，兩周后取脾臟T細(xì)胞測定其T細(xì)胞擴(kuò)增活性，結(jié)果如圖。
從圖中可以看出，當(dāng)DNA與蛋白質(zhì)VP1組合物免疫小鼠時，T細(xì)胞擴(kuò)增活性明顯低于其它組合物免疫后的水平。說明其DNA與蛋白質(zhì)組合后免疫動物，可以特異性的降低T細(xì)胞免疫水平。
圖7.比較DNA與滅活病毒抗原或與滅活病毒油佐劑疫苗組合后免疫小鼠對T細(xì)胞特異性擴(kuò)增的影響
為說明DNA與滅活病毒抗原或DNA與滅活病毒油佐劑疫苗組合物免疫小鼠后對免疫系統(tǒng)中細(xì)胞免疫水平的影響，在小白鼠肌肉注射本發(fā)明提到各種組合物后，比較免疫效果，在第二周再重復(fù)注射同等劑量各種組合物一次，兩周后取脾臟T細(xì)胞測定其T細(xì)胞擴(kuò)增活性，結(jié)果如圖。
從圖中可以看出，當(dāng)DNA與滅活病毒抗原146S或DNA與滅活病毒油佐劑疫苗組合物免疫小鼠時，T細(xì)胞擴(kuò)增活性明顯低于其它組合物免疫后的水平，其中DNA與滅活病毒油佐劑疫苗組合物免疫后降低的水平更多。說明其DNA與滅活病毒抗原或DNA與滅活病毒油佐劑疫苗組合后免疫動物，可以特異性的降低T細(xì)胞免疫水平。
圖8.比較DNA與蛋白質(zhì)或DNA與滅活病毒抗原組合物免疫后小鼠對細(xì)胞介素水平的影響為說明DNA與蛋白質(zhì)或DNA與滅活病毒抗原組合物影響免疫系統(tǒng)和細(xì)胞免疫水平，免疫后對小鼠的細(xì)胞介素IL-4、IL-10和IFN-γ進(jìn)行檢測。圖中不同組合免疫后產(chǎn)生的細(xì)胞介素變化看出，當(dāng)DNA與蛋白質(zhì)或DNA與滅活病毒抗原組合物免疫小鼠時，IL-4和IL-10上升，而IL-2和IFN-γ下降。由此證明其組合物抑制T細(xì)胞活性是通過IL-4和IL-10水平完成的。
五、具體實施例下面這些實施例是示范性的，而不是限制性的，可根據(jù)上述本發(fā)明的技術(shù)方案和實際情況，來確定具體的實施方式。下面的實施例可以幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1 DNA的制備一種方法是將動物組織低溫后粉碎，在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白質(zhì)，雙鏈DNA經(jīng)乙醇沉淀而分離出來。
另一種方法是從植物組織中采用CTAB法提取DNA，在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白質(zhì)，雙鏈DNA經(jīng)乙醇沉淀而分離出來。
另一種方法是從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA，在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白質(zhì)，雙鏈DNA經(jīng)乙醇沉淀而分離出來。
以上提取方法和技術(shù)的詳細(xì)描敘可在Sambrook等人的″Molecular Cloning″(第二版1998，Cold Spring Harbor Laboratory Press，紐約)和厲朝龍等編，《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗技術(shù)》浙江大學(xué)出版社查尋。
實施例2蛋白質(zhì)和多肽的制備蛋白質(zhì)和多肽可以通過標(biāo)準(zhǔn)的自動多肽合成儀(如ABI，433A等)合成，合成方法按儀器制造商使用方法；或從動物組織和細(xì)胞、植物組織和細(xì)胞或微生物中，按常規(guī)的蛋白質(zhì)化學(xué)方法進(jìn)行提取，也可以從基因工程表達(dá)菌或細(xì)胞中提取。這些多肽提取方法都是公知的，在Doonan的″Protein Purification Protocols″(1996，Humana Press，NJ)中有詳細(xì)描敘。
實施例3病原物的制備及滅活病原體通過生物體分離和生產(chǎn)的病毒、菌、支原體、寄生蟲及過敏物質(zhì)經(jīng)公知的滅活方法和試劑如甲醛或福爾馬林、β-丙內(nèi)酯、N-乙酰乙烯亞胺以及二乙烯亞胺等，滅活后而得到的無感染性病原體，再經(jīng)分離純化后而制成。
實施例4口蹄疫VP1 cDNA克隆及其表達(dá)的鑒定。
在我們申請的中國發(fā)明專利(公開號1391954)中已有詳細(xì)的描述。
實施例5表達(dá)載體SuperY/VP1的構(gòu)建與鑒定用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I酶切口蹄疫VP1 cDNA產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖電泳，回收后，將VP1基因片段克隆入穿梭質(zhì)粒SuperY的EcoR I和Xba I位點，轉(zhuǎn)化至Top10 F′感受態(tài)細(xì)胞，篩選鑒定陽性克隆，并以序列分析鑒定。
實施例6VP1在酵母中的表達(dá)與檢測將SuperY/VP1采用電擊轉(zhuǎn)化酵母，篩出單菌落30℃搖瓶培養(yǎng)48-96小時后，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，并用凝膠成像系統(tǒng)照相。VP1的表達(dá)產(chǎn)物分子量約66kD和43kD兩種，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，以5％脫脂牛奶作封閉劑，然后依次與?？箍谔阋吒呙庋?、羊抗牛IgG-HRP酶標(biāo)抗體孵育，最后在DAB/H2O2下顯色。
實施例7抗原的配制1、146S抗原的制備是由購自的蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)口蹄疫牛O型滅活疫苗，經(jīng)去除滅活苗中的礦物油，保存在4℃。
2、生殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)抗原是由購自的哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)生殖與呼吸綜合癥病毒滅活疫苗，經(jīng)去除滅活苗中的礦物油，保存在4℃。
3、純化后的VP1蛋白質(zhì)溶于0.9％生理鹽水中，保存在4℃。
以上抗原，用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。
實施例8測定核酸/蛋白質(zhì)組合物實驗為證明核酸物質(zhì)與蛋白類物質(zhì)在混合后無性質(zhì)上的改變，將DNA與146S抗原混合后置于37℃孵育24小時，經(jīng)瓊脂糖電泳，比較變化情況。
圖中顯示，泳道1和2是未經(jīng)混合的DNA樣品，3和4是混合的DNA與146s的樣品在電泳后的情況，泳道5、6是混合的DNA和146s的樣品經(jīng)37℃孵育24小時后的情況。
實施例9小鼠免疫實驗實驗中用到的組合物均溶于0.9％NaCl中。將6-8周齡BALR/c(H-2d)雌性小鼠每組6只進(jìn)行注射。每只小鼠肌肉多點注射100μg pcD-VP1重組質(zhì)粒及相應(yīng)的化學(xué)佐劑，第一次免疫后14天加強(qiáng)免疫一次。對照組注射空載體pcDNA3。分別在第0、35和50天收集血清。
實施例10抗體的ELISA檢測在小白鼠肌肉注射100μg多核酸/肽/多聚物復(fù)合物后，在第二周再重復(fù)注射同等劑量一次，兩周取血清對免疫血清進(jìn)行抗體水平ELISA檢測，測定其免疫反應(yīng)。
將96孔酶標(biāo)板用適量抗原包被，4℃過夜；棄去包被液PBST洗板三次；加入不低于1∶100稀釋度的免疫動物血清，37℃孵育2小時；PBST洗板三次后，每孔加入適量辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗動物二抗(Ig)100μl 37℃孵育1小時后棄去；PBST洗三次，加入底物液100μl，室溫顯色反應(yīng)30分鐘，2M硫酸中止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定相應(yīng)波長的OD值。
實驗結(jié)果見附圖6。圖中對照pcDNA3，質(zhì)粒口蹄疫VP1 pcD-VP1質(zhì)粒，組合物為口蹄疫VP1多肽與pcD-VP1；口蹄疫146S抗原與pcD-VP1。
實施例11T細(xì)胞擴(kuò)增實驗雌性BALB/c小鼠被分為6組。每一組分別注射重組質(zhì)粒pcD-VP1 100μg與相應(yīng)的化學(xué)佐劑。加強(qiáng)免疫后14天，無菌取脾制成單個細(xì)胞懸液[15]。用PBS液洗三次，離心并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×106/ml，每組細(xì)胞懸液分4份加入96孔培養(yǎng)板中。其中一份加100μl的ConA至終濃度為5μg/ml，一份加146S抗原至終濃度為2μg/ml，一份加加100μl的BSA至終濃度為2μg/ml作為對照組，另一份不加刺激物，24h后，每孔加入100μl MTT至終濃度為5mg/ml，4h后，每孔加100μl SDS-DMSO(20％SDS溶于50％DMSO，pH2.0)，使其完全溶解，在酶標(biāo)儀上讀取570nm處的OD值。
實施例12細(xì)胞介素水平測定利用競爭定量PCR進(jìn)行檢測細(xì)胞介素mRNA的水平，其關(guān)鍵在于引入一個內(nèi)標(biāo)模板pQRS，它含有IL-2；IL；IL-5；IL-10；IL-12；TNF-α；TGF-β；IFN-γ；INOS；HRPT十個基因的部分序列，因此以pQRS可以檢測鼠的相應(yīng)細(xì)胞因子的含量。
取免疫后的小鼠斷頸處死后取出脾臟，提取總RNA后，由RT-PCR擴(kuò)增鼠脾臟總cDNA，其條件為42℃反轉(zhuǎn)錄30-60分鐘，99℃變性5分鐘，5℃放置5分鐘。PCR為94℃，5分鐘；94℃，40秒，55℃，20秒，72℃，40秒，擴(kuò)增40個循環(huán)；72℃，10分鐘。在1.5％瓊脂糖電泳后觀察結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)的核酸物質(zhì)與蛋白質(zhì)類的免疫組合物，其特征在于該組合物含有核酸物質(zhì)和蛋白質(zhì)或含有核酸物質(zhì)與多肽或或含有核酸物質(zhì)與滅活病原體和或含有核酸物質(zhì)與含礦物油的滅活疫苗的組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸物質(zhì)，其特征在于該核酸物質(zhì)為DNA片段或DNA質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求1所述核酸物質(zhì)是人工合成的或者通過從微生物或動物或植物細(xì)胞或組織提取而來的雙鏈DNA或DNA質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)和多肽為利用公知的化學(xué)合成方法生產(chǎn)而得到的。
5.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)和多肽是通過公知的基因重組和基因工程的方法在生物體生產(chǎn)而得到的。
6.如權(quán)利要求1所述的滅活病原體通過生物體分離和生產(chǎn)的病毒、菌、寄生蟲及過敏物質(zhì)經(jīng)公知的方法滅活后而得到的無感染性病原體，其特征在于該滅活病原體直接與DNA混合或滅活病原體經(jīng)與礦物油乳化后再與DNA混合。
7.如權(quán)利要求5和6所述生物體為大腸桿菌或芽孢桿菌或酵母菌或真核細(xì)胞在人工培養(yǎng)條件下可用于生產(chǎn)放大的生物體。
8.如權(quán)利要求5和6所述生物體為動物體或植物體。
9.如權(quán)利要求1所述抑制免疫反應(yīng)的DNA和蛋白質(zhì)類物質(zhì)的組合物通過以下方法得到將DNA與蛋白質(zhì)溶于生理鹽水中混合后，制備本發(fā)明的組合物。其中DNA與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比值為0.1∶1～1∶10。
10.如權(quán)利要求1所述抑制免疫反應(yīng)的或DNA與滅活病原體抗原的組合物通過以下方法得到將DNA與滅活病原體抗原溶于生理鹽水中混合后，制備本發(fā)明的組合物。其中DNA與滅活病原體抗原的質(zhì)量比值為0.1∶1～1∶10。
11.如權(quán)利要求1所述抑制免疫反應(yīng)的DNA與含礦物油的滅活疫苗的組合物通過以下方法得到將DNA溶于生理鹽水中后再溶于含礦物油的滅活疫苗乳劑中混合后，制備本發(fā)明的組合物。其中DNA與含礦物油的滅活疫苗的質(zhì)量比值為0.1∶1～1∶10。
12.如權(quán)利要求1所述的抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)的核酸物質(zhì)與蛋白質(zhì)類的免疫組合物的使用方法是通過注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法使上述組合物進(jìn)入機(jī)體。
全文摘要
一種抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)的核酸物質(zhì)與蛋白質(zhì)類的免疫組合物及其生產(chǎn)方法和使用方法，其組合物含有核酸物質(zhì)和蛋白質(zhì)或含有核酸物質(zhì)與多肽或含有核酸物質(zhì)與滅活病原體和或含有核酸物質(zhì)與含礦物油的滅活疫苗的組合物；其制備方法是將核酸物質(zhì)與蛋白質(zhì)類抗原物質(zhì)進(jìn)行混合。其使用方法是通過注射、噴射、口服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法使上述組合物進(jìn)入機(jī)體。本發(fā)明的技術(shù)效果利用本發(fā)明提供的組合物及生產(chǎn)和使用方法不僅使核酸物質(zhì)與蛋白質(zhì)或多肽或滅活病原體為抗原組合物有效的抑制特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)能力，而且副作用低，制備簡單無需復(fù)雜設(shè)備和操作簡單，并且易于實施，其免疫抑制效果超過未使用本發(fā)明組合物。
文檔編號A61K39/00GK1559607SQ200410039189
公開日2005年1月5日 申請日期2004年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月20日
發(fā)明者王賓, 俞慶齡, 王 賓 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)