用于豬瘟病毒檢測的重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于豬瘟病毒檢測的重組蛋白，由抗人紅細(xì)胞表面H抗原單鏈抗體基因和抗豬瘟病毒E2囊膜糖蛋白單鏈抗體基因拼接而成的融合基因所編碼。該重組蛋白具有雙功能特性，它既能夠與人紅細(xì)胞結(jié)合但不會發(fā)生凝集，又能夠與豬瘟病毒結(jié)合，在病毒橋聯(lián)作用下發(fā)生肉眼可觀察到的凝集現(xiàn)象。本發(fā)明獲得的重組蛋白可用于豬瘟病毒的檢測，操作簡單、靈敏度高且特異性強，滿足了基層現(xiàn)場使用快速、簡便的要求。
【專利說明】用于豬瘟病毒檢測的重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于重組蛋白【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于豬瘟病毒檢測的重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬瘟(Classical Swine Fever, CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的高度接觸性傳染病，世界動物衛(wèi)生組織(OIE )將其列為A類傳染病，也是我國計劃要消滅的重大動物疫病之一。豬瘟等動物疫病一直是阻礙我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要因素，每年造成的直接經(jīng)濟損失達(dá)百億元，因豬瘟的存在影響生豬及其產(chǎn)品出口造成的經(jīng)濟損失更是無法估量。
[0003]及時、準(zhǔn)確的對CSFV進行檢測，是診斷、預(yù)防和控制CSF的前提。目前CSFV的檢測技術(shù)包括易感動物攻毒試驗、兔體交互免疫試驗、ELISA抗原捕獲法、免疫突光試驗、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、核酸探針技術(shù)和基因芯片技術(shù)等，但是這些檢測方法要求較高，需要配備專門的儀器和專業(yè)技術(shù)人員，檢測成本昂貴，而且耗時相對較長，這極大地限制了其在基層單位的應(yīng)用。我國仍然以農(nóng)村中小規(guī)模豬場為主體，這些豬場由于受經(jīng)濟、技術(shù)條件的限制，無法建立自己的檢測實驗室，因此急需建立一種快速、簡便、成本低，不需要特殊儀器設(shè)備，適合基層和現(xiàn)場使用的CSFV檢測試劑和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技 術(shù)問題是提供一種用于豬瘟病毒檢測的重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用，以便于實現(xiàn)基層現(xiàn)場快速、簡便檢測CSFV的目的。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:用于豬瘟病毒檢測的重組蛋白，由抗人紅細(xì)胞表面H抗原單鏈抗體基因和抗豬瘟病毒E2囊膜糖蛋白單鏈抗體基因拼接而成的融合基因所編碼。
[0006]融合基因具有序列表SEQ.1D.N0.1的喊基序列。
[0007]上述重組蛋白，具有序列表SEQ.1D.N0.2的氨基酸序列。
[0008]上述重組蛋白的制備方法，包括以下步驟:
[0009]〈1>分別從分泌抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體和抗豬瘟病毒E2囊膜糖蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA作為RT-PCR反應(yīng)的模板，擴增出重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因；
[0010]<2>采用SOE-PCR方法將步驟〈1>獲得的兩組重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因分別拼接成單鏈抗體基因；
[0011]<3>將步驟〈2>獲得的兩個單鏈抗體基因通過SOE-PCR方法拼接成融合基因；
[0012]<4>將步驟〈3>獲得的融合基因插入到原核表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株，在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)出重組蛋白。[0013]步驟〈2>中的單鏈抗體基因是在重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因之間插入一段Linker連接序列而得，Linker連接序列具有序列表SEQ.1D.N0.3的堿基序列。
[0014]步驟〈3>中的兩個單鏈抗體基因分別具有序列表SEQ.1D.N0.4和SEQ.1D.N0.5的喊基序列，融合基因具有序列表SEQ.1D.N0.1的喊基序列。
[0015]上述制備方法，還包括以下步驟:
[0016]<5>將步驟〈4>獲得的重組蛋白經(jīng)純化、復(fù)性后得具有生物學(xué)活性的重組蛋白。
[0017]上述重組蛋白在制備檢測豬瘟病毒試劑方面的應(yīng)用。
[0018]1988年，Kemp等首先報道了建立檢測HIV抗體的自體紅細(xì)胞凝集試驗快速檢測方法，只需采集待檢人一滴血，5min內(nèi)即可得到結(jié)果，操作程序簡單，目測診斷結(jié)果，無需昂貴的特殊儀器和專門技術(shù)人員。其基本原理是:以紅細(xì)胞作為指示劑，利用重組雙功能融合蛋白既能與紅細(xì)胞結(jié)合又能與被檢抗體/抗原結(jié)合的性質(zhì)，通過被檢樣品中抗體/抗原的橋聯(lián)作用，使紅細(xì)胞發(fā)生肉眼可見的凝集，根據(jù)紅細(xì)胞的凝集情況即可快速進行結(jié)果判定。 [0019]基于前述原理，發(fā)明人構(gòu)建了具有雙功能特性的重組蛋白，它既能夠與人紅細(xì)胞結(jié)合但不會發(fā)生凝集，又能夠與豬瘟病毒結(jié)合，在病毒橋聯(lián)作用下發(fā)生肉眼可觀察到的凝集現(xiàn)象。該重組蛋白由抗人紅細(xì)胞表面H抗原單鏈抗體基因和抗豬瘟病毒E2囊膜糖蛋白單鏈抗體基因拼接而成的融合基因所編碼，具體制備按以下操作:分別從分泌抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體和抗豬瘟病毒E2囊膜糖蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA作為RT-PCR反應(yīng)的模板，擴增出重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因，用SOE-PCR方法分別將兩組重鏈、輕鏈可變區(qū)基因拼接成單鏈抗體基因，然后將兩個單鏈抗體基因通過SOE-PCR方法拼接成融合基因，將其經(jīng)克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得重組菌，并按常規(guī)方法誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化、復(fù)性后即得。本發(fā)明獲得的重組蛋白可用于豬瘟病毒的檢測，操作簡單、靈敏度高且特異性強，滿足了基層現(xiàn)場使用快速、簡便的要求。
【具體實施方式】
[0020]一、抗人紅細(xì)胞H抗原單鏈抗體基因的構(gòu)建
[0021]1.抗體可變區(qū)基因的克隆
[0022]1.1引物設(shè)計
[0023]根據(jù)單克隆抗體可變區(qū)基因序列設(shè)計并合成引物(表1)。
[0024]表1單克隆抗體可變區(qū)基因擴增引物
[0025]
引物名稱引物序列mm^
^VH-F S'-AGGTiCGXAOAiAOCTGCAGfCOAGTCXATJGG-a' SKQ.VH-R 5’-TGAGGAGACGCTOACCOTGGTCCCTTGGCCCCAG-y SKa , N(,；, VL-FS-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-B's_.1!).n?.1o
VL-RSt-GTTAGATcTCCAGCTTGGTCCC-Sfseq.m.fc.n
[0026]引物由北京博邁德生物公司合成。其中，引物VH-F、VH-R用于擴增抗體重鏈可變區(qū)基因，引物VL-F、VL-R用于擴增抗體輕鏈可變區(qū)基因。[0027]1.2CDNA 的制備
[0028]在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)分泌抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞(I X IO6),采用TRIzoI法提取細(xì)胞總RNA，再以總RNA為模板，oligo (dT)18為引物，按照反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行反轉(zhuǎn)錄，獲得⑶NA。
[0029]1.3目的基因的擴增
[0030]以⑶NA為模板，用引物VH-F、VH-R擴增抗體重鏈可變區(qū)基因，弓丨物VL_F、VL-R擴增抗體輕鏈可變區(qū)基因。PCR擴增條件均為:95°C預(yù)變性2min ;94°C變性lmin，57°C退火lmin，72°C延伸lmin，進行30個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0
[0031]1.4目的基因的克隆
[0032]用DNA凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定陽性克隆后送生物公司測序。
[0033]2.單鏈抗體基因的構(gòu)建
[0034]2.1引物設(shè)計
[0035]根據(jù)克隆所得到的抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因序列，設(shè)計并合成單鏈抗體基因擴增引物(表2 )。
[0036]表2單鏈抗體基因 擴增引物
【權(quán)利要求】
1.一種用于豬瘟病毒檢測的重組蛋白，其特征在于由抗人紅細(xì)胞表面H抗原單鏈抗體基因和抗豬瘟病毒E2囊膜糖蛋白單鏈抗體基因拼接而成的融合基因所編碼。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛋白，其特征在于:所述融合基因具有序列表SEQ.1D.N0.1的喊基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛋白，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.2的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 〈1>分別從分泌抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體和抗豬瘟病毒E2囊膜糖蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA作為RT-PCR反應(yīng)的模板，擴增出重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因; 〈2>采用SOE-PCR方法將步驟〈1>獲得的兩組重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因分別拼接成單鏈抗體基因； <3>將步驟〈2>獲得的兩個單鏈抗體基因通過SOE-PCR方法拼接成融合基因； <4>將步驟〈3>獲得的融合基因插入到原核表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株，在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)出重組蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟〈2>中的單鏈抗體基因是在重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū) 基因之間插入一段Linker連接序列而得，Linker連接序列具有序列表SEQ.1D.N0.3的喊基序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟〈3>中的兩個單鏈抗體基因分別具有序列表SEQ.1D.N0.4和SEQ.1D.N0.5的喊基序列，融合基因具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于還包括以下步驟: <5>將步驟〈4>獲得的重組蛋白經(jīng)純化、復(fù)性后得具有生物學(xué)活性的重組蛋白。
8.權(quán)利要求1所述重組蛋白在制備檢測豬瘟病毒試劑方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/70GK103694356SQ201310739413
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】吳健敏, 覃紹敏, 劉金鳳, 李作生, 韋建興, 馬玲, 白安斌, 陳鳳蓮, 饒桂波 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所