專(zhuān)利名稱(chēng)：應(yīng)用硫酸多糖治療出血障礙的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括先天性凝血功能障礙、后天性凝血功能障礙以及創(chuàng)傷引發(fā)的出血病癥在內(nèi)的出血障礙的治療。特別是，本發(fā)明涉及在血友病中用非抗凝血的硫酸多糖(NASP)以改善凝血并止血。
背景正常的血液凝固是一種復(fù)雜的生理和生化過(guò)程，涉及凝血因子級(jí)聯(lián)系統(tǒng)活化，在局部血管收縮的同時(shí)引起血纖蛋白形成和血小板聚集(Davie等，Biochemistry 3010363，1991評(píng)論)。凝血級(jí)聯(lián)由被認(rèn)為是啟動(dòng)正常凝血的主要方式的“外源性”途徑和有助于擴(kuò)大凝血響應(yīng)的“內(nèi)源性”途徑組成。對(duì)出血性創(chuàng)傷正常的響應(yīng)包括外源性途徑的活化。當(dāng)血液與一種創(chuàng)傷后暴露于或表達(dá)在組織上的凝血因子VII的輔因子——組織因子(TF)接觸時(shí)，啟動(dòng)外源性途徑的活化。TF與FVII形成復(fù)合物，以促進(jìn)FVIIa的產(chǎn)生。然后，F(xiàn)VIIa與TF結(jié)合，將FX轉(zhuǎn)化為絲氨酸蛋白酶Fxa，其為凝血酶原酶復(fù)合物的關(guān)鍵組分。通過(guò)FXa/FVa/鈣/磷脂復(fù)合物將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，刺激了血纖蛋白的形成和血小板的活化，這一切都是正常凝血所必需的。此外，通過(guò)內(nèi)源性途徑因子IXa和VIIIa進(jìn)一步增強(qiáng)了正常止血，其也是將FX轉(zhuǎn)化為Fxa。
出血障礙中的凝血不充分，這可能是由先天性凝血功能障礙、后天性凝血功能障礙或創(chuàng)傷引發(fā)的出血病癥所引起。出血是一種最嚴(yán)重的且表現(xiàn)明顯的疾病，可從局部發(fā)生或延及全身。局部性出血與損傷相關(guān)，且因有缺陷的止血機(jī)制而進(jìn)一步復(fù)雜化。任何凝血因子先天性或后天性的缺乏都伴隨著出血傾向。先天性凝血功能障礙包括血友病，其是一種包括凝血因子VIII缺乏(血友病A)或凝血因子IX缺乏(血友病B)和血管性血友病(von Willebrands disease)在內(nèi)的隱性X-連鎖疾病。其中的血管性血友病是一種包括重度血管性血友病因子缺乏在內(nèi)的罕見(jiàn)的出血障礙。由于疾病過(guò)程，后天性凝血功能障礙可在無(wú)既往出血史的個(gè)體中出現(xiàn)。例如，后天性凝血功能障礙可由凝血因子抑制劑或抗凝血因子的自身免疫所引起，所述凝血因子例如凝血因子VIII、血管性血友病因子、凝血因子IX、V、XI、XII和XIII；或由諸如肝病引發(fā)的止血障礙所引起，其與合成的凝血因子減少相關(guān)。通常，凝血因子缺乏是通過(guò)因子置換來(lái)治療，其昂貴、不便(靜脈注射)，且不一定總是有效。有20％的接受長(zhǎng)期凝血因子置換療法的患者可能產(chǎn)生抗置換因子的中和抗體。
因此，需要有新的療法用于治療出血障礙。適用于眾多出血障礙的安全、便利且有效的單一藥劑將有利地影響著臨床實(shí)踐。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了使用非抗凝血的硫酸多糖(NASPs)作為促凝血?jiǎng)?、治療出血障礙的方法和組合物。NASPs可作為單一藥劑給藥，或與另一種NASPs或其它的止血?jiǎng)┞?lián)合給藥。特別是，本文描述了NASPs在治療包括先天性凝血功能障礙，后天性凝血功能障礙，以及創(chuàng)傷引起的出血病癥的出血障礙中的應(yīng)用。
在一方面，本發(fā)明提供了一種治療需要增強(qiáng)凝血的受治療者的方法，該方法包括給予所述受治療者治療有效量的含有非抗凝血的硫酸多糖(NASP)的組合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療具有出血障礙的受治療者的方法，該方法包括給予所述受治療者治療有效量的含有NASP的組合物。在某些實(shí)施方案中，NASP選自由N-乙?；?肝素(NAH)、N-乙?；?脫-O-硫酸化肝素(NA-de-o-SH)、脫-N-硫酸化肝素(De-NSH)、脫-N-硫酸化乙酰化肝素(De-NSAH)、高碘酸氧化肝素(POH)、化學(xué)硫酸化海帶多糖(CSL)、化學(xué)硫酸化褐藻酸(CSAA)、化學(xué)硫酸化果膠(CSP)、硫酸葡聚糖(DXS)、肝素衍生的寡糖(HDO)、戊聚糖多硫酸酯(PPS)和巖藻依聚糖組成的組。
在其它實(shí)施方案中，NASP選自由先前所列化合物的低分子量片段組成的組。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)在dPT測(cè)定中測(cè)試時(shí)，NASP的片段減少了血液凝血時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述NASP是一種巖藻依聚糖片段，其在dPT測(cè)定中測(cè)試時(shí)減少了血液凝血時(shí)間。
在其它實(shí)施方案中，所述NASP能與一種或多種不同的NASPs同時(shí)給藥，和/或與一種或多種其它的治療劑聯(lián)合給藥。
在某些實(shí)施方案中，給予受治療者NASP以治療由以下所列出血障礙組成的組血友病A，血友病B，血管性血友病，原發(fā)性血小板減少癥，一種或多種接觸因子的缺乏，例如凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶和高分子量激肽原(HMWK)，一種或多種與臨床上明顯可見(jiàn)的出血相關(guān)的凝血因子的缺乏，例如凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II(低凝血酶原血)和血管性血友病因子，維生素K缺乏癥，纖維蛋白原病癥包括纖維蛋白原缺乏血癥，低纖維蛋白原血癥和異常纖維蛋白原血癥，α2-抗血纖蛋白酶缺乏癥以及過(guò)量流血，例如由肝病、腎臟病、血小板減少癥、血小板機(jī)能障礙、血腫、內(nèi)出血、關(guān)節(jié)積血、外科手術(shù)、創(chuàng)傷、低體溫、行經(jīng)以及懷孕引起的過(guò)量流血。
在某些實(shí)施方案中，給予受治療者NASP以治療由血液因子缺乏引起的先天性凝血功能障礙或后天性凝血功能障礙。所述血液因子缺乏可由一種或多種凝血因子缺乏所致，包括但不限于凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、凝血因子X(jué)III和血管性血友病因子。
在某些實(shí)施方案中，聯(lián)合給予所述具有出血障礙的受治療者治療有效量的含有NASP的組合物以及另一種治療劑。例如，可給予所述受治療者治療有效量的含有NASP的組合物以及一種或多種選自由凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子組成的組的凝血因子。治療可進(jìn)一步包括給予促凝血?jiǎng)├缒?；?nèi)源性凝血途徑活化劑，包括凝血因子X(jué)a、凝血因子IXa、凝血因子X(jué)Ia、凝血因子X(jué)IIa和VIIIa、前激肽釋放酶和高分子量激肽原；或外源性凝血途徑活化劑，包括組織因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子X(jué)a。用于治療具有出血障礙的受治療者的治療劑可在相同或不同的組合物中，并且在與NASP同時(shí)、之前或之后給予。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種逆轉(zhuǎn)受治療者中抗凝血?jiǎng)┬?yīng)的方法，該方法包括給予受治療者治療有效量的含有非抗凝血的硫酸多糖(NASP)的組合物。在某些實(shí)施方案中，受治療者可以是已用抗凝血?jiǎng)┻M(jìn)行了治療，這些抗凝血?jiǎng)┌ǖ幌抻诟嗡?、諸如丙酮芐羥香豆素或雙香豆素的香豆素衍生物、組織因子通道抑制劑(TFPI)、抗凝血酶III、狼瘡抗凝劑、線(xiàn)蟲(chóng)抗凝肽(NAPc2)、活性位點(diǎn)封閉的凝血因子VIIa(凝血因子VIIai)、凝血因子IXa抑制劑、凝血因子X(jué)a抑制劑、包括磺達(dá)肝癸鈉(fondaparinux)、達(dá)肝癸鈉(idraparinux)、DX-9065a和瑞扎沙班(razaxaban)(DPC906)，凝血因子Va和VIIIa抑制劑、包括激活蛋白C(APC)和可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白，凝血酶抑制劑，包括水蛭素、比伐盧定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)和希美加曲(ximelagatran)。在某些實(shí)施方案中，所述受治療者中的抗凝血?jiǎng)┛梢允墙Y(jié)合凝血因子的抗體，包括但不限于結(jié)合到凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II、凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、血管性血友病因子、前激肽釋放酶或高分子量激肽原(HMWK)的抗體。
在某些實(shí)施方案中，NASP可與一種或多種不同的NASPs同時(shí)給藥和/或與一種或多種其它的治療劑聯(lián)合給藥用于逆轉(zhuǎn)受治療者中抗凝血?jiǎng)┬?yīng)。例如，可給予所述受治療者治療有效量的包含NASP和一種或多種凝血因子的組合物，所述凝血因子選自由凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II、凝血因子VIIa以及血管性血友病因子組成的組。治療可進(jìn)一步包括給予促凝血?jiǎng)?，例如?nèi)源性凝血途徑活化劑，包括凝血因子X(jué)a、凝血因子IXa、凝血因子X(jué)Ia、凝血因子X(jué)IIa和VIIIa、前激肽釋放酶以及高分子量激肽原；或外源性凝血途徑活化劑，包括組織因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子X(jué)a。與NASP聯(lián)合使用以逆轉(zhuǎn)受治療者中抗凝血?jiǎng)┬?yīng)的治療劑可在相同或不同的組合物中，并且在與NASP同時(shí)、之前或之后給予。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種治療經(jīng)受外科或侵入性操作的受治療者以改善其凝血的方法，該方法包括給予受治療者治療有效量的包含非抗凝血的硫酸多糖(NASP)的組合物。在某些實(shí)施方案中，所述NASP可與一種或多種不同的NASPs同時(shí)給予和/或與一種或多種其它的治療劑聯(lián)合給予經(jīng)歷外科或侵入性操作的受治療者。例如，可給予所述受治療者治療有效量的一種或多種選自由凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子的凝血因子組成的組。治療可進(jìn)一步包括給予促凝血?jiǎng)?，例如?nèi)源性凝血途徑活化劑，包括凝血因子X(jué)a、凝血因子IXa、凝血因子X(jué)Ia、凝血因子X(jué)IIa和VIIIa、前激肽釋放酶和高分子量激肽原；或外源性凝血途徑活化劑，包括組織因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子X(jué)a。用于治療經(jīng)歷外科或侵入性操作的的受治療者的治療劑可在相同或不同的組合物中，并且在與NASP同時(shí)、之前或之后給予。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種抑制受治療者中TFPI活性的方法，所述方法包括給予受治療者治療有效量的包含NASP的組合物。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種抑制生物樣品中TFPI活性的方法，所述方法包括將所述生物樣品(如血液或血漿)與足夠量的非抗凝血的硫酸多糖(NASP)結(jié)合以抑制TFPI活性。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種包含NASP的組合物。在某些實(shí)施方案中，所述NASP由選自N-乙?；?肝素(NAH)、N-乙?；?脫-O-硫酸化肝素(NA-de-o-SH)、脫-N-硫酸化肝素(De-NSH)、脫-N-硫酸化乙?；嗡?De-NSAH)、高碘酸氧化的肝素(POH)、化學(xué)硫酸化海帶多糖(CSL)、化學(xué)硫酸化褐藻酸(CSAA)、化學(xué)硫酸化果膠(CSP)、硫酸葡聚糖(DXS)、肝素衍生的寡糖(HDO)、戊聚糖多硫酸酯(PPS)和巖藻依聚糖組成的組。在其它實(shí)施方案中，NASP選自由先前所列化合物的低分子量片段組成的組。在某些實(shí)施方案中，所述組合物可進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方案中，所述組合物可進(jìn)一步包含一種或多種不同的NASPs，和/或一種或多種治療劑，和/或試劑。例如，所述組合物可進(jìn)一步包含一種或多種選自由凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II和血管性血友病因子、組織因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子X(jué)a、凝血因子IXa、凝血因子X(jué)Ia、凝血因子X(jué)IIa以及VIIIa的凝血因子組成的組；和/或一種或多種選自由APTT試劑、凝血激酶、血纖蛋白、TFPI、魯塞爾氏蝰蛇毒、微粉化的二氧化硅顆粒、逆沒(méi)食子酸、硫腦苷脂和高嶺土的試劑組成的組。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種在生物樣品中利用NASP測(cè)定凝血加速的方法，所述方法包括a)將所述生物樣品與包含NASP的組合物結(jié)合，b)測(cè)定所述生物樣品的凝血時(shí)間，c)比較所述生物樣品與不暴露于NASP的相應(yīng)生物樣品的凝血時(shí)間，其中，如果觀(guān)察到暴露于NASP的生物樣品的凝血時(shí)間減少，則表明NASP加速了凝血。
在某些實(shí)施方案中，可添加一種或多種不同的NASPs和/或治療劑、和/或試劑到生物樣品中用于測(cè)定凝血時(shí)間。例如，可添加一種或多種凝血因子，包括但不限于凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II和血管性血友病因子、組織因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子X(jué)a、凝血因子IXa、凝血因子X(jué)Ia、凝血因子X(jué)IIa以及VIIIa；和/或一種或多種試劑，包括但不限于A(yíng)PTT試劑、組織因子、凝血激酶、血纖蛋白、TFPI、魯塞爾氏蝰蛇毒、微粉化的二氧化硅顆粒、逆沒(méi)食子酸、硫腦苷脂和高嶺土。
鑒于在此公開(kāi)的內(nèi)容，本發(fā)明技術(shù)人員能容易地想到本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方案。
附圖概述

圖1顯示了通過(guò)dPT測(cè)定法所測(cè)定的在組織因子通道抑制劑(TFPI)存在下，血友病A(Hem-A)血漿的凝血時(shí)間增加了。凝血時(shí)間(s)對(duì)TFPI濃度(μg/ml)所作的圖顯示了凝血時(shí)間隨TFPI劑量呈線(xiàn)性增加。
圖2比較了可能的NASPs、N-乙酰基-肝素(NAH)、N-乙酰基-脫-O-硫酸化肝素(NA-de-O-SH)、脫-N-硫酸化肝素(De-N-SH)、脫-N-硫酸化乙?；嗡?De-N-SAH)、戊聚糖多硫酸酯(PPS)、巖藻依聚糖和肝素的抗凝血活性。在Hem-A血漿中于不同濃度下測(cè)試所選擇的多糖。圖2顯示了凝血時(shí)間(s)對(duì)NASP濃度(nM)所作的圖。所顯示的數(shù)據(jù)點(diǎn)是兩次重復(fù)測(cè)量的平均值。
圖3比較了當(dāng)使用aPTT測(cè)定法測(cè)定時(shí)，NAH、PPS、巖藻依聚糖和肝素對(duì)含1.25％FACT血漿的Hem-A血漿凝血時(shí)間的影響。圖3顯示了凝血時(shí)間(s)對(duì)NASP濃度(nM)所作的圖。所顯示的數(shù)據(jù)點(diǎn)是兩次重復(fù)測(cè)量的平均值。
圖4顯示了NASPs，包括NAH、PPS和巖藻依聚糖加速了含重組TFPI的Hem-A血漿的凝血。在添加血漿前，將NASPs與TFPI簡(jiǎn)短地預(yù)溫育。用dPT測(cè)定法測(cè)定凝血時(shí)間。顯示了凝血時(shí)間(s)對(duì)NASP濃度(nM)所作的圖。所顯示的數(shù)據(jù)點(diǎn)是兩次重復(fù)測(cè)量的平均值。NASP對(duì)TFPI活性的抑制導(dǎo)致了減少的血漿凝血時(shí)間。
圖5顯示了NASPs，包括NAH、PPS和巖藻依聚糖加速了含重組TFPI的血友病B(Hem-B)血漿的凝血。在添加血漿前，將NASPs與TFPI簡(jiǎn)短地預(yù)溫育。使用dPT測(cè)定法測(cè)定凝血時(shí)間。顯示了凝血時(shí)間(s)對(duì)NASP濃度(nM)所作的圖。所顯示的數(shù)據(jù)點(diǎn)是兩次重復(fù)測(cè)量的平均值。NASP對(duì)TFPI活性的抑制導(dǎo)致了減少的血漿凝血時(shí)間。
圖6顯示了NAH、PPS和巖藻依聚糖加速含TFPI的Hem-A血漿的凝血，在TFPI引入血漿前TFPI不與NASPs預(yù)溫育。顯示了凝血時(shí)間(s)對(duì)NASP濃度(nM)所作的圖。使用dPT測(cè)定法測(cè)定凝血時(shí)間。所顯示的數(shù)據(jù)點(diǎn)是兩次重復(fù)測(cè)量的平均值。
圖7顯示了在不存在外源TFPI補(bǔ)充下，PPS和巖藻依聚糖加速Hem-A血漿的凝血。比較NASPs和用于加強(qiáng)外源性途徑活化的陽(yáng)性對(duì)照物凝血因子VIIa的劑量-響應(yīng)。圖7顯示了凝血時(shí)間(s)對(duì)NASP濃度(nM)所作的圖。使用dPT測(cè)定法測(cè)定凝血時(shí)間。所顯示的數(shù)據(jù)點(diǎn)是兩次重復(fù)測(cè)量的平均值。
圖8顯示了在dPT測(cè)定中巖藻依聚糖和PPS加速凝血因子VII-缺乏的血漿的凝血。在凝血因子VII-缺乏的血漿與不同濃度巖藻依聚糖或PPS預(yù)溫育后測(cè)定凝血時(shí)間。圖8顯示了凝血時(shí)間(s)對(duì)NASP濃度(nM)所作的圖。所顯示的數(shù)據(jù)點(diǎn)是兩次重復(fù)測(cè)量的平均值。
發(fā)明詳述除非另作指示，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明將應(yīng)用到在本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)之內(nèi)的藥理學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、凝血、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)方法。這些技術(shù)已在文獻(xiàn)中得到了充分的說(shuō)明，參見(jiàn)如Handbook of ExperimentalImmunology，Vols.I-IV(D.M.Weir和CC.Blackwell編.，BlackwellScientific Publications)；A.L.Lehninger，Biochemistry(WorthPublishers，Inc.，current addition)；Sambrook，等，MolecularCloningA Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan編，Academic Press，Inc.)。
I.定義在本發(fā)明描述中，將使用以下術(shù)語(yǔ)，其定義為如下所述。
應(yīng)當(dāng)指出的是，除非該內(nèi)容清楚地另作指示，在本說(shuō)明書(shū)和附加的權(quán)利要求書(shū)中使用的單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)對(duì)象。因此，例如，所提及的“a NASP”包括兩種或更多種這樣的試劑等等的混合物。
在此使用的“NASP”所指的硫酸多糖是在稀釋凝血酶原時(shí)間(dPT)或活化部分凝血激酶時(shí)間(aPTT)凝集測(cè)定中顯示出抗凝血?jiǎng)┗钚缘牧蛩岫嗵?，其具有不超過(guò)未分級(jí)肝素(分子量范圍8,000-30,000；平均18,000道爾頓)三分之一、優(yōu)選低于十分之一摩爾抗凝血(凝血時(shí)間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著地增加了)活性。NASPs可以是從天然來(lái)源(如褐藻類(lèi)、樹(shù)皮、動(dòng)物組織)純化和/或改性的，或可以是從頭合成的，分子量范圍在100道爾頓-1,000,000道爾頓。NASPs可用于本發(fā)明的方法中在治療出血障礙特別是與凝血因子缺乏相關(guān)的那些出血障礙中用于改善止血，或用于逆轉(zhuǎn)抗凝血?jiǎng)┬?yīng)。使用各種體外凝集測(cè)定法(如dPT和aPTT測(cè)定法)和體內(nèi)出血模型(如在血友病小鼠或狗中測(cè)定剪去尾部、橫向切口的全血凝血時(shí)間或表皮出血時(shí)間)能容易地確定出NASPs促進(jìn)凝血和減少出血的能力。參見(jiàn)如PDR Staff.Physicians′Desk Reference.2004，Anderson等，(1976)Thromb.Res.9575-580；Nordfang等，(1991)Thromb Haemost.66464-467；Welsch等，(1991)Thrombosis Research 64213-222；Broze等，(2001)Thromb Haemost 85747-748；Scallan等，(2003)Blood.1022031-2037；Pijnappels等.(1986)Thromb.Haemost.5570-73；和Giles等，(1982)Blood 60727-730。
在此使用的“促凝血?jiǎng)敝溉魏文軉?dòng)或加速血凝塊形成的因子或試劑。本發(fā)明的促凝血?jiǎng)┌ㄈ魏蝺?nèi)源性或外源性凝血途徑的活化劑，例如選自由凝血因子X(jué)a、凝血因子IXa、凝血因子X(jué)Ia、凝血因子X(jué)IIa和VIIIa、前激肽釋放酶、高分子量激肽原、組織因子、凝血因子VIIa以及凝血因子Va的凝血因子組成的組。其它促進(jìn)凝血的試劑包括激肽釋放酶、APTT抑制劑(即一種含有磷脂和接觸活化劑的試劑)、魯塞爾氏蝰蛇毒(RW時(shí)間)以及凝血激酶(用于dPT)。可用于本發(fā)明方法中作為促凝血?jiǎng)┑慕佑|活化劑，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的微粉化的二氧化硅顆粒、逆沒(méi)食子酸、硫腦苷脂、高嶺土或等等。促凝血?jiǎng)┛梢允翘烊淮痔嵛?，血液或血漿樣品、分離的和基本上純化了的、合成的或重組的。促凝血?jiǎng)┛砂ū３稚锘钚?即促進(jìn)凝血)的天然存在的凝血因子或其片段、變體或共價(jià)修飾的衍生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可測(cè)定促凝血?jiǎng)┑淖罴褲舛取?br> 在此使用的術(shù)語(yǔ)“多糖”指一種包含多個(gè)(即兩個(gè)或更多個(gè))以共價(jià)鍵鏈接的糖殘基的聚合物。鍵可以是天然的或非天然的。天然鍵包括例如糖苷鍵，而非天然鍵則可包括例如酯、胺或肟鍵部分。多糖可具有任意寬范圍的平均分子量(MW)值，但通常至少為約100道爾頓。例如，多糖可具有至少約500、1000、2000、4000、6000、8000、10,000、20,000、30,000、50,000、100,000、500,000道爾頓或更高的分子量。多糖可具有直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)。多糖可包括由更大的多糖降解(如水解)所產(chǎn)生的多糖片段?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何一種方法進(jìn)行降解，包括用酸、堿、加熱或酶處理多糖以產(chǎn)生降解的多糖。多糖可以是化學(xué)改性的，亦可是改性的，包括但不限于硫酸化、聚硫酸化、酯化以及甲基化。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“衍生自”用于確定分子的原始來(lái)源，但并不旨在限制所述分子的制備方法，其可以是如通過(guò)化學(xué)合成或重組方法制備的。
術(shù)語(yǔ)“變體”、“類(lèi)似物”和“突變蛋白”指參照分子的生物活性衍生物。它們?cè)谥委熢诖怂龅某鲅系K中保持期望活性，例如凝血活性。一般而言，關(guān)于多肽(如凝血因子)的術(shù)語(yǔ)“變體”和“類(lèi)似物”指具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代(一般在特性上保守)和/或缺失的天然多肽序列和結(jié)構(gòu)的化合物，相對(duì)于天然分子，只要所述修飾并不破壞生物活性，其就是與如下所定義的參照分子“基本上同源的”。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)兩條序列比對(duì)時(shí)，這樣的類(lèi)似物的氨基酸序列應(yīng)與參照序列具有高度的序列同源性，如超過(guò)50％的氨基酸序列同源性、通常超過(guò)60％-70％、甚至更特別地為80％-85％或更高，例如至少90％-95％或更高。通常，所述類(lèi)似物應(yīng)包括相同數(shù)目的氨基酸，但應(yīng)包括在此所解釋的取代。術(shù)語(yǔ)“突變蛋白”進(jìn)一步包括具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸樣分子的多肽，包括但不限于僅包含氨基和/或亞氨基分子的化合物，包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸類(lèi)似物(包括例如，非天然氨基酸等)的多肽，具有取代的鍵的多肽，以及其它本領(lǐng)域公知的修飾，天然存在或非天然存在的(如合成)，環(huán)化的、含支鏈分子等等。該術(shù)語(yǔ)也包括包含一個(gè)或多個(gè)N-取代的甘氨酸殘基(“類(lèi)肽”)以及其它的合成氨基酸或肽的分子(參見(jiàn)如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,831,005；5,877,278和5,977,301；Nguyen等，Chem Biol.(2000)7463-473以及Simon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)899367-9371對(duì)于類(lèi)肽的描述)。更適宜地，所述類(lèi)似物或突變蛋白與天然分子具有至少相同的凝血活性。本領(lǐng)域公知制備多肽類(lèi)似物和突變蛋白的方法描述如下。
如上所解釋的，類(lèi)似物通常包括在特性上保守的取代，即在側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)所發(fā)生的那些取代。具體來(lái)說(shuō)，氨基酸通常分為四個(gè)家族(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性-賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性-丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電荷的極性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)被歸類(lèi)為芳香族氨基酸。例如，可合理地預(yù)測(cè)用異亮氨酸或纈氨酸單獨(dú)取代亮氨酸、用谷氨酸單獨(dú)取代天冬氨酸、用絲氨酸單獨(dú)取代蘇氨酸、或用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸單獨(dú)取代氨基酸的類(lèi)似的保守取代，將不會(huì)對(duì)生物活性起大的影響。例如，目的多肽可包括多達(dá)約5-10個(gè)保守或非保守的氨基酸取代，或甚至多達(dá)約15-25個(gè)保守或非保守的氨基酸取代，或在5-25個(gè)之間任何整數(shù)個(gè)取代，只要分子仍然保持完整的期望功能即可。通過(guò)參考本領(lǐng)域眾所周知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle圖，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定目的分子能容忍改變的區(qū)域。
“衍生”意指目的參照分子或其類(lèi)似物任何合適的修飾，例如硫酸化、乙?；?、糖基化、磷酸化、聚合物結(jié)合(例如與聚乙二醇)，或外源部分的其他添加，只要參照分子仍然保持期望生物活性(如凝血活性、抑制TFPI活性)即可。例如，可用一種或多種有機(jī)或無(wú)機(jī)基團(tuán)衍生化多糖。實(shí)例包括用另一基團(tuán)(如硫酸基、羧基、磷酸基、氨基、腈、鹵素、甲硅烷基、胺基、酰基、脂肪族、芳香族或糖基)取代至少一個(gè)羥基的多糖，或環(huán)上的氧已被硫、氮、亞甲基等取代的多糖。多糖可進(jìn)行化學(xué)改性，例如以改善促凝血?jiǎng)┕δ?。這樣的改性可包括但不限于，硫酸化、聚硫酸化、酯化和甲基化。制備類(lèi)似物和衍生物的方法通常能從現(xiàn)有技術(shù)中獲得。
“片段”意指一種僅由完整全長(zhǎng)序列和結(jié)構(gòu)的一部分組成的分子。多糖片段可通過(guò)降解(如水解)更大的多糖而產(chǎn)生。多糖活性片段通常應(yīng)包括至少約2-20個(gè)全長(zhǎng)多糖的糖單元，優(yōu)選至少約5-10個(gè)全長(zhǎng)分子的糖單元或在2個(gè)糖單元至全長(zhǎng)分子之間的任何整數(shù)個(gè)糖單元，只要該片段保持生物活性，例如凝血活性和/或抑制TFPI活性的能力即可。多肽片段可包括天然多肽的C-末端缺失和N-末端缺失、和/或中間缺失。特定蛋白質(zhì)的活性片段通常以包括至少約5-10個(gè)全長(zhǎng)分子的連續(xù)氨基酸殘基，優(yōu)選至少約15-25個(gè)全長(zhǎng)分子的連續(xù)氨基酸殘基，最優(yōu)選至少約20-50個(gè)或更多個(gè)全長(zhǎng)分子的連續(xù)氨基酸殘基，或在5個(gè)氨基酸到全長(zhǎng)序列之間的任意整數(shù)個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，只要正該片段仍然保持生物活性例如在此描述的凝血活性即可。
“基本上純的”通常指分離物質(zhì)(如硫酸多糖)以使得所述物質(zhì)在其所存在的樣品中占絕大百分?jǐn)?shù)。一般來(lái)說(shuō)，樣品中基本上純的組分包含50％、優(yōu)選80％-85％、更優(yōu)選90-95％的樣品。本領(lǐng)域眾所周知用于純化目的多糖、多核苷酸以及多肽的技術(shù)，包括如離子交換層析、親和層析以及密度沉降法。
當(dāng)涉及多糖或多肽時(shí)，“分離的”意指所指示的分子與其天然存在的所有有機(jī)體是分開(kāi)且分離的，或以基本上不存在同種類(lèi)型的其它生物大分子的形式存在。
“同源性”指兩個(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽部分之間的同一性百分?jǐn)?shù)。當(dāng)序列在規(guī)定分子長(zhǎng)度的范圍內(nèi)具有至少約50％、優(yōu)選至少約75％、更優(yōu)選至少約80％-85％、優(yōu)選至少約90％以及最優(yōu)選至少約95％-98％序列同一性時(shí)，兩條核酸或兩條多肽序列是彼此“基本上同源的”。在此使用的基本上同源的也指顯示與所指定序列具有完全同一性的序列。
具體而言，“同一性”分別指兩條多核苷酸或多肽序列精確的核苷酸與核苷酸或氨基酸與氨基酸的對(duì)應(yīng)。同一性百分?jǐn)?shù)可通過(guò)直接比較兩個(gè)分子(參照序列和與相對(duì)于所述參照序列具有未知％同一性的序列)之間的序列信息，通過(guò)排列序列、計(jì)算兩條排列序列之間匹配的精確數(shù)目、除以參照序列的長(zhǎng)度并將結(jié)果乘以100來(lái)測(cè)定。可使用容易獲得的計(jì)算機(jī)程序幫助分析，例如ALIGN，Dayhoff，M.O.in Atlas of Protein Sequence andStructure M.O.Dayhoff編，5 Suppl.3353-358，National biomedicalResearch Foundation，Washington，DC，其改寫(xiě)了Smith和WatermanAdvances in Appl.Math.2482-489，1981用于肽分析的局部同源性算法。確定核苷酸序列同一性的程序可由Wiscons in Sequence AnalysisPackage，第8版獲得(獲得自Genetics Computer Group，Madison，WI)，例如，同樣基于Smith和Waterman算法的BESTFIT、FASTA和GAP程序。利用廠(chǎng)商所推薦及描述于上述提及的Wisconsin Sequence AnalysisPackage中的缺省參數(shù)，這些程序很容易執(zhí)行。例如，可使用帶有缺省得分表和6核苷酸位置缺口罰分的Smith和Waterman的同源性算法來(lái)確定特定核苷酸序列與參照序列的同一性百分?jǐn)?shù)。
本發(fā)明文中另一種確定同一性百分?jǐn)?shù)方法是使用愛(ài)丁堡大學(xué)版權(quán)所有的、由John F.Collins和Shane S.Sturrok開(kāi)發(fā)并通過(guò)IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)分發(fā)的MPSRCH程序包。Smith-Waterman算法可用于這一套程序包中，在此缺省參數(shù)用于得分表(例如，缺口開(kāi)放罰分12、缺口延伸罰分1以及缺口為6)。由產(chǎn)生“匹配”值的數(shù)據(jù)反映了“序列同一性”。其它用于計(jì)算序列之間同一性或相似性百分?jǐn)?shù)的合適程序?yàn)楸绢I(lǐng)域所常知，例如，另一種比排列序是使用缺省參數(shù)的BLAST。例如，可被使用的BLASTN和BLASTP可使用如下缺省參數(shù)遺傳密碼＝標(biāo)準(zhǔn)；過(guò)濾器＝無(wú)；鏈＝兩條；截止值＝60；期望值＝10；矩陣＝BLOSUM62；描述(Descriptions)＝50條序列；分類(lèi)＝高得分(HIGH SCORE)；數(shù)據(jù)庫(kù)＝非冗余的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻譯+Swiss protein+Spupdate+PIR。這些程序的細(xì)節(jié)容易獲得。
或者，同源性可通過(guò)在同源區(qū)域之間形成穩(wěn)定的雙鏈體的條件下雜交多核苷酸、然后用單鏈特異性核酸酶消化，并測(cè)定所消化片段的大小來(lái)測(cè)定?；旧贤吹腄NA序列可在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中于例如對(duì)于該特定系統(tǒng)所規(guī)定的嚴(yán)格條件下鑒定。確定合適的雜交條件屬于本領(lǐng)域技術(shù)范疇之內(nèi)。參見(jiàn)如Sambrook等.，見(jiàn)上；DNA Cloning，見(jiàn)上；Nucleic AcidHybridization，見(jiàn)上。
在此用于描述核酸分子的“重組”意指基因組的多聚核苷酸、cDNA、病毒、半合成或合成來(lái)源的多核苷酸根據(jù)其來(lái)源或操作不與天然多核苷酸的全部或部分相關(guān)。在涉及蛋白質(zhì)或多肽時(shí)所使用的術(shù)語(yǔ)“重組”意指通過(guò)表達(dá)重組多核苷酸產(chǎn)生的多肽。一般而言，目的基因被克隆，然后在轉(zhuǎn)化的生物體中表達(dá)，如下將作進(jìn)一步描述。宿主生物體在表達(dá)條件下表達(dá)外源基因以產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
“脊椎動(dòng)物研究對(duì)象”意指脊索動(dòng)物亞門(mén)的任何成員，包括不限于人和其它靈長(zhǎng)類(lèi)，包括非人靈長(zhǎng)類(lèi)，例如黑猩猩和其它猿類(lèi)以及猴子；家畜例如牛、綿羊、豬、山羊和馬；馴化的哺乳動(dòng)物例如狗和貓；實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物包括嚙齒類(lèi)動(dòng)物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鳥(niǎo)類(lèi)，包括馴化的、野生的和獵鳥(niǎo)，例如雞、火雞和其它鶉雞類(lèi)鳥(niǎo)類(lèi)、鴨、鵝等等。該術(shù)語(yǔ)并不指示具體的年齡。因此旨在包括成年和新生的個(gè)體。在此描述的本發(fā)明意在用于任何上述的脊椎動(dòng)物。
術(shù)語(yǔ)“患者”指患有或易患可通過(guò)給予本發(fā)明的NASP預(yù)防或治療的病癥的活生物體，包括人和動(dòng)物。
在此使用的“生物樣品”指組織樣品或分離自受治療者的液體，包括但不限于，例如血液，血漿，血清，排泄物，尿液，骨髓，膽汁，脊髓液，淋巴液，皮膚樣品，皮膚、呼吸器官、腸和生殖泌尿道的外分泌物，淚液，唾液，乳液，血細(xì)胞，器官，活組織檢查以及體外細(xì)胞培養(yǎng)組分的樣品，包括但不限于培養(yǎng)基中細(xì)胞和組織培養(yǎng)的條件培養(yǎng)物，如重組的細(xì)胞和細(xì)胞組分。
NASP、血液因子或其它治療劑的“治療有效劑量或治療有效量”意指在按照這里所描述的情形給藥時(shí)，產(chǎn)生陽(yáng)性治療反應(yīng)例如減少出血或縮短凝血時(shí)間的量。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“出血障礙”指任何與過(guò)量流血相關(guān)的病癥，例如先天性凝血功能障礙、后天性凝血功能障礙或創(chuàng)傷引起的出血病癥。這樣的出血障礙包括但不限于，血友病A，血友病B，血管性血友病，原發(fā)性血小板減少癥，一種或多種接觸因子的缺乏，例如凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶和高分子量激肽原(HMWK)，一種或多種與臨床上明顯可見(jiàn)的出血相關(guān)的凝血因子的缺乏，例如凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II(低凝血酶原血)和血管性血友病因子，維生素K缺乏癥，纖維蛋白原病癥包括纖維蛋白原缺乏血癥，低纖維蛋白原血癥和異常纖維蛋白原血癥，α2-抗血纖蛋白酶缺乏癥以及過(guò)量流血，例如由肝病、腎臟病、血小板減少癥、血小板機(jī)能障礙、血腫、內(nèi)出血、關(guān)節(jié)積血、外科手術(shù)、創(chuàng)傷、低體溫、行經(jīng)以及懷孕引起的過(guò)量流血。
II.實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法在詳述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)明白的是本發(fā)明并不限于特定的配方或工藝參數(shù)，當(dāng)然自身可以改變。也應(yīng)當(dāng)明白的是在此使用的術(shù)語(yǔ)目的僅在于描述本發(fā)明的特定實(shí)施方案，并不意在限制。
盡管許多類(lèi)似于或等價(jià)于在此描述的方法和物質(zhì)均能用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，但是在此描述的是優(yōu)選的物質(zhì)和方法。
A.概述凝血障礙包括通常采用因子置換治療的血友病(Hem)A和Hem B、重度血管性血友病(svWD)以及重度凝血因子VII(FVII)缺乏。例如，對(duì)于HemA和svWD用凝血因子VIII置換治療，對(duì)于Hem B用凝血因子IX置換治療，對(duì)于FVII-缺乏以及其他用凝血因子VII(a)置換治療(最近評(píng)論于Bishop等，(2004)Nat.Rev.Drug Discov.3684-694；Carcao等，(2004)Blood Rev.18101-113；Roberts等，(2004)Anesthesiology100722-730；和Lee(2004)Int.Anesthesiol.Clin.4259-76中)。雖然這樣的治療通常是有效的，但是其應(yīng)用受到如高成本、不方便(即通過(guò)靜脈注射給藥)以及產(chǎn)生中和抗體等的限制(Bishop等，見(jiàn)上；Carcao等，見(jiàn)上；Roberts等，見(jiàn)上；Lee，見(jiàn)上；和Bohn等，(2004)Haemophilia10 Suppl.12-8)。雖然FVIIa越來(lái)越多地應(yīng)用于多種出血障礙中(Roberts等，見(jiàn)上)，但開(kāi)發(fā)出可避免前述約束條件、并有廣泛應(yīng)用的可替換的單一化合物促凝血?jiǎng)┲委煼桨溉砸鹑藗兊呐d趣。
一種改善有出血障礙的個(gè)體的止血的常規(guī)方法是通過(guò)上調(diào)凝血外源性途徑以改善凝血啟動(dòng)。盡管凝血內(nèi)源性和外源性途徑都有助于凝血酶產(chǎn)生和血纖蛋白凝塊形成(Davie等，(1991)Biochemistry3010363-10370)，但是對(duì)于啟動(dòng)以及幫助體內(nèi)凝血傳播而言，外源的或組織因子(TF)介導(dǎo)的途徑是關(guān)鍵的(Mann(2003)Chest 124(3Suppl)1S-3S；Rapaport等，(1995)Thromb.Haemost.747-17)。一種上調(diào)外源性途徑活性的可能的機(jī)制是減弱組織因子通道抑制劑(TFPI)。TFPI是一種FVIIa/TF的Kunitz型蛋白酶抑制劑，其提供外源性途徑活化的滋補(bǔ)下調(diào)(參見(jiàn)Broze(1992)Semin.Hematol.29159-169；Broze(2003)J.Thromb.Haemost.11671-1675；和Johnson等，(1998)Coron.Artery Dis.9(2-3)83-87評(píng)論)。實(shí)際上，在小鼠中雜合的TFPI缺乏可導(dǎo)致加劇血栓形成(Westrick等，(2001)Circulation 1033044-3046)，且TFPI基因突變亦是人血栓癥的危險(xiǎn)因素(Kleesiek等.(1999)Thromb.Haemost.821-5)。Nordfan等和Wun等描述了在血友病中通過(guò)靶向TFPI調(diào)節(jié)凝血，他們揭示出了抗-TFPI抗體能縮短血友病血漿的凝血時(shí)間(Nordfang等，(1991)Thromb.Haemost.66464-467；Welsch等，(1991)Thromb.Res.64213-222)，且抗-TFPI IgG改善了凝血因子VIII缺乏的兔子的出血時(shí)間(Erhardtsen等，(1995)Blood Coagul.Fibrinolysis6388-394)。
作為一類(lèi)物質(zhì)，硫酸多糖的特點(diǎn)在于多血質(zhì)的生物活性，其在動(dòng)物和人中具有通常有利的耐受分布圖。這些聚陰離子分子一般來(lái)自植物和動(dòng)物組織，包含大量的亞類(lèi)包括肝素、粘多糖、巖藻依聚糖、角叉膠、戊聚糖多硫酸酯和皮膚素或硫酸葡聚糖(Toida等，(2003)Trends inGlycoscience and Glycotechnology 1529-46)。已報(bào)道了較低分子量、低異質(zhì)性以及化學(xué)合成的硫酸多糖，并已達(dá)到不同的藥物開(kāi)發(fā)階段(Sinay(1999)Nature 398377-378；Bates等，(1998)Coron.ArteryDis.965-74；Orgueira等，(2003)Chemistry 9140-169；McAuliffe(1997)Chemical Industry Magazine 3170-174；Williams等，(1998)Gen.Pharmacol.30337-341)。通過(guò)與抗凝血酶III和/或肝素輔因子II相互作用的介導(dǎo)，肝素類(lèi)硫酸多糖顯示出差異抗凝血活性(Toida等，見(jiàn)上)。值得注意的是，某些天然來(lái)源或化學(xué)修飾的化合物在基本上不具有抗凝血活性的濃度(或劑量)上顯示出其它生物活性(Williams等，1998)Gen.Pharmacol.30337-341；Wan等，(2002)Inflamm.Res.51435-443；Bourin等，(1993)Biochem.J.289(Pt 2)313-330；McCaffrey等，(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.184773-781；Luyt等，(2003)J.Pharmacol.Exp.Ther.30524-30)。此外，也已顯示硫酸化肝素與TFPI具有強(qiáng)的相互作用(Broze(1992)Semin.Hematol.29159-169；Broze(2003)J.Thromb.Haemost.11671-1675；Johnson等，(1998)Coron.Artery Dis.983-87；Novotny等，(1991)Blood；78(2)394-400)。
與那些與抗凝血相關(guān)的相比，在此描述的某些硫酸多糖與TFPI相互作用并在更低濃度下抑制其活性。這樣的分子可用于血凝塊形成受損的地方。
B.作為凝血促進(jìn)劑的NASPs本發(fā)明基于非抗凝血的硫酸多糖(NASPs)在治療具有出血障礙的患者中可用作促凝血?jiǎng)┑陌l(fā)現(xiàn)。發(fā)明人在此已發(fā)現(xiàn)一種用于調(diào)節(jié)止血的新方法，即反常地使用了諸如肝素類(lèi)硫酸多糖的硫酸多糖來(lái)促進(jìn)凝血。在此描述的所選擇的硫酸多糖在很大程度上不具有抗凝血活性或在顯著低于其具有抗凝血活性的濃度的濃度下具有促凝血活性，因此被稱(chēng)之為“非抗凝血的硫酸多糖”。
如實(shí)施例4-6所示，根據(jù)稀釋凝血酶原時(shí)間(dPT)和活化部分凝血激酶時(shí)間(aPTT)凝集測(cè)定，NASPs促進(jìn)患血友病A(Hem-A)或血友病B(Hem-B)的受治療者的血漿凝血。此外，NASPs減少血友病A和B小鼠模型受傷后的出血時(shí)間(實(shí)施例7)。在本文所披露的試驗(yàn)中，與肝素比較，在凝集測(cè)定中所示的某些候選NASPs被證實(shí)具有至少10倍更低的抗凝血活性。此外，NASPs的一亞類(lèi)，包括戊聚糖多硫酸酯(PPS)和巖藻依聚糖，當(dāng)在稀釋凝血酶原時(shí)間(dPT)測(cè)定中于4-500nM濃度范圍下測(cè)試時(shí)，抑制了組織因子通道抑制劑(TFPI)并改善了(即加速)人血友病A和血友病B血漿或具有減少的FVII水平的血漿的凝血時(shí)間。于低劑量皮下給予PPS或巖藻依聚糖或NASP與因子補(bǔ)充物的組合后，在血友病A或B小鼠中觀(guān)察到了改善的體內(nèi)止血。也觀(guān)察到了在出血激發(fā)后因子缺乏的小鼠存活率的增加。這些結(jié)果表明系統(tǒng)地給予選擇的NASPs可能代表著一種用于調(diào)節(jié)出血障礙中止血的獨(dú)特方法。
因此，本發(fā)明涉及使用NASPs來(lái)控制具有包括先天性凝血功能障礙，后天性凝血功能障礙以及創(chuàng)傷引起的出血病癥在內(nèi)的出血障礙的受治療者的止血。
C.NASPs供本發(fā)明方法使用的NASPs是具有促凝血?jiǎng)┗钚缘牧蛩岫嗵?。潛在NASPs的非凝血特性使用稀釋凝血酶原時(shí)間(dPT)或活化部分凝血激酶時(shí)間(aPTT)凝集測(cè)定來(lái)確定。非凝血的硫酸多糖具有不超過(guò)未分級(jí)的肝素(分子量范圍8,000-30,000；平均18,000道爾頓)三分之一、優(yōu)選小于十分之一的抗凝血活性(通過(guò)凝血時(shí)間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加所測(cè)定)。
具有潛在NASP活性的硫酸多糖包括但不限于，粘多糖(GAGs)、肝素類(lèi)分子包括N-乙酰基肝素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和N-脫硫酸化肝素(Sigma-Aldrich)、類(lèi)硫酸(sulfatoids)、多硫酸化寡糖(Karst等.(2003)Curr.Med.Chem.101993-2031；Kuszmann等，(2004)Pharmazie.59344-348)、硫酸軟骨素(Sigma-Aldrich)、硫酸皮膚素(CelsusLaboratories Cincinnati，OH)、巖藻依聚糖(Sigma-Aldrich)、戊聚糖多硫酸酯(PPS)(Ortho-McNeil Pharmaceuticals，Raritan，NJ)、硫酸巖藻吡喃酮(Katzman等，(1973)J.Biol.Chem.24850-55)以及新的類(lèi)硫酸例如GM1474(Williams等，(1998)General Pharmacology 30337)和SR 80258A(Burg等，(1997)Laboratory Investigation 76505)和新的類(lèi)肝素及其類(lèi)似物。NASPs可以是從天然來(lái)源(如褐藻類(lèi)、樹(shù)皮、動(dòng)物組織)純化和/或改性的，或可以是從頭合成的，且分子量范圍在100道爾頓-1,000,000道爾頓。具有潛在NASP活性的其他的化合物包括高碘酸氧化的肝素(POH)(Neoparin，Inc.，San Leandro，CA)、化學(xué)硫酸化海帶多糖(CSL)(Sigma-Aldrich)、化學(xué)硫酸化褐藻酸(CSAA)(Sigma-Aldrich)、化學(xué)硫酸化果膠(CSP)(Sigma-Aldrich)、硫酸葡聚糖(DXS)(Sigma-Aldrich)、肝素衍生的寡糖(HDO)(Neoparin，Inc.，SanLeandro，CA)。
原則上，任何糖結(jié)合物的單糖組分上的游離羥基皆可通過(guò)硫酸化得到改性以產(chǎn)生硫酸化的糖結(jié)合物均可以用作為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的NASP。例如，這樣的硫酸化糖結(jié)合物可包括但不限于粘多糖(D-葡糖胺和D-葡萄糖醛酸殘基)、凝膠多糖(羧甲基乙醚，硫化氫，羧甲基化的凝膠多糖)(Sigma-Aldrich)、硫酸化裂殖菌多糖(Itoh等，(1990)Int.J.Immunopharmacol.12225-223；Hirata等，(1994)Pharm.Bull.17739-741)、硫酸化粘多糖、硫酸多糖-粘肽復(fù)合物、硫酸化烷基麥芽寡糖(Katsuraya等，(1994)Carbohydr Res.26051-61)、硫酸支鏈淀粉、N-乙?；?肝素(NAH)(Sigma-Aldrich)、N-乙?；?脫-O-硫酸化肝素(NA-de-o-SH)(Sigma-Aldrich)、脫-N-硫酸化肝素(De-NSH)(Sigma-Aldrich)和脫-N-硫酸化乙?；嗡?De-NSAH)(Sigma-Aldrich)。
使用各種體外凝集測(cè)定法(如dPT和aPTT測(cè)定法)和體內(nèi)出血模型(如在血友病小鼠或狗中測(cè)定剪去尾部、橫向切口的全血凝血時(shí)間或表皮出血時(shí)間)能容易地確定NASPs促進(jìn)凝血和減少出血的能力。參見(jiàn)如PDRStaff.Physicians′Desk Reference.2004，Anderson等，(1976)Thromb.Res.9575-580；Nordfang等，(1991)Thromb Haemost.66464-467；Welsch等，(1991)Thrombosis Research 64213-222；Broze等，(2001)Thromb Haemost 85747-748；Scallan等，(2003)Blood.1022031-2037；Pijnappels等，(1986)Thromb.Haemost.5570-73；和Giles等，(1982)Blood 60727-730。凝集測(cè)定可在NASPs和一種或多種血液因子、促凝血?jiǎng)┗蚱渌噭┐嬖谙逻M(jìn)行。例如，可添加一種或多種因子，包括但不限于凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II和血管性血友病因子、組織因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子X(jué)a、凝血因子IXa、凝血因子X(jué)Ia、凝血因子X(jué)IIa以及VIIIa；和/或一種或多種試劑，包括但不限于A(yíng)PTT試劑、凝血激酶、血纖蛋白、TFPI、魯塞爾氏蝰蛇毒、微粉化的二氧化硅顆粒、逆沒(méi)食子酸、硫腦苷脂和高嶺土。
實(shí)施例3-4和圖2-3證實(shí)了在此提及作為NASPs的試劑確實(shí)是“非抗凝血的”，即在所研究的整個(gè)濃度范圍內(nèi)它們不顯著增加凝血時(shí)間。這樣的化合物可用于本發(fā)明方法和組合物中，只要它們所具有的任何抗凝血活性?xún)H出現(xiàn)在顯著高于它們的促凝血?jiǎng)┗钚缘臐舛鹊臐舛壬?。出現(xiàn)不期望抗凝血特性的濃度與出現(xiàn)期望促凝血?jiǎng)┗钚缘臐舛鹊谋戎捣Q(chēng)為NASP的治療指數(shù)。本發(fā)明的NASPs的治療指數(shù)可以是5、10、30、100、300、1000或更高。
D.藥物組合物任選地，本發(fā)明的NASP組合物可進(jìn)一步包含一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑以提供藥物組合物。賦形劑的實(shí)例包括但不限于，碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽、抗微生物劑、抗氧化劑、表面活性劑、緩沖劑、酸、堿及它們的組合。適用于可注射組合物的賦形劑包括水、乙醇、多羥基化合物、甘油、植物油、磷脂和表面活性劑。碳水化合物，諸如糖、由糖醇、糖醛酸和酯化糖的衍生的糖、和/或糖聚合物可作為賦形劑。具體的碳水化合物賦形劑包括，例如單糖，例如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等等；多糖，例如蜜三糖、松三糖、糊精、葡聚糖、淀粉等等；以及醛醇，例如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇等等。賦形劑也可包括無(wú)機(jī)鹽或緩沖劑，例如檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉及它們的組合。
本發(fā)明組合物亦可包括用于預(yù)防或阻止微生物生長(zhǎng)的抗微生物劑。適合本發(fā)明使用的抗微生物劑的非限制性實(shí)例包括氯化苯，芐索氯銨、苯甲醇、西吡氯銨、三氯叔丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、噻汞撒(thimersol)及它們的組合。
組合物中也可含有抗氧化劑?？寡趸瘎┍挥糜诜乐寡趸?，因此防止NASP或制劑其它組分的降解。適合本發(fā)明使用的抗氧化劑包括，例如，抗壞血酸棕櫚酸脂、丁羥基茴香醚、丁羥基甲苯、次磷酸、二羥基丙硫醇、沒(méi)食子酸丙酯、亞硫酸氫鈉、甲醛次硫酸鈉、焦亞硫酸鈉及它們的組合。
表面活性劑可作為賦形劑存在。表面活性劑的例子包括聚山梨醇酯，例如“吐溫20(Tween20)”和“吐溫80(Tween80)”以及諸如F68和F88的普流羅尼類(lèi)(pluronics)(BASF，Mount Olive，New Jersey)；山梨醇酐酯；脂類(lèi)，例如諸如卵磷脂和其它磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺(盡管脂質(zhì)體類(lèi)型并不是優(yōu)選的)的磷脂、脂肪酸和脂肪酯；甾族化合物，例如膽固醇；螯合劑，例如EDTA；以及鋅和其它適合的陽(yáng)離子。
在組合物中酸或堿可作為賦形劑存在?？墒褂玫乃岬姆窍拗菩詫?shí)例包括選自由鹽酸、醋酸、磷酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富馬酸及其組合的那些酸組成的組。合適的堿的實(shí)例包括但不限于，選自由氫氧化鈉、醋酸鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、醋酸銨、醋酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉、甲酸鈉、硫酸鈉、硫酸鉀、富馬酸鉀及其組合的堿組成的組。
組合物中NASP(如當(dāng)含有在藥物遞送系統(tǒng)中時(shí))的量取決于眾多因素而變化，但最佳的是當(dāng)所述組合物以單位劑量形式或在容器(如管形瓶)里存在時(shí)的治療有效劑量。確定治療有效劑量可通過(guò)重復(fù)給予遞增量的組合物以確定能產(chǎn)生臨床期望終點(diǎn)的量來(lái)進(jìn)行。
組合物中任何單獨(dú)賦形劑的量取決于該賦形劑的特性和功能以及組合物的特定需求而變化。通常任何單獨(dú)賦形劑的最佳量可通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)確定，即通過(guò)制備含有不同量賦形劑(范圍從低到高)的組合物，檢查穩(wěn)定性和其它參數(shù)，接著確定獲得最佳性能而無(wú)明顯不利效應(yīng)的范圍。但是，一般而言，按賦形劑重量計(jì)，組合物中所存在的賦形劑量應(yīng)為約1％至約99％，優(yōu)選為約5％至約98％，更優(yōu)選為約15至約95％，最優(yōu)選含量低于30％。上述這些藥物賦形劑以及其它賦形劑描述于“RemingtonThe Science &Practice of Pharmacy”，第19版，Williams & Williams，(1995)，the“Physician′s Desk Reference”，第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)和Kibbe，A.H.，Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，American Pharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000中。
組合物包括所有類(lèi)型的劑型，特別是那些適于注射的劑型，如在使用前可用溶劑重建的粉劑或凍干劑，以及注射備用溶液或混懸液，在使用前與賦形劑結(jié)合的干的不溶性組合物，以及乳劑和在給藥前稀釋的液體濃縮物。適于在注射前重建固體組合物的稀釋劑的實(shí)例包括用于注射的抑菌水、5％葡萄糖水溶液、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液、鹽水、無(wú)菌水、去離子水及它們的組合。就液體藥物組合物而言，預(yù)想的是溶液和混懸液。其它優(yōu)選的組合物包括那些經(jīng)口、經(jīng)眼或局部遞送的組合物。
根據(jù)不同的遞送和使用的期望方式，這里的藥物制劑亦可置于注射器、植入裝置等等中。更適宜地，在此描述的NASP組合物以預(yù)測(cè)量的或預(yù)包裝的單位劑量形式存在，意味著是適于單次劑量的本發(fā)明的接合物或組合物的量。
在此NASP組合物可任選地包括一種或多種附加試劑，例如止血?jiǎng)?、血液因子或其它用于治療受治療者病癥或疾病的藥物。特別優(yōu)選的是包括一種或多種血液因子，例如凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子的復(fù)方制劑。NASP組合物也可包括其它促凝血?jiǎng)?，例如?nèi)源性凝血途徑活化劑，包括但不限于凝血因子X(jué)a、凝血因子Ixa、凝血因子X(jué)ia、凝血因子X(jué)IIa和VIIIa、前激肽釋放酶以及高分子量激肽原；或外源性凝血途徑活化劑，包括但不限于組織因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子X(jué)a。NASP組合物可包括天然存在的、合成或重組的凝血因子，或它們的保持了生物活性(即促凝血)的片段、變體或共價(jià)修飾的衍生物。或者，這樣的試劑可包含于與NASP分離的組合物中并與本發(fā)明的NASP組合物同時(shí)給藥、或在其給藥之前或之后給藥。
E.給藥給予受治療者至少一個(gè)治療有效周期的NASP治療?！爸委煹闹委熡行е芷凇币庵妇椭委煶鲅系K個(gè)體而言，在給藥時(shí)產(chǎn)生陽(yáng)性治療反應(yīng)的治療周期。特別感興趣的是改善止血的NASP治療周期?！瓣?yáng)性治療反應(yīng)”意指?jìng)€(gè)體經(jīng)過(guò)本發(fā)明的治療后，表現(xiàn)出一種或多種出血障礙癥狀的改善，包括諸如縮短血液凝血時(shí)間和減少出血和/或減少因子置換治療需要的改善。
在某些實(shí)施方案中，多次治療有效劑量的組合物包含一種或多種NASPs和/或其它治療劑，例如止血?jiǎng)?、血液因子或其它?yīng)給予的藥物。盡管不是必需的，本發(fā)明的組合物通常是經(jīng)口、通過(guò)注射(皮下、由靜脈內(nèi)或肌內(nèi))、通過(guò)輸注或局部給予。藥物制劑可在剛給藥前以液體溶液或混懸液形式存在，但也可以其它方式存在，例如糖漿劑、霜?jiǎng)?、軟膏劑、片劑、膠囊、粉劑、凝膠、基質(zhì)、栓劑等等。亦考慮其它給藥方式，例如肺、直腸、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、鞘內(nèi)、心包、動(dòng)脈內(nèi)、大腦內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)等等。依照本領(lǐng)域公知的任何醫(yī)學(xué)上可接受的方法，包含NASPs和其它試劑的藥物組合物可使用相同或不同的給藥途徑給予。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用于局部遞送NASP，例如用于治療損傷、受傷或外科手術(shù)所引起的出血。根據(jù)本發(fā)明的制劑也適合于局部治療。例如，可通過(guò)在出血部位注射或以固體、液體或軟膏劑的形式給予NASP，優(yōu)選通過(guò)膠帶或傷口覆蓋物給予。亦可使用栓劑、膠囊特別是抗胃液膠囊、滴劑或噴霧劑。選擇具體的制劑和合適的給藥方法以靶向出血部位。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含NASPs和/或其它試劑的藥物組合物被預(yù)防性地給予，例如在計(jì)劃的外科手術(shù)前進(jìn)行。對(duì)于具有已知之前存在凝血障礙的受治療者而言，這樣的預(yù)防性應(yīng)用特別有價(jià)值。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，包含NASPs和/或其它試劑的藥物組合物是持續(xù)釋放劑型或使用持續(xù)釋放裝置給藥的劑型。這樣的裝置是本領(lǐng)域眾所周知的，包括例如，透皮貼劑和微型植入泵。所述微型植入泵能在一段時(shí)間內(nèi)以連續(xù)、穩(wěn)定的方式在不同劑量下使用非持續(xù)釋放的藥物組合物，以提供藥物遞送以達(dá)到持續(xù)釋放效果。
本發(fā)明也提供了一種將含有在此提供的NASP的結(jié)合物給予患者的方法，該患者所患的病癥對(duì)該含有NASP的結(jié)合物或組合物有響應(yīng)。所述方法包括通過(guò)任何在此描述的方式給予治療有效量的結(jié)合物或藥物遞送系統(tǒng)，優(yōu)選的是作為藥物組合物一部分所提供。該給藥方法可用于治療任何響應(yīng)NASP治療的病癥。更特別地，在此的組合物能有效地治療出血障礙，包括血友病A，血友病B，血管性血友病，原發(fā)性血小板減少癥，一種或多種接觸因子的缺乏，例如凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶和高分子量激肽原(HMWK)，一種或多種與臨床上明顯可見(jiàn)的出血相關(guān)的凝血因子的缺乏，例如凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II(低凝血酶原血)和血管性血友病因子，維生素K缺乏癥，纖維蛋白原病癥包括纖維蛋白原缺乏血癥，低纖維蛋白原血癥和異常纖維蛋白原血癥，α2-抗血纖蛋白酶缺乏癥以及過(guò)量流血，例如由肝病、腎臟病、血小板減少癥、血小板機(jī)能障礙、血腫、內(nèi)出血、關(guān)節(jié)積血、外科手術(shù)、創(chuàng)傷、低體溫、行經(jīng)以及懷孕引起的過(guò)量流血。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白特定NASP所能有效治療的病癥。所要給予的實(shí)際劑量取決于受治療者的年齡、體重和一般狀況以及被治療的病癥的嚴(yán)重程度、衛(wèi)生保健專(zhuān)家的評(píng)價(jià)以及要給予的結(jié)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定治療有效量，并可依每一特定病例之特定需求而調(diào)節(jié)。
一般來(lái)說(shuō)，治療有效量應(yīng)在每日約0.01mg/kg至200mg/kg的NASP范圍內(nèi)，更優(yōu)選每日約0.01mg/kg至20mg/kg，最優(yōu)選每日約0.02mg/kg至2mg/kg。更適宜地，這樣的劑量在0.01-50mg/kg每天四次(QID)、0.01-10mg/kg QID、0.01-2mg/kg QID、0.01-0.2mg/kg QID、0.01-50mg/kg每天三次(TID)、0.01-10mg/kg TID、0.01-2mg/kg TID、0.01-0.2mg/kg TID、0.01-100mg/kg每天兩次(BID)、0.01-10mg/kg BID、0.01-2mg/kg BID或0.01-0.2mg/kg BID的范圍內(nèi)。所給予的化合物的量取決于特定NASP的效力和量值或期望的促凝血?jiǎng)┬Ч约敖o藥途徑。
NASP(再次，優(yōu)選作為藥物制劑的一部分提供)可單獨(dú)給藥或與其它NASPs或諸如止血?jiǎng)?、血液因子或其它用于治療特定病癥或疾病的藥物的治療劑聯(lián)合給藥，根據(jù)臨床醫(yī)師的判斷、患者的需要等等依照多種給藥方案給藥。特定的給藥方案應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并可使用常規(guī)方法通過(guò)試驗(yàn)確定。例證性的給藥方案包括但不限于，每天5次、每天4次、每天3次、每天兩次、每天一次、每周3次、每周兩次、每周一次、每月兩次、每月一次給藥以及它們?nèi)我獾慕M合。優(yōu)選的組合物是那些需要?jiǎng)┝坎怀^(guò)每天一次的。
NASP可在其它試劑給予之前、給予同時(shí)或給予之后給予。如果與其它試劑同時(shí)提供，則NASP可在相同或不同的組合物中提供。因此，在同時(shí)治療中NASPs和其它試劑可被單獨(dú)給予個(gè)體。“同時(shí)治療”意指給予受治療者物質(zhì)組合使得在受治療者經(jīng)受治療過(guò)程中產(chǎn)生其治療效果。例如，可通過(guò)給予一劑量的包含NASP的藥物組合物和一劑量的包含至少一種其它試劑的藥物組合物以實(shí)現(xiàn)同時(shí)治療，所述其它試劑例如止血?jiǎng)┗蚰蜃?如FVIII或FDC)，依照特定的給藥方案該組合包含治療有效的劑量。同樣地，一種或多種NASPs和治療劑可以在至少一次治療劑量下給予。單獨(dú)藥物組合物的給藥可同時(shí)進(jìn)行或在不同時(shí)間進(jìn)行(即順次、以任一種次序，在同一天或在不同天給藥)，只要受治療者經(jīng)受治療過(guò)程中產(chǎn)生這些物質(zhì)組合的治療效果即可。
F.應(yīng)用在一方面，在本發(fā)明的方法中，NASPs可被用于改善在治療出血障礙，特別是那些與凝血因子缺乏相關(guān)的出血障礙中的止血，或逆轉(zhuǎn)受治療者中抗凝血?jiǎng)┬?yīng)。給予受治療者NASPs，以治療出血障礙，包括先天性凝血功能障礙、后天性凝血功能障礙和由創(chuàng)傷引起的出血病癥?？捎肗ASPs治療的出血障礙的實(shí)例包括但不限于，血友病A，血友病B，血管性血友病，原發(fā)性血小板減少癥，一種或多種接觸因子的缺乏，例如凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶和高分子量激肽原(HMWK)，一種或多種與臨床上明顯可見(jiàn)的出血相關(guān)的凝血因子的缺乏，例如凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II(低凝血酶原血)和血管性血友病因子，維生素K缺乏癥，纖維蛋白原病癥包括纖維蛋白原缺乏血癥，低纖維蛋白原血癥和異常纖維蛋白原血癥，α2-抗血纖蛋白酶缺乏癥以及過(guò)量流血，例如由肝病、腎臟病、血小板減少癥、血小板機(jī)能障礙、血腫、內(nèi)出血、關(guān)節(jié)積血、外科手術(shù)、創(chuàng)傷、低體溫、行經(jīng)以及懷孕引起的過(guò)量流血。在某些實(shí)施方案中，NASPs被用于治療包括血友病A、血友病B和血管性血友病的先天性凝血功能障礙。在其它實(shí)施方案中，NASPs被用于治療后天性凝血功能障礙，包括凝血因子VIII、血管性血友病因子、凝血因子IX、凝血因子V、凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II和凝血因子X(jué)III缺乏，特別是由由凝血因子抑制劑或抗凝血因子的自身免疫所引起障礙，或由減少的凝血因子合成所引發(fā)的疾病或病癥引起的止血障礙。
患者的需要應(yīng)取決于所要治療的具體出血障礙。例如，可在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)以多次劑量給予NASP以治療慢性病癥(如先天性或后天性凝血因子缺乏)?；蛘撸谙鄬?duì)短的時(shí)間內(nèi)，例如一到兩周，以單次或多次劑量給予NASP以治療急性病癥(如由外科手術(shù)或或創(chuàng)傷或在接受凝血置換療法的受治療者中凝血因子抑制劑/自身免疫事件引起的出血)。此外，可將NASP治療與其它止血?jiǎng)?、血液因子以及藥物?lián)合使用。例如，可給予受治療者治療有效量的一種或多種選自由凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子組成的組中的因子。治療可進(jìn)一步包含給予促凝血?jiǎng)?，例如?nèi)源性凝血途徑活化劑，包括凝血因子X(jué)a、凝血因子Ixa、凝血因子X(jué)ia、凝血因子X(jué)IIa和VIIIa、前激肽釋放酶和高分子量激肽原；或外源性凝血途徑活化劑，包括組織因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子X(jué)a。此外，在經(jīng)歷過(guò)量流血的受治療者中，可能需要輸入血液制品以補(bǔ)充失血，在損傷的病例中，可能需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖中g(shù)修補(bǔ)來(lái)停止出血。
本發(fā)明也提供了一種用于逆轉(zhuǎn)受治療者中抗凝血?jiǎng)┬?yīng)的方法，所述方法包括給予受治療者治療有效量的含NASP的組合物。在某些實(shí)施方案中，所述受治療者已用抗凝血?jiǎng)┲委煟隹鼓獎(jiǎng)┌ǖ幌抻诟嗡?、諸如丙酮芐羥香豆素或雙香豆素的香豆素衍生物、TFPI、ATIII、狼瘡抗凝物、線(xiàn)蟲(chóng)抗凝肽(NAPc2)、活性位點(diǎn)封閉的凝血因子VIIa(凝血因子VIIai)、凝血因子IXa抑制劑、凝血因子X(jué)a抑制劑，包括磺達(dá)肝癸鈉(fondaparinux)、依達(dá)肝癸鈉(idraparinux)、DX-9065a和瑞扎沙班(razaxaban)(DPC906)、凝血因子Va和VIIIa抑制劑，包括激活蛋白C(APC)和可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白、凝血酶抑制劑，包括水蛭素、比伐盧定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)和希美加曲(ximelagatran)。在某些實(shí)施方案中，所述受治療者中的抗凝血?jiǎng)┛梢允墙Y(jié)合凝血因子的抗體，包括但不限于結(jié)合凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II、凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、血管性血友病因子、前激肽釋放酶或高分子量激肽原(HMWK)的抗體。
在某些實(shí)施方案中，NASP可單獨(dú)給藥或與一種或多種不同的NASPs共同給藥和/或與一種或多種其它治療劑聯(lián)合給藥，以逆轉(zhuǎn)受治療者中抗凝血?jiǎng)┬?yīng)。例如，可給予受治療者治療有效量的包含NASP和一種或多種因子的組合物，所述因子選自由凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子組成的組。治療可進(jìn)一步包括給予促凝血?jiǎng)鐑?nèi)源性凝血途徑活化劑，包括凝血因子X(jué)a、凝血因子Ixa、凝血因子X(jué)ia、凝血因子X(jué)IIa和VIIIa、前激肽釋放酶和高分子量激肽原；或外源性凝血途徑活化劑，包括組織因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子X(jué)a。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種治療經(jīng)受外科或侵入性操作的受治療者以改善其凝血的方法，所述方法包括給予受治療者治療有效量的包含非抗凝血的硫酸多糖(NASP)的組合物。在某些實(shí)施方案中，NASP可單獨(dú)給予或與一種或多種不同的NASPs共同給予和/或與一種或多種其它治療劑聯(lián)合給予經(jīng)受外科或侵入性操作的患者。例如，可給予受治療者治療有效量的一種或多種因子，所述因子選自由凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子組成的組。治療可進(jìn)一步包括給予促凝血?jiǎng)?，例如?nèi)源性凝血途徑活化劑，包括凝血因子X(jué)a、凝血因子Ixa、凝血因子X(jué)ia、凝血因子X(jué)IIa和VIIIa、前激肽釋放酶和高分子量激肽原；或外源性凝血途徑活化劑，包括組織因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子X(jué)a。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種抑制TFPI活性的方法，包括將包含TFPI的組合物與足夠量的NASP結(jié)合以抑制TFPI活性。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)一種方法抑制受治療者中TFPI活性，該方法包括給予受治療者治療有效量的包含NASP的組合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抑制生物樣品中TFPI活性的方法，所述方法包括將生物樣品(如血液或血漿)與足夠量的NASP結(jié)合以抑制TFPI活性。
III.實(shí)驗(yàn)以下是用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明特定實(shí)施方案的實(shí)例。這些實(shí)例僅作為例證性的目的來(lái)提供，并不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
所使用的數(shù)值(如量、溫度等)的精確度均能得到確保，但應(yīng)當(dāng)允許某些試驗(yàn)誤差和偏差的存在。
實(shí)施例1材料和方法A.試劑肝素和改性的肝素，以及巖藻依聚糖購(gòu)自Sigma(St.Louis，MO)。戊聚糖多硫酸鈉(PPS)的來(lái)源是處方藥物Elmiron，獲自O(shè)rtho-McNeilPharmaceuticals(Raritan，NJ)。人血漿獲自George King Biomedical(Overland Park，KS)。凝血因子VIIa和人重組TFPI獲自AmericanDiagnostica(Stamford，CT)，凝血因子VIII是處方藥物ReFactoR，獲自Wyeth Pharmaceuticals(Madison，NJ)。SIMPLASTIN EXCEL和APTT試劑獲自bioMerieux(Durham，NC)或Organon Teknika(Roseland，NewJersey)。
B.動(dòng)物Hem-A小鼠(外顯子16FVIII KO等位基因純合的)是John HopkinsUniversity所許可的，Hem-B小鼠(外顯子1-3FIX KO純合的)是University of North Carolina at Chapel Hill所許可的。所有涉及的動(dòng)物操作均根據(jù)“Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals”(National Research Council.Guide for the care and use oflaboratory animals.Washington，D.CNational Academy Press；1996)進(jìn)行，所有的操作均經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(institutionalanimal care and use committee)檢查和核準(zhǔn)。
C.凝集測(cè)定活化部分凝血激酶時(shí)間(aPTT)測(cè)定aPTT測(cè)定按如前所述有所修改(PDR Staff.Physicians′DeskReference.2004，Anderson Lo，Barrowcliffe，T.W.，Homier，E.，Johnson，E.A.，Sims，G.E.C.Thromb.Res.1976；9575-580)。將25mM CaCl2和血纖蛋白杯(Fisher)在37℃下預(yù)保溫。添加0.1ml解凍的人血漿(正?；蜓巡〉?到保溫的試管中。在室溫下，5μl鹽水(如Sigma)或溶解于鹽水中的5μl測(cè)試試劑(如NASP)與95μl血漿溫育30分鐘。在3ml蒸餾水中重建APTT試劑(如Organon Teknika)，并將0.1ml的含APTT試劑的重建溶液添加到每個(gè)試管中。將含有測(cè)試試劑或鹽水對(duì)照及aPTT試劑的0.2ml血漿從試管中轉(zhuǎn)移到預(yù)保溫的血纖蛋白杯中并溫育2-3分鐘。添加0.1ml預(yù)保溫的25mM CaCl2以啟動(dòng)凝血并用BBL FIBROSYSTEM血纖蛋白儀(fibrometer)測(cè)定血漿凝固時(shí)間。
稀釋凝血酶原時(shí)間(dPT)測(cè)定所使用的dPT測(cè)定是經(jīng)修改的標(biāo)準(zhǔn)臨床PT測(cè)定(Nordfang等.(1991)Thromb Haemost 66464-467；Welsch等.(1991)Thrombosis Research64213-222)。用廠(chǎng)商稀釋劑重建SIMPLASTTN EXCEL凝血激酶試劑(Organon Teknika)并在0.9％鹽水中進(jìn)一步稀釋到1∶100。在啟動(dòng)測(cè)定前于37℃下預(yù)保溫凝血激酶試劑、25mM CaCl2和血漿樣品。在微量離心管中等分100μl解凍的血漿。對(duì)于TFPI活性測(cè)定，添加5μl鹽水(如Sigma)或5μl測(cè)試試劑(如硫酸多糖)到95μl血漿中并在室溫下溫育約30分鐘。添加100μl稀釋的凝血激酶試劑和100μl 25mM CaCl2到在37℃預(yù)保溫的血纖蛋白杯(Fisher)中。將100μl含有測(cè)試試劑或鹽水對(duì)照的血漿(正?；蜓巡〉?添加到含有凝血激酶試劑和CaCl2的血纖蛋白杯中以啟動(dòng)凝血。使用BBL FIBROSYSTEM血纖蛋白儀(fibrometer)測(cè)定血漿凝血時(shí)間。
動(dòng)物出血時(shí)間測(cè)定該出血時(shí)間測(cè)定可用于在給予測(cè)試試劑(如載體對(duì)照或NASP)后，于正?；蜓巡?FVIII或FIX或vWF缺乏)嚙齒動(dòng)物中測(cè)量止血功能的改變。經(jīng)口、腸胃外或通過(guò)連續(xù)輸注每日一次或兩次給予嚙齒動(dòng)物測(cè)試試劑(如載體對(duì)照或NASP)。例如，可用小的量針將0.1ml/10g體重(肩胛下)的測(cè)試試劑以0.1-10mg/kg的劑量范圍每日給予兩次，持續(xù)至少一天，優(yōu)選超過(guò)3天。在測(cè)定出血時(shí)間的這一天，用氯胺酮/甲苯噻嗪(或異氟烷)麻醉嚙齒動(dòng)物。在無(wú)菌襯墊上排齊嚙齒動(dòng)物，將尾部浸入盛鹽水的皮氏培養(yǎng)皿中。將EMLA乳酪施用于嚙齒動(dòng)物尾部所要切口的部位。對(duì)于小鼠，剪斷尾部末梢，將尾部置于鹽水培養(yǎng)皿中并啟動(dòng)計(jì)時(shí)器。對(duì)于大鼠，在其尾部的背側(cè)部位切一8mm長(zhǎng)1mm深的切口，然后轉(zhuǎn)移到鹽水中。記錄在鹽水中可見(jiàn)出血停止的時(shí)間。對(duì)于嚙齒動(dòng)物，正常對(duì)照小鼠的出血時(shí)間約為10分鐘，正常對(duì)照大鼠的為6分鐘。在出血時(shí)間測(cè)定完成后，用無(wú)菌紗布(gauge)干燥嚙齒動(dòng)物尾部，檢驗(yàn)止血情況，并將嚙齒動(dòng)物放回到籠子中。如果需要可在切口部位施用硝酸銀。
或者，可通過(guò)其它方法在小鼠(Broze等.(2001)Thromb.Haemost.85747-748)或狗(Scallan等.(2003)Blood 1022031-2037；Pijnappels等.(1986)Thromb.Haemost.5570-73)中測(cè)定出血時(shí)間?？蛇x的或其他的藥效終點(diǎn)可包括從NASP-處理的受治療者中抽血，用于直接分析或用于血漿分離以及測(cè)量離體凝血時(shí)間(如全血凝血時(shí)間和/或PT和/或APTT)或凝血因子水平。
全血凝血時(shí)間(WBCT)測(cè)定WBCT測(cè)定進(jìn)行如下。在異氟烷室中簡(jiǎn)單地將小鼠麻醉。然后從后眼窩血管叢抽血(如150μl)到塑料血液收集試管中。將試管置于37℃水浴中并使用秒表測(cè)定凝血時(shí)間。在這一期間，每隔1分鐘倒置試管一次。測(cè)定凝血(完全/非部分凝血)所需時(shí)間。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)于凝集測(cè)定，使用學(xué)生t-檢驗(yàn)(Student’s t-test)分析NASP處理的樣品和載體對(duì)照之間的顯著性。利用單向卡方分析(Chi-squaredanalysis)研究小鼠出血測(cè)試的數(shù)據(jù)較載體對(duì)照數(shù)據(jù)(或如下表所示的其它組)的顯著性。通過(guò)Fisher氏精確檢驗(yàn)(Fisher’s exact test)獲得幾乎一致的結(jié)果。
實(shí)施例2在dPT測(cè)定中TFPI增加了凝血時(shí)間進(jìn)行以下試驗(yàn)以證實(shí)在dPT測(cè)定中TFPI增加了凝血時(shí)間，并測(cè)定供隨后NASP試驗(yàn)使用的TFPI濃度。在鹽水中將100μg/mL TFPI母液(American Diagnostica，Stamford，CT)進(jìn)行連續(xù)稀釋以產(chǎn)生如下濃度的TFPI溶液20、15、10、6和2μg/mL。將5μl的這些TFPI稀釋液與95μl的FVIII缺乏的血漿混合并在室溫下溫育30分鐘。dPT測(cè)定進(jìn)行如下在鹽水中以1∶100稀釋SIMPLASTIN凝血激酶并預(yù)保溫在37℃下。將25mM CaCl2和100μl含TFPI的測(cè)試血漿在37℃預(yù)保溫。將100μl SIMPLASTIN凝血激酶和100μl CaCl2混合并使用BBL血纖蛋白儀測(cè)定凝血時(shí)間。結(jié)果概述于表1中。
表1TFPI存在下的凝血時(shí)間

TFPI增加了Hem-A血漿的凝血時(shí)間，具有線(xiàn)性劑量響應(yīng)(見(jiàn)圖1)?；谶@些數(shù)據(jù)，選擇0.5μg/ml濃度的TFPI用于NASP促凝血?jiǎng)┕δ艿臏y(cè)定。
實(shí)施例3篩選NASPs對(duì)包括改性的肝素、戊聚糖多硫酸酯和巖藻依聚糖的硫酸多糖化合物的抗凝血活性進(jìn)行測(cè)試，并與肝素比較以確定它們是否具有“非抗凝血”資格。所測(cè)試的化合物列于表2中。
表2用于測(cè)試抗凝血活性的NASPs

將測(cè)試化合物稀釋到100μM、10μM、2μM和200nM。對(duì)于每一測(cè)試化合物，添加12.5μl含測(cè)試化合物的稀釋溶液到237.5μl的Hem-A血漿中并在室溫下溫育。移取100μl含測(cè)試化合物的血漿用于如實(shí)施例2所述血漿凝血時(shí)間的dPT測(cè)定。結(jié)果概述于下表3中。
表3
根據(jù)dPT測(cè)定NASPs對(duì)凝血時(shí)間*的影響

*所示值是所選擇多糖的凝血時(shí)間(s)。在缺少NASPs下Hem-A血漿的凝血時(shí)間為41.5秒。
如表3和圖2所示，超過(guò)10nM濃度的肝素明顯抗凝，而N-乙?；嗡?NAH)、N-乙?；?脫-O-硫酸化肝素(NA-de-O-SH)、脫-N-硫酸化肝素(De-N-SH)在＞5000nM濃度下則顯示很小的凝血時(shí)間延長(zhǎng)或不延長(zhǎng)凝血時(shí)間。同樣地，巖藻依聚糖和PPS分別是弱抗凝血的，與肝素相比，在約10-至100-倍更高的濃度下顯示50％的凝血時(shí)間延長(zhǎng)，因此稱(chēng)為“非抗凝血的”。使用正常的人血漿觀(guān)察到了幾乎一致的分布圖(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例4根據(jù)aPTT測(cè)定NASPs對(duì)人血漿凝集的影響同樣使用aPTT測(cè)定法測(cè)定NASPs對(duì)血漿凝血時(shí)間的影響，以確定它們是否具有“非抗凝血”資格。在人Hem-A血漿中制備FACT稀釋液，一種“正常的”人參照血漿(George King Biomedical)，以產(chǎn)生具有0.31-100％正常血漿濃度的血漿。然后aPTT測(cè)定進(jìn)行如下將100μl的FACT-Hem-A血漿混合液與100μl的aPTT試劑混合并在37℃下溫育3分鐘。添加100μl的CaCl2并使用BBL血纖蛋白儀測(cè)定血漿凝血時(shí)間。結(jié)果如表4所示。
表4FACT濃度對(duì)凝血時(shí)間的影響

基于此數(shù)據(jù)，選擇1.25％的FACT濃度用于篩選用于促凝血?jiǎng)┗钚缘腘ASPs的測(cè)定。NASPs對(duì)血漿凝血時(shí)間的影響測(cè)定如下將5μl的NASP添加到95μl的在人Hem-A血漿中稀釋的1.25％FACT中，并在室溫下溫育30分鐘。如實(shí)施例1所述進(jìn)行aPTT測(cè)定，以確定血漿凝血時(shí)間。結(jié)果如表5所示。
表5根據(jù)aPTT測(cè)定NASPs對(duì)血漿凝血時(shí)間的影響


通過(guò)在A(yíng)PTT凝集測(cè)定中使用Hem-A血漿評(píng)估三種化合物，證實(shí)了對(duì)“NASP”活性的進(jìn)一步驗(yàn)證。與肝素相比，對(duì)于巖藻依聚糖、PPS和NAH產(chǎn)生大約50％凝血時(shí)間延長(zhǎng)的濃度分別高于肝素的10-或100-或＞500倍(見(jiàn)圖3)。
實(shí)施例5利用NASPs抑制TFPI活性A.在添加到血漿前預(yù)溫育TFPI和NASPs在dPT凝集測(cè)定中使用正常的或血友病血漿以及添加的重組TFPI，以評(píng)估NASPs對(duì)TFPI活性的抑制。在添加血漿前將稀釋的重組TFPI與NASPs在室溫下預(yù)溫育5分鐘。添加血漿后，將混合液再溫育25分鐘，隨后啟動(dòng)dPT。在Hem-A血漿中進(jìn)行的測(cè)定結(jié)果如表6和圖4所示。
表6NASP抑制Hem-A血漿中TFPI活性


Hem-A血漿本身的凝血時(shí)間是44秒。
Hem-A血漿+TFPI的凝血時(shí)間是151秒。
取決于試驗(yàn)和人血漿來(lái)源，TFPI在約0.5μg/ml的最終濃度下將血漿的凝血時(shí)間從約40秒延長(zhǎng)到100-200秒。如果TFPI活性受硫酸多糖抑制，則在NASPs存在下應(yīng)觀(guān)察到凝血時(shí)間的縮短(參見(jiàn)Nordfang等.(1991)Thromb.Haemost.66(4)464-467)。如圖4所示，添加大于1nM濃度的巖藻依聚糖和PPS明顯加速了含TFPI的Hem-A血漿的凝集。相比之下，NAH需要大約100nM的濃度才能縮短凝血時(shí)間，而肝素(未顯示)則僅能延長(zhǎng)凝血時(shí)間。重要的是，在PPS或巖藻依聚糖在最佳濃度下，凝血時(shí)間縮短到無(wú)TFPI或載體對(duì)照水平，或稍微低于該水平，TFPI效應(yīng)中和幅度橫跨至少100-倍范圍(如5-500nM)。
此外，也在Hem-B和正常血漿中測(cè)試了TFPI存在下NASPs加速血漿凝集。在Hem-B血漿中進(jìn)行的測(cè)定結(jié)果如表7和圖5所示。
表7NASP抑制Hem-B血漿中TFPI活性

僅有Hem-B血漿，無(wú)TFPI的凝血時(shí)間46秒。
Hem-B血漿+TFPI的凝血時(shí)間101秒。
在Hem-B血漿(表7和圖5)和正常人血漿(數(shù)據(jù)未顯示)中，類(lèi)似地證實(shí)了NASPs通過(guò)抑制TFPI活性來(lái)加速血漿凝集的假設(shè)。NASPs之間效力的等級(jí)次序與Hem A血漿研究相同，濃度響應(yīng)分布圖也幾乎相同。
B.TFPI不與NASPs預(yù)溫育下對(duì)TFPI活性的抑制在暴露于血漿前不進(jìn)行硫酸多糖和TFPI的預(yù)溫育，而重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)。為增加NASP抑制TFPI活性測(cè)試的嚴(yán)格性，在添加NASP前先將TFPI添加到血漿中。結(jié)果示于表8和圖6中。
表8在Hem-A血漿中無(wú)預(yù)溫育下NAH和PPS對(duì)TFPI的抑制

HemA+TFPI183秒僅有Hem-A，無(wú)TFPI45秒如圖6所描述，清楚地證實(shí)了NASPs在Hem A血漿中與在預(yù)溫育研究(圖4)中具有相同的凝血時(shí)間加速特性以及幾乎相同的劑量響應(yīng)分布圖。有趣的是，巖藻依聚糖是最有效的，明顯加速凝集的濃度窗口大于100-倍。因此，這些研究確定了某些NASPs例如PPS和巖藻依聚糖可顯示出TFPI中和活性，且這種效力在十分寬的濃度范圍中都得到了證實(shí)，而在這些濃度范圍內(nèi)未觀(guān)察到網(wǎng)狀抗凝。
實(shí)施例6在缺少TFPI補(bǔ)充物下NASPs對(duì)血友病血漿凝血的改善同樣地，在dPT測(cè)定中也測(cè)試了在缺少TFPI補(bǔ)充物下，NASPs加速因子缺乏的血漿凝集的能力。如果觀(guān)察到促凝血?jiǎng)╉憫?yīng)，則可能是與內(nèi)源TFPI活性的中和相關(guān)，其在人血漿中的濃度大約為100ng/ml(Nordfang等.，見(jiàn)上)，很大程度上與脂蛋白或血小板相關(guān)(Broze等.(1992)Semin.Hematol.29159-169；Broze等.(2003)J.Thromb.Haemost.11671-1675)。
A.在缺少外源TFPI下Hem-A血漿凝集的加速對(duì)在缺少外源TFPI下，NASPs加速Hem-A血漿凝集的能力進(jìn)行了測(cè)試。將巖藻依聚糖或PPS滴定入Hem A血漿中并進(jìn)行dPT測(cè)定。另外，對(duì)凝血因子VIIa的劑量響應(yīng)進(jìn)行分析，并作為放大外源性途徑活化的陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果示于圖7和表9中。
表9在缺少外源TFPI下Hem-A血漿凝集的加速

僅有Hem-A，無(wú)NASP的凝血時(shí)間69秒巖藻依聚糖和PPS都以劑量依賴(lài)性方式明顯地加速了凝血時(shí)間，巖藻依聚糖具有最好的效力和最高的功效。在其它研究中，在巖藻依聚糖存在下，促凝血?jiǎng)┬?yīng)的窗口為約5nM至＞100nM。注意在圖7中，當(dāng)響應(yīng)曲線(xiàn)在巖藻依聚糖＞100nM的濃度處開(kāi)始偏向上時(shí)，相對(duì)于載體對(duì)照仍然加速了凝集，因此巖藻依聚糖是促凝血?jiǎng)?。雖然在20nM巖藻依聚糖下，凝血時(shí)間從約70秒縮短到55秒并無(wú)大的差別，但NAH沒(méi)有活性。在先前使用像FVIIa和凝血酶的促凝血?jiǎng)┮蜃又袠I(yè)已觀(guān)察到了這樣的加速。因此，將FVIIa添加到20nM加速凝血時(shí)間約20秒，優(yōu)于巖藻依聚糖(圖7)。但是，有趣的是注意到20nM巖藻依聚糖與5nM FVIIa的藥理學(xué)濃度是可比較的。
B.在缺少外源TFPI下Hem-B血漿和FVII-缺乏的血漿的凝集的加速通過(guò)在Hem B血漿和FVII缺乏的血漿中測(cè)試NASP活性，評(píng)估NASPs對(duì)其它人出血障礙的表觀(guān)促凝血?jiǎng)┗钚?。在Hem-B血漿中觀(guān)察到了與Hem-A血漿類(lèi)似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
在dPT測(cè)定中也評(píng)估了對(duì)凝血因子VII-缺乏的血漿凝集的調(diào)節(jié)。如所預(yù)期的，F(xiàn)VII-缺乏的血漿因沒(méi)有FVIIa重建而無(wú)法在300秒內(nèi)凝集。添加FVIIa到約0.1nM使凝血時(shí)間恢復(fù)到約150秒(數(shù)據(jù)未顯示)。在dPT測(cè)定中顯示出的這樣的凝血時(shí)間的變化，模仿了人凝血因子VII-缺乏的某些形式。將巖藻依聚糖和PPS滴定到FVII-缺乏的血漿中加速了凝血時(shí)間。結(jié)果示于圖8和表10中。
表10在缺少外源TFPI下凝血因子VII-缺乏的血漿凝集的加速


無(wú)NASP，無(wú)FVIIa凝血時(shí)間＞300秒無(wú)NASP，+0.1nM FVIIa凝血時(shí)間173秒如圖8所示，巖藻依聚糖和PPS的滴定加速了凝血因子VII-缺乏的血漿的凝集，且如用Hem A血漿所觀(guān)察到的，巖藻依聚糖較PPS明顯更有效。另外，治療窗口擴(kuò)寬；就巖藻依聚糖而言，在約10nM-500nM濃度范圍內(nèi)就能觀(guān)察到實(shí)質(zhì)上的凝集加速。
實(shí)施例7NASP-處理的小鼠中改善的止血用PPS和巖藻依聚糖處理Hem A或Hem B小鼠，以評(píng)估體內(nèi)潛在的止血改善。將NASPs進(jìn)行皮下注射，所用劑量是患血友病小鼠能很好地合理耐受的常用劑量，且通過(guò)該途徑的不同硫酸多糖的生物利用度已得到確定(MacGregor等.(1985)Thromb.Haemost.53411-414；Millet等.(1999)Thromb.Haemost.81391-395)。PPS和巖藻依聚糖半衰期可短至1-2小時(shí)。因此，采用每日兩次的給藥方案。最初的研究表明持續(xù)幾天的劑量?jī)?yōu)選在1-2天內(nèi)的給予。
在已處理的小鼠中評(píng)估NASP處理對(duì)凝血調(diào)節(jié)的影響是基于幾個(gè)潛在的終點(diǎn)進(jìn)行的。這些潛在的終點(diǎn)包括用于dPT測(cè)定的血漿分離、用于全血凝血時(shí)間(WBCT)測(cè)定的血樣、急性出血時(shí)間以及剪尾或橫切口后的長(zhǎng)期存活，(Broze等.(2001)Thromb.Haemost.85747-748)。使用PPS和巖藻依聚糖的5-天體內(nèi)研究結(jié)果概述于表11-13中。
A.在Hem-A和Hem-B小鼠中PPS的功效測(cè)試了PPS對(duì)改善Hem-A和Hem-B小鼠凝血的功效。皮下給予Hem-A和Hem-B雄性小鼠或雌性小鼠0.02、0.06或0.2mg/kg劑量的PPS或鹽水載體，每天兩次持續(xù)5天。在給藥后第5天的早上，剪斷距末梢1cm的尾部，并在隨后的20-24小時(shí)內(nèi)監(jiān)測(cè)小鼠的行為和存活。結(jié)果示于表11中。
表11在PPS-處理的血友病小鼠中改善的止血

在切割尾部(t＝0)后，隨機(jī)分組小鼠并皮下給予指示劑，每天兩次持續(xù)4.5天。
#p＝0.07對(duì)載體用0.06mg/kg的PPS對(duì)Hem-A小鼠的處理顯示幾乎兩倍改善的存活，但是該結(jié)果并不是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(0.05＜p＜0.1)(表11)。療效還進(jìn)一步得到了對(duì)處理組不知情的技術(shù)人員目視觀(guān)察的支持。相對(duì)于載體對(duì)照，在中高劑量動(dòng)物中觀(guān)察到了更多的正常行為(較少的嗜睡和蹲伏)以及較小范圍的出血。同樣地，隨后對(duì)Hem-B小鼠使用0.06mg/kg皮下每天兩次更有效劑量的處理，產(chǎn)生了與在FVIII-缺乏的小鼠中所觀(guān)察到的相同的結(jié)果。
在dPT測(cè)定中進(jìn)一步測(cè)試了PPS在改善Hem-B小鼠凝血的功效。在研究前對(duì)所有的小鼠都放血以確定基線(xiàn)(預(yù)試驗(yàn))凝血時(shí)間。用PPS皮下處理小鼠(14周大)，每天兩次，持續(xù)4.5天，并采用如下劑量在250μl體積中的2、0.3和0.06mg/kg，。在4.5天后對(duì)小鼠放血并測(cè)定所收集血樣的凝血時(shí)間。結(jié)果示于表12中。
表12用PPS處理的Hem-B小鼠的凝血NASPs改善了dPT

未用過(guò)藥的Hem-B具有44-50秒的dPT。
B.在Hem-A小鼠中巖藻依聚糖的功效如上所述，已知在某些凝集測(cè)定中，與PPS相比，巖藻依聚糖具有改善的效力和功效量級(jí)。因此，在Hem-A小鼠中用巖藻依聚糖進(jìn)行了額外的研究。在使用巖藻依聚糖進(jìn)行的最初研究中，采用了幾乎與PPS所述的相同的給藥方案，但劑量水平稍有不同。以0.1或1.0mg/kg劑量皮下給予Hem-A雄性小鼠巖藻依聚糖或鹽水，每天兩次持續(xù)4天。在第5天的早上，在放血測(cè)試前給予小鼠兩倍劑量的巖藻依聚糖。與載體對(duì)照相比，評(píng)估用巖藻依聚糖處理的小鼠的存活和動(dòng)物行為。
在接下來(lái)的對(duì)巖藻依聚糖的研究中，評(píng)估了與凝血因子VIII聯(lián)合治療的潛力。除在第5天早上小鼠遠(yuǎn)離身體的尾靜脈中接受了53mU/小鼠FVIII(約1.25％的FVIII正常水平)的靜脈推注劑量之外，如上所述進(jìn)行該研究。之前，側(cè)面的尾靜脈而非動(dòng)脈在相應(yīng)于約2.7mm直徑的區(qū)域切斷2小時(shí)。在這些巖藻依聚糖研究中，使用了尾靜脈切斷的改進(jìn)處理，發(fā)現(xiàn)其能更精確地評(píng)估止血及其調(diào)節(jié)(Broze等，(2001)Thromb.Haemost.85747-748)。記錄存活和臨床觀(guān)察20-24小時(shí)。結(jié)果示于表13中。
表13巖藻依聚糖和巖藻依聚糖+FVIII在血友病A小鼠中的功效

在尾靜脈切口(t＝0)后，隨機(jī)分組小鼠并皮下給予載體或NASP，每天兩次持續(xù)4.5天。在此指出，在尾部切割前2小時(shí)給予FVIII。注意在這些小鼠中1％FVIII重建產(chǎn)生了-10％存活，而2％FVIII重建則提供了-100％存活。
*p＜0.05對(duì)載體+p＝0.06對(duì)載體#p＝0.06對(duì)巖藻依聚糖在最初的研究中，用0.1mg/kg劑量的巖藻依聚糖處理小鼠較1.0mg/kg劑量的處理似乎更有效(在約10小時(shí)處載體的存活是1/6，0.1mg/kg的是4/6以及1.0mg/kg的是3/6)。因此，用0.1mg/kg劑量的巖藻依聚糖進(jìn)行接下來(lái)的研究。
正如表13頂部?jī)尚兴砻鞯?，Hem A小鼠的巖藻依聚糖處理明顯改善了出血存活。如上所述，在所有巖藻依聚糖處理的小鼠中，在切口后最初8-10小時(shí)期間，動(dòng)物行為更加正常，在幾乎一半的動(dòng)物中很清楚得到了長(zhǎng)期改善。
通過(guò)用FVIII+/-巖藻依聚糖處理小鼠，預(yù)先評(píng)估了聯(lián)合治療的潛力(表13)。在尾部切口前2小時(shí)單獨(dú)給予Hem A小鼠的初步劑量導(dǎo)向研究表明，對(duì)于存活有著非常明顯的劑量響應(yīng)關(guān)系。給予正常的1％的ReFactoR產(chǎn)生約10％的存活，而給予正常的2％則產(chǎn)生約100％的存活(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，選擇1.25％劑量的FVIII重建以給出約50％的存活。值得注意的是，用巖藻依聚糖+FVIII處理組中的存活百分率一向高于用巖藻依聚糖或FVIII單獨(dú)處理的組中的存活百分率。因此，PPS和巖藻依聚糖研究結(jié)果表明，在選擇的NASP給予后，血友病動(dòng)物模型中的止血得到了改善。
結(jié)論著手了一系列的研究以測(cè)試NASPs在離體和體內(nèi)血友病模型中對(duì)凝血的改善。與肝素相比，硫酸多糖被確認(rèn)為具有相當(dāng)大程度上減少的抗凝血特性。那些NASPs的亞類(lèi)，即巖藻依聚糖和PPS則顯示出能有力地抑制凝血外源性途徑主要下調(diào)物—TFPI的活性。巖藻依聚糖和PPS改善了缺乏凝血因子VII、VIII或IX的人血漿的稀釋凝血酶原凝血時(shí)間。從血友病小鼠放血測(cè)試中顯然可見(jiàn)巖藻依聚糖或PPS體內(nèi)處理的療效。
PPS和巖藻依聚糖在較高濃度下均可顯示出抗凝血活性，很可能是與肝素輔因子II相互作用的結(jié)果(Church等，(1989)J.Biol.Chem.2643618-3623；Giedrojc等，(1999)J.Cardiovasc.Pharmacol.34340-345)。皮下給予大鼠PPS需要＞5mg/kg的劑量以延長(zhǎng)凝血(Giedrojc等，見(jiàn)上)，而巖藻依聚糖似乎在兔中具有良好的耐受性，甚至其劑量為靜脈內(nèi)給予10mg/kg(Granert等，(1999)Infect.Immun.672071-2074)。因此，目前的結(jié)果顯示在血友病嚙齒動(dòng)物中于＜0.1mg/kg劑量下止血得到改善。體內(nèi)改善止血的劑量水平低于引起其它所報(bào)告結(jié)果的劑量水平(Toida等，(2003)Trends in Glycoscience andGlycotechnology 1529-46；Luyt等，(2003)J.Pharmacol.Exp.Ther.30524-30；Berteau等，(2003)Glycobiology 1329R-40R；Granert等，見(jiàn)上；and Sweeney等，(2002)Blood 9944-51)。
不受特定理論限制，NASP對(duì)TFPI的抑制能部分地解釋為所觀(guān)察到的離體或體內(nèi)凝集的改善?？贵w對(duì)TFPI的中和已顯示出在兔Hem A模型中改善了止血，并加速了人血友病血漿凝血(Nordfang等，見(jiàn)上；Welsch等，見(jiàn)上；和Erhardtsen等，(1995)Blood Coagul.Fibrinolysis6388-394)。在目前的研究中，在血友病血漿dPT測(cè)定中，僅僅是那些抑制TFPI活性的化合物也減少了凝血時(shí)間。此外，與PPS相比，當(dāng)TFPI先混合入血漿以最好地模擬天然條件時(shí)，在dPT凝集測(cè)試中巖藻依聚糖顯示出更好的效力，而這或許是更強(qiáng)的最佳效應(yīng)。同樣地，與PPS相比，對(duì)小鼠用巖藻依聚糖處理產(chǎn)生了稍好的效力，盡管尚不明確的相對(duì)藥物動(dòng)力學(xué)可能會(huì)對(duì)出血效果有所影響。
值得注意的是在所有測(cè)試的NASPs中這樣的行為并不都是明顯的。例如，NAH僅具有弱的TFPI-中和活性(圖4-6)，在缺少TFPI添加下并不能加速血友病血漿的凝血時(shí)間(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，三種在高達(dá)5000nM的濃度下都無(wú)法顯示固有的抗凝血活性(圖2；De-N-S-AH、De-N-SH和NA-De-O-SH)的NASPs并未顯示出任何TFPI-中和活性，并且同樣地在HemA血漿中也無(wú)法加速凝血時(shí)間(數(shù)據(jù)未顯示)。
使用NASPs所觀(guān)察到的改善的止血量級(jí)似乎與臨床相關(guān)。在最佳巖藻依聚糖濃度下的Hem A血漿改善的凝血時(shí)間，可與已證實(shí)為在患者標(biāo)準(zhǔn)化的止血中有效的約5nM的FVIIa補(bǔ)充物(實(shí)施例6)相比較(Bishop等，(2004)Nat.Rev.Drug Discov.3684-694；Carcao等，(2004)BloodRev.18101-113；Roberts等，(2004)Anesthesiology 100722-730；Lee等，(2004)Int.Anes thesiol.Clin.4259-76；和Brummel等，(2004)J.Thromb.Haemost.21735-1744)。此外，用NASP處理小鼠明顯有利于其存活(實(shí)施例7)。在巖藻依聚糖加速凝血的dPT測(cè)定中，與用小鼠血漿相比，用人血友病血漿的效果更為明顯(數(shù)據(jù)未顯示)。
就NASP用于出血障礙的潛在臨床開(kāi)發(fā)而言，顯然要考慮到治療指數(shù)。具體來(lái)說(shuō)，該指數(shù)是指改善止血和轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓g的指數(shù)。根據(jù)諸如PPS或巖藻依聚糖的化合物在人血漿中的凝集測(cè)定結(jié)果，在抗-TFPI或加速dPT凝集“活性”和喪失這樣的功效及發(fā)生網(wǎng)狀抗凝血之間的差額應(yīng)似乎要＞50-倍。如上所述對(duì)于小鼠的研究，在小鼠中出現(xiàn)的該指數(shù)應(yīng)至少是10倍。此外，作為一類(lèi)物質(zhì)，肝素類(lèi)硫酸多糖通常是良好耐受的。
總之，全身給予選擇的NASPs代表的可能是一種獨(dú)特的用于在出血障礙中調(diào)節(jié)止血方法。特別是，戊聚糖多硫酸酯和巖藻依聚糖抑制了TFPI活性，并改善了人凝血因子VII-、VIII-和IX-缺乏的血漿中凝血。因此，NASP處理改善了止血，并代表了當(dāng)前的一種相對(duì)低成本、安全及便利的凝血因子治療的備選方法或補(bǔ)充。
盡管本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案業(yè)已得到說(shuō)明和描述，但是應(yīng)當(dāng)明白的是在此可進(jìn)行各種不背離本發(fā)明的精神和范圍的改變。
權(quán)利要求
1.非抗凝血的硫酸多糖(NASP)在制備用于治療需要增強(qiáng)凝血的受治療者的組合物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述NASP選自由N-乙?；?肝素(NAH)、N-乙?；?脫-0-硫酸化肝素(NA-de-o-SH)、脫-N-硫酸化肝素(De-NSH)、脫-N-硫酸化乙?；嗡?De-NSAH)、高碘酸氧化肝素(POH)、化學(xué)硫酸化海帶多糖(CSL)、化學(xué)硫酸化褐藻酸(CSAA)、化學(xué)硫酸化果膠(CSP)、硫酸葡聚糖(DXS)、肝素衍生的寡糖(HDO)、戊聚糖多硫酸酯(PPS)和巖藻依聚糖組成的組。
3.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中所述NASP是NAH。
4.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中所述NASP是PPS。
5.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中所述NASP是巖藻依聚糖。
6.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中所述NASP是在dPT測(cè)定中減少血液凝血時(shí)間的巖藻依聚糖的片段。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中NASP在約0.01 mg/kg至約100 mg/kg的劑量下給予。
8.前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中受治療者患有選自由慢性或急性出血障礙、由血液因子缺乏引起的先天性凝血功能障礙以及后天性凝血功能障礙組成的組的出血障礙。
9.權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中血液因子缺乏是一種或多種選自由凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、凝血因子X(jué)III和血管性血友病因子組成的組的因子缺乏。
10.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中對(duì)增強(qiáng)凝血的需要是在給予抗凝血?jiǎng)┗蜻M(jìn)行外科或其它侵入性操作之前。
11.前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中通過(guò)給予選自由促凝血?jiǎng)?nèi)源性凝血途徑活化劑、外源性凝血途徑活化劑和第二種NASP組成的組的試劑對(duì)受治療者作進(jìn)一步治療。
12.權(quán)利要求11的應(yīng)用，其中內(nèi)源性凝血途徑活化劑選自由凝血因子X(jué)a、凝血因子IXa、凝血因子X(jué)Ia、凝血因子X(jué)II a和VIIIa、前激肽釋放酶以及高分子量激肽原組成的組。
13.權(quán)利要求11的應(yīng)用，其中外源性凝血途徑活化劑選自由組織因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子X(jué)a組成的組。
14.前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中通過(guò)給予一種或多種選自由凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II、凝血因子VIIa和血管性血友病因子組成的組的因子，對(duì)受治療者作進(jìn)一步治療。
15.權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中抗凝血?jiǎng)┻x自由肝素、諸如丙酮芐羥香豆素或雙香豆素的香豆素衍生物、組織因子通道抑制劑(TFPI)、抗凝血酶III、狼瘡抗凝物、線(xiàn)蟲(chóng)抗凝肽(NAPc2)、活性位點(diǎn)封閉的凝血因子VIIa(凝血因子VIIai)、凝血因子IXa抑制劑、包括磺達(dá)肝癸鈉(fondaparinux)、依達(dá)肝癸鈉(idraparinux)、DX-9065a和瑞扎沙班(razaxaban)(DPC 906)在內(nèi)的凝血因子X(jué)a抑制劑、包括激活蛋白C(APC)和可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白在內(nèi)的凝血因子Va和VIIIa抑制劑、包括水蛭素、比伐盧定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)和希美加曲(ximelagatran)在內(nèi)的凝血酶抑制劑，以及結(jié)合凝血因子的抗體組成的組。
16.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中抗凝血?jiǎng)┦墙Y(jié)合凝血因子的抗體，所述凝血因子選自由凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II、凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、血管性血友病因子、前激肽釋放酶和高分子量激肽原(HMWK)組成的組。
17.非抗凝血的硫酸多糖(NASP)在制備用于抑制受治療者中TFPI活性的組合物中的應(yīng)用。
18.非抗凝血的硫酸多糖(NASP)在制備用于抑制生物樣品中TFPI活性的組合物中的應(yīng)用。
19.組合物，含有非抗凝血的硫酸多糖(NASP)；藥學(xué)上可接受的賦形劑；和一種或多種選自由凝血因子X(jué)I、凝血因子X(jué)II、前激肽釋放酶、高分子量激肽原(HMWK)、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X(jué)、凝血因子X(jué)III、凝血因子II和血管性血友病因子、組織因子、凝血因子VIIa、凝血因子Va和凝血因子X(jué)a、凝血因子IXa、凝血因子X(jué)Ia、凝血因子X(jué)IIa以及VIIIa組成的組中的因子。
20.治療需要增強(qiáng)凝血的受治療者的方法，包括給予所述受治療者治療有效量的含有非抗凝血的硫酸多糖(NASP)的組合物。
21.抑制受治療者中TFPI活性的方法，該方法包括給予受治療者治療有效量的含有非抗凝血的硫酸多糖(NASP)的組合物。
22.抑制生物樣品中TFPI活性的方法，該方法包括將生物樣品與足夠量的非抗凝血的硫酸多糖(NASP)結(jié)合以抑制所述TFPI活性。
23.在生物樣品中利用非抗凝血的硫酸多糖(NASP)測(cè)定凝血加速的方法，該方法包括a)將生物樣品與含有所述NASP的組合物結(jié)合，b)測(cè)定所述生物樣品的凝血時(shí)間，c)比較所述生物樣品與不暴露于NASP的相應(yīng)生物樣品的凝血時(shí)間，其中暴露于NASP的生物樣品的凝血時(shí)間的減少意味著NASP加速了凝血時(shí)間。
全文摘要
披露了使用非抗凝血的硫酸多糖(NASPs)作為促凝血?jiǎng)┯糜谥委煶鲅系K的方法。NASPs可作為單一試劑給藥或與另外的NASPs或其它藥物(例如凝血因子VII、VIII和IX)聯(lián)合給藥以促止血。特別是，描述了NASPs在治療包括先天性凝血功能障礙、后天性凝血功能障礙和創(chuàng)傷引起的出血病癥的出血障礙中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/717GK1984664SQ200580023658
公開(kāi)日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2005年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月27日
發(fā)明者科爾克·W·約翰遜 申請(qǐng)人:艾維根有限公司