專(zhuān)利名稱(chēng)：兩性自組裝蛋白質(zhì)在配制低水溶性的有效物質(zhì)中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兩性自組裝蛋白質(zhì)在配制低水溶性的有效物質(zhì)中的用途。

背景技術(shù)：
DE 10059213A1描述了通過(guò)在含蛋白質(zhì)的保護(hù)膠體中分散活性物質(zhì)、絮凝以及分離覆蓋保護(hù)膠體的活性物質(zhì)并轉(zhuǎn)變成干粉來(lái)生產(chǎn)水不溶的或低水溶性的活性物質(zhì)的固體制劑的方法。將酪蛋白和牛膠原蛋白、豬膠原蛋白以及魚(yú)膠原蛋白作為優(yōu)選的保護(hù)膠體。
DE 102004057587A1描述低水溶性活性物質(zhì)和來(lái)自單細(xì)胞生物的蛋白質(zhì)材料的混合物的水性分散液及從其中制成的干粉。
發(fā)明目的 到目前為止，配制水不溶的或低水溶性的活性物質(zhì)和有效物質(zhì)的方法無(wú)法滿(mǎn)足對(duì)活性物質(zhì)，特別是配制用于化妝品和制藥的活性物質(zhì)的所有要求，如熱穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性和耐光性、機(jī)械穩(wěn)定性與毒性的可接受性。
因此，本發(fā)明旨在提供允許配制低水溶性活性物質(zhì)的方法，而且比現(xiàn)有技術(shù)提供的已知方法能更好地滿(mǎn)足上述標(biāo)準(zhǔn)。


發(fā)明內(nèi)容
在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及兩性自組裝蛋白質(zhì)在配制低水溶性有效物質(zhì)中的用途。兩親性自組裝蛋白質(zhì)適于作為低水溶性的疏水性活性物質(zhì)的配制佐劑。由于其兩親性的分子特征，這些蛋白質(zhì)在水溶液中能穩(wěn)定疏水性活性物質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的自組裝特征使其呈現(xiàn)更高的分子量結(jié)構(gòu)，并因此持久地包裹疏水性活性物質(zhì)。
本發(fā)明另外提供生產(chǎn)有效物質(zhì)制劑的方法，其中 (i)低水溶性有效物質(zhì)與兩親性自組裝蛋白質(zhì)在共同分散相中混合在一起，和 (ii)然后相分離成富含蛋白質(zhì)和有效物質(zhì)的相，以及缺乏蛋白質(zhì)和有效物質(zhì)的相。
隨后可將富含蛋白質(zhì)和有效物質(zhì)的相硬化并作為機(jī)械穩(wěn)定的含有效物質(zhì)的蛋白質(zhì)微粒分離，如果合適，進(jìn)行干燥。
(i)兩親性自組裝蛋白質(zhì) 兩親性自組裝蛋白質(zhì)由氨基酸特別是20種天然形成的氨基酸構(gòu)成的多肽組成。氨基酸也可被修飾，如乙?；?、糖基化、法尼基化。
適用于配制低水溶性有效物質(zhì)的兩親性自組裝蛋白質(zhì)是那些可形成蛋白質(zhì)微粒的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)微粒具有球形構(gòu)造，平均粒子直徑從0.1至100μm特別是從0.5至20μm，優(yōu)選從1至5μm并且特別優(yōu)選從2至4μm。
蛋白質(zhì)微?？蓛?yōu)選通過(guò)下述方法制備 蛋白質(zhì)溶于第一溶劑。可用于此處的溶劑，例如鹽水溶液。具體而言，濃度高于2M，特別是高于4M，而且特別優(yōu)選高于5M的高濃度鹽溶液是合適的，其離子比鈉離子和氯離子具有更顯著的離液序列高的特征。這種鹽溶液的實(shí)例是6M的硫氰酸胍或9M的溴化鋰。此外，有機(jī)溶劑也可用于溶解蛋白質(zhì)。具體而言，氟化醇、環(huán)烴類(lèi)或有機(jī)酸是合適的。其實(shí)例是六氟異丙醇、環(huán)己烷和蟻酸。蛋白質(zhì)微粒的制備可在上述溶劑中進(jìn)行?；蛘撸撊軇┮部捎闪硗獾娜軇┐?，例如，經(jīng)過(guò)透析或稀釋的低濃度鹽溶液(c<0.5M)。溶解的蛋白質(zhì)終濃度應(yīng)在0.1至100mg/ml。該方法進(jìn)行的溫度通常是0-80℃，優(yōu)選5-50℃并且特別優(yōu)選10-40℃。
當(dāng)使用水溶液時(shí)，這些也可與緩沖液混合，優(yōu)選pH范圍為4-10，特別優(yōu)選5-9，尤其特別優(yōu)選6-8.5。
通過(guò)加入添加劑來(lái)誘導(dǎo)相分離。此處在溶劑和添加劑的混合物中形成乳化的富含蛋白質(zhì)相。由于表面效應(yīng)，乳化的富含蛋白質(zhì)的液滴呈現(xiàn)圓形。通過(guò)溶劑、添加劑和蛋白質(zhì)濃度的選擇，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)微粒的平均直徑在0.1μm與100μm之間。
可用的添加劑是一方面易與第一溶劑混合，并且另一方面能誘導(dǎo)富含蛋白質(zhì)相形成的所有物質(zhì)。如果微粒形成在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，用于該用途的適宜有機(jī)物質(zhì)應(yīng)該比溶劑的極性低，例如甲苯。在水溶液中，其離子比鈉離子和氯離子具有更顯著的離液序列高特征的鹽(如硫酸銨、磷酸鉀)可用作添加劑。基于蛋白質(zhì)溶液，取決于添加劑的性質(zhì)，添加劑的最終濃度應(yīng)在以重量計(jì)1％與50％之間。
富含蛋白質(zhì)的液滴通過(guò)硬化固定，其圓形狀保留。這里，固定是基于強(qiáng)的分子間相互作用的發(fā)展。相互作用的類(lèi)型可以是非共價(jià)的，如由于分子間β-折疊葉狀晶體的形成，或共價(jià)的，如由于化學(xué)交聯(lián)。硬化可以作為由于添加劑和/或由于添加另外合適物質(zhì)的結(jié)果而發(fā)生。硬化發(fā)生溫度在0℃與80℃之間，優(yōu)選在5℃與60℃之間。
另外的物質(zhì)可以是化學(xué)交聯(lián)劑。此處化學(xué)交聯(lián)劑應(yīng)理解為由至少兩種化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)通過(guò)連接鍵結(jié)合而成的分子。其實(shí)例是巰基反應(yīng)基團(tuán)(如順丁烯二酰亞胺、吡啶二硫化物、α-鹵代乙酰類(lèi)、乙烯基砜、硫酸烷基砜(sulfatoakyl sulfones)(優(yōu)選硫酸乙基砜)、胺反應(yīng)基團(tuán)(如琥珀酰亞胺酯、碳化二亞胺、羥甲基膦、酰亞胺酯、PFP酯、乙醛、異硫氰酸酯等)、羧基反應(yīng)基團(tuán)(如胺等)、羥基反應(yīng)基團(tuán)(如異氰酸鹽酯等)、非選擇性基團(tuán)(如芳基疊氮化物等)和光可活化基團(tuán)(如全氟苯基疊氮化物等)。這些反應(yīng)基團(tuán)與存在于蛋白質(zhì)中的胺、硫醇、羧基或羥基基團(tuán)可形成共價(jià)鍵。
穩(wěn)定化的微粒用另外適當(dāng)?shù)娜軇_洗，如水，然后通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的方法進(jìn)行干燥，如凍干法、接觸干燥或噴霧干燥。使用掃描電子顯微鏡檢查微粒形成與否。
適宜生產(chǎn)蛋白質(zhì)微粒的是在水溶液中主要以固有無(wú)折疊形式存在的蛋白質(zhì)。這種狀態(tài)可以通過(guò)計(jì)算實(shí)現(xiàn)，例如，依據(jù)形成IUpred項(xiàng)目基礎(chǔ)的運(yùn)算法則(http://iupred.enzim.hu/index.html；The Pairwise Energy ContentEstimated from Amino Acid Composition Discriminates between Foldedand Intrinsically Unstructured Proteins；Zsuzsanna Dosztányi、VeronikaCsizmók、Péter Tompa和István Simon；J.Mol.Biol.(2005)347，827-839)。當(dāng)對(duì)于超過(guò)50％的氨基酸殘基依照該運(yùn)算法則計(jì)算出值>0.5時(shí)，可以認(rèn)定為主要以固有無(wú)折疊狀態(tài)存在(預(yù)測(cè)類(lèi)型長(zhǎng)無(wú)序性)。
用于配制低水溶性有效物質(zhì)的另外合適的蛋白質(zhì)是絲蛋白。在下文中，這些應(yīng)理解為指包含高度重復(fù)氨基酸序列并且在動(dòng)物中和當(dāng)分泌時(shí)以流體形式儲(chǔ)存的那些蛋白質(zhì)，纖維形成是作為剪切或旋轉(zhuǎn)的結(jié)果(Craig，C.L.(1997)Evolution of arthropod silks.Annu.Rev.Entomol.42231-67)。
用于配制低水溶性有效物質(zhì)的特別合適的蛋白質(zhì)是能夠從蜘蛛中以其原有形式被分離的蛛絲蛋白。特別合適的蛋白質(zhì)是能從蜘蛛的“主壺腹”腺分離的絲蛋白。
優(yōu)選的絲蛋白是來(lái)自十字圓蛛(Araneus diadematus)“主壺腹”腺的ADF3和ADF4(Guerette等人，Science 272，5258112-5(1996))。
用于配制低水溶性有效物質(zhì)的同樣合適的蛋白質(zhì)是從天然絲蛋白衍生的并且在原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中使用基因工程方法異源產(chǎn)生的天然或合成蛋白質(zhì)。原核表達(dá)生物的非限定性實(shí)例是大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)等。真核表達(dá)生物的非限定性實(shí)例是酵母，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母(Pichia pastoris)等，絲狀真菌，如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、構(gòu)巢曲霉(Aspgrgillus nidulans)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、頂頭孢產(chǎn)黃青霉(Acremonium chrysogenum)等，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如HeLa細(xì)胞、COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞等，昆蟲(chóng)細(xì)胞，如Sf9細(xì)胞、MEL細(xì)胞等。
用于配制低水溶性有效物質(zhì)特別優(yōu)選的是基于天然絲蛋白重復(fù)單位的合成蛋白。除合成的重復(fù)絲蛋白序列外，這些可另外包含一個(gè)或多個(gè)天然非重復(fù)絲蛋白序列(Winkler和Kaplan，J Biotechnol 7485-93(2000))。
用于配制低水溶性有效物質(zhì)的合成的絲蛋白中，優(yōu)選基于天然蛛絲蛋白的重復(fù)單位的合成蛛絲蛋白。除合成的重復(fù)蛛絲蛋白序列外，這些可另外包括一個(gè)或多個(gè)天然非重復(fù)蛛絲蛋白序列。
在合成蛛絲蛋白中，所謂的C16蛋白質(zhì)是參考(Huemmerich等人Biochemistry，43(42)13604-13612(2004))而提及。該蛋白質(zhì)具有如SEQ IDNO1所示的多肽序列。除在SEQ ID NO1所示的多肽序列外，也優(yōu)選該序列的特定的功能當(dāng)量物、功能衍生物及鹽。
依據(jù)本發(fā)明，“功能當(dāng)量物”也可以特別理解為突變體，其在上述氨基酸序列中至少有一個(gè)序列位點(diǎn)上的氨基酸與明確提到的氨基酸不同，但卻具有包裝低水溶性有效物質(zhì)有義突變體。
“功能當(dāng)量物”因此包括由一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代、缺失和/或顛倒可獲得的突變體，所述改變可發(fā)生在任何序列位點(diǎn)，假如它們形成帶有依據(jù)本發(fā)明的特性譜的突變體。功能等價(jià)也特別存在于當(dāng)突變體和未改變的多肽之間反應(yīng)模式是定性相符時(shí)。
從上述意義上，“功能當(dāng)量物”也是所述多肽的“前體”并且也是多肽的“功能衍生物”和“鹽”。
此處，“前體”是具有或不具有期望的生物活性的多肽的天然或合成前體。
合適的氨基酸取代的實(shí)例見(jiàn)下表 原始基團(tuán) 取代實(shí)例 Ala Ser Arg Lys Asn Gln；His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Asn；Gln Ile Leu；Val Leu Ile；Val Lys Arg；Gln；Glu Met Leu；Ile Phe Met；Leu；Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp；Phe Val Ile；Leu 依據(jù)本發(fā)明，“鹽”應(yīng)理解為指羧基基團(tuán)的鹽和根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子氨基的酸加成鹽?？梢员旧硪阎姆绞街苽漪然鶊F(tuán)的鹽，包括無(wú)機(jī)鹽，如鈉、鈣、銨、鐵和鋅鹽，以及含有有機(jī)堿基的鹽，如胺，如三乙醇胺、精氨酸、賴(lài)氨酸、哌啶等。本發(fā)明同樣提供酸加成鹽，如含有無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸的鹽，以及含有有機(jī)酸如乙酸和草酸的鹽。
借助已知技術(shù)在功能性氨基酸側(cè)基或在其N(xiāo)或C末端同樣也可制備依據(jù)本發(fā)明的多肽的“功能衍生物”。該類(lèi)型的衍生物包括，例如通過(guò)與氨、或與伯胺或仲胺反應(yīng)獲得的羧酸基團(tuán)的脂肪酸酯、羧酸基團(tuán)的酰胺，與?；磻?yīng)制備的游離氨基的N-酰基衍生物，或與?；磻?yīng)制備的游離羥基的O-?；苌铩?br> (ii)低水溶性有效物質(zhì) 在下文中，術(shù)語(yǔ)低水溶性有效物質(zhì)、疏水性有效物質(zhì)、疏水性活性物質(zhì)以及效應(yīng)分子可同義的使用。在下文中，術(shù)語(yǔ)低水溶性有效物質(zhì)用來(lái)指20℃時(shí)水中溶解度以重量計(jì)小于5％，優(yōu)選以重量計(jì)小于1％，特別優(yōu)選以重量計(jì)小于0.5％，極其優(yōu)選以重量計(jì)小于0.1％的那些化合物。
合適的低水溶性有效物質(zhì)是染料，特別是在下表中指出的那些物質(zhì) 特別有利的染料是在下面列表中列出的可溶于油的或可分散在油中的化合物。染料索引號(hào)(CIN)見(jiàn)Rowe Colour Index，第三版，Society of Dyersand Colourists，Bradford，England，1971。
另外優(yōu)選的效應(yīng)分子是脂肪酸，特別是具有烷基支鏈的飽和脂肪酸，特別是優(yōu)選支鏈花生酸，如18-甲基花生酸。
另外優(yōu)選的效應(yīng)分子是類(lèi)胡蘿卜素。依據(jù)本發(fā)明，類(lèi)胡蘿卜素應(yīng)理解為指下列化合物及其酯化的或糖基化的衍生物β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、蝦紅素、玉米黃質(zhì)、隱黃質(zhì)、茜草黃質(zhì)、斑蝥黃、胭脂樹(shù)橙、β-阿樸-4-胡蘿卜素醛、β-阿樸-8-胡蘿卜素醛、β-阿樸-8-胡蘿卜酸乙酯、鏈孢紅素、海膽酮、金盞花紅素、紫黃質(zhì)、圓酵母素、圓酵母紅素，單獨(dú)地或作為混合物。優(yōu)選使用的類(lèi)胡蘿卜素是β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、蝦紅素、玉米黃質(zhì)、茜草黃質(zhì)和斑蝥黃。
另外優(yōu)選的效應(yīng)分子是維生素，特別是類(lèi)維生素A及其酯。
本發(fā)明的內(nèi)容中，類(lèi)維生素A指維生素A醇(視黃醇)及其衍生物，例如維生素A醛(視黃醛)、維生素A酸(視黃酸)和維生素A酯(如視黃醇乙酸酯、視黃醇丙酸酯和棕櫚酸視黃酯)。此處術(shù)語(yǔ)視黃酸包括所有反式視黃酸以及13-順式視黃酸。術(shù)語(yǔ)視黃醇和視黃醛優(yōu)選包括所有反式化合物。依據(jù)本發(fā)明用于制劑的優(yōu)選類(lèi)維生素A是所有反式視黃醇，下面稱(chēng)作視黃醇。
另外優(yōu)選的效應(yīng)分子是來(lái)自A、C、E和F族的維生素、維他命原以及維生素前體，尤其是3，4-脫氫視黃醇、β-胡蘿卜素(維生素A的維他命原)、抗壞血酸的棕櫚酸酯、生育酚，特別是α-生育酚及其酯，如乙酸酯、煙酸酯、磷酸鹽和琥珀酸鹽，以及維生素F，其中已知的必需脂肪酸，尤其是亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸。
另外優(yōu)選的效應(yīng)分子是來(lái)自維生素E族的親脂性的、溶于油的抗氧化劑，即生育酚及其衍生物、沒(méi)食子酸酯、類(lèi)黃酮和類(lèi)胡蘿卜素，以及丁羥基甲苯/苯甲醚。
另外優(yōu)選的效應(yīng)分子是硫辛酸及其合適的衍生物(鹽、酯、糖、核苷酸、核苷、肽和脂質(zhì))。
另外優(yōu)選的效應(yīng)分子是UV光保護(hù)過(guò)濾物。這些應(yīng)理解為指能吸收紫外線并以長(zhǎng)波輻射如熱的形式再次釋放吸收的能量的有機(jī)物質(zhì)。
可利用的溶于油的UV-B過(guò)濾物，例如下面所示的物質(zhì) 3-苯亞甲基樟腦及其衍生物，如3-(4-甲基苯亞甲基)樟腦；4-氨基苯甲酸衍生物，優(yōu)選2-乙基己基4-(二甲氨基)苯甲酸酯、2-辛基4-(二甲氨基)苯甲酸酯和戊基4-(二甲氨基)苯甲酸酯；肉桂酸的酯，優(yōu)選2-乙基己基4-甲氧基肉桂酸辛酯、丙基4-甲氧基肉桂酸辛酯、異戊基4-甲氧基肉桂酸辛酯、異戊基4-甲氧基肉桂酸辛酯、2-乙基己基2-氰基-3-苯基肉桂酸辛酯(奧克立林)；水楊酸的酯，優(yōu)選2-乙基己基水楊酸酯、4-異丙苯甲基水楊酸酯、三甲基環(huán)己基水楊酸酯(homomenthyl salicylate)；苯甲酮衍生物，優(yōu)選2-羥基-4-甲氧基苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基-4′-甲基苯甲酮、2，2′-二羥-4-甲氧基苯甲酮；苯亞甲基丙二酸的酯，優(yōu)選雙-2-乙基己基4-甲氧基苯甲酮；三嗪衍生物，例如，2，4，6-三苯胺基-(對(duì)-羰-2′-乙基-1′-己氧基)-1，3，5-三嗪(三苯胺三嗪)和雙辛基氨基三嗪酮(

HEB)；丙烷-1，3-二酮，例如，1-(4-叔丁基)-3-(4′-甲氧基苯基)丙烷-1，3-二酮。
特別優(yōu)選肉桂酸酯的應(yīng)用，優(yōu)選2-乙基己基4-甲氧基肉桂酸辛酯、異戊基4-甲氧基肉桂酸辛酯、2-乙基己基2-氰基-3-苯基肉桂酸辛酯(奧克立林)。
此外，優(yōu)選苯甲酮衍生物的應(yīng)用，特別是2-羥基-4-甲氧基苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基-4′-甲基苯甲酮、2，2′-二羥-4-甲氧基苯甲酮、以及丙烷-1，3-二酮的應(yīng)用，如1-(4-叔丁基)-3-(4′-甲氧基苯基)丙烷-1，3-二酮。
考慮的典型UV-A過(guò)濾物是 苯甲?；淄榈难苌?，例如，1-(4′-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)丙烷-1，3-二酮，4-叔丁基-4′-甲氧基聯(lián)苯甲酰甲烷或1-苯基l-3-(4′-異丙基苯基)丙烷-1，3-二酮；苯甲酮的氨羥基取代衍生物，例如，N，N-二乙基氨羥基苯甲酰-正-苯甲酸己酯。
UV-A和UV-B過(guò)濾物當(dāng)然也可以混合物來(lái)使用。
合適的UV過(guò)濾物列于下表中。
除上述兩類(lèi)初級(jí)光保護(hù)物質(zhì)之外，也可能使用抗氧化劑類(lèi)型的二級(jí)光保護(hù)制劑，其干擾UV放射物透入皮膚時(shí)觸發(fā)的光化學(xué)反應(yīng)鏈。其典型實(shí)例是生育酚(維生素E)和溶于油的抗壞血酸衍生物(維生素C)。
依據(jù)本發(fā)明，所述化合物的適宜衍生物(鹽、酯、糖、核苷酸、核苷、肽和脂質(zhì))可用作效應(yīng)分子。
另外優(yōu)選的是所謂的過(guò)氧化物分解劑，即可分解過(guò)氧化物的化合物，特別優(yōu)選分解脂質(zhì)過(guò)氧化物。這些可理解為包括有機(jī)物質(zhì)，如5-羥基嘧啶衍生物和3-羥基吡啶衍生物以及丙丁酚。
此外，所述過(guò)氧化物分解劑優(yōu)選是描述于專(zhuān)利申請(qǐng)WO/0207698和WO/03059312中的物質(zhì)，對(duì)其內(nèi)容，此處明確作出參考，優(yōu)選其中描述的含硼或含氮化合物，其能夠?qū)⑦^(guò)氧化物或氫過(guò)氧化物還原成相應(yīng)的醇而沒(méi)有自由基轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的形成?？臻g位阻胺也可用于該用途。
另一類(lèi)是抗刺激劑，其在由UV光損傷的皮膚上具有抗炎癥效果。這些物質(zhì)是例如沒(méi)藥醇、葉綠醇和植烷三醇。
另一類(lèi)低水溶性效應(yīng)物質(zhì)是可用于作物保護(hù)，如除草劑、殺蟲(chóng)劑和殺真菌劑的活性物質(zhì)。
另外適合作為低水溶性有效物質(zhì)的是用于制藥學(xué)上用途的活性物質(zhì)，特別是那些用于口服用途的活性物質(zhì)。不論醫(yī)學(xué)指征，依據(jù)本發(fā)明的方法原則上可用于大量活性物質(zhì)。
適宜用于藥物的低水溶性活性物質(zhì)的實(shí)例列于下表。
(iii)疏水性活性物質(zhì)的配制 低水溶性活性物質(zhì)的配制可使用兩親性自組裝蛋白質(zhì)以多種方式來(lái)制備?？蓪⒌退苄?、疏水性的活性物質(zhì)包裝在蛋白質(zhì)微粒中或以通過(guò)蛋白質(zhì)包被的膠體分散方式來(lái)穩(wěn)定，其可實(shí)現(xiàn)于如微粉化樣品組(batch)中。疏水性的活性物質(zhì)的配制可通過(guò)包被在微粒中來(lái)進(jìn)行。該過(guò)程包括兩個(gè)步驟。第一步，將疏水性的活性物質(zhì)和兩親性自組裝蛋白質(zhì)溶解于共同相中。為此，活性物質(zhì)和蛋白質(zhì)可由溶劑或溶劑混合物直接溶解。備選地，可首先將活性物質(zhì)和蛋白質(zhì)溶解于不同溶劑中然后將溶液混合起來(lái)，因而再次形成共同相。共同相可以是分子性分散相或膠體性分散相。
疏水性活性物質(zhì)和蛋白質(zhì)不能溶解于共同溶劑或溶劑混合物中時(shí)，在不同溶劑中溶解疏水性活性物質(zhì)和蛋白質(zhì)以及后續(xù)混合這兩種溶液是特別有效的。這樣通過(guò)該過(guò)程，將溶解在合適溶劑中的活性物質(zhì)稀釋于活性物質(zhì)不能溶解的另一種溶劑中，也可制備疏水性活性物質(zhì)的膠體分散溶液。
因?yàn)榈鞍踪|(zhì)通常是易溶于水的，優(yōu)選的是對(duì)水溶液以及水和易混合于水的有機(jī)溶劑的混合物起作用。
合適的、易混合于水的溶劑的實(shí)例是醇，如甲醇、乙醇和異丙醇，氟化醇，如六氟異丙醇和三氟乙醇，烷酮，如丙酮，以及亞砜，例如二甲基亞砜，或甲酰胺，如二甲基甲酰胺，或其它有機(jī)溶劑，例如四氫呋喃和氰甲烷或N-甲基-2-吡咯酮。通常，可能對(duì)可溶解蛋白質(zhì)的溶劑或溶劑混合物起作用。合適溶劑的實(shí)例是氟化醇，例如六氟異丙醇或三氟乙醇，離子流體，如EMIM乙酸酯，離液序列高的鹽的水溶液，如尿素、鹽酸胍和硫氰酸胍，或有機(jī)酸，如蟻酸，以及這些溶劑與其它有機(jī)溶劑的混合物?？膳c針對(duì)蛋白質(zhì)的溶劑混合的溶劑的實(shí)例尤其是醇，如甲醇、乙醇和異丙醇，烷酮，如丙酮，亞砜，如二甲基亞砜，甲酰胺，如二甲基甲酰胺，鹵代烷，如二氯甲烷，以及另外的有機(jī)溶劑，如四氫呋喃。
在微粒中配制疏水性活性物質(zhì)的第二步是將相分離成缺乏蛋白質(zhì)和活性物質(zhì)的相以及富含蛋白質(zhì)和活性物質(zhì)繼而硬化的相。此處將疏水性活性物質(zhì)摻入蛋白質(zhì)的組裝形式。由于相分離過(guò)程中的表面效應(yīng)，優(yōu)選形成圓形蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，即所謂的微粒。
相分離是優(yōu)選通過(guò)將易溶鹽的水溶液加入到蛋白質(zhì)與疏水性活性物質(zhì)的混合物中來(lái)誘導(dǎo)。合適的易溶鹽由霍夫邁斯特系列描述。硫酸銨和磷酸鉀是特別合適的。這些溶液的加入可由簡(jiǎn)單混合、逐滴添加或經(jīng)由透析來(lái)進(jìn)行。
疏水性活性物質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用主要是基于它們的疏水特性，然而也可涉及氫鍵、離子間相互作用、范德華作用?？蓪⑹杷曰钚晕镔|(zhì)結(jié)合到表面、摻入微?；蛄硗馔瑫r(shí)以?xún)煞N方法與微粒相連。疏水性活性物質(zhì)與微粒的結(jié)合可由在溶解的活性物質(zhì)的組裝混合物中的消耗來(lái)確定?；钚晕镔|(zhì)的濃度可由其特征的定量分析來(lái)確定。因此，例如通過(guò)光度測(cè)定方法可分析光吸收活性物質(zhì)的結(jié)合。為此，如在制劑混合物中微粒的著色或缺乏蛋白質(zhì)和活性物質(zhì)的相的去色通過(guò)測(cè)定有色活性物質(zhì)的吸收值來(lái)確定。使用這些方法，也可確定微粒中活性物質(zhì)含量高的程度。
作為由于蛋白酶對(duì)微粒的降解或通過(guò)合適溶劑對(duì)微粒的溶解結(jié)果而在合適溶劑中由于解吸附作用發(fā)生從微粒中釋放活性物質(zhì)。針對(duì)解吸附作用的合適溶劑是所有可溶解活性物質(zhì)的溶劑或溶劑混合物。合適的蛋白酶可作為工業(yè)級(jí)蛋白酶以靶向方式加入到蛋白質(zhì)微粒的懸浮液中，或自然發(fā)生于效應(yīng)分子期望的活性位點(diǎn)，例如皮膚蛋白酶、消化道蛋白酶，如胃或腸蛋白酶，或微生物釋放的蛋白酶。可溶解微粒的溶劑如氟化醇，例如六氟異丙醇或三氟乙醇，離子流體，如EMIM乙酸酯，離液序列高的鹽的水溶液，如尿素、鹽酸胍和硫氰酸胍，或有機(jī)酸，如蟻酸，以及這些溶劑與其它有機(jī)溶劑的混合物。例如通過(guò)活性物質(zhì)的電荷密度和微粒的大小和/或其體積與表面積的比率可調(diào)節(jié)效應(yīng)分子的釋放比率和動(dòng)力學(xué)。
低水溶性活性物質(zhì)的配制也可通過(guò)其膠體分散溶液的穩(wěn)定性來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)微粉化。
本發(fā)明還提供使用所述兩親性自組裝蛋白質(zhì)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)微?；蚶缬晌⒎刍a(chǎn)的膠體分散蛋白質(zhì)制劑，在藥物、化妝品、農(nóng)作物保護(hù)產(chǎn)品、食品和動(dòng)物飼料的貯存、運(yùn)輸或釋放活性物質(zhì)中的用途。在這一情況中，蛋白質(zhì)微粒另外提供用來(lái)如保護(hù)包裝的活性物質(zhì)免受環(huán)境影響，例如，氧化過(guò)程或UV射線，或免受由于與產(chǎn)品的其它成分反應(yīng)而造成的破壞，或免受某些蛋白酶的降解?；钚晕镔|(zhì)可從蛋白質(zhì)微?；蚰z體分散蛋白質(zhì)制劑中通過(guò)解吸附作用、蛋白水解性降解、靶向釋放或緩慢釋放或這些機(jī)制的組合來(lái)釋放。
優(yōu)選在用于經(jīng)口施用的藥物中隨其配制的蛋白質(zhì)微粒和活性物質(zhì)。在這一情況中，經(jīng)由胃的過(guò)程中可增加活性成分的穩(wěn)定性，因?yàn)樵诒疚耐ǔ５那闆r下沒(méi)有蛋白質(zhì)微粒的蛋白水解引起的降解發(fā)生。然后在腸內(nèi)從經(jīng)口施用的包含活性物質(zhì)的微粒中釋放活性物質(zhì)。蛋白質(zhì)微粒和其中包埋的藥物活性物質(zhì)的局部應(yīng)用也是可能的。蛋白質(zhì)微粒的降解和從中引起的活性物質(zhì)的釋放然后由存在于皮膚和/或表皮層上的蛋白酶來(lái)調(diào)節(jié)。
在藥品、食品和動(dòng)物飼料以及農(nóng)作物保護(hù)產(chǎn)品中，含有所述的兩親性自組裝蛋白質(zhì)的活性物質(zhì)的制劑還可導(dǎo)致活性物質(zhì)生物利用率的增加。在活性物質(zhì)的蛋白質(zhì)微?；蚰z體分散制劑中使用所述兩親性自組裝蛋白質(zhì)來(lái)包裝藥物的活性物質(zhì)也可導(dǎo)致活性物質(zhì)更能克服血腦屏障或促進(jìn)經(jīng)由腸黏膜的吸收。
通過(guò)膠囊化和/或包埋在蛋白質(zhì)微粒中可保護(hù)農(nóng)作物保護(hù)產(chǎn)品免受沖洗?？捎傻鞍踪|(zhì)微粒中的包裝或經(jīng)由膠體分散制劑，例如，通過(guò)使用兩親性自組裝蛋白質(zhì)的微粉化混合物來(lái)確定更好吸收和/或具有更好生物利用率的某種活性物質(zhì)微粒大小。
通過(guò)改變所述兩親性自組裝蛋白質(zhì)的氨基酸序列和/或通過(guò)與附加的蛋白質(zhì)或多肽序列的融合，可能產(chǎn)生特異性識(shí)別某些表面如皮膚、毛發(fā)、葉片、根部或腸表面或血管表面和/或由這些表面或存在的受體來(lái)識(shí)別和結(jié)合的結(jié)構(gòu)。
結(jié)果，可能使配制含有所述兩親性自組裝蛋白質(zhì)的活性物質(zhì)對(duì)于期望的活性位點(diǎn)和/或改善活性物質(zhì)的吸收更加有效。如果將其包裝在以與在消化道中結(jié)合到細(xì)胞(如黏膜細(xì)胞)某些表面標(biāo)記的蛋白質(zhì)融合和/或連接的形式附加存在的蛋白質(zhì)微粒中，可增加藥物活性物質(zhì)或食品和動(dòng)物飼料中的活性物質(zhì)的生物利用率。這些蛋白質(zhì)如來(lái)自羅伊乳桿菌(Lactobacillusreuteri)的MapA蛋白質(zhì)或膠原結(jié)合蛋白質(zhì)CnBP(Miyoshi等人，2006，Biosci.Biotechnol.Biochem.701622-1628)或來(lái)自其它微生物，主要是天然的腸胃細(xì)菌叢的功能性相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)。所述的結(jié)合蛋白介導(dǎo)微生物吸附到細(xì)胞表面。由于結(jié)合蛋白與所述兩親性自組裝蛋白質(zhì)接合和/或融合，從中形成的包含活性物質(zhì)的蛋白質(zhì)微粒將以更具靶向性的方式到達(dá)相應(yīng)的吸附位點(diǎn)和/或在這些位點(diǎn)停留更長(zhǎng)的時(shí)間，從而延長(zhǎng)和改進(jìn)活性物質(zhì)的釋放和吸收。
此外，通過(guò)改變所述兩親性自組裝蛋白質(zhì)的氨基酸序列用于活性物質(zhì)配制和/或與附加蛋白質(zhì)或多肽序列的融合，可能將活性物質(zhì)以靶向方式導(dǎo)入到期望的活性位點(diǎn)以便因此達(dá)到如特異性更高、活性物質(zhì)消耗或活性物質(zhì)劑量更低，或速度更快或效果更為明顯。
實(shí)施例 實(shí)施例1 從THF和THF/異丙醇在微粒中包裝β-胡蘿卜素并且通過(guò)蛋白質(zhì)水解釋放 β-胡蘿卜素溶液的制備 通過(guò)將80mg β-胡蘿卜素和16mg生育酚溶解于10g THF中來(lái)制備原液。然后通過(guò)對(duì)應(yīng)于表1.1的稀釋從該保存液中制備溶液1-4。
所有溶液使用前現(xiàn)配并在稀釋后立即使用。
表1.1β-胡蘿卜素溶液 通過(guò)直接添加磷酸鉀而在微粒中包裝β-胡蘿卜素 為將β-胡蘿卜素包裝進(jìn)C16蛋白質(zhì)微粒，首先制備C16蛋白質(zhì)和β-胡蘿卜素的共同相。為此，每次將500μl溶于5mM、pH 8磷酸鉀中的10mg/ml C16蛋白質(zhì)的溶液與50μl或100μl的β-胡蘿卜素溶液混合(溶液1-4)(表1.2)。在來(lái)自THF/異丙醇的含β-胡蘿卜素的樣品組情況下(樣品組1-4)，獲得橙色分散液；在來(lái)自THF的含β-胡蘿卜素的樣品組情況下(樣品組5-8)，獲得黃色分散液。
為了通過(guò)相分離誘導(dǎo)C16蛋白質(zhì)微粒形成，將1000μl的1M、pH 8.0磷酸鉀溶液加入每一樣品組中(表1.2)。于室溫孵育15分鐘后，將樣品組離心分離成包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質(zhì)微粒的顯著著色沉淀和無(wú)色上清液。所用β-胡蘿卜素因此在相位分離過(guò)程中完全轉(zhuǎn)移到微粒中。分離掉無(wú)色上清液。然后將沉淀用蒸餾水沖洗兩次并重新分散。
C16蛋白質(zhì)微粒經(jīng)再分散后，在來(lái)自THF/異丙醇包含β-胡蘿卜素溶液的樣品組情況下(樣品組1-4)，獲得橙色分散液；并且在來(lái)自THF包含β-胡蘿卜素溶液的樣品組情況下(樣品組5-8)，獲得黃色分散液。

表1.2通過(guò)加入1M磷酸鉀溶液在C16蛋白質(zhì)微粒中從THF和THF/異丙醇包裝β-胡蘿卜素 通過(guò)對(duì)磷酸鉀透析而在C16蛋白質(zhì)微粒中包裝β-胡蘿卜素 備選地向β-胡蘿卜素和C16蛋白質(zhì)的共同相中直接添加磷酸鉀，相分離也可通過(guò)對(duì)1M磷酸鉀透析來(lái)進(jìn)行。由于透析在透析管中完成，與直接添加磷酸鉀溶液相比，每次吸取10倍體積的樣品組(表1.3)。

表1.3通過(guò)對(duì)1M磷酸鉀溶液透析而在C16蛋白質(zhì)微粒中從THF和THF/異丙醇包裝β-胡蘿卜素 為此，將C16溶液(10mg/ml于5mM、pH 8.0磷酸鉀中)與特定的β-胡蘿卜素溶液混合然后將混合物立即放入透析管并且對(duì)1M磷酸鉀溶液透析。透析過(guò)夜后，將微粒分散液從管中移出并離心分離成無(wú)色上清液和著色沉淀。同樣在向C16蛋白質(zhì)和β-胡蘿卜素的共同相中直接添加磷酸鉀的情況下，C16蛋白質(zhì)以蛋白質(zhì)微粒的形式定量結(jié)合β-胡蘿卜素。分離并棄掉無(wú)色上清液。隨后沉淀用蒸餾水沖洗兩次然后重新分散。
蛋白質(zhì)微粒經(jīng)再分散后，在來(lái)自THF/異丙醇的包含β-胡蘿卜素溶液的樣品組情況下(樣品組1-4)，獲得橙色分散液；并且在來(lái)自THF的包含β-胡蘿卜素溶液的樣品組情況下(樣品組5-8)，獲得黃色分散液(

圖1)。
圖1來(lái)自THF和THF/異丙醇的具有β-胡蘿卜素的C16蛋白質(zhì)微粒在水中的分散液。從左至右樣品組D1-D4(THF/異丙醇)和樣品組D5-D8(THF)。在C16蛋白質(zhì)微粒中β-胡蘿卜素的含量引用為基于C16蛋白質(zhì)微粒重量的以重量計(jì)的百分?jǐn)?shù)。
為了來(lái)自THF和THF/異丙醇的再生包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質(zhì)微粒的不同著色，在更大范圍內(nèi)重復(fù)樣品組D4和D5(表1.4)。再次從THF獲得含β-胡蘿卜素的黃色C16蛋白質(zhì)微粒，并且從THF/異丙醇獲得含β-胡蘿卜素的橙色C16蛋白質(zhì)微粒(圖2)。
表1.4通過(guò)對(duì)1M磷酸鉀溶液透析從THF和THF/異丙醇在C16蛋白質(zhì)微粒中包裝β-胡蘿卜素 圖2來(lái)自THF/異丙醇(以重量計(jì)0.9％的β-胡蘿卜素，樣品組G1，左)和THF(以重量計(jì)0.3％的β-胡蘿卜素，樣品組G2，右)的包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質(zhì)微粒的分散液。
通過(guò)蛋白酶K的消化作用將β-胡蘿卜素從C16蛋白質(zhì)微粒中釋放 為說(shuō)明C16蛋白質(zhì)微粒中的β-胡蘿卜素可通過(guò)蛋白質(zhì)水解釋放，將200μl溶于水的微粒分散液G1和G2與500μl的5M、pH 8.0磷酸鉀混合。然后加入5μl蛋白酶K(羅氏(Roche)，19.45mg/ml)并且將混合物于室溫孵育過(guò)夜。每次使用的對(duì)照是無(wú)蛋白酶K的C16蛋白質(zhì)微粒分散液的混合物。過(guò)夜孵育后，將混合物離心。蛋白酶存在時(shí)，消化C16蛋白質(zhì)微粒并且釋放β-胡蘿卜素。離心后，沒(méi)有可見(jiàn)沉淀。上清液高度著色。無(wú)蛋白酶時(shí)，可將完整的C16蛋白質(zhì)微粒離心除去?？捎^察到顯著著色的沉淀。上清液無(wú)色。
圖3通過(guò)蛋白酶K消化C16蛋白質(zhì)微粒分散液。A)無(wú)蛋白酶的來(lái)自THF/異丙醇的包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質(zhì)微粒(以重量計(jì)百分之0.9的β-胡蘿卜素，樣品組G1)，B)有蛋白酶的來(lái)自THF/異丙醇的包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質(zhì)微粒(以重量計(jì)0.9％的β-胡蘿卜素，樣品組G1)，C)無(wú)蛋白酶的來(lái)自THF的包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質(zhì)微粒(以重量計(jì)0.3％的β-胡蘿卜素，樣品組G2)；D)有蛋白酶的來(lái)自THF的包含β-胡蘿卜素的C16蛋白質(zhì)微粒(以重量計(jì)0.3％的β-胡蘿卜素，樣品組G2)。
實(shí)施例2 含β-胡蘿卜素的微粒的穩(wěn)定性以及通過(guò)蛋白水解消化從微粒中釋放β-胡蘿卜素 通過(guò)使用在人體胃部和/或腸內(nèi)起作用的不同蛋白酶來(lái)處理含β-胡蘿卜素的C16蛋白質(zhì)微粒，目的是說(shuō)明作為用于藥物有效物質(zhì)的存儲(chǔ)、運(yùn)輸和/或傳遞系統(tǒng)的蛋白質(zhì)微粒的適宜性。
為制備含有β-胡蘿卜素的C16蛋白質(zhì)微粒，將80mg β-胡蘿卜素和16mg維生素E溶解于10ml THF中并且然后用90ml異丙醇稀釋。然后將部分該溶液與10體積的C16蛋白質(zhì)溶液混合(10mg/ml于5mM、pH 8磷酸鉀緩沖液中)。然后將混合物與2體積的1M、pH 8磷酸鉀緩沖液混合。將產(chǎn)生的含β-胡蘿卜素的C16蛋白質(zhì)微粒通過(guò)離心獲得，并且通過(guò)用水沖洗沉淀物來(lái)去除剩余的游離β-胡蘿卜素。
20mg含β-胡蘿卜素的C16蛋白質(zhì)微粒用2ml人造胃液(6.4mg胃蛋白酶、80mM HCl、4mg NaCl)或2ml人造腸液I(20mg胰酶、0.45M、pH 7.5磷酸鈉、0.9mM?；悄懰徕c)或2ml人造腸液II(20mg胰酶、0.45M、pH 7.5磷酸鈉、6mM?；悄懰徕c)進(jìn)行重懸，并于37℃振蕩(140rpm)孵育0、1、2、6、24和48h。未被蛋白水解而降解的C16蛋白質(zhì)微粒經(jīng)由600nm處懸浮液的散射來(lái)測(cè)定(圖4)。然后通過(guò)離心獲得完整的C16蛋白質(zhì)微粒，并且通過(guò)445nm處吸收值的測(cè)定來(lái)分析上清液中β-胡蘿卜素的含量(圖5)。
由于用含胃蛋白酶的人造胃液處理，甚至在48h后，才剛剛降解C16蛋白質(zhì)微粒(圖4)并因此釋放β-胡蘿卜素(圖5)。反之，用含胰酶的人造腸液I和I處理，在僅僅6h內(nèi)實(shí)際上完全降解C16蛋白質(zhì)微粒(圖4)并且釋放存在的β-胡蘿卜素(圖5)。因此，C16蛋白質(zhì)微粒在經(jīng)過(guò)人體胃部時(shí)耐受住而沒(méi)有顯著降解并且由于腸道中的蛋白水解降解而只釋放結(jié)合的效應(yīng)物質(zhì)。
圖4通過(guò)分析600nm處的光吸收值來(lái)測(cè)定完整的C16蛋白質(zhì)微粒。
圖5通過(guò)分析445nm處的光吸收值來(lái)測(cè)定從C16蛋白質(zhì)微粒中釋放的β-胡蘿卜素。
實(shí)施例3 C16蛛絲蛋白的微粉化 將2g的晶體狀番茄紅素和0.4g的α-生育酚溶解于500g THF中。在室溫條件下，活性物質(zhì)溶液以2.42g/分鐘的流速與在5mM磷酸鉀緩沖液(pH8)中0.2g/l的C16蛋白質(zhì)組成的流速為25.4g/分鐘的水溶液不斷混合。在THF/水混合物中混合形成的活性物質(zhì)微粒具有103nm的微粒大小。2h后，用C16蛋白質(zhì)處理的樣品(圖6B)與未處理樣品(圖6A)相比可見(jiàn)明顯的分散穩(wěn)定性。甚至在幾天后，含C16蛋白質(zhì)的番茄紅素分散液顯示出穩(wěn)定性，然而未處理的番茄紅素分散液很大程度上絮凝(圖7)。將由于C16蛋白質(zhì)穩(wěn)定的某些番茄紅素分散液濃縮成含量為0.28％的固體。這樣，干燥的番茄紅素很難分散。備選地，由C16蛋白質(zhì)穩(wěn)定的番茄紅素分散液用330mM磷酸鉀處理(混合物中的終濃度)并干燥。得到易于分散的番茄紅素粉末。
圖6用C16蛛絲蛋白配制番茄紅素。混合后(黑色圖)和混合后2h(紅色圖)的未處理的番茄紅素樣品(A)和用C16蛋白質(zhì)處理的番茄紅素樣品的光吸收值(B)。
圖7用C16蛛絲蛋白配制番茄紅素。混合后約30天時(shí)未處理的番茄紅素分散液(左)與C16蛋白質(zhì)穩(wěn)定的番茄紅素分散液(右)的比較。
實(shí)施例4 從異丙醇在微粒中包裝吡唑草胺并通過(guò)蛋白質(zhì)水解釋放 可將低水溶性的植物活性物質(zhì)包裝在制備自?xún)捎H性自組裝蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)微粒中，然后從其中釋放。為此，所選的非限定性實(shí)例是除草劑活性物質(zhì)吡唑草胺。
500μl的含10mg/ml C16蛋白質(zhì)的磷酸鉀溶液(5mM、pH 8.0)與100μl吡唑草胺溶液(50mg/ml于異丙醇中)混合。通過(guò)加入1ml的1M磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)來(lái)誘導(dǎo)C16蛋白質(zhì)微粒的形成?；旌衔镉谑覝胤跤?h，然后在20000×g下離心10分鐘。沉淀用5ml雙蒸水沖洗兩次然后凍干。不含C16蛋白質(zhì)的同樣的混合物作為對(duì)照。
用磷酸鉀沉淀后，于C16蛋白質(zhì)和吡唑草胺的混合物中形成微粒。這些與那些含C16蛋白質(zhì)但不含活性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)混合物是在形態(tài)學(xué)上相當(dāng)?shù)?。在C16吡唑草胺混合物中，沒(méi)有可見(jiàn)的吡唑草胺晶體。另一方面，在不含C16蛋白質(zhì)的吡唑草胺混合物中形成了大量活性物質(zhì)晶體。這說(shuō)明C16蛋白質(zhì)在水性磷酸鉀緩沖液存在下對(duì)吡唑草胺的結(jié)晶化具有明顯的抑制效應(yīng)。
C16蛋白質(zhì)沉淀或C16微粒形成后上清液中吡唑草胺濃度的測(cè)定顯示，大約90％的活性物質(zhì)在蛋白質(zhì)微粒中以包裝形式和/或以與其連接的形式存在。每次約20％的活性物質(zhì)存在于沖洗上清液中。
凍干的含吡唑草胺的C16蛋白質(zhì)微粒于37℃在1ml 10mM Tris緩沖液、0.1％ SDS、100μg蛋白酶K中進(jìn)行蛋白水解消化1h。離心10分鐘(20000×g)后的混合物中剩余的活性物質(zhì)晶體在500μl異丙醇中溶解。在蛋白酶消化的上清液中檢測(cè)到約使用量的11％的吡唑草胺。活性物質(zhì)晶體再溶解到含有約使用量的35％的吡唑草胺的異丙醇中。
活性物質(zhì)分布的分析(在λ＝215nm處的吸光度測(cè)定)

實(shí)施例5 蛋白質(zhì)微粒中視黃醇的包裝和穩(wěn)定化 可將對(duì)于如氧自由基、UV等的影響不穩(wěn)定的低水溶性的或水不溶的活性物質(zhì)包裝在制備自?xún)捎H性自組裝蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)微粒中。它們也可繼而從其中再次釋放。此外，活性物質(zhì)配制和/或包裝在蛋白質(zhì)微粒中可保護(hù)其免受有害影響和由此引起的降解。為說(shuō)明這些，所選的非限定性實(shí)例是活性物質(zhì)視黃醇，將其包裝在C16蛋白質(zhì)微粒中，并在空氣、均勻攪動(dòng)數(shù)小時(shí)攪動(dòng)起泡。在不同時(shí)間點(diǎn)上，取出樣品并且在THF萃取后量化剩余的視黃醇。
研究表5.1中所示的樣品組。為此，首先將異丙醇中視黃醇-THF溶液稀釋?zhuān)缓笈c水性C16蛋白質(zhì)溶液混合，然后在樣品組1的情況下，通過(guò)加入1M磷酸鉀溶液來(lái)誘導(dǎo)C16蛋白質(zhì)微粒形成。由于陽(yáng)離子的存在，如經(jīng)由C16蛋白質(zhì)包裝樣品組中的磷酸鉀，原則上有助于增加游離溶解的視黃醇或以微粒形式出現(xiàn)的視黃醇的氧化，將154mM氯化鈉溶液加入到含和不含C16蛛絲蛋白的對(duì)照中，但其中沒(méi)有誘導(dǎo)C16蛋白質(zhì)微粒形成(參見(jiàn)Fisher等，1972，Biochem.J.132259-270)。樣品組孵育在用塑料蓋子封閉的玻璃容器中進(jìn)行，在磁力攪拌器上攪拌并且經(jīng)由套管連續(xù)起泡達(dá)7h。取樣時(shí)每次取出4×300μl，通過(guò)計(jì)算，在其各自中應(yīng)存在9.38μg最大量的視黃醇。移除后，將包裝樣品組的C16微粒離心分離，并且得到的視黃醇用1.5ml THF萃取并通過(guò)325nm處的吸光度測(cè)定來(lái)定量。在沒(méi)有C16微粒的樣品組情況下，將1.5ml THF直接加入到300μl樣品中，混合樣品并且離心以實(shí)現(xiàn)相分離。然后出現(xiàn)在THF相上層的視黃醇同樣借助于325nm處的吸光度測(cè)定來(lái)定量。
表5.1用于量化C16蛛絲蛋白介導(dǎo)的視黃醇氧化穩(wěn)定性的多種樣品組。
在含有C16蛛絲蛋白的樣品組中(樣品組1-包裝在C16微粒中，樣品組2-可溶性C16)，與不含C16蛋白質(zhì)的對(duì)照相比，觀察到在大氣中氧氣存在下視黃醇的顯著穩(wěn)定性(表5.2；圖8)。然而樣品組2中視黃醇的量也在5至7h后顯著降低，已將活性成分包裝進(jìn)C16微粒的樣品組1中，甚至在7h后也可檢測(cè)到超過(guò)70％的完整視黃醇(表5.2；圖8)。因此，C16微粒中視黃醇的包裝看來(lái)是合適的方法，通過(guò)該方法可起到抵抗氧自由基誘導(dǎo)的降解的穩(wěn)定作用。在1ml 5mM、pH 8磷酸鉀緩沖液中，利用蛋白酶K(2.25 U)通過(guò)蛋白水解來(lái)降解裝載視黃醇的C16微粒，可以釋放出活性成分。
表5.2C16制劑樣品組中視黃醇穩(wěn)定性的測(cè)定。
圖8C16制劑樣品組中作為孵育時(shí)間的函數(shù)的視黃醇穩(wěn)定性的測(cè)定。
為確定C16微粒對(duì)活性物質(zhì)的最大裝填密度，在包裝樣品組中使用不同量的視黃醇(參見(jiàn)樣品組1)。此處針對(duì)活性物質(zhì)使用的溶劑是專(zhuān)用的THF。然后通過(guò)加入1M磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)來(lái)誘導(dǎo)C16蛋白質(zhì)微粒形成。樣品組在10℃孵育1h，然后在20000×g下離心10分鐘。形成的沉淀用蒸餾水沖洗兩次。然后通過(guò)用2ml THF沖洗C16蛋白質(zhì)微粒來(lái)溶解掉活性物質(zhì)并且借助于325nm處吸光度測(cè)定來(lái)進(jìn)行定量(參見(jiàn)表5.3)。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)中視黃醇的最大負(fù)荷密度大約是1.9mg每5mg所用C16蛋白質(zhì)(表5.3)。在對(duì)C16微粒定量沉淀的情況下，視黃醇活性物質(zhì)濃度或裝填密度相應(yīng)為約38％。

表5.3量化包裝在5mg C16微粒中并且從中再次釋放的視黃醇。
實(shí)施例6 從THF在微粒中包裝布洛芬(ibuprofen)并由蛋白質(zhì)水解釋放 可將低水溶性的或水不溶的藥物活性物質(zhì)包裝在制備自?xún)捎H性自組裝蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)微粒中。然后它們也可從其中再次釋放。另外，通過(guò)蛋白質(zhì)微粒中活性物質(zhì)的配制和/或包裝可保護(hù)其免受有害影響，例如，某些蛋白酶或強(qiáng)酸性pH值以及從中引起的降解。更好吸收和/或具有更好生物利用率的某種活性物質(zhì)微粒大小或活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)可由蛋白質(zhì)微粒中活性物質(zhì)的包裝和/或經(jīng)由使用兩親性自組裝蛋白質(zhì)的微粉化樣品組來(lái)確定。為說(shuō)明這些，選擇活性物質(zhì)布洛芬[(RS)-2-(4-異丁苯基)丙酸]作為非限定性實(shí)例。
500μl含10mg/ml C16蛋白質(zhì)的磷酸鉀溶液(5mM、pH 8.0)與100μl布洛芬溶液(5mg/ml于異丙醇中)混合。通過(guò)加入1ml 1M磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)來(lái)誘導(dǎo)C16蛋白質(zhì)微粒形成。樣品組于室溫孵育1h并然后以20000×g離心10分鐘。沉淀用5ml雙蒸水沖洗兩次。
用磷酸鉀沉淀后，微粒形成于C16蛋白質(zhì)和布洛芬的樣品組中。這些與那些含C16蛋白質(zhì)但不含活性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品組在形態(tài)學(xué)術(shù)語(yǔ)上是相當(dāng)?shù)摹Ｔ谠摌悠方M中將布洛芬包裝進(jìn)C16蛋白質(zhì)微粒是定量完成的，并且這是誘導(dǎo)微粒形成后在上清液中借助于吸光度測(cè)定可檢測(cè)到布洛芬的原因。由于在1ml的5mM、pH 8磷酸鉀緩沖液中利用蛋白酶K(2.25 U)非特異性蛋白水解來(lái)降解裝載布洛芬的C16微粒，釋放出活性成分。
在含胃蛋白酶的樣品組中(類(lèi)似于實(shí)施例2)，裝載布洛芬的C16蛋白質(zhì)微粒的蛋白水解消化未能導(dǎo)致活性物質(zhì)的釋放。在含胰酶的樣品組中(類(lèi)似于實(shí)施例2)，布洛芬裝載的C16蛋白質(zhì)微粒的處理導(dǎo)致活性物質(zhì)的釋放。因此，C16微?？商峁┍Ｗo(hù)以抵抗胃部蛋白酶和胃中常見(jiàn)的極其酸性pH值。然而，腸內(nèi)條件下的釋放是可能的。C16微粒因此適合，尤其是經(jīng)口施用的、在腸內(nèi)吸收的或有效的并且在經(jīng)過(guò)胃部時(shí)將被保護(hù)的活性物質(zhì)的包裝和配制。
序列表
<110>巴斯夫歐洲公司
<120>兩性自組裝蛋白質(zhì)在配制低水溶性的有效物質(zhì)中的用途
<130>PF58768
<160>1
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>576
<212>PRT
<213>合成
<400>權(quán)利要求
1.兩親性自組裝蛋白質(zhì)在配制低水溶性有效物質(zhì)中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中兩親性自組裝蛋白質(zhì)是形成微粒的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1的用途，其中兩親性自組裝蛋白質(zhì)是固有無(wú)折疊蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1的用途，其中兩親性自組裝蛋白質(zhì)是絲蛋白。
5.權(quán)利要求1的用途，其中兩親性自組裝蛋白質(zhì)是蛛絲蛋白。
6.權(quán)利要求1的用途，其中兩親性自組裝蛋白質(zhì)是C16蛛絲蛋白。
7.權(quán)利要求1至6的用途，其中所用有效物質(zhì)是藥物活性成份。
8.權(quán)利要求1至6的用途，其中所用有效物質(zhì)是農(nóng)作物保護(hù)活性成分。
9.權(quán)利要求1至6的用途，其中所用有效物質(zhì)是用于皮膚和頭發(fā)的化妝品的活性成分。
10.生產(chǎn)有效物質(zhì)制劑的方法，其中
(i)低水溶性有效物質(zhì)與兩親性自組裝蛋白質(zhì)在共同的分散相中混合在一起，和
(ii)然后進(jìn)行相分離形成富含蛋白質(zhì)和有效物質(zhì)的相，和缺乏蛋白質(zhì)和有效物質(zhì)的相。
11.權(quán)利要求10的方法，其中相分離(ii)通過(guò)易溶的鹽實(shí)現(xiàn)。
12.權(quán)利要求10的方法，其中工作溫度在5和50℃之間。
13.權(quán)利要求10至12的方法，其中將富含蛋白質(zhì)和有效物質(zhì)的相硬化和作為機(jī)械穩(wěn)定的含有效物質(zhì)的蛋白質(zhì)微粒分離，且如果合適進(jìn)行干燥。
14.化妝品制劑，其包含已用至少一種兩親性自組裝蛋白質(zhì)配制的低水溶性有效物質(zhì)，連同另外的化妝品輔劑。
15.藥物制劑，其包含已用至少一種兩親性自組裝蛋白質(zhì)配制的低水溶性有效物質(zhì)，連同另外的藥物輔劑。
16.農(nóng)用化學(xué)品制劑，其包含已用至少一種兩親性自組裝蛋白質(zhì)配制的低水溶性有效物質(zhì)，連同另外的農(nóng)用化學(xué)品輔劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及兩親性自組裝蛋白質(zhì)在配制低水溶性有效物質(zhì)中的用途。
文檔編號(hào)A61K47/42GK101370481SQ200780003088
公開(kāi)日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2007年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月20日
發(fā)明者B·利布曼, M·費(fèi)爾, D·許梅里希, I·馬丁, M·布蘭茨, A·普托克, T·沙伊貝爾 申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司