一種伯克霍爾德氏菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物領域，具體公開了一種伯克霍爾德氏菌。本發(fā)明所述伯克霍爾德氏菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.7980。本發(fā)明所述伯克霍爾德氏菌可以穩(wěn)定定殖在土壤中，其微生物肥料能夠改善土壤微生物環(huán)境，消除連作生物障礙，并對尖孢鐮刀菌具有明顯抑制作用，而且可促進香草蘭的生長，可應用于防治尖孢鐮刀菌和促進香草蘭生長中。
【專利說明】一種伯克霍爾德氏菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領域，更具體的說是涉及一種伯克霍爾德氏菌及其應用。
【背景技術】
[0002]香草蘭(Vanilla planifolia Andrews)是蘭科熱帶藤本香料植物,有“天然食品香料之王”的美譽。其鮮豆莢經過生香加工后含有250多種芳香成分，香氣獨特，被廣泛用于調制各種高級香煙、名酒、茶葉，是各類高檔食品和飲料的配香原料，在國際市場上供不應求。
[0003]由于香草蘭對氣候條件要求較高，目前我國香草蘭種植區(qū)主要分布在海南省，但海南省降水充沛，淋溶作用強烈，土壤酸度較高，土壤中鐵，鋁與磷形成難溶性的鐵磷和鋁磷，甚至有效性更低的閉蓄態(tài)磷，使土壤磷和施入土壤中的肥料磷絕大部分轉化為固定態(tài)磷，導致絕大部分的酸性土壤嚴重缺磷，致使香草蘭長勢較差。另外，香草蘭為多年生作物，隨著種植年限的增加，土壤微生物區(qū)系失調，土傳病原菌的數(shù)量明顯增加，土壤微生物多樣性趨于簡單，為降低病原菌數(shù)量，生產中大量使用農藥，導致生產成本增加、農民負擔加重，豆莢品質下降，生態(tài)環(huán)境嚴重污染。目前，土壤養(yǎng)分缺乏和土壤微生物區(qū)系失衡已經成為制約香草蘭規(guī)模化種植的主要因素，也是亟待解決的瓶頸問題。

【發(fā)明內容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種伯克霍爾德氏菌，使得該菌株的微生物肥料對尖孢鐮刀菌具有明顯抑制作用，且能夠促進香草蘭的生長和在土壤中穩(wěn)定定殖。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種從20年園齡香草蘭種植園中長勢較好的根際土壤中分離得到的菌株，命`名為菌株V-29，篩選分離方法如下:
[0006]選擇20年園齡香草蘭種植園中長勢較好的根際土壤，樣品帶回實驗室稀釋涂布、培養(yǎng)。挑選在NBRIP選擇性培養(yǎng)基上有明顯解磷圈的菌株，再通過盆栽試驗最終復篩出高效促生菌V-29。通過16S rDNA方法(其16S rDNA如SEQ ID NO: 1所示)鑒定菌種為伯克霍爾德氏菌。該菌株可解磷，在以淀粉、牛肉膏為唯一碳、氮源的條件下生長良好。
[0007]V-29可溶解難于被作物吸收利用的磷，施用該菌液或微生物肥料可減少化學磷肥施用量，在制成的微生物有機肥料產品中無需添加任何含磷化肥，使用本產品后能使作物順利度過苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤后生物有效性較差。
[0008]本發(fā)明所述伯克霍爾德氏菌已于2013年8月3日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.7980。
[0009]本發(fā)明還提供所述伯克霍爾德氏菌在制備防治尖孢鐮刀菌和促進香草蘭生長的微生物肥料中的應用。
[0010]當本發(fā)明所述伯克霍爾德氏菌應用到微生物肥料的制備中時，所述微生物肥料，由保藏編號為CGMCC N0.7980的伯克霍爾德氏菌以及牲畜家禽糞便經固體發(fā)酵獲得。作為優(yōu)選，所述牲畜家禽糞便為牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物，更優(yōu)選的，所述牲畜家禽糞便為腐熟后的牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物。最優(yōu)選的，所述腐熟的各牲畜家禽糞便中，有機質質量比含量> 35%，有機氮質量比含量為1.0%-2.0%，含水量質量比為25%-30%。
[0011]所述微生物肥料制備方法包括以下步驟:
[0012]步驟1、將保藏編號為CGMCC N0.7980的伯克霍爾德氏菌接種于pH值為6_8的NA液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，離心菌體，用無菌水重懸，再離心，用等體積的無菌水懸浮后獲得菌懸液；
[0013]步驟2、將菌懸液接種到牲畜家禽糞便中進行固體發(fā)酵至所述伯克霍爾德氏菌數(shù)量達到108cfu/g以上，期間固體發(fā)酵溫度不高于50°C，獲得微生物菌肥。
[0014]其中，作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)條件為28°C -35°C，振蕩速度為160-220轉/min，培養(yǎng)時間為24h-48h，最優(yōu)選為36h。作為優(yōu)選，所述ΝΑ液體培養(yǎng)基配方為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，余量為水。
[0015]作為優(yōu)選，所述牲畜家禽糞便為牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物，更優(yōu)選的，所述牲畜家禽糞便為腐熟后的牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物。最優(yōu)選的，所述腐熟的各牲畜家禽糞便中，有機質質量比含量>35%，有機氮質量比含量為1.0%-2.0%，含水量質量比為25%-30%。
[0016]作為優(yōu)選，所述菌懸液和牲畜家禽糞便的體積質量比為lmL-2mL:10g。
[0017]作為所述微生物肥料制備的優(yōu)選方案，還包括步驟3:
[0018]將所述微生物菌肥進行后熟3-5天，最后在溫度45°C -60°C將其含水量蒸發(fā)至30%以下。
[0019]本發(fā)明所述微生物肥料除了能夠明顯抑制尖孢鐮刀菌外，還能夠促進香草蘭的生長，如提高香草蘭根系干重、莖干重、葉片干重、根系直徑、根系總體積等。同時施用含有107cfu/g數(shù)量伯克霍爾德氏菌的微生物肥料5個月后，其在土壤中的數(shù)量仍保持在106cfu/g以上，充分表明本發(fā)明所述微生物肥料可以穩(wěn)定定殖在土壤中，改善土壤微生物環(huán)境。
[0020]由以上技術方案可知，本發(fā)明所述伯克霍爾德氏菌可以穩(wěn)定定殖在土壤中，其微生物肥料能夠改善土壤微生物環(huán)境，消除連作生物障礙，并對尖孢鐮刀菌具有明顯抑制作用，而且可促進香草蘭的生長，可應用于防治尖孢鐮刀菌和促進香草蘭生長中。
[0021]生物保藏說明
[0022]分類命名:伯克霍爾德氏菌, Burkholderia stabilis.于2013年8月3日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.7980。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1所示為不同處理對香草蘭植株地上部及根系干重的影響的柱形圖，每個柱形圖所代表的含義參見圖1圖例，柱形圖上a、b、c、be字母表示差異顯著程度；
[0024]圖2所示為不同處理對香草蘭根系直徑和根系總體積的影響的柱形圖，每個柱形圖所代表的含義參見圖2橫縱坐標標示，柱形圖上a、b、c、be字母表示差異顯著程度；
[0025]圖3所示為不同處理對香草蘭根際土壤尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響的柱形圖，每個柱形圖所代表的含義參見圖3橫縱坐標標示，柱形圖上a、b字母表示差異顯著程度；
[0026]圖4所示為菌株V-29在香草蘭根際土壤定殖情況的柱形圖，每個柱形圖所代表的含義參見圖4橫縱坐標標示，柱形圖上a、b字母表示差異顯著程度。
【具體實施方式】
[0027]本發(fā)明公開了一種伯克霍爾德氏菌及其應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述伯克霍爾德氏菌及其應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
[0028]下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0029]實施例1:本發(fā)明所述伯克霍爾德氏菌的分離和鑒定
[0030]選擇20年園齡香草蘭種植園中長勢較好的根際土壤，樣品帶回實驗室稀釋涂布、培養(yǎng)。挑選在NBRIP選擇性培養(yǎng)基上有明顯解磷圈的菌株，再通過盆栽試驗最終復篩出高效促生菌V-29。通過16S rDNA方法鑒定菌種，該菌株V-29屬于伯克霍爾德氏菌(Burkholderia stabilis),可解磷，在以淀粉、牛肉膏為唯一碳、氮源的條件下生長良好。
[0031]所述伯克霍爾德氏菌已于2013年8月3日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.7980。
[0032]實施例2:本發(fā)明所述微生物肥料的制備
[0033]將保藏編號為CGMCC N0.7980的伯克霍爾德氏菌接種于pH值為6_8的NA液體培養(yǎng)基中，在28 V -35 °C、160-220轉/min轉速下振蕩培養(yǎng)36h，離心菌體，用無菌水重懸，再離心，用等體積的無菌水懸浮后獲得菌懸液；其中，NA液體培養(yǎng)基配方為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，余量為水。
[0034]將菌懸液接種到腐熟后的牛糞中(菌懸液和腐熟牛糞的體積質量比為2mL:10g)進行固體發(fā)酵至所述伯克霍爾德氏菌數(shù)量達到108cfu/g以上，期間固體發(fā)酵溫度不高于50°C，每天翻動1次，獲得微生物菌肥。其中，腐熟的牛糞中有機質質量比含量> 35%，有機氮質量比含量為1.0%-2.0%，含水量質量比為25%-30%。
[0035]將所得到的微生物菌肥進行后熟4天，最后在溫度45°C -60°C將其含水量蒸發(fā)至30%以下。
[0036]經過后熟的微生物肥料含有108cfu/g以上的伯克霍爾德氏菌，總氮磷鉀養(yǎng)分質量比含量為5%-11%，有機質質量比含量為30%-40%。
[0037]實施例3:盆栽試驗
[0038]采集20年園齡、有明顯連作生物障礙的香草蘭種植園土壤做為供試土壤，試驗盆缽采用周轉箱(內尺寸600X420X165mm)，選取長勢一致的健康香草蘭做為供試苗。
[0039]將綠色熒光蛋白分子標記后的菌株V-29接種至2000ml含0.3mg/ml卡那霉素的NA液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)36h,離心菌體,用無菌水重懸,再離心，用等體積的無菌水懸浮后獲的菌懸液；其中，NA液體培養(yǎng)基配方為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，余量為水。[0040]將菌懸液接種到腐熟后的牛糞中(菌懸液和腐熟牛糞的體積質量比為2mL: 10g)進行固體發(fā)酵至所述伯克霍爾德氏菌數(shù)量達到108cfu/g，期間固體發(fā)酵溫度不高于50°C，每天翻動1次，獲得微生物菌肥。其中，腐熟的牛糞中有機質質量比含量> 35%，有機氮質量比含量為1.0%-2.0%，含水量質量比為25%-30%。
[0041]試驗設4個處理:1)對照(CK，施用等量化肥)；2)施用牛糞堆肥(0M，施肥量3%)；3)施用標記菌株V-29菌懸液(V-29，接種濃度為107cfu/g 土);4)施用微生物肥料(ΒΙ0，施肥量3%，V-29接種濃度為107cfu/g 土)。該盆栽試驗每盆栽種1株香草蘭,每處理重復4次，三次獨立試驗，共48盆。
[0042]測定指標:在香草蘭移栽5個月后毀滅性采樣，采用根系掃描儀測定根系形態(tài)；植株地上部及根系干重；根際土壤標記菌株V-29及尖孢鐮刀菌數(shù)量。結果分別見圖1-圖3。
[0043]由圖1可知，施用微生物肥料的處理香草蘭根系干重和莖干重均顯著高于其他處理。
[0044]由圖2可知，施用微生物肥料的處理根系直徑和根系總體積均顯著高于其他處理，這說明施用微生物肥料可促進香草蘭根系生長。另外，施用牛糞的處理根系直徑和總體積顯著低于施用生物有機肥的處理，表明施用生物有機肥改善香草蘭根系生長狀況顯著好于施用牛糞。
[0045]由圖3可知，施用微生物肥料的處理香草蘭根際土壤尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著低于其他的處理，另外，其他處理之間差異不顯著。表明施用微生物肥料可顯著抑制香草蘭根際土壤有害真菌尖孢鐮刀菌的 生長，降低其在根際土壤數(shù)量。
[0046]由圖4可知，施用V-29菌液或其微生物肥料5個月后，V_29在土壤中的濃度分別在105cfu/g及106cfu/g以上，而在對照及施用牛糞堆肥的處理中并未檢測到該菌株，這說明V-29可在土壤中穩(wěn)定定殖，利于香草蘭生長及改善土壤微生物環(huán)境。并且，施用微生物有機肥的處理V-29在根際土壤的數(shù)量顯著高于單獨施用菌液的處理，這表明微生物有機肥可為促生菌V-29提供豐富的碳、氮源，更利于其在土壤中存活。
[0047]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種伯克霍爾德氏菌，保藏編號為CGMCC N0.7980。
2.根據權利要求1所述伯克霍爾德氏菌，其特征在于，16SrDNA如SEQ ID NO: 1所示。
3.權利要求1所述伯克霍爾德氏菌在制備防治尖孢鐮刀菌和促進香草蘭生長的微生物肥料中的應用。
4.一種微生物肥料，其特征在于，由保藏編號為CGMCC N0.7980的伯克霍爾德氏菌以及牲畜家禽糞便經固體發(fā)酵獲得。
5.一種微生物肥料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:步驟1、將保藏編號為CGMCC N0.7980的伯克霍爾德氏菌接種于pH值為6_8的NA液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，離心菌體，用無菌水重懸，再離心，用等體積的無菌水懸浮后獲得菌懸液； 步驟2、將菌懸液接種到牲畜家禽糞便中進行固體發(fā)酵至所述伯克霍爾德氏菌數(shù)量達到108cfu/g以上，期間固體發(fā)酵溫度不高于50°C，獲得微生物菌肥。
6.根據權利要求5所述制備方法，其特征在于，還包括步驟3:將所述微生物菌肥進行后熟3-5天，最后在溫度45°C -60°C將其含水量蒸發(fā)至30%以下。
7.根據權利要求5所述制備方法，其特征在于，所述牲畜家禽糞便為牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物。
8.根據權利要求7所述制備方法，其特征在于，所述牲畜家禽糞便為腐熟后的牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物。
9.根據權利要求5所述制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)條件為28°C_35°C，振蕩速度為160-220轉/min，培養(yǎng)時間為24h_48h。
10.根據權利要求5所述制備方法，其特征在于，所述ΝΑ液體培養(yǎng)基配方為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，余量為水。
【文檔編號】C12N1/20GK103642742SQ201310739463
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權日:2013年12月27日
【發(fā)明者】趙青云, 王 華, 莊輝發(fā), 趙秋芳, 王輝, 宋應輝, 朱自慧 申請人:中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所