專利名稱：木犀草素與一種鉑類化療藥物的聯(lián)合的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于抗腫瘤的由一種黃酮類化合物與一種鉑類化療藥物組成的組合物；本發(fā)明還涉及該化合物在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
背景技術：
“化療”是“化學藥物治療”的簡稱。目前化療的概念一般被理解為“腫瘤的化療”，即使用抗腫瘤化療藥物，采用某些措施和方案治療腫瘤的方法。其中“鉑類抗腫瘤化療藥物”具有相相似的抗腫瘤作用機理主要的作用靶點位于DNA，可以通過形成DNA璉內交聯(lián)、鏈間交聯(lián)、DNA-蛋白質交聯(lián)，破壞DNA的復制及抑制細胞分裂等作用來抑制腫瘤細胞的生長。常見的有順鉑(cisplatin CDDP)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin，草酸鉑，L-OH)、奈達鉑(nedaplatin)、絡鉑(lobaplatin)等。作為同類化療藥物它們有著類似的抗腫瘤藥理機理，也有著類似的毒副作用。
然而，常見的化療藥物如長春新堿、順鉑、甲氨喋呤、環(huán)磷酰胺、5-氟脲嘧啶(5-Fu)等可產(chǎn)生注射局部疼痛、靜脈栓塞、骨髓抑制、胃腸道反應、外周神經(jīng)病變等毒副作用。
為減少化療藥物的毒副作用、提高療效、減少腫瘤復發(fā)和避免抗藥性的產(chǎn)生，選擇不同的化療藥物聯(lián)合使用，已成為腫瘤化療的重要手段之一。例如，臨床上將順鉑與5-Fu、博來霉素或表鬼臼毒素等聯(lián)合使用治療食管癌。
“協(xié)同作用”(Synergistic Effect)是指兩種藥物聯(lián)合使用時所產(chǎn)生的療效大于相同劑量時兩藥單獨使用時的療效之和。根據(jù)中效原理(Joseph R.Bertino，Ting-Chao Chou，ChemotherapySynergism and Antagonism，Encyclopedia of Cancer，1996，Academic Press，Inc.)，兩藥聯(lián)合使用時的作用效果可通過“聯(lián)合指數(shù)”(Combination Index，CI)進行判斷CI=D1(Dx)1+D2(Dx)2+α×D1×D2(Dx)1×(Dx)2]]>
其中，D1、D2分別為藥物1和藥物2單獨使用時，細胞增殖抑制率達到x％時的藥物濃度；(Dx)1、(Dx)2為達到相同細胞增殖抑制率時混和物中藥物1和藥物2的濃度。
對相互獨立的兩種藥物α＝0；而互不獨立的藥物α＝1。
當CI＜1時，為協(xié)同作用，CI＝1時，為相加作用；CI＞1時，為拮抗作用。
由于動物體內試驗很難類似體外試驗方式，即多劑量，多濃度的藥物作用模式。所以難于獲得CI數(shù)值。故本領域的普通技術人員也有采用金氏公式的Q值計算和統(tǒng)計學處理后獲得的顯著性差異有否(p值)來作為對動物試驗結果的判定(戴體均，中國藥理學通報，1998，14(5)479-480)Q＝E(a+b)/Ea+Eb(1-Ea)；其中E為抑瘤率，當Q＜0.85為拮抗，Q0.85～1.15之間為相加，Q＞1.15為協(xié)同。
根據(jù)美國國立癌癥研究所在1983年確立的抗腫瘤物質篩選的動物試驗模式，用于小鼠體內移植瘤株的有小鼠黑色素細胞瘤細胞株B16，小鼠纖維肉瘤細胞株M5076等固體腫瘤(實體腫瘤)瘤株；小鼠白血病細胞株L1210等血液系腫瘤瘤株。故本領域的普通技術人員多采用選用某種腫瘤瘤株來作為針對移植腫瘤的動物體內試驗模式如選用小鼠黑色素細胞瘤細胞株B16的小鼠動物試驗來作為針對實體腫瘤的動物體內試驗模式；選用小鼠白血病細胞株L1210的小鼠動物試驗來作為針對血液系腫瘤的動物體內試驗模式。通過結合體內外試驗結果來判斷待測物質是否具有抗腫瘤作用。
木犀草素(別名黃色色素、黃示靈等；英文名Luteolin)，屬于黃酮類化合物，可從一些植物如金銀花、菊花等中提取得到。為黃色晶體，分子量286.2，熔點328℃-330℃，微溶于水，溶于堿溶液。結構式如下 據(jù)文獻報道，木犀草素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、解痙、祛痰、抑酶、利尿利膽的作用。
迄今未見有關木犀草素和化療藥物在抗腫瘤上具有協(xié)同作用的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的問世部分地是基于這樣一個意外的發(fā)現(xiàn)木犀草素和一種鉑類化療藥物包括順鉑、奧沙利鉑和卡鉑具有協(xié)同抗腫瘤作用；聯(lián)合使用木犀草素和一種鉑類化療藥物如順鉑、奧沙利鉑或卡鉑比起單用其中一種藥物能產(chǎn)生更強的抗腫瘤作用。
本發(fā)明涉及一種木犀草素或其可藥用鹽在制備一種與鉑類化療藥物包括順鉑、奧沙利鉑和卡鉑聯(lián)合以治療腫瘤的藥物中的用途。
本發(fā)明的第二個方面是涉及一種抗腫瘤的藥物組合物，包括木犀草素和一種鉑類化療藥物。
本發(fā)明還涉及一種治療腫瘤的方法，其包括對需要進行治療的哺乳動物使用有效量的一種鉑類化療藥物和木犀草素組合物。
本發(fā)明的具體實施方式
將在以下部分闡述。本發(fā)明的其他特點、目的和優(yōu)勢將通過以下闡述得以彰顯。
具體實施例方式本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，當本發(fā)明的木犀草素與一種鉑類化療藥物包括但不限于順鉑、奧沙利鉑或卡鉑先后或者同時給藥時，可明顯提高兩者的抗腫瘤活性，具有協(xié)同作用；從而可減少兩者的用量，降低其毒副作用。因此，本發(fā)明的木犀草素與一種鉑類化療藥物包括但不限于順鉑、奧沙利鉑或卡鉑可聯(lián)合使用以治療腫瘤。
如本發(fā)明所用，術語“治療”是指基于治愈、緩解、改善、減輕、影響治療對象疾病、癥狀、疾病體質(predisposition)的目的而給予需要進行治療的哺乳動物聯(lián)合使用本發(fā)明的木犀草素與一種鉑類化療藥物。
術語“可藥用鹽”包括各種無機或有機酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、扁桃酸鹽和草酸鹽；各種無機或有機堿鹽如氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷(TRIS，tromethane)和N-甲基-葡萄糖胺。
本發(fā)明所引用參考資料的技術內容就其整體一并引入本文作為參考。
本發(fā)明的木犀草素可從金銀花、菊花等植物中提取得到。本發(fā)明的木犀草素也可通過商業(yè)途徑獲得或者通過本領域的普通合成技術制得或者通過微生物的作用制得。用于分離或合成本發(fā)明的木犀草素的化學品包括溶劑、試劑、催化劑、保護基團試劑、去保護基團試劑。所述分離與合成還可以包括加入或去除適宜的保護基團以最終得到所需木犀草素的步驟。用于制備本發(fā)明的木犀草素的合成化學轉化和基團保護(去保護)的方法對本領域的普通技術人員來說是公知的，可參見R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Green and P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，3rdEd.，John Wiley and Sons(1999)，L.Fieser and M.Fieser，F(xiàn)ieser and Fieser’s Reagents forOrganic Synthesis，John Wiley and Sons(1994)；and L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagentsfor Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)及其后續(xù)著作。
本發(fā)明涉及使用兩種成分(木犀草素與一種鉑類化療藥物包括但不限于順鉑、奧沙利鉑或卡鉑)的組合物的治療方法。這兩種成分可以同時或先后給藥，或將木犀草素及一種鉑類化療藥物在一種可藥用載體中制成一種藥物組合物使用。該藥物組合物的成分可以任何方便的腸道或非腸道途徑給藥的劑型分別或一起給藥。腸道給藥制劑包括但不限于膠囊、片劑、乳劑、水懸浮劑、膠體液、溶液、微膠囊、丸劑、錠劑、顆粒劑、粉劑。常用于膠囊劑的可藥用載體包括乳糖和干玉米淀粉。常用于片劑的可藥用載體包括乳糖和玉米淀粉，通常還會加入硬脂酸鎂等潤滑劑。當制成口服水懸浮劑和/或乳劑時，本發(fā)明的藥物組合物可懸浮或溶解于油相里并與乳化劑或懸浮劑相結合。如果需要，也可以加入一些甜味劑和/或香味劑和/或增色劑。
非腸道給藥途徑包括皮下、皮內、動脈、靜脈、肌肉、關節(jié)、滑液、胸骨、鞘內、病灶內、顱內注射或滴注。其它給藥途徑可包括局部、直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、陰道、舌下、粘膜、氣管或尿道。此外，本發(fā)明的藥物組合物還可以通過氣霧吸入或植入蓄積或針刺等方式給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可被制成無菌注射劑，如無菌水相或油相懸浮液。該懸浮液可按本領域的常規(guī)方法，使用適宜的分散劑或濕潤劑(如Tween 80)及懸浮劑等制得。其還可以是在可腸道外給藥的無毒稀釋劑或溶劑中的水溶液或懸浮液，如在1，3-丁二醇中的溶液。相關的可用載體或溶劑包括甘露醇、水、林格氏液、等滲氯化鈉等，還可能含有土溫類或丙二醇等增溶劑。另外，無菌的固定油(bland fixed oil)常被作為溶劑或懸浮劑的媒介，因而包括合成甘油單酯或甘油二酯在內的多種柔和的固定油均適用。脂肪酸，如十八烯酸及其甘油酯衍生物(如橄欖油或蓖麻油，特別是其聚氧乙烯基衍生物)等可用于制備所述注射劑。所述油溶液或懸浮液還可包含一種長鏈的乙醇稀釋劑或分散劑或羧甲基纖維素或類似的其他分散劑，此類物質常用于制備可藥用乳劑和/或懸浮劑。其它一些制劑常用的表面活性劑如Tweens或Spans和/或其他類似的乳化劑或生物利用度促進劑等也同樣可用于制備本發(fā)明的制劑。
本發(fā)明的藥物組合物可制成栓劑通過直腸給藥，方法是將本發(fā)明的藥物組合物與適宜的非刺激性賦形劑混合，后者在室溫下為固體而在直腸溫度下為液體，因而該栓劑可溶解于直腸中并釋放出活性成份。此類賦形劑包括但不限于可可油、蜂蠟和聚乙烯。本發(fā)明的藥物組合物的局部給藥制劑(如油膏)可直接用于患處。此類局部制劑含有活性成份及可藥用載體，后者包括但不限于礦物油、液體石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯或聚氧丙稀化合物、乳化臘或水。另外，本發(fā)明的藥物組合物還可制成洗劑或油劑。適用的載體包括但不限于礦物油、三梨醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鯨臘酯、十六烷醇、2-十八烷醇、苯甲基乙醇或水。本發(fā)明的藥物組合物還可制成灌腸劑等用于直腸局部給藥。
局部透皮貼劑亦在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明的藥物組合物亦可經(jīng)鼻噴霧或者吸入給藥，即按本領域的常規(guī)方法，使用苯甲基乙醇或其他防腐劑、吸收促進劑、碳氟化合物和/或其他增溶劑或分散劑制得鹽溶液。
本發(fā)明的藥物組合物還可通過植入給藥。采用植入給藥方式可達到在給藥對象體內持續(xù)，定時釋放本發(fā)明的藥物組合物的效果。另外，植入給藥還能在局部組織和器官定位給藥(Negrin et al.，Biomaterials 22(6)563，2001)定時釋放技術亦可用于本發(fā)明的藥物組合物的給藥中，如基于聚合體技術的定時釋藥膠囊、緩釋技術和制劑包裹技術(如聚合體和脂質體)等。
貼劑同樣包括在本發(fā)明的保護范圍之內。其包括基層(如聚合體、布、紗和繃帶)和本發(fā)明的藥物組合物?；鶎拥囊贿吙稍O有一保護層以防止活性成份的流出。所述貼劑還可含有一用于固定的粘合劑，后者可以是一種自然的或者合成的物質，當其與給藥對象的皮膚接觸時可暫時粘附于皮膚上。粘合劑可以是防水的。
“可藥用載體”不會破壞本發(fā)明的藥物組合物的藥學活性，同時其有效用量，即能夠起到藥物載體作用時的用量對人體無毒?！翱伤幱幂d體”包括但不限于離子交換材料、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物傳遞系統(tǒng)(SEDDS)如d-α-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐溫(Tweens)或其他類似聚合介質等藥物制劑用的表面活化劑、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸部分甘油酯混合物、水、鹽、電解質如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二納、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、硅酸鎂等。聚乙烯吡咯酮、纖維素物質、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙稀酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛酯、環(huán)糊精如α-、β-及γ-環(huán)糊精或其經(jīng)化學修飾的衍生物如2-和3-羥丙基-β-環(huán)糊精等羥烷基環(huán)糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促進本發(fā)明的藥物組合物的藥物傳遞。
本發(fā)明的藥物組合物所含的木犀草素與一種鉑類化療藥物包括但不限于順鉑、奧沙利鉑或卡鉑的協(xié)同作用的有效范圍(摩爾濃度比)已通過合適的體外試驗(in vitro assay)得以驗證。作為一種常用的腫瘤化療藥物，順鉑、卡鉑和奧沙利鉑的常規(guī)用量及給藥途徑如下順鉑15-35毫克/平方米(人體表面積)連續(xù)用藥數(shù)日，也有70-100毫克/平方米單次用藥；卡鉑300-400毫克/平方米單次用藥或分數(shù)次數(shù)日給藥；奧沙利鉑85-135毫克/平方米單次用藥。尚未見有關木犀草素臨床抗腫瘤劑量及其適宜的給藥途徑的文獻報道。所使用的組合物中任何成分的準確用量在臨床實際使用過程中可根據(jù)所用化合物的效力、病人的年齡、體重、身體狀況和病人的敏感性等來確定。本領域的普通技術人員亦應知如何通過本領域的常規(guī)技術，按照本發(fā)明公開的摩爾濃度比，將木犀草素與順鉑、奧沙利鉑或卡鉑混合在一起，制備本發(fā)明的具有腫瘤治療作用的藥物組合物。
為了便于理解本發(fā)明，特列舉以下實施例。其作用應被理解為是對本發(fā)明的詮釋而絕非對本發(fā)明的任何形式的限制。
實施例1 木犀草素對順鉑(CDDP)在抗肝癌細胞上的協(xié)同作用人肝癌細胞株HepG2，將細胞株懸浮在含有10％(小)牛胎兒血清的細胞培養(yǎng)液中，以5×103/孔播種于96孔細胞培養(yǎng)盤。在培養(yǎng)24小時后，加入木犀草素，并與順鉑以不同摩爾濃度比混合加入培養(yǎng)液里。最終濃度木犀草素0.3-200μg/ml，順鉑0.3-3μg/ml。再繼續(xù)培養(yǎng)72小時后作MTT測定。用四氮唑鹽(MTT)法染色并計算單用及聯(lián)用木犀草素和順鉑時對HepG2增殖的抑制率，用CalcuSyn統(tǒng)計軟件及聯(lián)合用藥指數(shù)值(CI)法進行數(shù)據(jù)分析。
單獨用藥和聯(lián)合用藥時的HepG2細胞增殖抑制率，以及聯(lián)合用藥指數(shù)值見表1表1


注木犀＝木犀草素；Pt＝順鉑(CDDP)結論表1顯示木犀草素與順鉑(CDDP)在對HepG2聯(lián)合用藥時，當順鉑與木犀草素的摩爾濃度比為1∶1、1∶2、1∶4，1∶10時呈現(xiàn)出良好的協(xié)同作用效果。
實施例2 木犀草素對順鉑(CDDP)在抗肺癌細胞上的協(xié)同作用人肺癌細胞株A549，將細胞株懸浮在含有10％(小)牛胎兒血清的細胞培養(yǎng)液中，以5×103/孔播種于96孔細胞培養(yǎng)盤。在培養(yǎng)24小時后，加入木犀草素，并與順鉑以不同摩爾濃度比混合加入培養(yǎng)液里。最終濃度木犀草素0.3-200μg/ml，順鉑0.3-3μg/ml。再繼續(xù)培養(yǎng)72小時后作MTT測定。用四氮唑鹽(MTT)法染色并計算單用及聯(lián)用木犀草素和順鉑時對A549增殖的抑制率，用CalcuSyn統(tǒng)計軟件及聯(lián)合用藥指數(shù)值(CI)法進行數(shù)據(jù)分析。
單獨用藥和聯(lián)合用藥時的A549細胞增殖抑制率，以及聯(lián)合用藥指數(shù)值見表2
表2

注木犀＝木犀草素；Pt＝順鉑(CDDP)結論表2顯示木犀草素與順鉑(CDDP)在對A549聯(lián)合用藥時，當順鉑與木犀草素的摩爾濃度比為1∶2.5、1∶5、1∶10時呈現(xiàn)出良好的協(xié)同作用效果。
實施例3 木犀草素對順鉑(CDDP)在抗胃癌細胞上的協(xié)同作用人胃癌細胞株MKN28，將細胞株懸浮在含有10％(小)牛胎兒血清的細胞培養(yǎng)液中，以5×103/孔播種于96孔細胞培養(yǎng)盤。在培養(yǎng)24小時后，加入木犀草素，并與順鉑以不同摩爾濃度比混合加入培養(yǎng)液里。最終濃度木犀草素0.3-200μg/ml，順鉑0.3-3μg/ml。再繼續(xù)培養(yǎng)72小時后作MTT測定。用四氮唑鹽(MTT)法染色并計算單用及聯(lián)用木犀草素和順鉑時對MKN28增殖的抑制率，用CalcuSyn統(tǒng)計軟件及聯(lián)合用藥指數(shù)值(CI)法進行數(shù)據(jù)分析。
單獨用藥和聯(lián)合用藥時的MKN28細胞增殖抑制率，以及聯(lián)合用藥指數(shù)值見表3表3


注木犀＝木犀草素；Pt＝順鉑(CDDP)結論表3顯示木犀草素在與順鉑(CDDP)在對MKN28聯(lián)合用藥時，當順鉑與木犀草素的摩爾濃度比為1∶2.5、1∶5、1∶10時呈現(xiàn)出良好的協(xié)同作用效果。
實施例4 木犀草素對順鉑(CDDP)在抗大腸癌細胞株上的協(xié)同作用人大腸癌細胞株HCT116，將細胞株懸浮在含有10％(小)牛胎兒血清的細胞培養(yǎng)液中，以5×103/孔播種于96孔細胞培養(yǎng)盤。在培養(yǎng)24小時后，加入木犀草素，并與順鉑以不同摩爾濃度比混合加入培養(yǎng)液里。最終濃度木犀草素0.3-200μg/ml，順鉑0.3-3μg/ml。再繼續(xù)培養(yǎng)72小時后作MTT測定。用四氮唑鹽(MTT)法染色并計算單用及聯(lián)用木犀草素和順鉑時對HCT116增殖的抑制率，用CalcuSyn統(tǒng)計軟件及聯(lián)合用藥指數(shù)值(CI)法進行數(shù)據(jù)分析。
單獨用藥和聯(lián)合用藥時的HCT116細胞增殖抑制率，以及聯(lián)合用藥指數(shù)值見表4表4


注木犀＝木犀草素；Pt＝順鉑(CDDP)結論表4顯示木犀草素在與順鉑(CDDP)在對HCT116聯(lián)合用藥時，當順鉑與木犀草素的摩爾濃度比在1∶2.5，1∶5，1∶10時呈現(xiàn)出良好的協(xié)同作用效果。
實施例5 木犀草素對順鉑(CDDP)在抗食道癌上的協(xié)同作用人食道癌細胞株TE2，將細胞株懸浮在含有10％(小)牛胎兒血清的細胞培養(yǎng)液中，以5×103/孔播種于96孔細胞培養(yǎng)盤。在培養(yǎng)24小時后，加入木犀草素，并與順鉑以不同摩爾濃度比混合加入培養(yǎng)液里。最終濃度木犀草素0.3-200μg/ml，順鉑0.3-3μg/ml。再繼續(xù)培養(yǎng)72小時后作MTT測定。用四氮唑鹽(MTT)法染色并計算單用及聯(lián)用木犀草素和順鉑時對HE2增殖的抑制率，用CalcuSyn統(tǒng)計軟件及聯(lián)合用藥指數(shù)值(CI)法進行數(shù)據(jù)分析。
單獨用藥和聯(lián)合用藥時的TE2細胞增殖抑制率，以及聯(lián)合用藥指數(shù)值見表5表5


注木犀＝木犀草素；Pt＝順鉑(CDDP)結論表5顯示木犀草素在與順鉑(CDDP)在對TE2聯(lián)合用藥時，當順鉑與木犀草素的摩爾濃度比在1∶2.5，1∶5，1∶10時呈現(xiàn)出良好的協(xié)同作用效果。
實施例6 木犀草素聯(lián)合順鉑(CDDP)對移植性腫瘤的抗腫瘤協(xié)同作用將B16黑色素瘤細胞株在體外培養(yǎng)兩代后，以2×106細胞/只接種于實驗動物雌性C57BL/6(體重在20克左右)小鼠腋下皮下。接種后第二天隨機分組，并按0.1ml/10g體重開始給藥。木犀草素(陜西慧科植物開發(fā)有限公司)，并與順鉑(Sigma公司產(chǎn)品)以單獨給藥，聯(lián)合給藥等不同的給藥方式分組進行抗腫瘤試驗。每組的實驗動物均為10只。給藥前測定動物體重，試驗第15日稱動物體重后脫頸處死，剝取瘤塊組織稱重。抑瘤率的測定按計算公式；抑瘤率＝(1-治療組瘤重/空白對照組瘤重)×100％計算瘤重抑制率和進行統(tǒng)計學(t檢驗)處理。并按照金氏公式計算出Q值。
試驗結果見表6表6單獨用藥和聯(lián)合順鉑用藥時對移植B16黑色素瘤的動物試驗結果

木犀＝木犀草素給藥方式順鉑；腹腔，木犀草素；腹腔給藥*與單用順鉑組相比P＜0.05**與單用順鉑組相比P＜0.01#Q值顯示相加作用##Q值顯示協(xié)同作用試驗結果可見木犀草素和順鉑合用時體現(xiàn)了明顯的抗腫瘤增效作用。順鉑+木犀草素5mg/kg，順鉑+木犀草素10mg/kg，順鉑+木犀草素20mg/kg各組與單用順鉑組相比較都具有統(tǒng)計學上顯著差異。Q值也顯示出具有相加和協(xié)同作用。動物試驗結果明顯地支持了體外試驗的結果，即木犀草素和順鉑在1∶2.5～1∶10濃度比附近的區(qū)域具有比較明顯的協(xié)同用藥效果。從動物體重變化可以看到，各合用組未見有任何毒性增強趨勢。
綜合動物試驗可見；木犀草素和順鉑具有良好的協(xié)同抗腫瘤作用。
實施例7 木犀草素聯(lián)合奧沙利鉑(草酸鉑)在人腫瘤細胞株體外生長抑制的協(xié)同作用將各類人腫瘤細胞株細胞懸浮在含有10％(小)牛胎兒血清的細胞培養(yǎng)液中，以5×103/孔播種于96孔細胞培養(yǎng)盤。在培養(yǎng)24小時后，加入木犀草素(陜西慧科植物開發(fā)有限公司)，并與奧沙利鉑(Sigma公司產(chǎn)品)以不同濃度比混合加入培養(yǎng)液里。培養(yǎng)72小時后作MTT測定。用四氮唑鹽(MTT)法染色并計算單用及聯(lián)用木犀草素和奧沙利鉑時對細胞增殖的抑制率，用CalcuSyn統(tǒng)計軟件及聯(lián)合用藥指數(shù)值(CI)法進行數(shù)據(jù)分析。當CI＜1時，為協(xié)同作用，CI＝1時，為相加作用；CI＞1時，為拮抗作用。
各人腫瘤細胞株為人大腸癌細胞HCT116 表7人肺癌細胞株A549表8人胃癌細胞株MKN45 表9單獨用藥和聯(lián)合用藥時的細胞增殖抑制率，以及聯(lián)合用藥指數(shù)值見表7表7 木犀草素單獨用藥和聯(lián)合奧沙利鉑用藥時的HCT116細胞增值抑制率，以及聯(lián)合用藥指數(shù)


表8木犀草素單獨用藥和聯(lián)合奧沙利鉑用藥時的A549細胞增值抑制率，以及聯(lián)合用藥指數(shù)


表9木犀草素單獨用藥和聯(lián)合奧沙利鉑用藥時的MKN45細胞增值抑制率，以及聯(lián)合用藥指數(shù)


注木犀＝木犀草素；奧鉑＝奧沙利鉑抑制率％；均值±SD，n＝3當CI＜1時，為協(xié)同作用，CI＝1時，為相加作用；CI＞1時，為拮抗作用。
表7-9顯示在此濃度比附近的區(qū)域(1∶5～1∶15)內均有良好的聯(lián)合用藥指數(shù)，可以明顯地表明木犀草素與奧沙利鉑在對人大腸癌細胞株HCT116、人肺癌細胞株A549、人胃癌細胞株MKN45都具有良好的聯(lián)合用藥效果。
實施例8 木犀草素對奧沙利鉑在抗移植性腫瘤上的協(xié)同作用將B16黑色素瘤細胞株在體外培養(yǎng)兩代后，以2×106細胞/只接種于實驗動物雌性C57BL/6(體重在20克左右)小鼠腋下皮下。接種后第二天隨機分組，并按0.1ml/10g體重開始給藥。木犀草素(陜西慧科植物開發(fā)有限公司)，并與奧沙利鉑(Sigma公司產(chǎn)品)以單獨給藥，聯(lián)合給藥等不同的給藥方式分組進行抗腫瘤試驗。每組的實驗動物均為10只。給藥前測定動物體重，試驗第15日稱動物體重后脫頸處死，剝取瘤塊組織稱重。抑瘤率的測定按計算公式；抑瘤率＝(1-治療組瘤重/空白對照組瘤重)×100％。計算瘤重抑制率和進行統(tǒng)計學(t檢驗)處理。并按照金氏公式計算出Q值。
試驗結果見表10表10單獨用藥和聯(lián)合奧沙利鉑用藥時對移植B16黑色素瘤的動物試驗結果


木犀＝木犀草素；奧鉑＝奧沙利鉑給藥方式奧沙利鉑；腹腔，木犀草素；腹腔給藥**與單用奧沙利鉑組相比P＜0.01#Q值顯示相加作用試驗結果可見木犀草素和奧沙利鉑合用時體現(xiàn)了明顯的抗腫瘤增效作用。奧沙利鉑+木犀草素10mg/kg，奧沙利鉑+木犀草素20mg/kg，奧沙利鉑+木犀草素30mg/kg各組與單用奧沙利鉑組相比較都具有統(tǒng)計學上顯著差異。Q值也顯示出具有相加作用。動物試驗結果明顯地支持了體外試驗的結果，即木犀草素對和奧沙利鉑在1∶5～1∶15濃度比附近的區(qū)域具有比較明顯的協(xié)同用藥效果。從動物體重變化可以看到，各合用組未見有任何毒性增強趨勢。
綜合動物試驗可見；木犀草素和奧沙利鉑具有良好的協(xié)同抗腫瘤作用。
實施例9 木犀草素聯(lián)合卡鉑在人腫瘤細胞株體外生長抑制的協(xié)同作用將人肺癌細胞株細胞A549懸浮在含有10％(小)牛胎兒血清的細胞培養(yǎng)液中，以5×103/孔播種于96孔細胞培養(yǎng)盤。在培養(yǎng)24小時后，加入木犀草素(陜西慧科植物開發(fā)有限公司)，并與卡鉑(Sigma公司產(chǎn)品)以不同濃度比混合加入培養(yǎng)液里。培養(yǎng)72小時后作MTT測定。用四氮唑鹽(MTT)法染色并計算單用及聯(lián)用木犀草素和卡鉑時對細胞增殖的抑制率，用CalcuSyn統(tǒng)計軟件及聯(lián)合用藥指數(shù)值(CI)法進行數(shù)據(jù)分析。當CI＜1時，為協(xié)同作用，CI＝1時，為相加作用；CI＞1時，為拮抗作用。
單獨用藥和聯(lián)合用藥時的細胞增殖抑制率，以及聯(lián)合用藥指數(shù)值見表11表11木犀草素單獨用藥和聯(lián)合卡鉑用藥時的A549細胞增值抑制率，以及聯(lián)合用藥指數(shù)


注木犀＝木犀草素抑制率％；均值±SD，n＝3當CI＜1時，為協(xié)同作用，CI＝1時，為相加作用；CI＞1時，為拮抗作用。
表16顯示出在卡鉑對和木犀草素對A549細胞株的IC50之摩爾濃度比約為(1∶1)，顯示在此濃度比附近的區(qū)域(1∶2～2∶1)內均有良好的聯(lián)合用藥指數(shù)，可以明顯地表明與卡鉑和木犀草素對人肺癌細胞株A549具有良好的聯(lián)合用藥效果。
實施例10木犀草素聯(lián)合卡鉑對移植性腫瘤的抗腫瘤協(xié)同作用將B16黑色素瘤細胞株在體外培養(yǎng)兩代后，以2×106細胞/只接種于實驗動物雌性C57BL/6(體重在20克左右)小鼠腋下皮下。接種后第二天隨機分組，并按0.1ml/10g體重開始給藥。木犀草素(陜西慧科植物開發(fā)有限公司)，并與卡鉑(Sigma公司產(chǎn)品)以單獨給藥，聯(lián)合合給藥等不同的給藥方式分組進行抗腫瘤試驗。每組的實驗動物均為10只。給藥前測定動物體重，試驗第15日稱動物體重后脫頸處死，剝取瘤塊組織稱重。抑瘤率的測定按計算公式；抑瘤率＝(1-治療組瘤重/空白對照組瘤重)×100％計算瘤重抑制率和進行統(tǒng)計學(t檢驗)處理。并按照金氏公式計算出Q值。
試驗結果見表12表12單獨用藥和聯(lián)合卡鉑用藥時對移植B16黑色素瘤的動物試驗結果

木犀＝木犀草素給藥方式卡鉑；腹腔，木犀草素；腹腔給藥**與單用卡鉑組相比P＜0.01#Q值顯示相加作用##Q值顯示協(xié)同作用試驗結果可見木犀草素和卡鉑合用時體現(xiàn)了明顯的抗腫瘤增效作用?？ㄣK+木犀草素5mg/kg，卡鉑+木犀草素10mg/kg，卡鉑+木犀草素20mg/kg各組與單用卡鉑組相比較都具有統(tǒng)計學上顯著差異。Q值也顯示出具有相加和協(xié)同作用。動物試驗結果明顯地支持了體外試驗的結果，即木犀草素對和卡鉑在1∶2～2∶1濃度比附近的區(qū)域具有比較明顯的協(xié)同用藥效果。從動物體重變化可以看到，各合用組未見有任何毒性增強趨勢。
綜合動物試驗可見；木犀草素和卡鉑具有良好的協(xié)同抗腫瘤作用。
上文所列的各相關文獻均以全篇引入本申請作為參考。本發(fā)明所涉及的多個方面已做如上闡述。然而，應理解的是，在不偏離本發(fā)明精神之前提下，本領域技術人員可對其進行等同變換和修飾。它們的范圍也包括在所附的權利要求中。
權利要求
1.木犀草素或其可藥用鹽在制備一種與鉑類化療藥物聯(lián)合以治療腫瘤的藥物中的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述鉑類化療藥物選自順鉑、奧沙利鉑和卡鉑。
3.權利要求2的用途，其中當所述鉑類化療藥物為順鉑時，所述腫瘤選自黑色素瘤、肝癌、肺癌、大腸癌、胃癌、食道癌和其他實體瘤。
4.權利要求2的用途，其中當所述鉑類化療藥物為奧沙利鉑時，所述腫瘤選自黑色素瘤、大腸癌、肺癌、胃癌和其他實體瘤。
5.權利要求2的用途，其中當所述鉑類化療藥物為卡鉑時，所述腫瘤選自黑色素瘤、肺癌和其他實體瘤。
6.一種治療腫瘤的藥物組合物，包括權利要求1的木犀草素和一種鉑類化療藥物。
7.權利要求6的藥物組合物，其中所述鉑類化療藥物選自順鉑、奧沙利鉑和卡鉑。
8.權利要求7的藥物組合物，其中當所述鉑類化療藥物為順鉑時，所述順鉑和木犀草素的摩爾濃度比為1∶2.5至1∶10。
9.權利要求8的藥物組合物，其中所述腫瘤為實體瘤。
10.權利要求8的藥物組合物，其中所述腫瘤為黑色素瘤。
11.權利要求7的藥物組合物，其中當所述鉑類化療藥物為奧沙利鉑時，所述奧沙利鉑和木犀草素的摩爾濃度比為1∶5至1∶15。
12.權利要求11的藥物組合物，其中所述腫瘤為實體瘤。
13.權利要求11的藥物組合物，其中所述腫瘤為黑色素瘤。
14.權利要求7的藥物組合物，其中當所述鉑類化療藥物為卡鉑時，所述卡鉑和木犀草素的摩爾濃度比為1∶2至2∶1。
15.權利要求14的藥物組合物，其中所述腫瘤為實體瘤。
16.權利要求14的藥物組合物，其中所述腫瘤為黑色素瘤。
17.權利要求6～16的任一藥物組合物的制備方法，該方法包括將一種鉑類化合物與權利要求1的木犀草素混合。
18.權利要求17的方法，其中所述鉑類化合物選自順鉑、奧沙利鉑和卡鉑。
全文摘要
本發(fā)明公開了木犀草素在制備一種與鉑類化療藥物包括順鉑、奧沙利鉑或卡鉑聯(lián)合以治療腫瘤的藥物中的用途。本發(fā)明還公開了上述用途中有用的藥物組合物。
文檔編號A61K31/194GK1853625SQ200610074209
公開日2006年11月1日 申請日期2006年3月30日 優(yōu)先權日2005年4月5日
發(fā)明者吳一心 申請人:吳一心