專利名稱：一種檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)類鼻疽菌感染的試紙及其制備方法，特別涉及一種檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙及其制備方法。
背景技術(shù)：
類鼻疽病(Melioidosis)是由類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderiapseudomallei)感染引起的人獸共患病。類鼻疽菌是重要的生物戰(zhàn)劑，已被列入國(guó)際禁止生物武器公約致病微生物核查清單，“9.11”以后被美國(guó)列入可能用于進(jìn)行生物恐怖活動(dòng)的烈性細(xì)菌。人和動(dòng)物通過(guò)吸入和/或食入類鼻疽菌感染，如得不到及時(shí)治療，可發(fā)展為急性敗血癥，死亡率極高，法越戰(zhàn)爭(zhēng)時(shí)期，法國(guó)侵略者傘兵在越南境內(nèi)跳傘造成外傷者，感染死亡率在90％以上；慢性癥狀可表現(xiàn)為持續(xù)發(fā)熱、傷口不愈、蜂窩組織炎、胸膜積液、肺炎和不愈性咳嗽等。由于類鼻疽病沒(méi)有典型的臨床癥狀，并且急性致死率高，慢性癥狀如沒(méi)有對(duì)應(yīng)的抗菌素治療，很難治愈。因此快速和特異的診斷試驗(yàn)尤其必要。
類鼻疽病一般是根據(jù)流行病學(xué)資料、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室診斷的綜合結(jié)果作為診斷依據(jù)。
類鼻疽疫源地主要分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)，有類鼻疽疫區(qū)生活史、旅行史和野外作業(yè)史，出現(xiàn)原因不明發(fā)熱或化膿性患者，或X-射線檢查表現(xiàn)為肺結(jié)核而又不能查出結(jié)核桿菌的病人，均應(yīng)初步懷疑類鼻疽菌感染。
類鼻疽病根據(jù)其臨床表現(xiàn)可分為急性敗血型、亞急性型和慢性型。急性敗血型潛伏期一般4-5d，病人表現(xiàn)嚴(yán)重寒戰(zhàn)、發(fā)熱、虛脫及呼吸道感染癥狀(咳嗽、膿痰、咯血、胸痛等)、腎衰竭和消化道癥狀，預(yù)后不良，死亡率極高，為最為嚴(yán)重的臨床類型。亞急性型病程數(shù)周至數(shù)月，感染可發(fā)生于各種組織，其中以肺部感染為多，以發(fā)熱、咳嗽和消瘦為特征，X線透視可見(jiàn)肺空洞和浸潤(rùn)，多見(jiàn)于肺上葉。該型可轉(zhuǎn)化為急性敗血型或慢性型。慢性型病程長(zhǎng)達(dá)數(shù)年，慢性類鼻疽病局限于某一器官，受侵最常見(jiàn)肺部，酷似結(jié)核或真菌感染。
臨床樣品中的類鼻疽菌培養(yǎng)和鑒定是重要的診斷方法，一般是從病人的血液、痰、膿、尿或腦髓分離類鼻疽菌，然后進(jìn)行一系列生化和血清學(xué)鑒定。但是從臨床樣品中分離和培養(yǎng)細(xì)菌受到許多限制，如病人是否用藥、實(shí)驗(yàn)室是否具備條件，并且培養(yǎng)和鑒定操作繁鎖，使臨床診斷困難。
血清抗體檢測(cè)是另一個(gè)快速而可靠的類鼻疽病診斷方法，患者感染1周后可出現(xiàn)特異血清抗體，國(guó)內(nèi)外均有臨床診斷應(yīng)用的報(bào)道，常用的抗體檢測(cè)方法有間接血球凝集(IHA)、間接免疫熒光(IFA)和ELISA，這三種試驗(yàn)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)不同，但均有較好的診斷意義。IHA抗體滴度達(dá)1∶80以上判為陽(yáng)性反應(yīng)，即有類鼻疽菌感染，ELISA試驗(yàn)中檢出IgM抗體、或IgG抗體1∶400以上判為陽(yáng)性反應(yīng)。
臨床診斷技術(shù)的發(fā)展方向?yàn)楦?jiǎn)便、更快速，非專業(yè)技術(shù)人員或患者本人在短時(shí)間內(nèi)即可操作解讀。這些技術(shù)中近年來(lái)發(fā)展較快、應(yīng)用較廣的是免疫層析檢測(cè)(Immuno-Chromatographic Assay，ICA)試紙技術(shù)，即金標(biāo)技術(shù)，該技術(shù)是用包被在NC膜上的配對(duì)物(抗原或抗體)進(jìn)行捕捉，然后用免疫膠體金探針檢測(cè)，陽(yáng)性樣品2分鐘后出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀線，該技術(shù)與其它方法比較，優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)過(guò)程中樣品處理簡(jiǎn)單，不需要專門(mén)儀器和人員培訓(xùn)，非專業(yè)技術(shù)人員按照說(shuō)明書(shū)即可操作，并可迅速觀察結(jié)果，很適合突發(fā)事件現(xiàn)場(chǎng)和基層使用。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙(ICA試紙)。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙(ICA試紙)，包括吸水紙墊、緊密連接于所述吸水紙墊上面的纖維膜、緊密連接于所述纖維膜上面的含有金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊和緊密連接于所述金標(biāo)墊上面的樣品墊；所述纖維膜載有相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線為類鼻疽菌多糖抗原，所述質(zhì)控線為可和金黃色葡萄球菌蛋白A結(jié)合的抗體。
為了使用更加方便，所述吸水紙墊的下面還緊密連接有背板。背板的材料可以是多種多樣的，如塑料、樹(shù)脂、PVC板等。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備上述檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙的方法。
本發(fā)明所提供的制備上述檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)制備類鼻疽菌多糖抗原；用0.01M pH7.2的磷酸緩沖液(PB)將該抗原和可與金黃色葡萄球菌蛋白A結(jié)合的抗體分別稀釋至2-4mg/ml和1-4mg/ml，然后分別噴于纖維膜上形成相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線，37℃干燥2-4小時(shí)，然后將其粘貼在吸水紙墊上；2)制備金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記膠體金探針；將該探針溶于0.25-0.4％四硼酸鈉溶液中，使其終濃度為5-10％，然后將玻璃纖維膜、樹(shù)脂浸入上述探針溶液中，得到金標(biāo)墊，在-20℃--50℃冰凍5-8小時(shí)后，冷凍抽干后將其粘貼在步驟1)中得到的粘貼于吸水紙墊上面的噴有相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線的纖維膜上面；3)在步驟2)中的金標(biāo)墊上面再粘貼樣品墊，得到檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙。
為了使用更加方便，所述吸水紙墊的下面還粘貼有背板。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙及其制備方法中，所述類鼻疽菌多糖抗原可按下述方法制備將類鼻疽伯克霍爾德氏菌接種于4％甘油普通瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24-48h，用無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔，流通蒸汽1h-2h，冷卻至室溫后5000-8000rpm離心10-15min，上清即為類鼻疽菌多糖抗原；所述金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)標(biāo)記膠體金探針，可按下述方法制備用水溶解氯金酸使其終濃度為0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液進(jìn)行以下操作加入1％的檸檬酸三鈉水溶液1.6ml，繼續(xù)煮沸10-15分鐘，用水恢復(fù)至100ml，冷卻至室溫后用K2CO3調(diào)pH至6-7，攪拌加入SPA 0.7-1.0mg，10min-30min后加入10％的聚乙二醇(20000)2ml，繼續(xù)攪拌20min-30min，9000rpm-15000rpm離心25min-35min，棄上清，沉淀即為SPA標(biāo)記膠體金探針；所述纖維膜可為硝酸纖維膜、醋酸纖維膜；所述金標(biāo)墊的材料可為玻璃纖維膜、樹(shù)脂等；所述可和金黃色葡萄球菌蛋白A結(jié)合的抗體可為羊、兔、豚鼠、豬、小鼠、猴等IgG。
其中，調(diào)節(jié)pH值的K2CO3的濃度可為0.1M-0.3M，優(yōu)選為0.2M。
在實(shí)際應(yīng)用中，所述纖維膜的厚度可為2.5-3mm；所述金標(biāo)墊的厚度可為30-70mm；所述樣品墊的厚度可為0.1-0.2mm。
本發(fā)明的檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙與ELISA方法檢測(cè)原理相同，檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙是將類鼻疽菌多糖包被在NC膜上，用于捕捉血清中類鼻疽抗體，然后用標(biāo)記了SPA的免疫膠體金探針檢測(cè)；陽(yáng)性血清樣品類鼻疽抗體(IgG和IgM)的Fc端與金顆粒上的SPA結(jié)合，F(xiàn)ab端與NC膜上的類鼻疽多糖結(jié)合，層析2分鐘后出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀線。
實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙?zhí)禺愋詮?qiáng)、敏感、簡(jiǎn)便、快速，與IHA和ELISA相比，更適合于臨床、突發(fā)事件以及基層的類鼻疽病診斷。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙的制備材料氯金酸(HAuCl4.4H2O)，分析純，上海試劑一廠；檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H2O)，分析純，北京化工廠；碳酸鉀(K2CO3)，分析純，北京化工廠；
金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)，購(gòu)于Amersham Pharmacia Biotech公司；類鼻疽菌株，(中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，350102)；羊抗人IgG(提取人的IgG免疫羊獲得，具體方法見(jiàn)《免疫化學(xué)研究進(jìn)展》，李成文著，中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1993年)；類鼻疽陽(yáng)性兔血清，(類鼻疽菌多糖抗原免疫家兔獲得，具體方法見(jiàn)《免疫化學(xué)研究進(jìn)展》，李成文著，中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1993年)。
正常兔血清，類鼻疽陽(yáng)性豬血清，正常豬血清，類鼻疽陽(yáng)性人血清，正常人血清，按常規(guī)方法分離保存；1、類鼻疽菌多糖抗原的制備將類鼻疽伯克霍爾德氏菌350102接種于4％甘油普通瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h，用無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔，菌懸液約為比濁濃度(1×108個(gè)菌/ml)，流通蒸汽1h，冷卻至室溫后8000rpm離心15min，上清即為類鼻疽菌多糖抗原，收集上清備用。
2、金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)膠體金探針的制備用純水溶解氯金酸使其終濃度為0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液進(jìn)行以下操作加入1％的檸檬酸三鈉水溶液1.6ml，繼續(xù)煮沸10分鐘，用純水恢復(fù)原體積(100ml)，冷卻至室溫后用0.2M K2CO3調(diào)pH6，磁力攪拌下加入SPA 0.7mg，15min后加入10％的聚乙二醇20000 2ml，繼續(xù)攪拌30min，15000rpm離心35min，棄上清，沉淀即為SPA標(biāo)記膠體金探針，用0.25％四硼酸鈉保存液恢復(fù)至原體積的十分之一，即10ml，4C冰箱保存。
3、檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙的制備檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙由吸水紙墊、硝酸纖維膜、金標(biāo)墊和玻璃纖維膜樣品墊四部分組成。
分別用0.01M pH7.2磷酸緩沖液稀釋步驟1中制備的類鼻疽菌多糖抗原至2mg/ml和羊抗人IgG至2.5mg/ml，用BIODOT公司XYZ3000噴膜機(jī)分別噴于2.5mm厚硝酸纖維素膜上，形成相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線，37℃干燥2.5h，然后將其用雙面膠粘貼在吸水紙墊上；將50mm厚的玻璃纖維膜浸于步驟2中制備的SPA標(biāo)記膠體金探針液中制備成金標(biāo)墊，冷凍干燥機(jī)抽干后備用；將該金標(biāo)墊用雙面膠粘貼在上述具有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維膜上，再在該金標(biāo)墊上面用雙面膠粘貼0.15mm厚的玻璃纖維膜樣品墊，最后將它們用雙面膠粘貼在塑料背板上，按所需大小切割，即為檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙，加干燥劑后密封保存。
實(shí)施例2、檢測(cè)臨床血清樣品將待檢人或動(dòng)物血清樣品用生理鹽水按1∶40稀釋，取實(shí)施例1中制備的檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙1條，浸入經(jīng)上述稀釋的血清樣品中，2min后開(kāi)始觀察結(jié)果，15min觀察終止。以血清效價(jià)1∶40以上為陽(yáng)性診斷標(biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)1條紅色(對(duì)照)沉淀線，為類鼻疽血清學(xué)診斷陰性，即無(wú)類鼻疽菌感染；出現(xiàn)2條紅色(樣品和對(duì)照)沉淀線，為類鼻疽血清學(xué)診斷陽(yáng)性，即有類鼻疽菌感染。
檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙檢測(cè)動(dòng)物血清樣品結(jié)果如表1所示，表明檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙與IHA在檢測(cè)動(dòng)物血清樣品中具有較好的一致性，1號(hào)兔血清為免疫血清，因此在IHA和ICA中均具有較高的抗體效價(jià)，2號(hào)和3號(hào)為正常兔血清，在IHA和ICA中全部為陰性；1-4號(hào)豬血清收集自然疫源地流行病調(diào)查中無(wú)癥狀隱性感染豬，在IHA和ICA中均具有抗體效價(jià)，5-13號(hào)豬血清收集自非疫源地；正常豬，在IHA和ICA中全部為陰性。
檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙檢測(cè)人血清結(jié)果如表2所示，表明1-6號(hào)人血清(來(lái)自臨床經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)診斷為類鼻疽病患者)，在ELISA和ICA中均具有較高的抗體效價(jià)；7-26號(hào)人血清來(lái)自與上述類鼻疽病患者同一地區(qū)的正常體檢人群，在ELISA和ICA中全部為陰性。結(jié)果說(shuō)明檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙與ELISA在檢測(cè)人血清樣品中也具有較好的一致性，因?yàn)檫@些人血清來(lái)自同一地區(qū)的類鼻疽病患者和正常人，用于檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙?zhí)禺愋栽u(píng)價(jià)，具有良好的可比性。
表1.檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙檢測(cè)動(dòng)物血清樣品樣品(編號(hào)) IHA效價(jià) ICA效價(jià) 樣品(編號(hào)) IHA效價(jià)ICA效價(jià)兔血清(1)1∶2560 1∶20000豬血清(6) - -兔血清(2)- - 豬血清(7) - -兔血清(3)- - 豬血清(8) - -豬血清(1)1∶40 1∶1000 豬血清(9) - -豬血清(2)1∶1601∶1000 豬血清(10) - -豬血清(3)1∶80 1∶1000 豬血清(11) - -豬血清(4)1∶6401∶5000 豬血清(12) - -豬血清(5)- - 豬血清(13) - -
表2.檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙檢測(cè)人血清樣品樣品編號(hào) ELISA效價(jià) ICA效價(jià)樣品編號(hào) ELISA效價(jià)ICA效價(jià)11∶32001∶800014--21∶25600 1∶80000 15--31∶32001∶10000 16--41∶16001∶200017--51∶64001∶20000 18--61∶400 1∶100019--7- - 20--9- - 22--10 - - 23--11 - - 24--12 - - 25--13 - - 26--
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙，包括吸水紙墊、緊密連接于所述吸水紙墊上面的纖維膜、緊密連接于所述纖維膜上面的含有金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊和緊密連接于所述金標(biāo)墊上面的樣品墊；所述纖維膜載有相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線為類鼻疽菌多糖抗原，所述質(zhì)控線為可和金黃色葡萄球菌蛋白A結(jié)合的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙，其特征在于所述吸水紙墊的下面還緊密連接有背板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙，其特征在于所述類鼻疽菌多糖抗原可按下述方法制備將類鼻疽伯克霍爾德氏菌接種于4％甘油普通瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24-48h，用無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔，流通蒸汽1-2h，冷卻至室溫后5000-8000rpm離心10-15min，上清即為類鼻疽菌多糖抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙，其特征在于所述金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記膠體金探針，可按下述方法制備用水溶解氯金酸使其終濃度為0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液進(jìn)行以下操作加入1％的檸檬酸三鈉水溶液1.6ml，繼續(xù)煮沸10-15分鐘，用純水恢復(fù)至100ml，冷卻至室溫后用K2CO3調(diào)pH至6-7，攪拌加入SPA 0.7-1.0mg，10-30min后加入10％的聚乙二醇(20000)2ml，繼續(xù)攪拌20-30min，9000rpm-15000rpm，離心25min-35min，棄上清，沉淀即為SPA標(biāo)記膠體金探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙，其特征在于所述纖維膜為硝酸纖維膜、醋酸纖維膜；所述金標(biāo)墊的材料為玻璃纖維膜、樹(shù)脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙，其特征在于所述可和金黃色葡萄球菌蛋白A結(jié)合的抗體為羊、兔、豚鼠、豬、小鼠、猴IgG。
7.一種制備檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)制備類鼻疽菌多糖抗原；用0.01M pH7.2的磷酸緩沖液將該抗原和可與金黃色葡萄球菌蛋白A結(jié)合的抗體分別稀釋至2-4mg/ml和1-4mg/ml，然后分別噴于纖維膜上形成相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線，37℃干燥2-4小時(shí)，然后將其粘貼在吸水紙墊上；2)制備金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記膠體金探針；將該探針溶于0.25％-0.4％四硼酸鈉溶液中，使其終濃度為5％-10％，然后將玻璃纖維膜、樹(shù)脂浸入上述探針溶液中，得到金標(biāo)墊，在-20℃--50℃干燥5-8小時(shí)后，將其粘貼在步驟1)中得到的粘貼于吸水紙墊上面的噴有相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線的纖維膜上面；3)在步驟2)中的金標(biāo)墊上面再粘貼樣品墊，得到檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述吸水紙墊的下面還粘貼有背板。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述類鼻疽菌多糖抗原可按下述方法制備將類鼻疽伯克霍爾德氏菌接種于4％甘油普通瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24-48h，用無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔，流通蒸汽1-2h，冷卻至室溫后5000-8000rpm離心10-15min，上清即為類鼻疽菌多糖抗原；所述金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記膠體金探針，可按下述方法制備用水溶解氯金酸使其終濃度為0.01％，煮沸后每100ml氯金酸溶液進(jìn)行以下操作加入1％的檸檬酸三鈉水溶液1.6ml，繼續(xù)煮沸10-15分鐘，用純水恢復(fù)至100ml，冷卻至室溫后用K2CO3調(diào)pH至6-7，攪拌加入SPA 0.7-1.0mg，10-30min后加入10％的聚乙二醇(20000)2ml，繼續(xù)攪拌20-30min，9000rpm-15000rpm，離心25min-35min，棄上清，沉淀即為SPA標(biāo)記膠體金探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述纖維膜為硝酸纖維膜、醋酸纖維膜；所述金標(biāo)墊的材料為玻璃纖維膜、樹(shù)脂；所述可和金黃色葡萄球菌蛋白A結(jié)合的抗體為羊、兔、豚鼠、豬、小鼠、猴IgG。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙及其制備方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙，包括吸水紙墊、緊密連接于所述吸水紙墊上面的纖維膜、緊密連接于所述纖維膜上面的含有金黃色葡萄球菌蛋白A標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊和緊密連接于所述金標(biāo)墊上面的樣品墊；所述纖維膜載有相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線為類鼻疽菌多糖抗原，所述質(zhì)控線為可和金黃色葡萄球菌蛋白A結(jié)合的抗體。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的檢測(cè)類鼻疽菌感染的免疫層析試紙?zhí)禺愋詮?qiáng)、敏感、簡(jiǎn)便、快速，與IHA和ELISA相比，更適合于臨床、突發(fā)事件以及基層的類鼻疽病診斷。
文檔編號(hào)G01N33/558GK1632584SQ20041003076
公開(kāi)日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2004年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月2日
發(fā)明者端青, 檀華, 何君, 朱虹 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所