專利名稱：乳酸菌及其在預(yù)防腹瀉中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物腹瀉，更優(yōu)選與抗生素相關(guān)的腹瀉的組合物，包含有效量的至少一種乳酸菌菌株和藥物上可接受的載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的乳酸菌菌株選自嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌及其混合物組成的組。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的乳酸菌菌株屬于乳桿菌屬。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的嗜酸乳桿菌菌株至少為寄存在CNCM的菌株I-1492。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含至少約5億個(gè)在冷藏條件下長達(dá)約120天的活的和活性的嗜酸乳桿菌菌株微生物/克組合物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物在每單位該組合物中，包含約500億個(gè)在冷藏條件下長達(dá)約120天的活的和活性的嗜酸乳桿菌菌株微生物的群體，其中至少約80％的所述微生物是寄存在CNCM的嗜酸乳桿菌I-1492的微生物。本發(fā)明的組合物還可以在每單位該組合物中，包含至少約1000億個(gè)在冷藏條件下長達(dá)約90天的活的和活性的嗜酸乳桿菌菌株微生物的群體，其中至少約80％的所述微生物是寄存在CNCM的嗜酸乳桿菌I-1492的微生物。所謂″單位″指的是適合于商業(yè)用途的任何容器，它含有約98克本發(fā)明的組合物，諸如，但不限于常用于容納乳制品，諸如酸乳酪或其它酵素的罐或塑料容器。
按照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，該組合物包含Bio-KPlusTM產(chǎn)品。按照本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的乳酸菌組合物進(jìn)一步包含發(fā)酵乳蛋白和發(fā)酵大豆蛋白。Bio-K PlusTM產(chǎn)品為易于在市場(chǎng)上購得并且由Bio-K Plus International Inc.公司銷售的乳酸酵素產(chǎn)品。Bio-K PlusTM產(chǎn)品含有嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌，且更具體的是嗜酸乳桿菌I-1492 CNCM。因而本發(fā)明的組合物含有約95％的嗜酸乳桿菌和約5％的干酪乳桿菌。
如上所述，所述的腹瀉優(yōu)選，但不限于與抗生素相關(guān)的腹瀉。已知所有抗生素治療中約10％會(huì)導(dǎo)致胃腸副作用，特別是與抗生素相關(guān)的腹瀉(AAD)。所有類型的抗生素均可以導(dǎo)致AAD，但那些具有廣譜適用范圍的抗生素，諸如頭孢菌素類、廣譜青霉素類和克林霉素為AAD的最常見的病因。10-20％的AAD病例由艱難梭菌(C.difficile)感染導(dǎo)致(Hgenauer等，1998；Bartlett，2002)。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用于預(yù)防或治療由艱難梭菌導(dǎo)致的哺乳動(dòng)物腹瀉。然而，本發(fā)明的組合物還可以用于預(yù)防或治療″旅游腹瀉″類型的腹瀉。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的哺乳動(dòng)物為人。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何制備營養(yǎng)上可接受的組合物并且根據(jù)許多因素的變化確定特定的給予方法和應(yīng)給予的量。在可能影響其選擇的因素中有進(jìn)入組合物的組分的確切性質(zhì)，具有活性還是無活性；哺乳動(dòng)物的身體狀況、年齡和體重、AAD的階段和治療的性質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提出了本發(fā)明的組合物在預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物腹瀉中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提出了乳酸菌菌株在制備本發(fā)明的組合物中的應(yīng)用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的嗜酸乳桿菌菌株非I-1492；并且所述的干酪乳桿菌菌株可以為商購來源的且可以購自乳酸酵素制造商。
為了制備本發(fā)明的組合物，將本發(fā)明的乳桿菌屬菌株中的至少一種摻入合適的支持物，其用量為每個(gè)單位的約98g組合物中有約500億個(gè)-約1000億個(gè)微生物。
可以通過在基于乳的培養(yǎng)基中發(fā)酵乳酸菌獲得本發(fā)明的組合物。為了這一目的，可以使用下列方法。
首先，按照包括幾個(gè)步驟的標(biāo)準(zhǔn)程序在10％CO2環(huán)境中的MRS型發(fā)酵培養(yǎng)基中孵育I-1492、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌菌株。在95℃下將部分不含乳糖并且脫氣的調(diào)配的乳基質(zhì)進(jìn)行巴士消毒1,5分鐘且以10％接種。最后，按照下列程序孵育 1)I-1492菌株37℃，10％CO2下2小時(shí)； 2)嗜酸乳桿菌菌株37℃下2小時(shí)；和 3)干酪乳桿菌菌株37℃下1小時(shí)。
然后在37℃下和在厭氧氣氛和培養(yǎng)基中將產(chǎn)物共同發(fā)酵15小時(shí)(在CO2中脫氣)。
為了實(shí)施本發(fā)明，可以使用任何嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌菌株，只要它們不造成健康風(fēng)險(xiǎn)。在本發(fā)明的組合物中存在的嗜酸乳桿菌(包括獲自I-1492菌株的嗜酸乳桿菌)的總濃度必須至少等于每單位的98g組合物中500億個(gè)，并且I-1492的濃度必須為每單位的約98g組合物中微生物總數(shù)的至少80％。
盡管總氨基酸含量與奶相似，但是優(yōu)選游離氨基酸顯著較高。在本發(fā)明組合物中包含的具有1000至5000Da分子量的肽類的水平約為30％，并且具有少于10個(gè)殘基的小肽類的水平約為15％。已知這類肽類的水平以一種令人意外的方式強(qiáng)化了免疫和消化系統(tǒng)。
對(duì)人或動(dòng)物給予或存在于本發(fā)明組合物中的乳酸菌的數(shù)量或濃度為治療有效量。乳酸菌的治療有效量為獲得陽性結(jié)果而不會(huì)對(duì)給予乳酸菌或該組合物的宿主產(chǎn)生過度的負(fù)面作用的必需量。實(shí)際上，乳酸菌預(yù)防AAD的有效量是以任何方式足以減弱或減輕與AAD相關(guān)的癥狀的量。按照一種方案，可以將有效量在一次或多次給藥中給予。例如，如上所述，本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的有效量為每單位的約98g組合物中有約500-約1000億個(gè)細(xì)菌。可以將這樣的量在單劑量中給予或可以通過有效的另一種方案給予。然而，可以理解給予的組合物中乳酸菌或各成分的確切量和給予的組合物的量根據(jù)如下因素的不同而改變諸如預(yù)防的AAD的類型、組合物中的其它組分、給藥方式、哺乳動(dòng)物的年齡和體重等。
可以將本發(fā)明的組合物制成通常用于藥物或營養(yǎng)物給予的固體或液體劑型，即例如液體給予劑型、在凝膠、膠囊或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何其它支持物中的形式。在這些可用的組合物中，我們可以特別列舉可以通過口服給予的組合物。在這種情況中，可以將本發(fā)明的組合物作為食品形式(例如乳酸酵素)或作為食品補(bǔ)充劑給予。更具體地說，可以將本發(fā)明的組合物制成各種可食入的形式，諸如奶、酸乳酪、凝乳、發(fā)酵乳、基于奶的發(fā)酵產(chǎn)品、基于大豆的發(fā)酵產(chǎn)品、基于發(fā)酵谷類的產(chǎn)品、基于奶的粉末和嬰兒配方。還可以以食品或食品補(bǔ)充劑的形式給予該組合物。這類食品可以為蛋白質(zhì)濃縮物，諸如在醫(yī)院中使用的蛋白質(zhì)濃縮物。
就藥物制劑而言，可以制備成膠囊、片劑、液體細(xì)菌懸液、干口服補(bǔ)充劑、濕口服補(bǔ)充劑、干管飼或濕管飼等形式的產(chǎn)品，但不限于這些，其中摻入的乳桿菌屬菌株的量約多達(dá)300億個(gè)，但不限于此。
本發(fā)明還涉及預(yù)防或治療腹瀉的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物給予有效量的本發(fā)明的乳酸菌組合物的步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，給予為口服給予。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將該組合物先以約49g/天的用量給予2天，且然后以約98g/天的用量在接下來的至少10天持續(xù)時(shí)間內(nèi)給予。
作為預(yù)防性措施和對(duì)于一般性維持腸轉(zhuǎn)運(yùn)和健康，推薦優(yōu)選服用約98g/天的本發(fā)明組合物。作為對(duì)健康的一般性維持，推薦優(yōu)選每隔一天服用約98g并且持續(xù)30天。在″旅游腹瀉″類型的腹瀉病例中，推薦優(yōu)選服用約98g，一天兩次，持續(xù)3天，隨后是約98g/天，持續(xù)7-15天。就便秘的情況而言，推薦優(yōu)選服用約49g/天，持續(xù)4天。還可以對(duì)12個(gè)月以上的兒童以約24.5g/天的優(yōu)選用量給予本發(fā)明的組合物，并且對(duì)更小的嬰兒可以將本發(fā)明的組合物作為補(bǔ)充劑加入奶瓶中，優(yōu)選用量為約一茶匙/天。
本發(fā)明還包括用于例如預(yù)防AAD的有用藥盒。該藥盒包括一個(gè)或多個(gè)含有本發(fā)明組合物的容器。如果需要，這類藥盒還可以另外包括一種或多種常規(guī)的藥物成分，例如含有一種或多種藥物上可接受的載體的容器或任何其它附加的容器，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見。本發(fā)明的藥盒可以有利地包括小冊(cè)子或任何其它印刷載體形式的用法說明書，它們顯示了給予的組合物的量、給予說明和/或混合所述成分的說明。
具體實(shí)施例方式 下列實(shí)施例用于解釋本發(fā)明的使用范圍，但不限制本發(fā)明的范圍?？梢栽诓幻撾x本發(fā)明目的和范圍的情況下進(jìn)行修改和改變。描述了材料和優(yōu)選方法，不過可以使用與見于本文中的方法等效的其它方法或等同產(chǎn)品用于測(cè)試和實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
實(shí)施例1 在預(yù)防與抗生素相關(guān)的腹瀉中比較乳桿菌屬制劑(BIO-K+)的功效與安慰劑功效的研究 本實(shí)施例中所述的研究評(píng)價(jià)了乳桿菌屬在乳酸酵素中的制劑在AAD的初級(jí)預(yù)防中的應(yīng)用。因此，完成了雙盲、隨機(jī)化選擇、安慰劑對(duì)照的臨床研究。在本研究中比較兩組接受乳桿菌屬制劑的實(shí)驗(yàn)組和接受不含任何細(xì)菌菌株的乳清的安慰劑制劑的對(duì)照組。
種群研究 在Montreal，QC，Canada的Maisonneuve-Rosemont醫(yī)院的住院成年患者接受口服或非腸道抗生素治療，預(yù)計(jì)治療期為最少3天，而非單一療法中的氨基糖苷或萬古霉素，他們適合于本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)包括拒絕參與；不可能征得同意；不會(huì)講法語；活動(dòng)性腹瀉；在招募前3個(gè)月中出現(xiàn)艱難梭菌感染；經(jīng)證實(shí)的乳糖不耐受；非可控炎癥性腸病；和定期攝取益生菌。此外，從本研究中排除接受化療、放療、通過鼻飼導(dǎo)管的胃腸外飼喂或腸道飼喂的患者、無法口服的患者、進(jìn)行造口術(shù)的患者、具有受損或人造心臟瓣膜的患者和帶有移植物的患者。
對(duì)每一位參與者均應(yīng)征得書面同意并且治療醫(yī)生的批準(zhǔn)是必需的。將研究方案以及同意的表格提交給醫(yī)院的倫理委員會(huì)并且在2003年9月12日被接受。
研究目的 主要目的在于評(píng)價(jià)兩組中各自AAD的發(fā)病率，無論是在住院治療過程中，還是在患者已經(jīng)出院后發(fā)生。根據(jù)在24小時(shí)期間出現(xiàn)至少3次液體糞便來確定AAD。為了確保抗生素療法為原因，排除所有其它病因，諸如使用灌腸劑或緩瀉藥。計(jì)劃隨訪，以便評(píng)價(jià)所有患者的抗生素療法結(jié)束后21天的AAD發(fā)病率，除非在此前已經(jīng)發(fā)生AAD。
次要目的在于評(píng)價(jià)AAD的嚴(yán)重程度、住院治療的持續(xù)時(shí)間和乳桿菌屬制劑的無害性。為了評(píng)價(jià)AAD的嚴(yán)重程度，評(píng)價(jià)下列參數(shù)在糞便中存在艱難梭菌毒素B；在糞便中存在血(根據(jù)陽性

試驗(yàn))；存在發(fā)熱；腹瀉的持續(xù)時(shí)間；腹瀉發(fā)作過程中每天的液體糞便平均次數(shù)(分成三類每天3-4次；5-9次或9次以上液體糞便)；和依賴于抗生素治療來抵抗AAD。
為了評(píng)價(jià)潛在混雜變量的影響，記錄了年齡、治療的臨床適應(yīng)癥、患者病情的嚴(yán)重程度、使用的抗生素類別、抗生素療法的持續(xù)時(shí)間、接受抗生素的次數(shù)、在招募前月內(nèi)或預(yù)防后的隨訪期過程中使用的抗生素、艱難梭菌前情、在污染了艱難梭菌的監(jiān)護(hù)病房中住院、質(zhì)子泵抑制劑的使用、緩瀉藥的使用、麻醉藥的使用、鎂的口服補(bǔ)充劑的攝取以及酸乳酪的食用。應(yīng)注意告知患者在整個(gè)研究持續(xù)過程中不食用酸乳酪。根據(jù)借助于由HMR的醫(yī)療檔案服務(wù)機(jī)構(gòu)使用的″All PatientRefined Diagnosis Related Groups″(APR-DRG v12.0)分類系統(tǒng)獲得的臨床風(fēng)險(xiǎn)性發(fā)生率確定了患者病情的嚴(yán)重程度。
數(shù)據(jù)收集和研究過程 每天從接受抗生素療法的患者名單中確定可能的受試者。一旦修正了現(xiàn)在的和先前的檔案，就對(duì)患者進(jìn)行面試以便驗(yàn)證他們是否合格并且征得他們的同意。
按照預(yù)先建立的區(qū)組順序(block sequence)，由醫(yī)院的研究藥房進(jìn)行隨機(jī)化選擇。最初，在開始抗生素療法后24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)化選擇。在對(duì)方案進(jìn)行修訂后，可以在抗生素療法開始后48小時(shí)內(nèi)對(duì)患者進(jìn)行隨機(jī)化選擇。
在隨機(jī)化選擇后，患者按照指定的組接受嗜酸乳桿菌(I-1492)和干酪乳桿菌制劑或安慰劑。使用的劑量約為49克所述制劑(1/2杯)，每天一次，持續(xù)2天，和約98克(1杯)，每天一次，持續(xù)隨后的天數(shù)。預(yù)防總的持續(xù)時(shí)間相當(dāng)于抗生素療法的持續(xù)時(shí)間?？股丿煼ㄔ谟谝赃B續(xù)的方式接受所有的抗生素。在住院治療期間每天由研究藥房分發(fā)所述制劑并且由護(hù)士給藥。如果患者在抗生素療法結(jié)束前出院，那么對(duì)他給予完成預(yù)防所必需的杯數(shù)的量。
在抗生素療法過程中，每三天從醫(yī)療檔案中收集有關(guān)抗生素?cái)z取和AAD突發(fā)的數(shù)據(jù)。此后，在抗生素治療結(jié)束時(shí)和抗生素療法后第7、14和21天時(shí)收集數(shù)據(jù)。此外，為了評(píng)價(jià)有害作用的出現(xiàn)，在隨機(jī)化選擇后5天(或在患者出院時(shí)，如果其在先發(fā)生)，并且在抗生素療法的最后一天對(duì)患者進(jìn)行面試。這些隨訪方式僅應(yīng)用于住院治療期。如果患者在隨訪結(jié)束前出院，那么通過抗生素療法結(jié)束時(shí)和在抗生素療法后第7、14和21天時(shí)進(jìn)行的電話訪談采集數(shù)據(jù)。給患者提供記憶輔助器以便他/她記下有關(guān)他將會(huì)被詢問的不同信息。
在任何時(shí)刻，如果發(fā)生AAD，那么就終止預(yù)防，并且隨訪只限于評(píng)價(jià)AAD的嚴(yán)重程度。如果患者在離開醫(yī)院后出現(xiàn)AAD，那么他/她就必須與研究人員之一聯(lián)系，并且如果判斷適當(dāng)，那么就要求他/她去HMR的傳染病診所，以便進(jìn)行醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)和糞便分析。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 認(rèn)為本研究是每組120位患者的樣本大小的函數(shù)，以便能夠檢測(cè)兩個(gè)治療組之間AAD發(fā)病率下降50％(即30％-15％)，其統(tǒng)計(jì)效率為80％且置信水平為95％。這一計(jì)算基于兩種比例之間差異的雙向假設(shè)檢驗(yàn)。
以比例、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差或在中位值以及四分位值間距評(píng)價(jià)了患者的特征以及嚴(yán)重程度和無害性的有效測(cè)定值。通過Khi-平方檢驗(yàn)或確切的費(fèi)歇爾檢驗(yàn)對(duì)研究組之間離散變量進(jìn)行了比較。關(guān)于連續(xù)變量，斯氏t-檢驗(yàn)使在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間觀察到的差異的統(tǒng)計(jì)顯著性得到驗(yàn)證。所有分析均為雙向的并且使用的α-類型誤差為0.05。
對(duì)于每次分析，使用目的在于治療的手段以便評(píng)價(jià)乳桿菌屬制劑的實(shí)際功效。為了達(dá)到這一目的，使隨機(jī)化選擇的患者組隨機(jī)化并且為了分析而考慮使他們接受至少一種劑量的所研究制劑。為了主要目的，按照每種方案手段進(jìn)行二次分析以便僅包括接受所研究的制劑的三種劑量中最小劑量、服用至少75％的計(jì)劃劑量并完成計(jì)劃的隨訪的患者。
結(jié)果 翻閱開始抗生素療法的1422位患者的病歷檔案以便驗(yàn)證他們的合格中選條件。當(dāng)然，隨機(jī)化選擇89位患者。排除其他患者的原因描述在

圖1中。在這89位隨機(jī)化選擇的患者中，未統(tǒng)計(jì)5位患者，因?yàn)樗麄兾唇邮軇┝炕蛞蛟陔S機(jī)化選擇后出現(xiàn)符合排除標(biāo)準(zhǔn)。就分析的84位參與者而言，隨訪的平均持續(xù)時(shí)間為20±12天并且注意到在兩組之間無顯著性差異(p＝0.53)。在該人數(shù)中，58位患者(69.0％)如方案所計(jì)劃的完成了本研究。應(yīng)當(dāng)注意乳桿菌屬組中的3位患者在研究過程中去世。這些患者中無人出現(xiàn)AAD并且死亡看起來與使用所研究的制劑無直接相關(guān)性。患者分布圖如圖1中所示。
27位患者拒絕參與本研究。其人口統(tǒng)計(jì)特征以及抗生素療法與同意參與本研究的患者人口統(tǒng)計(jì)特征以及抗生素療法相差無幾。女性多于男性拒絕參與(66.7％對(duì)33.3％)，但這一分布與同意參與的患者的分布無顯著性差異(p＝0.17)。
兩組中患者的基本特征如表I中所述相似。僅使用β-丙氨酸的患者在兩組之間分布不均勻(p＝0.02)。因此，在邏輯斯諦回歸分析后，就AAD的突發(fā)而言，發(fā)現(xiàn)這種特征不是混雜變量(p＝0.08)。所研究的人群平均年齡為70歲并且主要治療的是呼吸道感染。
將有關(guān)AAD發(fā)病率、其嚴(yán)重程度和住院治療持續(xù)時(shí)間的結(jié)果列在表II中。
關(guān)于本研究的主要目的，27％(23/84)的患者發(fā)生AAD，即與接受乳桿菌屬的制劑的組中17.1％(7/41)相比，安慰劑組中為37.2％(16/34)。這一差異具有統(tǒng)計(jì)顯著性(p＝0.04)。在分析限于完成如方案中所計(jì)劃的本研究的患者時(shí)，它仍然具有顯著性(分別為53.3％(16/30)和25.0％(7/28)；p＝0.03)。在住院治療過程中，與接受乳桿菌屬制劑的患者中有7.3％(3/41)相比，該組中的患者的18.6％(8/43)發(fā)生AAD。這一差異不具有統(tǒng)計(jì)顯著性(p＝0.13)。在本研究過程中出院的患者中，安慰劑組中發(fā)生AAD的患者多于乳桿菌屬組，即34.8％(8/23)和13.8％(4/29)。也是在這種情況中，無顯著性差異(p＝0.07)。
就所列AAD的嚴(yán)重程度而言，所分析的患者數(shù)量有限限制了可能的結(jié)論。此外，未對(duì)所有患者進(jìn)行嚴(yán)重程度的某些測(cè)量。在65.2％的AAD病例中，進(jìn)行了糞便分析以便檢測(cè)艱難梭菌的存在。在所有發(fā)生AAD的患者中，安慰劑組織中有43.8％(7/16)的患者呈陽性結(jié)果，而在接受乳桿菌屬制劑的患者中有14.3％(1/7)。不過，這一差異不具有統(tǒng)計(jì)顯著性(p＝0.051)。根據(jù)所分析的患者總數(shù)，安慰劑組中16.3％(7/43)發(fā)生艱難梭菌感染，與之相比，在乳桿菌屬組中為2.4％(1/41)。這一差異具有統(tǒng)計(jì)顯著性(p＜0.05)。
僅對(duì)8.7％發(fā)生AAD的患者通過陽性

試驗(yàn)檢測(cè)了糞便。在65.2％發(fā)生AAD的患者中測(cè)量了體溫。對(duì)于這兩個(gè)變量而言，在兩組之間未注意到顯著性差異。AAD發(fā)作的平均持續(xù)時(shí)間在兩組之間無差異(p＝0.85)，不超過每天的糞便次數(shù)(p＝0.13)。令人感興趣的是注意到大多數(shù)AAD在抗生素療法結(jié)束后發(fā)生，即安慰劑組中有75％(12/16)，而乳桿菌屬組中有71.4％(5/7)(p＞0.99)?？股刂委熃Y(jié)束與AAD出現(xiàn)之間平均間隔的時(shí)間在兩組之間無差異(分別為8.5天(±6.3)和4.2天(±3.8)(p＝0.18))。
在發(fā)生AAD的患者中，使用按照經(jīng)驗(yàn)方式給予的或以證實(shí)的艱難梭菌感染為靶標(biāo)的抗生素治療(口服萬古霉素或靜脈內(nèi)或口服甲硝唑)分別用于安慰劑組和乳桿菌屬組中的81.3％(13/16)和42.9％(3/7)(p＝0.14)。
接受乳桿菌屬制劑的患者的平均住院治療持續(xù)時(shí)間短于接受安慰劑的患者的平均住院治療持續(xù)時(shí)間。接受所研究的制劑的組為8天(6-14.5)，而接受安慰劑的組為10天(9-8)。這一差異具有統(tǒng)計(jì)顯著性(p＝0.048)。
還按照使用的抗生素類別(β-丙氨酸、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和在其它類別中所列出的不同的抗生素)比較了乳桿菌屬制劑相對(duì)于安慰劑的功效。對(duì)每類抗生素而言，這些差異不具有統(tǒng)計(jì)顯著性。在圖2和3中圖解顯示了獲得的結(jié)果。
關(guān)于所研究的產(chǎn)品的無害性，將兩組中有害表現(xiàn)各自的發(fā)生率記載在表III中。有48.8％的患者報(bào)告了至少一種有害作用，并且這種情況在兩組中都有。就表現(xiàn)有害作用后退出的患者的發(fā)生率而言，組與組之間無差異(在安慰劑組中為20.1％(9/43)而在乳桿菌屬組中為9.8％(4/41)；p＝0.15)。
討論 盡管許多研究已經(jīng)評(píng)價(jià)了益生菌在AAD的初級(jí)預(yù)防中的功效，但是幾乎沒有可利用的結(jié)論性臨床數(shù)據(jù)并且迄今為止所獲得的結(jié)果為混雜的(Siitonen等，1990；Cremonini等，2002；Thomas等，2001；Tankanow等，1990；Armuzzi等，2001；McFarland等，1995；Surawicz等，1989；Arvola等，1999；Adam等，1977；Gotz等，1979；Lewis等，1998)。在某些研究中，觀察到AAD的嚴(yán)重程度下降或其出現(xiàn)延遲，不一定與其發(fā)病率的顯著下降相關(guān)(Siitonen等，1990；McFarland等，1995；Arvola等，1999；Vanderhoof等，1999)。此外，就隨訪的持續(xù)時(shí)間、使用的AAD定義、招募的患者的特征或研究中所包括的抗生素而言，存在重大差距(Lewis等，1998；Surawicz等，1989；Stoddart等，2002)。預(yù)防的持續(xù)時(shí)間(5-21天)和使用的劑量也極其可變(D′Souza等，2002)。
此外，大多數(shù)公開發(fā)表的研究使用了膠囊形式的凍干益生菌并且評(píng)價(jià)了不同的菌株。然而，重要的是提及了所有的益生菌并非以相同方式起作用并且它們可以具有不同的臨床功效。因此不應(yīng)將在不同研究中所獲得的結(jié)果視為對(duì)那些非這些試驗(yàn)中評(píng)價(jià)的菌株也是有效的(Cremonin等，2002；D′Souza等，2002)。迄今為止，尚無公開發(fā)表的研究評(píng)價(jià)用于本研究中的組合，即嗜酸乳桿菌、嗜酸乳桿菌I-1492和干酪乳桿菌的功效。
在本實(shí)施例中，研究了不同的參數(shù)以便彌補(bǔ)上述研究中觀察到的某些差距。因此，使用ADD的客觀和可再現(xiàn)的定義，即每24小時(shí)中存在三次或三次以上的液體糞便。該定義幾乎未給患者、護(hù)理人員和研究人員的解釋留有余地。此外，與固定的持續(xù)時(shí)間相反，按照抗生素療法的持續(xù)時(shí)間建立的預(yù)防的持續(xù)時(shí)間是對(duì)所有患者提供等效保護(hù)的策略。
在本實(shí)施例中，每天一次使用約98克(1杯)富含嗜酸乳桿菌、嗜酸乳桿菌I-1492和干酪乳桿菌的乳酸酵素(在前2天時(shí)約49克)被證明在AAD的初級(jí)預(yù)防中有效。盡管最初確定的樣本大小預(yù)見到240位患者的隨機(jī)化選擇，但是在樣本限于84位患者的兩組之間能觀察到統(tǒng)計(jì)顯著性差異。其中，可以根據(jù)研究過程中顯著的AAD發(fā)病率解釋這一觀察結(jié)果(安慰劑組中為37.2％)，證實(shí)了高于在樣本大小的計(jì)算中預(yù)計(jì)的30％。這一發(fā)病率是曾經(jīng)在文獻(xiàn)中報(bào)道的最高發(fā)病率之一，其中，其與在過去幾年中注意到的艱難梭菌的AAD病例數(shù)量增加一致。
必須提及52.1％(12/23)的AAD在家中出現(xiàn)。因此隨后對(duì)出院患者的隨訪成為必不可少的，以便確保對(duì)AAD的實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)更完整的評(píng)估。在住院治療的持續(xù)時(shí)間縮短的醫(yī)療保健體系中不臥床活動(dòng)的實(shí)際情況下在家中隨訪是同樣適當(dāng)?shù)?。有用的是警告患者，因?yàn)樵诩抑锌赡馨l(fā)生的并發(fā)癥最終在醫(yī)院環(huán)境時(shí)具有反彈(repercussions)。
抗生素后隨訪特別重要，因?yàn)樵趲缀?5％的受觀察的患者中在抗生素療法后發(fā)生AAD，并且這一情況在兩組中均出現(xiàn)。盡管AAD可能發(fā)生直到抗生素療法結(jié)束后6周，但是抗生素后隨訪僅限于3周，因?yàn)楦篂a發(fā)生得越晚，可能與另一種病因越有關(guān)(McFarland等，1995；Arvola等，1999)。應(yīng)當(dāng)注意抗生素療法后AAD出現(xiàn)延遲的數(shù)據(jù)范圍在兩組中均較大安慰劑組中1-20天且乳桿菌屬組中2-11天。照此，可能的情況是如果AAD的某些病例在抗生素療法結(jié)束后21天以上發(fā)生，那么就檢測(cè)不到他們。
平均為20天的隨訪持續(xù)時(shí)間，包括抗生素療法的持續(xù)時(shí)間可能看起來令人意外，因?yàn)檎J(rèn)為它短于21天的計(jì)劃的抗生素療法后隨訪。這可以由以下事實(shí)來解釋，即，就21％的患者而言，未完成計(jì)劃的隨訪(退出、錯(cuò)過隨訪、死亡或不考慮該方案)。此外，在AAD快速出現(xiàn)時(shí)，隨訪較短。
艱難梭菌AAD的發(fā)生是對(duì)考慮與之相關(guān)的已知臨床和經(jīng)費(fèi)問題說來重要的嚴(yán)重程度的參數(shù)。此外，令人感興趣的是注意到所研究的組合物顯著降低了艱難梭菌AAD的發(fā)病率。據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道因艱難梭菌導(dǎo)致的感染占全部AAD病例的10-20％(D′Souza等，2002；Gaynes等，2004)。在醫(yī)院環(huán)境中艱難梭菌感染突發(fā)的實(shí)際情況下，研究結(jié)果更正確地提示，諸如在安慰劑組中觀察到的比例為50％。盡管這一數(shù)值因本研究中患者的數(shù)量較少可能估計(jì)過高，但是這一比例可能與實(shí)際事實(shí)接近。
住院治療的持續(xù)時(shí)間在乳桿菌屬組中較短。這一觀察結(jié)果可由乳桿菌屬制劑降低AAD發(fā)病率的功效來解釋。然而，必須考慮到患者的基本醫(yī)學(xué)病情的嚴(yán)重性的可能影響。實(shí)際上，盡管在兩組之間無顯著性差異，但是注意到乳桿菌屬組與安慰劑組相比所包含的極其嚴(yán)重的病例較少而嚴(yán)重性較低的病例較多。
許多患者出現(xiàn)至少一種有害作用，即在兩組中各自有48.8％，其中大部分影響胃腸系統(tǒng)。這一發(fā)生率較高，但聲稱無嚴(yán)重的有害作用。盡管如此，但是在有害作用發(fā)生后，退出的患者數(shù)量并非可以忽略不計(jì)。這些數(shù)據(jù)提示了在本研究過程中以及在以后該制劑用于通常實(shí)踐的過程中可能的慣例問題。此外，令人意外的是在安慰劑組中觀察到有害表現(xiàn)的發(fā)生率同樣高。然而，必須考慮安慰劑為具有特殊味道的乳清并且其使用可能與消化出現(xiàn)的問題有關(guān)。
總之，使用98克/天的富含嗜酸乳桿菌、嗜酸乳桿菌CNCM I-1492和干酪乳桿菌組合的乳酸酵素能夠降低在接受治療性抗生素療法的84位住院治療的成年患者中AAD的發(fā)病率。乳桿菌屬制劑也能夠顯著縮短住院治療的持續(xù)時(shí)間。隨機(jī)化選擇的患者過少就無法檢測(cè)該制劑對(duì)AAD嚴(yán)重程度的影響。艱難梭菌AAD的發(fā)病率在治療組中較低。
實(shí)施例2 益生菌在解決Pierre-le Gardeur醫(yī)院中心的嚴(yán)重艱難梭菌結(jié)腸炎突發(fā)中的功效 簡介 艱難梭菌結(jié)腸炎是Pierre-le Gardeur醫(yī)院中心(Montreal區(qū)，Quebec，加拿大)中常見的醫(yī)院感染。實(shí)際上，在2002-2003財(cái)政年度，其發(fā)病率為9.5個(gè)病例/1000入院者。然而，即使是復(fù)發(fā)者，這些感染也未呈現(xiàn)任何嚴(yán)重程度并且在標(biāo)準(zhǔn)甲硝唑或口服萬古霉素治療后有起色。
在2003年8月-10月之間，具有嚴(yán)重程度的醫(yī)院病例發(fā)生率增加了接近50％，并且與這種類型的病理學(xué)沖突的死亡率罕見。此外，對(duì)常規(guī)治療的反應(yīng)有時(shí)是緩慢的并且甚至是無效果的。
在2003年11月，采取了一系列措施來對(duì)抗這種情況。將受感染的患者隔離作為由專門人員護(hù)理的群組。此外，對(duì)醫(yī)院進(jìn)行更為嚴(yán)格的維護(hù)，其中主要對(duì)腹瀉患者居住的房間內(nèi)的浴室、地面和墻壁進(jìn)行消毒。此外，對(duì)醫(yī)療設(shè)備在每位患者使用之間進(jìn)行消毒(臂章、人工攪拌碗等)。持續(xù)使用抗生素(第2和第3代頭孢菌素類)并且取消莫西沙星。實(shí)際上，這種抗生素在2003年8月到10月之間35％的病例中使用(單獨(dú)使用時(shí)為15％)。隨后，至多5.6％的服用莫西沙星的患者發(fā)生艱難梭菌結(jié)腸炎(單獨(dú)使用時(shí)為2.2％)。與之相比，使用第2和第3代頭孢菌素類治療的患者中有4.6％患有結(jié)腸炎(如果單獨(dú)使用為1.2％)，并且在使用克林霉素治療的患者中僅有0.9％患病(在無相關(guān)性情況下使用時(shí)為0.4％)。近來的出版物中已經(jīng)描述了喹諾酮類與假膜性結(jié)腸炎之間的這種相關(guān)性(Gaynes等，2004和McCusker等，2003)。
盡管采取了這些措施，但發(fā)生率仍然在增高。因此，在2004年2月1日，對(duì)所有接受抗生素療法的患者給予益生菌。降低艱難梭菌結(jié)腸炎嚴(yán)重病例的發(fā)生率是主要目的。
方法 Pierre-Le Gardeur醫(yī)院中心是一個(gè)有250張床位的非大學(xué)醫(yī)院。然而，自2004年4月16日以來，該醫(yī)院中心已經(jīng)搬入了有284張床位的新建筑物。本研究在2004年2月1日至2004年8月31日之間進(jìn)行。由于在搬遷過程中服務(wù)大量停止，所以在本研究中未考慮4月份期間艱難梭菌的發(fā)生率。
所有的患者，即那些住院治療的和那些在急診病房中觀察的接受抗生素療法的患者均在一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)接受益生菌。使用的益生菌為Bio-K+(International Inc.)。該產(chǎn)品含有嗜酸乳桿菌(I-1492)，它是來源于人的在Pasteur Institute表征的菌株。該產(chǎn)品作為兩種形式存在作為約98g的含有約500億個(gè)細(xì)菌的組合物的新鮮產(chǎn)品和作為含有約300億個(gè)細(xì)菌的膠囊。使用的劑量為約98g罐/天(在2004年2月和3月的當(dāng)月中給予)或2粒膠囊/天(在2004年5月開始前給予)。益生菌由醫(yī)院藥房供銷。開據(jù)恒定的處方以便確保在抗生素療法開始時(shí)快速啟動(dòng)益生菌治療。
通過記錄每1000例入院者中新醫(yī)院病例的數(shù)量計(jì)算每月的發(fā)病率。按照Atlanta(Garner等，1988)的CDC標(biāo)準(zhǔn)確定醫(yī)院病例。然而，已經(jīng)接受抗生素療法并且保持在急診病房中觀察而未住院3天或3天以上的患者也包括在本研究中。僅列表顯示了一次復(fù)發(fā)病例。此外，將醫(yī)院病例根據(jù)其嚴(yán)重程度再分組。根據(jù)存在如下情況中的至少一種來定義嚴(yán)重程度需要重癥監(jiān)護(hù)；感染性休克；中毒性巨結(jié)腸；必需進(jìn)行結(jié)腸切除術(shù)；對(duì)治療的反應(yīng)緩慢或無反應(yīng)(＞48小時(shí))和死亡率。
使用來自R-Biopharm公司的ELISA試驗(yàn)(RidascreenTM)對(duì)艱難梭菌A/B毒素進(jìn)行檢測(cè)。將這些試驗(yàn)對(duì)不使用防腐劑的糞便樣品每天進(jìn)行5次。
在2004年3月的當(dāng)月的三天過程中分析接受益生菌療法(僅用新鮮的產(chǎn)品)的患者對(duì)治療的遵從性。問詢未遵從治療的患者為何他們未遵從治療。對(duì)服用膠囊的患者不進(jìn)行這種分析，因?yàn)槲从^察到有關(guān)該產(chǎn)品的問題。沒有對(duì)社區(qū)中的患者對(duì)治療的遵從性進(jìn)行核實(shí)，但在患者出院后對(duì)其給予處方。
結(jié)果 總計(jì)2544位患者在2004年2月1日至8月31日之間接受了益生菌。將結(jié)果概括在圖4中。
在突發(fā)過程中的嚴(yán)重病例的平均發(fā)生率為7.7個(gè)病例/1000個(gè)入院者(2003年8月-2004年1月)。在本研究的第一個(gè)月后，發(fā)生率降至2.6個(gè)病例/1000個(gè)入院者(下降66％)。此外，自2004年3月以來，未再出現(xiàn)嚴(yán)重病例。在2003年8月-2004年1月之間直接死亡的有10個(gè)病例。1位患者在2003年11月進(jìn)行了全結(jié)腸切除術(shù)。死亡的最后一個(gè)病例可以回溯至2004年1月?？偘l(fā)生率也得以下降。實(shí)際上，目前的發(fā)生率(2.1個(gè)病例/1000個(gè)入院者)比突發(fā)前的發(fā)生率(9.5個(gè)病例/1000個(gè)入院者)低78％。自2004年8月11日以來宣稱無因艱難梭菌感染而隔離的新病例。
就順從性而言，在3天過程中進(jìn)行了201次觀察。記錄了66％的新鮮產(chǎn)品順從率。在接受觀察的患者中有23％拒絕服用益生菌且11％的患者部分服用了益生菌。缺乏對(duì)治療的順從性的主要原因在于產(chǎn)品的味道(甚至是對(duì)果香味的產(chǎn)品)。
估計(jì)的膠囊年度費(fèi)用為CAN $10 000.00，而新鮮產(chǎn)品的費(fèi)用約為CAN $25 000.00。
討論 經(jīng)證實(shí)使用益生菌(乳桿菌屬、Saccharomyces boulardii)可有效地初步預(yù)防與抗生素相關(guān)的腹瀉。最新薈萃分析提及了這一點(diǎn)(D′Souza等，2002)。原理為重構(gòu)因抗生素療法而受到部分破壞的腸內(nèi)菌群。
在Legardeur中心大量使用益生菌已經(jīng)產(chǎn)生了極為快速的效果。實(shí)際上，盡管環(huán)境衛(wèi)生得到了改善，但仍無法控制突發(fā)。這可以用下列事實(shí)來解釋，即，中心的老地點(diǎn)難以維護(hù)。幾乎沒有浴室并且發(fā)現(xiàn)大量的患者滯留在急診病房和不同病房的走廊中。另一種解釋是受感染的患者或那些帶有定居的艱難梭菌的特定菌株的患者的關(guān)鍵性階段變得過于重要。
新的醫(yī)院中心在環(huán)境清潔水平上呈現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。實(shí)際上，70％的病房為各自配有浴室的單人房間。其它病房設(shè)想供兩個(gè)患者使用并且也可以提供了浴室設(shè)施。沒有可容納四個(gè)患者的病房。此外，急診病房中不再有走廊。重要的是注意到在搬遷后2個(gè)月醫(yī)院艱難梭菌病例已經(jīng)開始顯著下降，而與這些改善無關(guān)。
盡管在本研究中對(duì)于確定益生菌功效進(jìn)行了回顧性比較，但對(duì)這種嚴(yán)重突發(fā)的快速控制和這一措施的費(fèi)用下降仍是醫(yī)院在面對(duì)這一問題時(shí)必須認(rèn)真考慮的要素。
表I 89位隨機(jī)選擇的患者的基本特征* *將數(shù)據(jù)表示為患者數(shù)量(百分比)或平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差； DAA與抗生素相關(guān)的腹瀉；PPI質(zhì)子泵抑制劑 §包括尿道感染、皮膚和軟組織感染；&包括青霉素類和頭孢菌素類；

8個(gè)缺少的結(jié)果(安慰劑組n＝2，乳桿菌屬組n＝6) 表IIDAA的發(fā)病率和嚴(yán)重程度以及住院治療持續(xù)時(shí)間* *將數(shù)據(jù)表示為患者數(shù)量(百分比)、平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差或中位數(shù)(四分位數(shù)間距)

乳桿菌屬組中的2個(gè)缺少的結(jié)果 表III研究過程中報(bào)道的不良作用* *對(duì)每個(gè)變量而言，在兩組之間未檢測(cè)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
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權(quán)利要求
1.預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物腹瀉的組合物，其特征在于它包含有效量的至少一種乳酸菌菌株和藥物上可接受的載體。
2.權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于所述的乳酸菌菌株選自嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌及其混合物組成的組。
3.權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述的乳酸菌菌株屬于乳桿菌屬。
4.權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于所述的嗜酸乳桿菌菌株至少為寄存在CNCM的菌株I-1492。
5.權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于在每單位該組合物中，包含至少約500億個(gè)在冷藏條件下長達(dá)約120天的活的和活性的嗜酸乳桿菌菌株微生物的群體，其中至少約80％的所述微生物屬于寄存在CNCM的嗜酸乳桿菌I-1492。
6.權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于所述的腹瀉與抗生素相關(guān)。
7.權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于所述的腹瀉因艱難梭菌感染導(dǎo)致。
8.權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于所述的哺乳動(dòng)物為人。
9.權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述的組合物的應(yīng)用，其特征在于它用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物腹瀉。
10.權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腹瀉與抗生素相關(guān)。
11.權(quán)利要求9或10所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腹瀉因艱難梭菌感染導(dǎo)致。
12.權(quán)利要求9-11中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述的哺乳動(dòng)物為人。
13.乳酸菌菌株在制備指定用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物腹瀉的組合物的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于所述的乳酸菌菌株屬于乳桿菌屬。
15.權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其特征在于所述的乳酸菌菌株屬于嗜酸乳桿菌和/或干酪乳桿菌的種類。
16.權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其特征在于所述的乳酸菌菌株為寄存在CNCM的菌株I-1492。
17.權(quán)利要求13-16中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腹瀉與抗生素相關(guān)。
18.權(quán)利要求13-17中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腹瀉因艱難梭菌感染導(dǎo)致。
19.權(quán)利要求17-18中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述的哺乳動(dòng)物為人。
20.預(yù)防或治療腹瀉的方法，其特征在于它包括對(duì)哺乳動(dòng)物給予有效量的權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)的乳酸菌組合物的步驟。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述的給予為口服給予。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于所述的口服給予為49g/天乳酸菌組合物兩(2)天和兩(2)天后98g/天。
23.用于預(yù)防或治療腹瀉的藥盒，其特征在于它至少包括含有如權(quán)利要求1-8中所述的組合物的容器。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療腹瀉，諸如與抗生素相關(guān)的腹瀉或“旅游腹瀉”的乳酸菌組合物。本發(fā)明的組合物至少含有選自嗜酸乳桿菌、嗜酸乳桿菌I－1492、干酪乳桿菌及其混合物組成的組的細(xì)菌菌株。
文檔編號(hào)A61P1/12GK101076346SQ200580024179
公開日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2005年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月18日
發(fā)明者F-M·呂凱 申請(qǐng)人:生物K+國際公司