專利名稱：：降低血壓的寡肽的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及對IPP的生產。
背景技術：
：高血壓是人類中相對常見的疾病狀態(tài)，其代表著對心血管疾病、腎衰竭和中風的流行風險因素。大量藥物產品(例如，鈣阻滯劑(blocker)、beta阻滯劑、利尿劑、alpha阻滯劑、中央alpha拮抗劑、血管緊張素II拮抗劑和ACE抑制劑)的有效性，展示出高血壓的基礎生理機制是多方面的。針對高血壓的生理機制，尤其是腎素-血管緊張素機制己引起了很多科學關注。在該機制中，血管緊張素由肝分泌，由肽酶腎素切割，以產生不具有生物活性的十肽血管緊張素I。隨著血管緊張素I經(jīng)過肺毛細血管，另一種被稱為血管緊張素轉化酶(下文中稱為ACE)的肽酶通過去除血管緊張素I的最后兩個殘基(His-Leu)作用于血管緊張素I，形成八肽血管緊張素II。血管緊張素II八肽展示出強大的血管收縮活性，因此提高了血壓。ACE抑制導致血管緊張素II水平降低，從而預防了血管收縮，因此預防了高血壓。除切割血管緊張素I之外，ACE還可水解緩激肽，這是也能參與血壓調控的一種九肽。在后一種機制中，ACE抑制導致緩激肽水平增加，這能促進血管舒張，也能降低血壓。抑制ACE因此通過至少兩種單獨的途徑導致血壓降低。還已知，八肽血管緊張素II刺激醛固酮通過腎上腺皮質釋放。醛固酮的目標器官是腎，在那里醛固酮促進腎小管對鈉的再吸收增加。通過這第三種機制，對ACE的抑制能降低血壓，但是在這種情況下，是通過消除鈉的再吸收來實現(xiàn)的。因為其多種生理學作用，對ACE蛋白水解活性的抑制是降低血壓的有效方法。該觀念導致產生了大量有效的藥物降血壓產品，例如卡托普利(captopril)和依那普利(enalapril)(Ondetti，M.A.etal.，1977，Science，WashingtonDC，196，441-444)。因為高血壓是相對常見的疾病狀態(tài)，用具有溫和活性的天然成分來控制這種現(xiàn)代生活方式造成的不想要的結果將是有利的。特別是能被加入到食物或飲料產品中的溫和活性天然成分，因為此類產品能有規(guī)律地被消耗?；蛘撸祟悳睾突钚缘奶烊怀煞挚杀话ㄟM膳食補充劑。最近數(shù)十年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵奶中存在的特定的肽具有ACE抑制能力，能在高血壓患者中誘導血壓降低。近來，大量體外試驗和一些動物試驗己證明了從多種蛋白來源獲得的不同的肽的ACE抑制作用。雖然體外ACE抑制檢驗已揭示出了許多不同的肽序列，但是必須強調，ACE抑制肽需要在血液中循環(huán)以施加體內影響。這暗示，有效的ACE抑制肽應當能抵抗腸胃蛋白水解消化系統(tǒng)的降解，并應當在隨后的腸道壁上轉運期間保持完整。對多種ACE抑制肽的結構-功能研究已暗示它們通常在其C-末端序列具有Pro-Pro、Ala-Pro或Ala-Hyp(Maruyama，S.andSuzuki，H.，1982；AgricBiolChem.，46(5)1393-1394)。該發(fā)現(xiàn)被下述事實部分解釋ACE是不能切割涉及脯氨酸的肽鍵的肽基二肽酶(EC3.4.15.1)。因此，不能從具有Xaa-Pro-Pro結構的三肽除去二肽Pro-Pro，因為Xaa-Pro鍵不能被切割開。因此能想到，如果具有Xaa-Pro-Pro結構的三肽以相對高的濃度存在，其將抑制ACE活性。因為不僅ACE而且?guī)缀跛械鞍姿饷笇τ谇懈頧aa-Pro或Pro-Pro鍵都有困難，肽的羧基末端存在(多個)脯氨酸殘基會產生相對來說具有蛋白抗性的分子這個觀點幾乎就是不言而喻的。類似地，含有代替脯氨酸的羥脯氨酸(Hyp)的肽相對而言是抗蛋白的。由此可以推斷出，在其羧基末端攜帶有一個或多個(羥)脯氨酸殘基的肽可能在胃腸道中避免被蛋白水解。這些結論將幫助我們理解特定ACE抑制肽顯著的體內降血壓作用它們不僅達到了ACE抑制的結構需求，并且還抵抗腸胃蛋白水解消化系統(tǒng)的降解在隨后腸道壁上轉運過程中保持完整。已經(jīng)報道了三肽Leu-Pro-Pro(JP02036127)、Val-Pro-Pro(EP0583074)和Ile-Pro-Pro(J.DairySci.，78777-7831995)的強大ACE抑制活性。起初對所有ACE抑制肽基于它們對ACE活性的體外影響進行分析，三肽Ile-Pro-Pro(下文中稱為IPP)、Val-Pro-Pro(下文中稱為VPP)和Leu-Pro-Pro(下文中稱為LPP)被選出，因為它們具有強大的ACE抑制作用，導致相對低的IC50值。后來，VPP以及IPP三肽的假定抗高血壓作用可在自發(fā)高血壓大鼠中得到驗證(Nakamuraetal.，J.DairySci.，7812531257(1995))。在這些實驗中，抑制性三肽是從乳酸細菌發(fā)酵的奶中獲得的。在奶發(fā)酵期間，想要的肽是通過生長中的乳酸細菌產生的蛋白酶產生的。這種發(fā)酵手段的缺點在于乳酸細菌是活的生物體，對其而言分泌的酶的類型和量都難于控制。ACE抑制肽的生產由此難于再現(xiàn)，而且也不太可能產生酶的最優(yōu)組以確保所需肽的最大產量。此外，需要的發(fā)酵時間相對較長，這與低產量一起暗示了對于生物活性肽而言不利的成本結構。此外，發(fā)酵的產物較不適合被直接加入到a.o.固體食物中，并且會產生嚴格的感官限制。此類發(fā)酵奶制品的差的美味程度，以及從此類發(fā)酵培養(yǎng)液中回收ACE抑制肽過程中遇到的許多加工困難已被描述于US6,428,812中。盡管有這些缺點，發(fā)酵奶制品已被作為口服血管減壓劑投入實踐應用。電滲析、中空纖維膜滲析或色譜方法之后從發(fā)酵奶制品中濃縮ACE抑制肽，已經(jīng)使其能以濃縮膳食補充劑的形式(例如，片劑或錠劑)出售。發(fā)酵生產途徑的上述缺點在a.o.專利申請WO01/68115和EP1231279中被認識到。在后一申請中，描述了純粹的酶促工藝，以從奶的酪蛋白中回收Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro。該申請要求保護一種用于生產這些三肽的方法，所述方法通過用蛋白酶和肽酶通過中間產物肽對含有奶的酪蛋白的物質進行消化來實現(xiàn)。這些酶溫育的每一種可能持續(xù)12小時長，并且在有利于微生物污染物生長的條件下進行。在與肽酶溫育之前，中間產物肽優(yōu)選被純化，高最終濃度的ACE抑制肽僅在對中間產物肽進行額外的色譜純化步驟之后獲得?？紤]到上述多種不利之處，人們需要更為簡單并且微生物學上更可信賴的酶促途徑，來產生具有高產率和可再現(xiàn)的抗高血壓肽的無味產品。
發(fā)明內容本發(fā)明涉及一種方法，用于生產包含來自蛋白來源的IPP的組合物，其中，從蛋白產生的IPP與VPP的比例為至少5∶1，優(yōu)選至少10∶1，更優(yōu)選至少20∶1(wt/wt)，所述方法優(yōu)選包含使用脯氨酸特異性內切蛋白酶或脯氨酰寡肽酶。本發(fā)明還涉及不具有氨基肽酶活性的脯氨酰寡肽酶或脯氨酸特異性內切蛋白酶的用途。脯氨酸特異性內切蛋白酶優(yōu)選能水解大的蛋白分子，例如多肽或蛋白自身。根據(jù)本發(fā)明的方法通常溫育時間少于24小時，優(yōu)選溫育時間小于10小時，更優(yōu)選小于4小時。溫育溫度通常高于30℃，優(yōu)選高于40℃，更優(yōu)選高于50℃。優(yōu)選地，在脯氨酸末端進行切割的蛋白酶，例如脯氨酸特異性內切蛋白酶，不含任何污染性的內切蛋白酶活性。優(yōu)選地，在脯氨酸末端進行切割的蛋白酶，例如脯氨酸特異性內切蛋白酶，不含污染性羧基肽酶活性。優(yōu)選地，在脯氨酸末端進行切割的蛋白酶，例如脯氨酸特異性內切蛋白酶，不含污染性氨基肽酶活性。不含污染性內切蛋白酶活性的脯氨酰寡肽酶或脯氨酸特異性內切蛋白酶是優(yōu)選具有小于1的Endo/Prol特異性活性比的酶制劑，更優(yōu)選小于0.01。不含污染性羧基肽酶活性的脯氨酰寡肽酶或脯氨酸特異性內切蛋白酶是優(yōu)選具有小于10的CPD/Pro特異性活性比的酶制劑，更優(yōu)選小于1。不含污染性氨基肽酶活性的脯氨酰寡肽酶或脯氨酸特異性內切蛋白酶是優(yōu)選具有小于1的AP/Pro特異性活性比的酶制劑，更優(yōu)選小于0.1。在生產IPP期間，LPP也有利地形成。本發(fā)明的另一方面是從水解蛋白純化或分離肽的方法，優(yōu)選地，所述蛋白是非天冬氨酸蛋白酶水解的，更優(yōu)選地，是絲氨酸蛋白酶水解的。該水解蛋白能在選定的pH條件下沉淀。純化或分離方法包括將pH改變?yōu)樗鏊獾鞍椎靡猿恋淼膒H，并且將沉淀的蛋白與溶液中的肽分離。因此，本發(fā)明涉及一種方法，用于制備包含可溶肽(優(yōu)選地，IPP)的組合物，所述方法包括將通過對合適的蛋白來源水解產生的組合物的pH改變?yōu)槭沟盟獾鞍椎囊徊糠肿優(yōu)椴豢扇艿膒H，以及將所述不可溶的部分與可溶肽分離，以產生包含可溶肽的組合物。本發(fā)明還涉及通過對蛋白水解產生的肽組合物，其具有至少5∶1的IPP對VPP比，優(yōu)選地，至少10∶1，更優(yōu)選地，至少20∶1，所述組合物優(yōu)選包含LPP，或者，本發(fā)明涉及一種組合物，其中包含根據(jù)本發(fā)明的可溶肽，所述組合物用作為營養(yǎng)藥物，優(yōu)選地作為藥劑。本發(fā)明還涉及這些肽組合物用于生產促進健康或者預防和/或治療疾病用的營養(yǎng)藥物(優(yōu)選地，藥劑)的用途，或者用于生產用于治療或預防高血壓(highbloodpressure，也作hypertension)、心力衰竭、前糖尿病或糖尿病、肥胖、葡萄糖耐量受損或壓力的營養(yǎng)藥物(優(yōu)選地，藥劑)的用途。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽組合物以膳食補充劑的形式，以個人護理應用(包括以水劑、凝膠或乳劑的形式局部應用)的形式，或者作為食物、飲料、飼料或寵物食品成分來使用。發(fā)明詳述根據(jù)已有技術，有效的ACE抑制肽可能在所述肽的羧基末端包括一個或兩個脯氨酸殘基。同樣的結構要求還適用于具有增加的抗蛋白水解降解的抗性的肽，由此增加了完整的肽最終達到血流的可能性。為獲得在其羧基末端具有至少一個但是優(yōu)選多個脯氨酸殘基的肽，使用能在脯氨酸殘基羧基末端進行切割的蛋白酶能提供感興趣的選擇。所謂的脯氨酰寡肽酶(EC3.4.21.26)具有偏向于在脯氨酸殘基羧基側對肽進行切割的獨特的可能性。在從哺乳動物以及微生物來源分離的所有被足夠分析的脯氨酸特異性蛋白酶中，已經(jīng)鑒定出了獨特的肽酶結構域，其把大的肽排除在酶的活性位點之外。事實上，這些酶不能降解含有超過大約30個氨基酸殘基的肽，使得這些酶現(xiàn)在被稱為“脯氨酸寡肽酶”(Fulopetal.Cell，vol.94，161-170，July24，1998)。結果，這些脯氨酰寡肽酶在能施加其水解作用前需要用其它內切蛋白酶進行的前水解。但是，如WO02/45523所述，甚至脯氨酰寡肽酶與此類其它內切蛋白酶的組合導致產生了下述水解產物，其特征為具有羧基末端脯氨酸殘基的肽的比例顯著增加。因為這個原因，此類水解產物形成了優(yōu)秀的起始點，用于分離具有外ACE抑制作用以及增加的對腸胃蛋白水解降解的抗性的肽。盡管存在這些潛在的好處，我們不知道具體地使用脯氨酸特異性內切蛋白酶用于回收ACE抑制肽的應用，更不用說對IPP的選擇性生產。本發(fā)明涉及一種方法，用于生產包含來自蛋白來源的IPP的組合物，其中，從蛋白產生的IPP對VPP的重量比為至少5∶1，優(yōu)選至少10∶1，更優(yōu)選至少20∶1，所述方法包括使用具有脯氨酸特異性內切蛋白酶活性或脯氨酰寡肽酶活性的酶活性以及能水解-I-P-P-序列氨基末端側的鍵的酶活性。有利地，具有脯氨酸特異性內切蛋白酶活性或脯氨酰寡肽酶活性的酶活性以及能水解-I-P-P-序列氨基末端側的鍵的活性存在于一種酶中，優(yōu)選地，該酶是脯氨酸特異性內切蛋白酶或脯氨酰寡肽酶，更優(yōu)選地，該酶是脯氨酸特異性內切蛋白酶。此外，本發(fā)明涉及一種方法，用于制備包含可溶肽(優(yōu)選地，IPP)的組合物，所述方法包括將水解條件的pH改變?yōu)槭顾鏊獾鞍椎囊徊糠肿優(yōu)椴豢扇艿膒H，以及將不可溶部分與可溶肽分離，得到包含可溶肽的組合物。用于分離步驟的溫度優(yōu)選在0至20℃之間，更優(yōu)選在1至10℃之間。本發(fā)明還涉及制備食物產品、飲料產品或膳食補充劑的方法，所述方法包含生產包含前述IPP的組合物，并且將該含有IPP的組合物加入到食物產品、飲料產品或膳食健康產品中。此外，本發(fā)明涉及一種方法，用于生產包含可溶肽的組合物，所述組合物是通過下述步驟生產的-首先，用脯氨酸特異性內切蛋白酶將蛋白水解至5-30％的DH，-可選地，進行第二種酶處理，優(yōu)選地，用蛋白酶來進行，以及-之后，將水解蛋白的不可溶部分與可溶部分在選定的pH條件下分離，優(yōu)選在酸性pH條件下，更優(yōu)選在3.5至6之間的pH下，最優(yōu)選在4至5之間的pH下，以產生包含可溶肽的組合物。本發(fā)明因此提供了可通過后一種方法獲得的組合物，并且，所述組合物包含可溶的肽，其中，所述肽的至少70wt％，優(yōu)選至少80wt％，最優(yōu)選至少90wt％在3.5至6之間的pH，優(yōu)選4至5之間的pH，最優(yōu)選pH＝4時是可溶的(在4℃測量的)，并且，其中，可溶肽中沒有任何一種肽以大于可溶肽40wt％的量存在，優(yōu)選地，可溶肽中沒有任何一種肽以大于可溶肽30wt％的量存在，最優(yōu)選可溶肽中沒有任何一種肽以大于可溶肽20wt％的量存在。后一種方法和后一種組合物是下一種觀點的結果，可獲得具有高含量可溶肽的組合物，其中，因為使用了脯氨酸特異性內切蛋白酶，其也含有高含量的具有羧基末端脯氨酸的肽。如上所述，首先用脯氨酸特異性內切蛋白酶對蛋白進行水解。在隨后通過額外的(第二種)蛋白酶對該水解蛋白進行水解的情況下，第二種酶將對具有羧基末端脯氨酸的肽進行進一步水解。優(yōu)選地，第二種酶處理通過純且選擇性的酶來進行。該第二種酶優(yōu)選是氨基肽酶(例如，CorolaseLAP，見實施例12和13)或內切蛋白酶，最優(yōu)選使用氨基肽酶。在實施例12和13中顯示，基于最高的IPP選擇性，額外的IPP和VPP從酪蛋白形成。該第二種酶的選擇一直與所用的蛋白相關。以這種方式，可能可以制造出量體裁衣般合適的組合物，其包含來自所用蛋白的可溶肽。該第二種酶處理可優(yōu)選在脯氨酸特異性內切蛋白酶水解之后進行，但是另一種選擇是第二種酶處理與脯氨酸特異性內切蛋白酶水解同時進行。根據(jù)本發(fā)明的另一種實施方式，該第二種酶處理可在酸沉淀步驟之后發(fā)生。在這種情況下，通過該第二種酶對可溶肽組合物進行進一步水解，以再次得到含有可溶肽的組合物。優(yōu)選地，可溶肽中的至少10摩爾％，更優(yōu)選至少20摩爾％，進一步更優(yōu)選至少30摩爾％具有羧基末端脯氨酸。在專利申請WO02/45523中，描述了該摩爾％可如何被測定。本發(fā)明涉及作為營養(yǎng)藥物(優(yōu)選是藥劑)的含有本發(fā)明的肽的組合物。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的肽的組合物作為營養(yǎng)藥物(優(yōu)選是藥劑)的用途，涉及含有本發(fā)明的肽的組合物用于生產營養(yǎng)藥物(優(yōu)選是藥劑)的用途，涉及含有本發(fā)明的肽的組合物用于促進健康和/或治療疾病的用途，涉及含有本發(fā)明的肽的組合物用于生產營養(yǎng)藥物(優(yōu)選是藥劑)的用途，涉及含有本發(fā)明的肽的組合物用于治療心血管疾病(例如高血壓和心力衰竭)的用途，涉及含有本發(fā)明的肽的組合物用于治療前糖尿病或糖尿病的用途，涉及含有本發(fā)明的肽的組合物治療或預防肥胖的用途，涉及含有本發(fā)明的肽的組合物用于提高血漿胰島素或者用于提高針對血漿胰島素敏感性的用途，涉及含有本發(fā)明的肽的組合物用于提高2型糖尿病或前糖尿病患者血漿胰島素或者用于提高他們針對血漿胰島素的敏感性的用途，涉及含有本發(fā)明的肽的組合物用于降低2型糖尿病或前糖尿病患者血液中餐后葡萄糖濃度的用途，涉及含有本發(fā)明的肽的組合物用于提高2型糖尿病或前糖尿病患者血液中餐后胰島素分泌的用途，涉及下述含有本發(fā)明的肽的組合物的用途，其中所述含有本發(fā)明的肽的組合物以膳食補充劑形式存在，涉及含有本發(fā)明的肽的組合物用于生產功能性食物產品的用途，所述食物產品用于對壓力作用進行藥物治療，涉及含有本發(fā)明的肽的組合物在局部應用中的用途(優(yōu)選在個人護理應用中)，以及涉及含有本發(fā)明的肽的組合物在飼料和寵物食品中的用途。此外，本發(fā)明涉及一種方法，用于治療1型和2型糖尿病，以及用于在具有前糖尿病或葡萄糖耐量受損(IGT)的個體中預防2型糖尿病，所述方法包括向需要此類治療的個體施予含有本發(fā)明的肽的組合物，還涉及一種方法，用于對遭受高血壓或心力衰竭的人群進行治療或者對高血壓和心力衰竭加以預防，所述方法包括向需要此類治療的個體施予含有本發(fā)明的肽的組合物，因此展示出降低血壓的作用。對ACE的抑制導致降低的血管收縮，提高的血管舒張，改進的鹽和水排泄，其進而導致了降低的外周血管抗性和血壓，以及改進的局部血流。因此，本發(fā)明的包含肽的水解產物特別有效于預防和治療可受ACE抑制影響的疾病，其包括但不限于高血壓、心力衰竭、心絞痛、心肌梗塞、中風、外周動脈阻塞疾病、血管硬化、腎病、腎功能不全、勃起障礙、內皮功能不全、左心室肥大、糖尿病血管病變、水腫和高醛甾酮癥。組合物還可用于預防和治療腸胃疾病(腹瀉、腸道激惹綜合征)、炎癥、糖尿病、肥胖、癡呆、癲癇、老年癡呆和Meriere’s癥。此外，組合物可提高認知功能和記憶力(包括Alzheimer’s癥)、飽腹感、限制缺血性損傷以及預防旁路手術或血管成形術后動脈再阻塞。糖尿病是廣泛發(fā)作的慢性疾病，其迄今為止沒有治愈方法。糖尿病的發(fā)作和流行指數(shù)增長，其在發(fā)達國家和發(fā)展中國家成為了最為常見的疾病之一。糖尿病是多種致病因素導致的復雜疾病，其特征在于與胰島素分泌和/或胰島素抵抗缺陷相關的碳水化合物、蛋白和脂肪代謝受損。這導致升高的空腹和餐后血糖濃度，如果未被治療將導致并發(fā)癥。該疾病有兩主要的類，胰島素依賴型糖尿病(IDDM，T1DM)和非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM，T2DM)。T1DM＝“Type1DiabetesMellitus”(1型糖尿病)。T2DM＝“Type2DiabetesMellitus”(2型糖尿病)。T1DM和T2DM糖尿病與高血糖、高血膽固醇和高血脂相關。在T1DM和T2DM中，絕對的胰島素缺陷和對胰島素的不敏感性分別導致肝臟、肌肉和脂肪組織對葡萄糖利用的降低，以及血糖水平的增加。未受控制的高血糖與增加的且過早的死亡率相關，這是由于對微血管和大血管疾病(包括腎病、神經(jīng)疾病、視網(wǎng)膜病、高血壓、中風和心臟病)的風險增加造成的。進來的證據(jù)顯示，嚴格的血糖控制是在T1DM和T2DM中預防這些并發(fā)癥的主要因素。因此，通過藥物或治療方法進行優(yōu)化血糖控制是治療糖尿病的重要手段。對T2DM的治療最初涉及膳食和生活方式改變，當這些手段不能保持足夠的血糖控制時，用口服降血糖試劑和/或外源胰島素來對患者進行治療。目前用于治療T2DM的口服藥物試劑包括促進胰島素分泌的那些(磺脲類試劑)、促進胰島素在肝臟中的作用的那些(雙胍類試劑)、胰島素增敏劑(噻唑烷酮類)和作用于抑制葡萄糖吸收的試劑(α-葡糖苷酶抑制劑)。但是，由于高血糖的逐漸惡化，目前可獲得的試劑通常不能長期保持足夠的血糖控制。能保持目標血糖水平的患者比例隨著時間顯著降低，這使得施予額外/替代性的藥物試劑成為必需。此外，藥物可能具有不想要的副作用，并且與高的初級或次級失敗率相關。最后，使用降血糖藥物可能有用于控制血糖水平，但是可能不能預防糖尿病的所有并發(fā)癥。因此，目前針對所有類型的糖尿病的治療方法無法獲得理想的血糖正?；皖A防糖尿病并發(fā)癥的效果。因此，雖然在對T1DM和T2DM的治療中療法的選擇基本基于施予胰島素和口服降血糖藥物，但人們需要安全有效的、具有最小化的副作用的營養(yǎng)補充劑來治療和預防糖尿病。很多患者都對能最小化高劑量藥物伴隨的副作用、并能產生額外的臨床益處的替代性療法感興趣。具有糖尿病的患者對于被認為是“天然的”、具有溫和抗糖尿病作用并且沒有大的副作用的治療有特殊興趣，其可被用作為輔助治療。T2DM是逐漸發(fā)展的、慢性疾病，其通常不會被認識到，直到顯著的損傷己發(fā)生于負責產生胰島素的胰腺細胞(Langerhans島的β-細胞)上。因此，人們對于開發(fā)下述膳食補充劑具有日益增加的興趣，所述補充劑可用于在風險人群中，尤其是具有發(fā)展T2DM的高風險的年長人群中預防β-細胞損傷，以及因此預防明顯的T2DM進程。對胰腺β-細胞的保護可通過降低血糖和/或脂類水平來獲得，因為葡萄糖和脂類會對β-細胞產生傷害。血糖水平的降低可通過不同機制獲得，例如通過提高胰島素敏感度和/或通過降低肝臟葡萄糖生產來獲得。降低血脂水平也可以通過不同機制獲得，例如，通過提高脂類氧化和/或脂類貯備來獲得。用于保護胰腺β-細胞的另一可能策略將是降低氧化脅迫(oxidativestress)。氧化脅迫還導致β-細胞損傷，以及隨后的胰島素分泌減少以及明顯的T2DM的進程。因此，T2DM是在多個器官位點共存的缺陷導致的復雜疾病肌肉和脂肪組織中對胰島素作用的抗性，有缺陷的胰腺胰島素分泌，未受限制的肝臟葡萄糖生產。這些缺陷通常與脂類異常和內皮功能不全相關。在T2DM中存在多種病原生理性損害的情況下，組合療法就是有吸引力的對其進行管理的手段。本發(fā)明涉及新穎的營養(yǎng)藥物組合物，其中包含本發(fā)明的含有肽的組合物。包含本發(fā)明的含有肽的組合物的營養(yǎng)藥物組合物還可包含未被水解的蛋白和碳水化合物作為活性成分，用于治療或預防糖尿病或與葡萄糖耐量受訓相關的其它狀況，例如綜合征X。在另一方面，本發(fā)明涉及此類組合物作為營養(yǎng)補充劑用于所述治療或預防的用途，例如，作為多種維生素制劑的補充劑，所述制劑包含維持正常代謝功能所必需的、但是體內無法合成的維生素和礦物質。在又一個方面，本發(fā)明涉及一種方法，用于治療1型和2型糖尿病，以及用于在具有前糖尿病或者葡萄糖耐量受損(IGT)或肥胖的個體中預防2型糖尿病，所述方法包括向需要此類治療的個體施予本發(fā)明的含有肽的組合物和蛋白水解產物或未水解蛋白和/或碳水化合物。本發(fā)明的組合物特別可用于治療T1DM和T2DM，以及用于在具有前糖尿病或葡萄糖耐量受損(IGT)的個體中預防T2DM。我們發(fā)現(xiàn)，含有本發(fā)明的肽的組合物可被用于2型糖尿病或前糖尿病，優(yōu)選地，用于降低餐后葡萄糖濃度或用于增加餐后血液中胰島素分泌。包含肽以及可選地碳水化合物的組合物刺激胰島素分泌，增加葡萄糖被安排到胰島素敏感的目標組織，例如脂肪組織，骨骼肌和肝臟，因此，在對糖尿病的治療中提供協(xié)同作用。通常認識到，壓力相關的疾病，以及壓力對于身體的負面作用在很多人群產生顯著影響。近年來，壓力的作用和其對于多種疾病和癥狀的發(fā)展的作用，已在醫(yī)學和科學界得到了更加廣泛的認可。消費者現(xiàn)在越來越認識到這些潛在的問題，并且對于減少或預防壓力對他們健康造成的可能負面影響越來越感興趣。本發(fā)明的另一個目的是提供一種食物產品或可被包含進食物產品的成分，其適用于幫助身體處理壓力的作用。還有一個目的是提供一種食物產品，其中包含含有本發(fā)明的肽的組合物，所述食物產品能提供健康方面的好處，例如幫助身體處理壓力的負面作用。術語“營養(yǎng)藥物”在本文中指在營養(yǎng)學應用和藥學領域都有用。因此，新的營養(yǎng)藥物組合物可作為食物和飲料的補充劑，也可作為藥物制劑和藥劑用于腸道或非腸道應用，其可以是固體制劑，例如膠囊或片劑，或者液體制劑，例如溶液或懸浮液。從前述可以看出，術語“營養(yǎng)藥物組合物”還包含其中包含含有本發(fā)明的肽的組合物以及可選地碳水化合物的食物和飲料，以及補充劑組分，例如，膳食補充劑，其中包含前述活性成分。術語“膳食補充劑”在本文中指用嘴攝取的產品，其中含有“膳食成分”以補充膳食。這些產品中的“膳食成分”可以包括維生素、礦物質、草本物質或其它植物性藥材、氨基酸以及酶、器官組織、腺體和代謝物等物質。膳食補充劑還可以是提取物或濃縮物，其可以以很多形式存在，例如片劑、膠囊、軟凝膠、凝膠膠囊、液體或粉末。它們還可以是其它形式的，例如條狀，但是如果它們是的話，膳食補充劑標簽上的信息將通常不表示該產品作為傳統(tǒng)食物或者餐食或膳食的唯一項目。多種維生素和礦物質補充劑可被加入到本發(fā)明的營養(yǎng)藥物組合物中，以獲得足夠量的、一些膳食中遺漏的必要營養(yǎng)物。多種維生素和礦物質補充劑還可用于疾病預防和保護，用于抵抗由于生活模式和糖尿病中一些時候觀察到的不足夠的膳食模式造成的缺陷和營養(yǎng)損失。此外，氧化脅迫還己被牽連于胰島素抵抗的發(fā)展中。反應活性氧種類可通過擾亂胰島素受體信號級聯(lián)來損傷胰島素刺激的葡萄糖吸收。用抗氧化劑，例如α-生育酚(維生素E)、抗壞血酸(維生素C)對氧化脅迫的控制在對糖尿病的治療中可以是有價值的。因此，對多種維生素補充劑的攝取可被加入到上文提到的活性物質中，以保持良好平衡的營養(yǎng)。此外，含有本發(fā)明的肽的組合物與礦物質(例如，鎂(Mg2+)、鈣(Ca2+)和/或鉀(K+))的組合可用于促進健康以及預防和/或治療包括但不限于心血管疾病和糖尿病等的疾病。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的營養(yǎng)藥物組合物含有含有本發(fā)明的肽的組合物。IPP適合以向被施予的個體提供每千克體重大約0.001g至每kg體重大約1g的每日劑量存在于根據(jù)本發(fā)明的組合物中。食物或飲料適合含有每份大約0.05g至每份大約50g的IPP。如果營養(yǎng)藥物組合物是藥物制劑，此類制劑可含有每劑量單位(例如，每膠囊或片劑)大約0.001g至大約1g的量的IPP，或者對液體制劑而言，每份每日劑量大約0.035g至每份每日劑量大約70g。含有本發(fā)明的肽的組合物適合在根據(jù)本發(fā)明的組合物中以向被施予的個體提供每千克體重大約0.01g至每kg體重大約3g的每日劑量存在。食物或飲料適合含有每份大約0.1g至每份大約100g的蛋白水解產物。如果營養(yǎng)藥物組合物是藥物制劑，此類制劑可含有每劑量單位(例如，每膠囊或片劑)大約0.01g至大約5g的量的含肽組合物，或者對液體制劑而言，每份每日劑量大約0.7g至每份每日劑量大約210g。在本發(fā)明的又一個優(yōu)選的方面，組合物包含上面特別指出的本發(fā)明的肽以及可選地，碳水化合物。碳水化合物適合以向被施予的個體提供每千克體重大約0.01g至每kg體重大約7g的每日劑量存在于根據(jù)本發(fā)明的組合物中。食物或飲料適合含有每份大約0.5g至每份大約200g的碳水化合物。如果營養(yǎng)藥物組合物是藥物制劑，此類制劑可含有每劑量單位(例如，每膠囊或片劑)大約0.05g至大約10g的量的含肽組合物，或者對液體制劑而言，每份每日劑量大約0.7g至每份每日劑量大約490g。劑量范圍(對70kg的人而言)IPP0.005-70g/天蛋白水解產物0.07-210g/天未水解的蛋白0.07-210g/天碳水化合物0.1-490g/天本發(fā)明的一個目的是提供可食用材料，其可用于向消耗其的個體提供健康方面的好處。另一個目的是提供可以以經(jīng)分離的形式或被包括進食物產品的形式被方便地攝取的上述可食用材料。本發(fā)明的又一個目的是提供一種食物產品或包含在其中的成分，它們適用于體重控制療程。本發(fā)明的又一個目的是提供一種食物產品或包含在其中的成分，它們適用于幫助保持心血管健康，例如，通過ACE抑制。本發(fā)明的又一個目的是提供一種食物產品或包含在其中的成分，它們具有可被接受的穩(wěn)定性和/或感官性質，特別是好的味道，例如不存在或者只存在可被接受的水平的苦味。又一個目的是提供一種食物產品，其具有高濃度的提供健康方面好處的成分，例如，輔助預防肥胖/體重控制和/或幫助保持心血管健康。令人驚奇地，根據(jù)本發(fā)明，通過含有本發(fā)明的肽的組合物用于制備消耗時能提供健康方面的好處的食物產品的用途，來獲得這些目的中的一個或多個。根據(jù)第一個方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的肽用于生產功能性食物產品的用途，所述食物產品用于預防肥胖或體重控制。根據(jù)第二個方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的肽用于生產功能性食物產品的用途，所述食物產品用于心血管健康保持。根據(jù)本發(fā)明，心血管健康保持包含對血管緊張素轉化(ACE)酶的抑制和/或對血糖水平的控制，這是尤其優(yōu)選的。根據(jù)第三個方面，本發(fā)明提供了一種功能性食物產品，其能對其消費者提供健康方面的好處，所述健康方面的好處選自預防肥胖、體重控制和心血管健康保持，并且所述食物產品包含含有本發(fā)明的肽的組合物。根據(jù)本發(fā)明的含有肽的組合物的另一個好處是含有該肽的組合物可方便地加入到食物產品中，以產生功能性食物產品，而不會不可接受地影響其穩(wěn)定性和/或感官性質。根據(jù)本發(fā)明“提供健康方面好處的試劑”是能提供健康方面的好處的物質，其是攝取時對于健康的某一方面具有正面影響的物質，或者能幫助保持良好健康的一方面，良好健康的這些方面是預防肥胖、體重控制和心血管健康保持?！敖】捣矫娴暮锰帯敝笇τ诮】档囊环矫婢哂姓嬗绊懟蛘邘椭３至己媒】档囊环矫?。根據(jù)本發(fā)明的“功能性食物產品”被定義為適合人類消耗的食物產品(為避免疑問，還包括飲料)，其中，本發(fā)明的含肽組合物以有效量被用作為使該食物產品消耗者獲得顯著的健康方面好處的成分。術語“包含”在本文中使用時不限于表示任何隨后指出的成分，其還包含沒有特別指出的、具有主要或次要功能重要性的成分。換句話說，列出的步驟、成分或選項并不一定是排他性的?！鞍ā被颉熬哂小笔褂弥?，這些術語與上文定義的“包含”等價?！半摹被颉肮央摹痹诒疚闹斜欢x為通過肽鍵相連的至少兩個氨基酸的鏈。術語“肽”和“寡肽”被認為是同義的(如通常所認為的)，在上下文需要的情況下，每種術語可互換使用。“多肽”在本文中被定義為含有多于30個氨基酸殘基的鏈。根據(jù)通常的實踐，本文中的所有(寡)肽和多肽結構式或序列都是按照從左到右的方向從氨基末端向羧基末端書寫的。本文中使用的氨基酸的單字母編號是本領域通常已知的，可在Sambrook，etal.(MolecularCloningALaboratoryManual，2nd，ed.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborlaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989)中找到。來自IUMB的、用于對所有酶進行分類和命名的國際承認的體系包括蛋白酶。更新的針對蛋白酶EC編號的IUMB文本可在互聯(lián)網(wǎng)站點http://www.chem.qmw/ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/11/找到。在該系統(tǒng)中，通過其催化單一反應的事實來定義酶。這具有如下重要的涵義若干種不同的蛋白都被定義為同一種酶，能催化超過一種反應的蛋白被處理為超過一種酶。該系統(tǒng)將蛋白酶分類為內切和外切蛋白酶。內切蛋白酶是水解內部肽鍵的那些，外切蛋白酶水解與末端氨基相鄰的肽鍵(“氨基肽酶”)或末端羧基和倒數(shù)第二個氨基酸之間的肽鍵(“羧基肽酶”)。內切蛋白酶基于催化機制被分為亞組。存在如下亞組絲氨酸內切蛋白酶(EC3.4.21)、半胱氨酸內切蛋白酶(EC3.4.22)、天冬氨酸內切蛋白酶(Ec3.4.23)、金屬內切蛋白酶(EC3.4.24)和蘇氨酸內切蛋白酶(EC3.4.25)。氨基肽酶在組3.4.11中。亞組分類基于去除20種不同氨基酸的相對效率。具有窄和寬特異性的氨基肽酶可被區(qū)分開。氨基肽酶可順序性地從蛋白和肽底物上移除單個氨基末端氨基酸。具有窄特異性的氨基肽酶展示出對P1位置上的氨基酸殘基類型(從底物肽釋放的)的強烈偏好。寬特異性的氨基肽酶能釋放N末端或P1位置上的一系列不同氨基酸(根據(jù)Schechter’s命名Schechter，I.andBerger，A.1967.BiochemBiophysResCommun27157-162)。羧基肽酶可順序性地從蛋白和肽底物移除單個羧基末端氨基酸。與內切蛋白酶的情況相當，羧基肽酶可基于催化機制被分為亞組。絲氨酸類型的羧基肽酶在EC3.4.16組中，金屬羧基肽酶在EC3.4.17組中，半胱氨酸類型的羧基肽酶在EC3.4.18組中。針對蛋白酶的EC列表的值用于提供針對多種蛋白酶活性類型的標準術語命名，尤其是對每種蛋白酶指定獨特的命名編號和推薦名稱。在EP1231279中，描述了一種純粹的酶促方法，用于從奶的酪蛋白中回收三肽VPP和IPP。后一申請要求保護一種方法，所述方法用于通過用蛋白酶和肽酶通過所謂的“中間產物肽”對含有奶的酪蛋白的物質進行消化來生產三肽，所述“中間產物肽”選自含有序列-V-P-P-但除了該序列中的這些之外不再含Pro的肽，以及含有序列-I-P-P-但除了該序列中的這些之外不再含Pro的肽構成的組。如EP1231279的實施例中所述，該方法涉及兩步方法。首先，產生包含VPP或IPP的中間產物肽。這是通過用酪蛋白與合適的蛋白酶溫育來實現(xiàn)的。根據(jù)實施例中的一種，在37攝氏度進行12小時的時間。然后，通過將該第一水解產物加熱至100攝氏度3分鐘來使所用的蛋白酶失活，再次冷卻后，加入另一種酶制劑(事實上，具有外蛋白水解活性的制劑)。再在37攝氏度與該另種酶制劑溫育12小時后，可展示出三肽VPP和IPP的存在。為獲得更高產量的這些ACE抑制肽，EP1231279進一步提出在暴露給外蛋白水解活性之前對中間產物肽進行純化和濃縮。EP1231279還暗示，在獲得中間產物肽之后，以及在中間產物肽與肽酶在流程中接觸之前，可選地，可進行多種操作，例如，通過例如在5000至20000rpm離心3至10分鐘來除去未反應的蛋白。所以，以工業(yè)方式而非笨拙的兩步酶促工藝來獲得想要的三肽。因為每次酶促溫育可能在4.5至7.0的pH以及25至50攝氏度的溫度下進行長達12小時，明顯該流程從微生物的角度來講是不可接受的。長的溫育時間組合25至50℃的低溫育溫度，可能容易導致含有蛋白的溶液被感染。WO02/45524描述了可從Aspergillusniger獲得的一種脯氨酸特異性內切蛋白酶。A.niger來源的酶偏好于在脯氨酸的羧基進行切割，但是也在羥脯氨酸的羧基末端進行切割，以及以較低效率在丙氨酸的羧基末端進行切割。WO02/45524還教導，該A.niger來源的酶和來自其它微生物或哺乳動物來源的已知脯氨酰寡肽酶之間不存在明顯的同源性。與已知脯氨酰寡肽酶相反，A.niger酶具有酸性pH最優(yōu)值。雖然已知的脯氨酰以及A.niger來源的酶是所謂的絲氨酸蛋白酶，我們在此(實施例1)展示，A.niger酶屬于完全不同的亞族。分泌的A.酶看起來是絲氨酸肽酶的S28家族的成員，而非大多數(shù)胞質脯氨酰寡肽酶被分入的S9家族的成員(Rawling，N.D.andBarrett，A.J.；Biochim.Biophys.Acta1298(1996)1-3)。在實施例2中，我們展示了A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶的pH和溫度最優(yōu)值。在實施例3中，我們展示了本發(fā)明的方法中使用的A.niger來源的酶制劑是高度純的，這意味著除了純的脯氨酸特異性內切蛋白酶固有的內蛋白水解活性之外沒有附著任何顯著的內蛋白水解活性。我們還展示出根據(jù)本發(fā)明使用的我們的A.niger來源的酶制劑不含任何外蛋白水解副活性，更特別地，氨基肽分解副活性。EP1231279中描述的所有陽性鑒定的蛋白酶樣品都是展示出不同蛋白水解活性的不同酶的復雜混合物。本領域技術人員將理解，EP1231279所描述的方法隨著內蛋白水解活性與一種或多種外蛋白水解酶活性的組合而變化。此類外蛋白水解活性在用于本發(fā)明方法中的A.niger來源的酶制劑中是不存在的。反之亦然，根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的酶在EP1231279中描述的復雜蛋白酶樣品中也不存在。關于該酶在非重組Aspergillus菌株中基本上不存在的觀點的實驗證明可在WO02/45524中找到。因為本發(fā)明的方法可能僅用脯氨酸特異性內切蛋白每，最優(yōu)溫育條件(例如溫度、pH等)可以容易地選擇，而不必如應用兩種或多種酶時那樣必須固定為亞最優(yōu)條件。在選擇反應條件時具有更多自由度使得可以更為容易地針對可能的其它標準加以選擇。例如，現(xiàn)在選出對于微生物感染更不敏感的條件以及相對隨后的蛋白沉淀步驟來優(yōu)化pH條件就容易得多。在實施例4中，我們展示，Aspergillus酶并非寡肽酶，其是真正的內肽酶，能水解完整蛋白、大的肽以及較小的肽分子，而無須輔助的內切蛋白酶。這種新的驚人發(fā)現(xiàn)開啟了使用A.niger酶來制備下述水解產物的可能性，所述水解產物中具有羧基末端脯氨酸殘基的肽以空前的高含量存在，這是因為不需要任何輔助性的內切蛋白酶。此類新的水解產物可從來自植物或來自動物來源的不同蛋白質起始材料來制備。此類起始材料的例子是乳清蛋白、乳清beta-乳球蛋白、乳清alpha乳白蛋白、酪蛋白、明膠、魚或卵蛋白、馬鈴薯蛋白、小麥和玉米麥麩、大豆和豌豆蛋白、水稻蛋白以及羽扁豆蛋白。當然，起始蛋白應當至少具有-I-P-P-序列。優(yōu)選地，該蛋白還在其蛋白序列中包含-L-p-p-序列。如上文所解釋的，該蛋白可能在其蛋白中具有-V-P-P-序列?？梢詮木哂懈吆扛彼嵋约傲u脯氨酸的底物，例如明膠，產生下述水解產物，其具有空前高含量的、具有羧基末端脯氨酸或羥脯氨酸殘基的肽。因為A.niger酶(例如已知得脯氨酰寡肽酶)不能切割Pro-Pro或Pro-Hyp、Hyp-Pro或Hyp-Hyp鍵，該手段將還產生含有空前高含量的下述肽的水解產物，所述肽具有兩個、三個或者甚至更多個羧基末端脯氨酸或羥脯氨酸殘基。明顯地，蛋白質起始材料的本質和脯氨酸含量制定了產生此類肽的可能性。優(yōu)選的底物是含有多于6％脯氨酸的底物(即，每100克蛋白中該氨基酸超過6克)，例如酪蛋白、明膠、小麥和玉米麥麩?？紤]到攜帶此類羧基末端氨基酸序列的肽預期具有在胃腸道水解活性中存活的公平機會，通過與A.niger來源的脯氨酰內切蛋白酶一起溫育提供了優(yōu)秀的起始材料，用于分離已知具有生物活性的肽以及用于鑒定出新的具有生物活性的肽。因為已知鈉在高血壓中有著重要的作用，用于生產ACE抑制肽的優(yōu)選底物是這些蛋白的鈣鹽和鉀鹽，而非鈉鹽。A.niger來源的脯氨酰內切蛋白酶的pH最優(yōu)值為大約4.3(見圖1)。因為該pH最優(yōu)值較低，因此將牛奶酪蛋白酸鹽與A.niger來源的脯氨酰內切蛋白酶溫育并非不言而喻。如果pH降低至低于6.0，牛奶酪蛋白酸鹽將沉淀，并且在此pH值下，A.niger酶僅具有有限的活性。但是，我們在實施例5中展示，甚至在該相當不利的條件下，用A.niger來源的脯氨酰內切蛋白酶仍能產生若干ACE抑制肽。根據(jù)本發(fā)明，ACE抑制三肽IPP和LPP以分別相當于酪蛋白中理論存在的量的10％和大約60％的產率產生。根據(jù)實施例5中提供的解釋，IPP的產率產生自下述事實IPP僅可由kappa酪蛋白釋放。如果考慮到這點，獲得的是大約40％的產率。優(yōu)選地，酸沉淀的酪蛋白被用作為本發(fā)明方法中的底物。相當驚人地，盡管VPP前體VVVPP以類似LPP的產率產生(即，理論存在值的大約60％)，但是并沒有VPP產生。優(yōu)選地，蛋白序列中存在的-L-P-P-序列中的至少20％，更優(yōu)選至少30％，進一步更優(yōu)選至少40％，最優(yōu)選至少60％被轉化為肽LPP。優(yōu)選地，蛋白序列中存在的-I-P-P-序列中的至少20％，更優(yōu)選至少30％，進一步更優(yōu)選至少40％，最優(yōu)選至少60％被轉化為肽IPP。脯氨酸特異性蛋白酶優(yōu)選能水解大的蛋白分子，例如底物蛋白自身。這些結果是用酪蛋白酸鹽與A.niger來源的內切蛋白酶在一步法酶促工藝中進行溫育來獲得的。含有蛋白的水溶液很容易受微生物感染的影響，尤其是在高于5.0的pH和50攝氏度或更低的溫度下保持數(shù)小時的情況下。特別地，在上述延長溫育步驟中可產生微生物毒素，其可能在后續(xù)加熱步驟中存活，并且形成對食品級工藝的潛在威脅。與EP1231279中描述的條件不同，根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選使用高于50攝氏度的溫育溫度。組合一步法酶促工藝，其中酶溫育進行小于24小時的時間，優(yōu)選小于8小時，更優(yōu)選小于4小時，根據(jù)本發(fā)明的方法提供了微生物穩(wěn)定性被提高的優(yōu)點。牛奶酪蛋白包括大量不同蛋白，包括beta酪蛋白和kappa酪蛋白。根據(jù)已知的氨基序列，beta酪蛋白包含ACE抑制三肽IPP(Ile-Pro-Pro)、VPP(ValPro-Pro)和LPP(Leu-Pro-Pro)。kappa酪蛋白僅包含IPP。在實施例5中，我們展示，用A.niger來源的脯氨酰內切蛋白酶與酪蛋白酸鉀一起溫育，以高產率產生了已知的ACE抑制肽IPP和LPP。使用本發(fā)明的酶-底物比例，組合高溫度條件，在3小時的溫育期間完成IPP和LPP的切割。相當驚人地，沒有展示出顯著數(shù)量的三肽VPP的伴隨生產。A.niger來源的酶不含任何可被測量到的氨基肽酶活性這個事實強烈暗示形成的IPP釋放自kappa酪蛋白中存在的-A107-I108-P109-P110-序列。我們猜測，IPP的肽鍵羧基末端被A.niger來源的脯氨酰內切蛋白酶的主活性所切割，而對前面的Ala-Ile鍵的切割是通過其Ala-特異性副活性來完成的。因此，本發(fā)明提供了一種方法，用于從蛋白來源產生IPP，其中產生的IPP對VPP的比例為至少5，優(yōu)選至少10，更優(yōu)選至少20，所述方法包括使用具有脯氨酸特異性內切蛋白酶活性的酶和能水解IPP氨基末端的鍵的酶。優(yōu)選地，能水解-I-P-P-氨基末端的鍵的酶同時不能水解-V-P-P-的氨基末端的鍵，或者對此僅有低活性。雖然針對本發(fā)明的方法提到了兩種酶活性，也可以在本發(fā)明的方法中使用同時具有兩種活性(分別為氨酸特異性內切蛋白酶活性和水解-I-P-P-氨基末端的鍵的活性)的酶，其例子是如本文所述的、優(yōu)選從A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶。因為根據(jù)本發(fā)明選用的水解方法，將形成比現(xiàn)有技術的方法中更少量的水溶性肽。在這些水溶性肽中，IPP以及可選地，LPP以主要含量存在。這在需要高濃度IPP以及可選地LPP化合物并且沒有許多其它化合物(通常為活性更低的化合物)的情況下尤其重要。根據(jù)本發(fā)明的方法，蛋白中存在的-A-I-P-P-或-A-L-P-P-中的優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少30％，最優(yōu)選至少40％分別轉化為IPP或LPP。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，蛋白中存在的-P-L-P-P-或-P-I-P-P-中的優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少30％，進一步更優(yōu)選至少40％，最優(yōu)選至少50％分別轉化為LPP或IPP。在實施例6中，我們展示了通過新的驚人純化步驟產生的對IPP的5倍純化作用。在該方法中，水解產物在55攝氏度、pH6.0下的短暫酶溫育期間形成，然后再被加熱至高于80攝氏度的溫度以殺死所有污染性的微生物，以及使A.niger來源的脯氨酰內切肽酶失活。隨后，對水解產物進行酸化，使pH降低至4.5或者至少低于5.0。該pH值不能被用于失活A.niger來源的脯氨酰內切肽酶(因為其代表著針對該酶的最優(yōu)條件)，在該pH值下，來自酪蛋白酸鹽的所有大的肽沉淀，從而僅有小的肽保留在溶液中。因為沉淀的酪蛋白酸鹽可通過傾析或過濾步驟或低速(即低于5000rpm)離心被容易地除去，水相含有相對存在的蛋白來說高比例的生物活性肽。根據(jù)Kjeldahl數(shù)據(jù)，通過低速離心步驟除去了酪蛋白酸鹽蛋白中的80至70％，這表明了對ACE抑制肽的四至五倍的純化。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，該純化原理可被有利地應用來獲得從非酪蛋白的蛋白質材料來源獲得的生物活性肽。根據(jù)本發(fā)明，不僅可分離并純化酶促產生的水解產物，還可分離并純化合適的微生物發(fā)酵得到的蛋白。在接近底物將要沉淀、而酶仍然具有活性的pH值的pH下溫育酶和底物，將允許該純化步驟發(fā)生。由于A.niger來源的脯氨酰內切蛋白酶的低pH最優(yōu)值，可以考慮在pH1.5至6.5的范圍內進行底物沉淀。考慮到它們特殊的沉淀行為，高于pH3.5的麥麩沉淀、高于pH3.5但低于pH6.0的乳清蛋白沉淀、高于pH3.5但低于pH5.0的卵白沉淀形成了水解蛋白得以沉淀的條件的例子，沉淀的蛋白可與水解蛋白或肽分離。水解產物的該可溶部分也被包括在水解產物的措辭中。該酸性可溶水解產物是通過下述方法形成的根據(jù)本發(fā)明對蛋白進行水解，接著調整酸性條件使得不可溶的水解部分能與可溶的肽分離。這種分離可以例如通過對不可溶部分進行沉淀或離心來實現(xiàn)。對于麥麩水解產物而言，酸性分離條件優(yōu)選為pH＝4，對乳清水解產物而言，酸性條件為優(yōu)選pH＝4.5，對酪蛋白水解產物而言，酸性條件為優(yōu)選pH＝4.5，對卵白而言，酸性條件為優(yōu)選pH＝5.0。通常，對于分離而言的優(yōu)選酸性條件為pH＝4.5。水解產物表示通過對蛋白水解形成的產物(或者，簡稱為蛋白水解產物或水解蛋白)，酸性可溶水解產物是蛋白水解產物的可溶部分，其在本文中還被描述為含有可溶肽的組合物或包含可溶肽的組合物)或蛋白水解產物與酸性可溶水解產物的混合物。在營養(yǎng)藥物應用和食物和飲料應用中，有利地使用本發(fā)明的水解產物。蛋白水解產物、酸性可溶水解產物及其混合物可用于營養(yǎng)藥物應用、食物應用或飲料。優(yōu)選地，酸性可溶水解產物用于營養(yǎng)藥物應用、食物應用或飲料，因為存在高含量的活性肽。雖然在奶酪制作工藝中使用了類似的原理以分離酪蛋白凝乳與乳清蛋白，但是在該奶酪制作工藝中，僅使用了天冬氨酸內切蛋白酶(EC3.4.23)。該酶的組(EC3.4.23)包括公知的奶酪制作酶，例如凝乳酶和多種胃蛋白酶，例如哺乳動物胃蛋白酶以及多種微生物胃蛋白酶，例如曲霉胃蛋白酶(aspergillopepsin)和粘膜胃蛋白酶(mucorpepsin)。在本發(fā)明的應用中，奶酪制作工藝中的凝乳和乳清不被定義為水解產物。此外，在本發(fā)明的水解方法中，有利地，不使用天冬氨酸內切蛋白酶(EC3.4.23)。此外，如前文所討論的，根據(jù)本發(fā)明的純化步驟對于非天冬氨酸內切蛋白酶產生的水解產物來說并非已知的。奶酪制作工藝或凝乳/乳清分離工藝被排除在本發(fā)明的純化方法之外，因此本發(fā)明的純化方法用于獲得可溶的肽，并且具有如下前提條件該方法并非奶酪制作工藝或凝乳/乳清分離工藝的一部分。雖然該純化步驟與奶酪制作工藝表面上具有相似性，但它們是完全不同的。在奶酪制作中，凝乳形成是由酶促步驟(“凝乳酶凝乳(renneting)”)或酸化步驟起始的。但是，凝乳酶凝乳工藝的進行不依賴于酸化，而酸化導致的奶酪凝乳結塊的進行不依賴于酶。在另一種純化方法中，根據(jù)本發(fā)明的方法，使用水可混溶的溶劑，例如，乙醇、丙酮、丙醇-1、丙醇-2、甲醇或其混合物，從水解蛋白中方便高效地回收肽。在該手段中，優(yōu)選地，在選定的pH條件下將蛋白水解產物與30-60％(v/v)的水可混溶溶劑小心地混合，該pH條件能使得較大的蛋白沉淀，而小的肽，例如IPP保留在溶液中。分離(例如傾析、過濾或低速離心)之后，可以以經(jīng)純化的狀態(tài)回收含有生物活性肽的上清液?？蛇x地，用額外的酶去處理該得到的含肽組合物(或含有可溶肽的組合物)，例如，以增加活性ACE抑制肽的水平(見實施例12和13)，或者肽組合物可與選擇性粘附劑(binder)接觸，所述粘附劑例如活性碳、來自AmberliteXADrange(Rohm)的色譜樹脂或Pharmacia提供的丁基瓊脂糖樹脂。隨后的蒸發(fā)以及可選的噴霧干燥步驟將產生用于獲得食品級高生物活性糊漿或粉末的經(jīng)濟途徑。對酪蛋白酸鹽進行消化后，獲得白色無嗅粉末，其具有高濃度的ACE抑制肽，富含IPP和LPP。如果適當稀釋至正確的三肽濃度，即可獲得具有優(yōu)秀口感的通用起始材料，其適合用于為所有種類的食物和飲料提供ACE抑制性質。如果需要的話，可通過隨后的純化來提高對生物活性成分的濃縮，其中利用肽IPP和LPP的疏水特征。優(yōu)選的純化方法包括微濾(nanofiltration)、萃取(例如用己烷或丁醇)接著蒸發(fā)/沉淀，或將獲得的酸化水解產物與粘附劑(例如活性碳或來自AmberliteXADrange(Roehm)的色譜樹脂)接觸。Pharmacia提供的丁基瓊脂糖樹脂也可使用。ACE抑制肽與此類材料的解吸附可用有機溶劑，例如甲醇/乙醇混合物或用丙醇來進行。在額外(例如色譜)純化步驟之前或之后獲得的肽可被用于加入到食物或飲料產品中，所述產品是常規(guī)消耗的。此類產品的例子是植物黃油、涂抹醬、多種奶制品(例如，黃油或酸奶)或含奶或乳清的飲料，優(yōu)選是基于酸奶或奶的產品，例如酸奶和奶。在其它飲料，例如果汁飲料或大豆飲料中，也可使用本發(fā)明的水解產物。另一種選擇是在健康產品，例如水果條、蛋白條、能量棒、基于谷物的產品(例如早餐谷物)中使用水解產物。本發(fā)明的另一方面涉及可通過本文在前所述的方法或工藝獲得的食物產品、飲料產品或膳食補充劑，所述用于制備食物或飲料產品的方法包括如下步驟從蛋白來源生產含有IPP的組合物，其中，從蛋白產生的IPP對VPP的重量比為至少5∶1，優(yōu)選至少10∶1，更優(yōu)選至少20∶1，所述方法包括使用脯氨酸特異性內切蛋白酶；以及(b)將所述含有IPP的組合物加入到食物產品、飲料產品或膳食補充劑中。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的所述食物產品、飲料產品或膳食補充劑包含0.05至10wt％，更優(yōu)選0.1至5wt％，最優(yōu)選0.2至4wt％的所述含IPP組合物或蛋白水解產物。還優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的食物或飲料產品或膳食補充劑包含每100克產品0.05至50mg的IPP，更優(yōu)選地，0.1至40mg，最優(yōu)選地，0.2至30mg。還優(yōu)選地，在本發(fā)明的食物或飲料產品或膳食補充劑中，IPP對VPP的重量比為5∶1至100∶1，更優(yōu)選地，5∶1至48∶1。還優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的食物產品、飲料產品或膳食補充劑包含IPP和LPP，其中，IPP對LPP的重量比為1∶10至1∶1，更優(yōu)選地，1.5∶7.1至4.8∶7.1。優(yōu)選地，食物或飲料產品或膳食補充劑選自由植物黃油、涂抹醬、黃油、奶制品或含乳清飲料構成的組，優(yōu)選地，基于酸奶或奶的產品，例如酸奶或奶，其中，所述食物或飲料產品或膳食補充劑包含如上所述的量的水解產物或如上所述的量的IPP。尤其優(yōu)選的是上文所述用于減輕人類高血壓的食物或飲料產品或膳食補充劑。對于食物或飲料或膳食補充劑而言，優(yōu)選份大小為例如每份5-350克，例如，5至150克。優(yōu)選地，每天的份數(shù)量為1-10份，例如2-5份。雖然此類組合物典型地被施予人類，它們還可以施予動物(優(yōu)選地，哺乳動物)，以減輕高血壓。此外，獲得的產品中高含量的ACE抑制劑或其它生物活性肽使得這些產品非常有用于加入到丸劑、片劑或高度濃縮溶液或糊狀或粉末形式存在的膳食補充劑中。確保ACE抑制肽或其它生物活性肽持續(xù)釋放的緩釋膳食補充劑是人們特別感興趣的。根據(jù)本發(fā)明的ACE抑制肽或其它生物活性肽可作為干燥粉末配制于例如丸劑、片劑、顆?；蛐〈蚰z囊中?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明的酶可作為液體被配制于例如糖漿或膠囊中。用于多種制劑的、含有根據(jù)本發(fā)明的酶的組合物還可包括至少一種下述組的化合物，所述組由生理上可接受的載體、佐劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑和稀釋劑構成，這些術語按照它們普通的含義使用，用來表示輔助包裝、運送、吸收、穩(wěn)定的物質，或者在使用佐劑的情況下，表示用來增強酶的生理作用的物質?？膳c根據(jù)本發(fā)明的酶在粉末形式中組合使用的多種化合物的相關背景可在″PharmaceuticalDosageForms″，secondedition，Volumes1，2and3，ISBN0-8247-8044-2MarcelDekker，Inc中找到。雖然根據(jù)本發(fā)明配制為干燥粉末的ACE抑制肽可儲藏相當長的時間，但應通過選用合適的包裝，例如鋁箔，來避免與水或潮濕空氣接觸。相對新的口服應用形式是使用多種類型的明膠膠囊或基于明膠的片劑?？紤]到天然ACE抑制肽與抵抗高血壓的相關性，本發(fā)明的新的經(jīng)濟有效的途徑提供了用于溫和降血壓食品或者甚至獸用產品的有吸引力的起點。因為本發(fā)明的途徑還包括驚人簡單的純化步驟，還增大了降血壓的經(jīng)濃縮膳食補充劑的可能性。根據(jù)本發(fā)明的方法可使用任何脯氨酸特異性寡蛋白酶或內切蛋白酶來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明或根據(jù)本發(fā)明使用的脯氨酸特異性寡肽酶表示屬于EC3.4.21.26的酶。根據(jù)本發(fā)明或根據(jù)本發(fā)明使用的脯氨酸特異性內切蛋白酶表示W(wǎng)O02/45525的權利要求1-5、11和13中提到的多肽。因此，該脯氨酸特異性內切蛋白酶是具有脯氨酸特異性內蛋白水解活性的多肽，其選自下述多肽構成的組(a)一種具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO2的1至526位氨基酸或其片段具有至少40％的氨基酸序列相同性；(b)一種多肽，其由下述多核苷酸編碼，所述多核苷酸能在低嚴謹度條件下與(i)SEQIDNO1的核酸序列，或其在60個，優(yōu)選100個核苷酸上至少80％或90％相同的片段，更優(yōu)選200個核苷酸上至少90％相同的片段，或(ii)與SEQIDNO1的核酸序列互補的核酸序列雜交。SEQIDNO1和SEQIDNO2如WO02/45524所示。優(yōu)選地，所述多肽以經(jīng)分離的形式存在。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選多肽包含SEQIDNO2的氨基酸序列或具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有與SEQIDNO2的1-526位氨基酸序列至少50％，優(yōu)選至少60％，優(yōu)選至少65％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，進一步更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％，進一步最優(yōu)選至少大約97％的相同性。優(yōu)選地，多肽由下述多核苷酸編碼，所述多核苷酸能在低嚴謹度條件下，更優(yōu)選地，中等嚴謹度條件下，最優(yōu)選高嚴謹度條件下，與(i)SEQIDNO1的核酸序列或其片段，或(ii)與SEQIDNO1的核酸序列互補的核酸序列雜交。術語“能雜交”指，本發(fā)明的目標多核苷酸能與用作為探針的核酸(例如，SEQIDNO1所示的核苷酸序列，或其片段，或SEQIDNO1的互補序列)以顯著高于背景的水平雜交。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明脯氨酸特異性內切蛋白酶的多核苷酸，以及與其互補的核苷酸序列。核苷酸序列可以是RNA或DNA，包括基因組DNA、合成DNA或cDNA。優(yōu)選地，核苷酸序列是DNA，最優(yōu)選地，基因組DNA序列。典型地，本發(fā)明的多核苷酸包含能在選擇性條件下與SEQIDNO1的編碼序列或編碼序列的互補序列雜交的核苷酸連續(xù)序列。此類核苷酸可根據(jù)本領域公知的方法合成。本發(fā)明的多核苷酸可以顯著高于背景的水平與SEQIDNO1的編碼序列或編碼序列的互補序列雜交。因為cDNA文庫中存在其它cDNA，可能出現(xiàn)背景雜交。本發(fā)明的多核苷酸與SEQIDNO1的編碼序列或編碼序列的互補序列之間的相互作用產生的信號水平典型地為其它多核苷酸與SEQIDNO1之間相互作用強度的至少10倍，優(yōu)選至少20倍，更優(yōu)選至少50倍，進一步更優(yōu)選至少100倍。相互作用的強度可例如通過對探針進行放射標記(例如用32P)來測量。典型地，選擇性雜交可使用低嚴謹度條件(0.3M氯化鈉以及0.03M檸檬酸鈉，大約40℃)、中等嚴謹度條件(例如，0.3M氯化鈉以及0.03M檸檬酸鈉，大約50℃)或高嚴謹度條件(例如，0.3M氯化鈉以及0.03M檸檬酸鈉，大約60℃)來獲得。UWGCGPackage提供了BESTFIT程序，其可以用來計算相同性(例如采用其缺省設置)。PILEUP和BLASTN算法可以用來計算序列相同性或對序列進行排列(lineup)(例如鑒定等同或對應的序列，例如使用其缺省設置)。用以開展BLAST分析的軟件可以通過NationalCenterforBiotechnologyInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)為公眾所獲得。該算法包括通過確定被查詢的序列中的長度為W的短字(shortword)，首先確定出高分數(shù)序列對(highscoringsequencepair，HSP)，所述的短字與數(shù)據(jù)庫序列中同樣長度的字進行比對時匹配或能達到為正值的某閾值分數(shù)T。T被稱為相鄰字分數(shù)閾值(neighbourhoodwordscorethreshold)。這些最初的相鄰字命中(wordhit)作為種子對搜索進行初始化，以找到含有它們的HSP。所述的字命中在每條序列的兩個方向上都延伸，直到累積比對分數(shù)(cumulativealignmentscore)能夠增加。當累積比對分數(shù)從其獲得的最大值降低了數(shù)量X；由于一個或多個分數(shù)為負的殘基比對的積累，所述累積分數(shù)到了零或以下；或到達了序列的任意末端之時，所述字配對在每個方向上的延伸就被中斷。BLAST算法的參數(shù)W、T和X確定了所述比對的敏感性和速度。所述的BLAST程序缺省使用的字長度(wordlength，W)為11，BLOSUM62分數(shù)矩陣比對(BLOSUM62scoringmatrixalignments，B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝4，缺省比較兩條鏈。BLAST算法進行了兩條序列間相似性的統(tǒng)計分析。由BLAST算法提供的一種對相似性的測量是最小總和概率(smallestsumprobability(P(N)))，它提供了對兩段核苷酸或氨基酸序列間的匹配將偶然發(fā)生的概率的指示。例如，如果第一條序列與第二條序列進行比較時的最小總和概率小于1左右，優(yōu)選小于0.1左右，更優(yōu)選小于0.01左右，以及最優(yōu)選小于0.001左右，則該序列就被認為與另一條相似。Aspergillus屬的菌株具有食品級狀態(tài)，從這些微生物獲得的酶已知能形成無可質疑的食品級來源。根據(jù)另一種優(yōu)選的實施方式，酶通過其生產細菌分泌，而并非非分泌的所謂胞質酶。以這種方式，可無需昂貴的純化步驟，就從細胞培養(yǎng)液中回收得到基本純凈狀態(tài)的酶。優(yōu)選地，酶具有與其底物在主要pH和溫度條件下的高度親和性。圖1A.niger來源的脯氨酰內切蛋白酶的pH最優(yōu)值的示意2A.niger來源的脯氨酰內切蛋白酶的特異性情況圖3完整卵清蛋白(ovalbumine)和合成27肽與經(jīng)色譜純化的A。niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶溫育之后的SDS-PAGE。圖4在合成底物F-pNA、Q-pNA和V-pNA上，pH6.0時，對含有三種商業(yè)可獲得的氨基肽酶的酶制劑的測得的相對活性。材料和方法材料可食用酪蛋白酸鉀(88％)從DMVInternational，TheNetherlands獲得。合成的發(fā)色肽從PepscanSystemsB.V.TheNetherlands或從Bachem，Switzerland獲得。Flavourzyme1000LBatchHPN00218從Novozymes(Denmark)獲得，SumizymeFP從ShinNihon(Japan)獲得，CorolaseLAPCh.4123從ABEnzymes(UK)獲得。來自A.niger的脯氨酸特異性內切蛋白酶。按照WO02/45524所述，對來自Aspergillusniger的脯氨酸特異性內切蛋白酶進行過量生產。在pH4.6的檸檬酸/磷酸二鈉緩沖液中，于37攝氏度，在合成肽Z-Gly-Pro-pNA上檢測酶活性。在405nm處通過分光光度方法監(jiān)測反應產物。一個單位被定義為在上述檢測條件下每分鐘釋放出1μmol對硝基酰苯胺(p-nitroanilide)的酶的量。對A.niger來源的內切蛋白酶進行色譜純化從過量生產的A.niger菌株獲得的培養(yǎng)液被用于對蛋白酶的色譜純化，以去除任何污染性的內或外蛋白水解活性。為達到此目的，首先對發(fā)酵培養(yǎng)液進行離心，以去除真菌生物質，然后將上清液經(jīng)過大量過濾器，所述過濾器具有逐漸減小的孔徑，以去除所有細胞片段。最后，在20毫摩爾/升乙酸鈉(pH5.1)中對獲得的超濾物稀釋10倍，上樣到Q-SepharoseFF柱上。使用在20毫摩爾/升乙酸鈉(pH5.1)中的0-0.4摩爾/升的NaCl梯度來洗脫蛋白。收集并匯合展示出針對Z-Gly-Pro-pNA切割活性的峰片斷，這按照WorldJournalofMicrobiology&Biotechnology11，209-2125(1995)所述的方法來進行，但試驗條件略有修改。考慮到A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶的酸性pH最優(yōu)值，酶試驗在37℃、pH4.6下于檸檬酸/二磷酸緩沖液中進行。匯合活性片段之后接著進行離心，最終產生了下述制劑，其在SDS-PAGE上僅顯示出單一條帶，在HP-SEC上顯示出一個峰。通過疏水相互作用色譜進行的進一步分析驗證了獲得的酶制劑的純度。LC/MS/MS分析使用偶聯(lián)到P4000泵(ThermoElectron，Breda，theNetherlands)上的離子阱質譜儀(ThermoElectron，Breda，theNetherlands)的HPLC被用于對目標肽進行定量，包括根據(jù)本發(fā)明的方法產生的酶促蛋白水解產物中的肽IPP(M＝325.2)、LPP(M＝325.2)、VPP(M＝311.2)、VVVPP(M＝509.3)和VVVPPF(M＝656.4)。使用Inertsil3ODS3，3μm，150*2.1mm柱(VarianBelgium，Belgium)組合MilliQ水中的0.1％甲酸(Millipore，Bedford，MA，USA；溶液A)和乙腈中的0.1％甲酸(溶液B)梯度用于洗脫，來分離形成的肽。梯度起始自100％的溶液A，保持5分鐘，10分鐘內線性增加至5％溶液B，接著在30分鐘內線性增加至45％溶液B，緊接著立刻回到起始條件，保持15分鐘以穩(wěn)定。所使用的注射體積為50微升，流速為每分鐘200微升，柱溫保持為55℃。注射樣品的蛋白濃度為大約50微克/毫升。關于各種肽的詳細信息通過使用針對目標肽的專門MS/MS來獲得，其中使用大約30％的最優(yōu)碰撞能。對各種肽的定量使用內部校正來進行，其中使用全部異亮氨酸被N15、C13標記的IPP(M＝332.2)，這通過使用在MS/MS模式中針對被分析的所有相關肽觀察到的最為豐富的片段離子來進行。使用的所有肽都通過Pepscan(Lelystand，TheNetherlands)合成。三肽LPP(M＝325.2)被用于在MS模式中針對最優(yōu)敏感度進行微調，在MS/MS模式中針對最優(yōu)片段化進行微調，其展示出5μg/ml的恒定注入率，在MS模式中產生質子化分子，在MS/MS模式中產生大約30％的最優(yōu)碰撞能，產生B-和Y-離子系列。在LC/MS/MS之前，在環(huán)境溫度和13000rpm下對酶促蛋白水解產物進行10分鐘離心，經(jīng)過0.22μm過濾器進行過濾，用去礦物質水(經(jīng)過Millipore水過濾設備過濾得的)(MilliQ水)對上清液進行1∶100的稀釋。水解程度使用快速OPA測試(Nielsen，P.M.；Petersen，D.；Dambmann，C.Improvedmethodfordeterminingfoodproteindegreeofhydrolysis.JournalofFoodScience2001，66，642-646)，對用多種蛋白水解混合物進行溫育期間獲得的水解程度(DH)進行監(jiān)測。Kjeldahl氮通過FlowInjection分析來測量總Kjeldahl氮。使用裝備有TKNMethodCassette5000-040、Pentinum4計算機(帶SOFIA軟件)和Tecator5027Autosampler的TecatorFIASTAR5000FlowInjectionSystem，在590nm處對從含蛋白質溶液中釋放出的氨進行定量。將對應于該方法動力學范圍(0.5-20mgN/l)的樣品量與95-97％的硫酸一起放置于消化管中，對Kjeltab于200攝氏度下30分鐘，接著360攝氏度下90分鐘的消化程序進行處理。注射后，在FIASTAR5000系統(tǒng)中測量氮峰，由其可推導出測量的蛋白的量。營養(yǎng)藥物產品根據(jù)本發(fā)明的營養(yǎng)藥物產品可以是任何食物類型。除食物產品外，它們可以以合適的量包含常見的食物成分，例如香料、糖、水果、礦物質、維生素、穩(wěn)定劑、增稠劑等。優(yōu)選地，營養(yǎng)藥物產品包含50-200mmol/kgK+和/或15-60mmol/kgCa2+和/或6-25mmol/kgMg2+，更優(yōu)選地，100-150mmol/kgK+和/或30-50mmol/kgCa2+和/或10-25mmol/kgMg2+，最優(yōu)選地，110-135mmol/kgK+和/或35-45mmol/kgCa2+和/或13-20mmol/kgMg2+。包括進根據(jù)本發(fā)明的營養(yǎng)藥物產品時，這些陽離子具有進一步降低血壓的有利作用。有利地，營養(yǎng)藥物產品包含一種或多種B族維生素。已知B族維生素葉酸參與高半胱氨酸(人類膳食中的氨基酸)代謝。數(shù)年來，已將高半胱氨酸的高水平關聯(lián)到心血管疾病的高發(fā)病率。人們認為，降低高半胱氨酸可降低心血管疾病發(fā)病的風險。已知維生素B6和B12干擾嘌呤和硫胺生物合成，參與用于生產甲硫氨酸的高半胱氨酸甲基化過程中的甲基合成，以及參與若干種生長過程。已知維生素B6(鹽酸吡哆醇)是維生素補充劑。維生素B12(cyanobalamin)促進神經(jīng)系統(tǒng)健康，其涉及對血紅細胞的生產。還已知其能作為食物補充劑中的維生素。因其對降低心血管疾病風險有組合性的積極作用，優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的產品包含維生素B6和維生素B12和葉酸。營養(yǎng)藥物產品中B族維生素的量可由本領域技術人員根據(jù)本文給出的這些B族維生素的日常量來計算葉酸200-800μg/天，優(yōu)選地，200-400μg/天；維生素B60.2-2mg/天，優(yōu)選地，0.5-1mg/天；以及維生素B120.5-4μg/天，優(yōu)選地，1-2μg/天。優(yōu)選地，營養(yǎng)藥物產品包含3至25wt％的固醇，更優(yōu)選地，7至15wt％的固醇。包括進固醇的好處在于其將導致人類血液中LDL-膽固醇水平的降低，這將使得心血管風險降低。提到固醇的時候，其包括飽和氫化固醇(stanol)以及固醇/氫化固醇的酯化衍生物或它們任何的混合物。在本申請中，提到固醇酯的時候，其也包括它們的飽和衍生物(氫化固醇酯)以及固醇酯和氫化固醇酯的組合。固醇或植物固醇(phytosterol，也作plantsterol或vegetablesterol)可被分為三組4-去甲基固醇、4-單甲基固醇和4，4’-二甲基固醇。在油中，它們主要作為游離固醇或脂肪酸的固醇酯存在，雖然固醇葡糖苷和?；檀计咸擒找彩谴嬖诘摹Ｓ腥N主要的植物固醇，即beta-谷固醇、豆固醇和菜油固醇。關于這些成分含義的示意圖在″InfluenceofProcessingonSterolsofEdibleVegetableOils″，S.P.Kochhar；Prog.LipidRes.22pp.161-188中給出。分別的5alpha-飽和的衍生物，例如氫化谷固醇、氫化菜油固醇和氫化麥角固醇和它們的衍生物，在本申請文件中被稱為氫化固醇。優(yōu)選地，(可選被酯化的)固醇或氫化固醇選自包含β-谷固醇、β-氫化谷固醇、菜油固醇、氫化菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、氫化菜籽固醇或其混合物的組?？蛇x地，固醇或氫化固醇至少部分被脂肪酸酯化。優(yōu)選地，固醇或氫化固醇被一種或多種C2-22脂肪酸酯化。就本發(fā)明的目的而言，術語C2-22脂肪酸表示包含C2-22主鏈和至少一個酸基團的任何分子。C2-22主鏈可部分被取代，或者可以存在側鏈，雖然這在本文上下文中并不是優(yōu)選的。但優(yōu)選地，C2-22脂肪酸是線性分子，其包含一個或兩個酸基團作為末尾基團。最優(yōu)選的是如天然油中存在的那些一樣的線性C8-22脂肪酸脂肪酸。任何此類脂肪酸的合適例子是乙酸、丙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸。其它合適的酸例如檸檬酸、乳酸、草酸和馬來酸。最優(yōu)選的是肉豆蔻酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、二十二碳酸、油酸、芥子酸、二十二碳烯酸、反式油酸(elaidicacid)、亞油酸和亞麻酸。如果需要的話，可使用脂肪酸的混合物用于對固醇或氫化固醇進行酯化。例如，可以使用天然存在的脂肪或油作為脂肪酸的來源，通過酯交換反應進行酯化。上述作用于增加心血管健康的營養(yǎng)藥物成分、K+、Ca2+和Mg2+、B族維生素(葉酸、B6、B12)和固醇在本文中被合稱為心臟健康成分。實施例1從A.niger獲得的酶代表一類新的脯氨酸特異性酶可以從WO02/45524提供的A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶的完全編碼序列測定526個氨基酸的蛋白序列。通過對數(shù)據(jù)庫，例如SwissProt、PIR和trEMBL進行BLAST搜索來驗證酶的新穎性。令我們吃驚地，在該A.niger酶和已知脯氨酰寡肽酶之間沒有探測到明顯的同源性。但是對氨基酸序列的更為接近的檢查揭示了與Pro-X羧基肽酶(EC3.4.16.2)、二肽基氨基肽酶I(EC3.4.14.2)和胸腺特異性絲氨酸蛋白酶之間低卻顯著的同源性。所有這些酶已被分進絲氨酸肽酶SC組的S28家族(HandbookofProteolyticEnzymes；BarrettA.J.；RawlingsN.D.；WoessnerJ.F.，Eds.；AcademicPress，London，UK，1998，369-415)。此外，活性位點絲氨酸周圍的GxSYxG構象在這些酶和A.niger來源的內切蛋白酶中是保守的。此外，S28家族的成員具有酸性pH最優(yōu)值，具有在脯氨酸殘基的羧基末端側進行切割的特異性，并且是用類似A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶的信號序列和前肽合成的。此外，A.niger酶的大小類似于S28家族的成員。因此，A.niger脯氨酸特異性內切蛋白酶看起來是絲氨酸蛋白酶S28家族的成員，而非大多數(shù)胞質脯氨酰寡肽酶(包括從Flavobacteriummeningosepticum獲得的酶)被歸入的S9家族的成員。在這些結構和生理特征的基礎上，我們已推斷出，A.niger酶屬于絲氨酸蛋白酶SC組的S28家族，而非S9家族。將A.niger來源的酶與屬于S9家族的脯氨酰寡肽酶區(qū)分開的另外的特征是下述事實與屬于后一家族的胞質脯氨酰內切蛋白酶不同，新鑒定出的A.niger酶被分泌進生長培養(yǎng)基。實施例2從A.niger獲得的脯氨酸特異性內切蛋白酶的DH和混度最優(yōu)值為建立A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶的pH最優(yōu)值，制備具有不同pH值的緩沖液。用0.05mol/l乙酸鈉和0.02MCaCl2來制備pH4.0-4.5-4.8-5.0-5.5和6.0的緩沖液；用含有0.02MCaCl2的0.05MTris/HCl緩沖液來制備pH7.0和8.0的緩沖液。分別使用乙酸和HCl調節(jié)pH值。發(fā)色合成肽Z-Gly-Pro-pNA被用作為底物。如果X-pNA肽鍵被切割的話，“pNA”(對硝基酰苯胺)底物會導致顏色改變。在水浴中將緩沖溶液、底物溶液和脯氨酰內切蛋白酶預稀釋液(活性為0.1U/mL)加熱至恰好37.0℃?；旌虾?，接著在405nm處于37.0℃分光光度監(jiān)測下進行3.5分鐘的反應，每0.5分鐘測量一次。從表1所示的結果可以清楚看出，A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶具有大約4的pH最優(yōu)值。此外還建立了脯氨酰內切蛋白酶的溫度最優(yōu)值。為達到此目的，在不同司溫度下，用CaseineResorufine(RocheDiagnostics，Alrnere，TheNetherlands)作為底物，在含有0.02mol/lCaCl2的0.1mol/l乙酸鈉中于pH5.0對經(jīng)過純化的酶制劑進行2小時溫育，通過在574nm處的測量來對酶活加以定量。根據(jù)獲得的結果，來自A.niger的脯氨酸特異性內切蛋白酶具有大約50攝氏度的溫度最優(yōu)值。實施例3A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶的特導性針對發(fā)色肽底物的集合體，對從含有多個拷貝的表達盒(見WO02/45524)的A.niger菌株獲得的粗制酶樣品和經(jīng)過色譜純化的酶樣品進行檢驗，以建立被編碼的內切蛋白酶的特異性。在AAXpNA底物上對該酶的內蛋白水解活性加以檢驗，其中，“X”代表不同的天然氨基酸殘基。在含有20CaCl2的0.1M乙酸緩沖液(pH4.0)中對AAX-pNA底物的貯液(150mmol/l)進行100X稀釋。于405nm處在TECANGeniosMTPReader(Salzburg，Vienna)中于40攝氏度進行的10分鐘動力學測量記錄了光學密度的增加。在Excel中對產生的數(shù)據(jù)進行進一步處理，產生圖2所示的圖。從結果可以清楚看出，A.niger來源的內切蛋白酶對于脯氨酰肽鍵具有高度特異性，其對丙氨酰鍵具有副活性。粗制的和經(jīng)過色譜純化的制劑顯示了相似的活性情況。實施例4A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶可以水解大的蛋白以及小的肽，其因此是真正的內切蛋白酶由于特殊的結構特征，屬于絲氨酸蛋白酶SC組的S9家族的脯氨酰寡肽酶不能消化大于30個氨基酸的肽。該限制對于應當盡可能迅速高效地水解不同蛋白的酶來說是明顯的缺點。為檢查A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶是否展示出與底物分子大小相關的同樣的局限性，我們將來自A.niger的經(jīng)色譜純化脯氨酰內切肽酶與小的合成肽和大的卵清蛋白分子一起溫育，以研究這些底物分子的降解動力學。所用的合成肽是序列NH2-FRASDNDRVIDPGKVETLTIRRLHIPR-COOH的27肽，其是Pepscan公司(Lelystad，TheNetherlands)的贈品。如其氨基酸序列所顯示的，該肽含有2個脯氨酸殘基，一個在中間一個在肽的非常末端。所用的完整卵清蛋白分子(PierceImject，含有20mg凍干物質的小管)由385個氨基酸構成，其分子量為42750Da。該分子含有14個脯氨酸殘基，其中一個位于該分子C末端最后一位，不能被脯氨酸特異性內切蛋白酶所切割。在50℃用經(jīng)純化的A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶與卵清蛋白和寡肽分別進行溫育。在若干次時間間隔點取樣，使用SDS-PAGE進行分析。用含有20mMCaCl2的0.1M乙酸緩沖液(pH4)對具有4.5單位/ml活性的經(jīng)色譜純化的A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶進行100倍稀釋。將卵清蛋白溶解于乙酸緩沖液(pH4)中，至濃度為1mg/ml(22μM)。將27肽溶解于同樣的緩沖液中，達到0.48mg/ml的濃度(152μM)。卵清蛋白和27肽溶液的摩爾濃度被選為使得兩種溶液含有相同摩爾濃度的可切割脯氨酸殘基。卵清蛋白含有13個可能的脯氨酸切割位點，而27肽僅有兩個。兩種底物溶液各取0.5ml，與10μl(0.45毫U)酶溶液在Eppendorf熱混合儀中于50℃進行溫育。在若干時間間隔點，從溫育混合物中取10μl樣品，保持在20℃，直到進行SDS-PAGE。用于SDS-PAGE和染色的所有材料都購自Invitrogen(Breda，TheNetherlands)。根據(jù)廠商說明書，使用LDS緩沖液來制備樣品，根據(jù)廠商說明書，使用MES-SDS緩沖體系，在12％Bis-Tris凝膠上進行分離。使用SimplyBlueSafeStain(CollodialCoomassieG250)進行染色。從圖3中可見，在最初4.75小時的溫育中，卵清蛋白被Aspergillus來源的酶切割為大約35-36kD的離散條帶(第3道)。延長的溫育期間導致進一步破碎為多種分子量的更小產物(第7道)。此外，27肽與酶的溫育導致迅速降解，這可從第4、6和8道中稍暗淡且更模糊的條帶來判斷。因為27肽以與大得多的卵清蛋白分子同樣的速度破裂，因此可以推斷出，與屬于S9家族的已知脯氨酰寡肽酶不同，較之大得多的蛋白，A.niger來源的脯氨選特異性內切蛋白酶對小尺寸肽沒有特別偏好。該觀察證實A.niger來源的酶代表真實的內切蛋白酶，以及水解不同類型蛋白的優(yōu)選的酶。該發(fā)現(xiàn)導致了下述實施例闡述的該酶的驚人用途。實施例5將酪蛋白酸鉀與來自A.niger的脯氨酸特異性內切蛋白酶一起溫育迅速產生IPP和LPP而不產生VPP在本實驗中，過量生產的、基本上純的來自A.niger的脯氨酸特異性內切蛋白酶與酪蛋白酸鉀一起溫育，以檢驗ACE抑制肽IPP、VPP以及LPP的釋放。所用的內切蛋白酶基本上純，這表明，除了純的脯氨酸特異性內切蛋白酶所固有的內蛋白水解活性(即，對脯氨酸和丙氨酸殘基的羧基末端切割)之外不存在其它顯著的蛋白水解活性(見實施例7)。為盡可能限制作為攝取ACE抑制肽造成的鈉攝取，用酪蛋白酸鉀作為該溫育中的底物。將酪蛋白酸鹽懸浮于65攝氏度水中，濃度為10％(w/w)蛋白，之后用磷酸將pH調節(jié)為6.0。然后將懸浮液冷卻至55攝氏度，將A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶以4單位/克蛋白的濃度加入(關于單位的定義，見材料和方法一節(jié))。在持續(xù)攪拌下，對該混合物進行24小時的溫育。在該期間不進行進一步的pH調節(jié)。1、2、3、4、8和24小時的溫育之后取樣。通過將樣品迅速加熱至90攝氏度5分鐘，對每份樣品終止酶活性。冷卻后，使用磷酸將每份樣品的pH迅速降低至4.5，之后在Hereaus臺式離心機中于3000rpm對懸浮液離心5分鐘。完全澄清的上清液被用于LC/MS/MS分析，以對上清液中的肽VPP、IPP、LPP、VVVPP和VVVPPF進行定量(見材料和方法一節(jié))。牛奶酪蛋白包括數(shù)種不同蛋白，包括beta酪蛋白和kappa酪蛋白。根據(jù)已知的氨基酸序列，beta酪蛋白包含ACE抑制三肽IPP、VPP和LPP。在beta酪蛋白中，IPP被含有于序列-P71-O72-N73-I74-P75-P76-中，VPP被含有于序列-P81-V82-V83-V84-P85-P86-中，LPP被含有于序列-P150-L151-P152-P153-中。kappa酪蛋白以大約是beta酪蛋白濃度的50％的摩爾濃度存在于酸沉淀的酪蛋白酸鹽制劑中，其僅包含IPP。kappa酪蛋白中，IPP被含有于序列-A107-I108-P109-P110-中。酪蛋白的其它蛋白成分不含IPP、VPP或LPP。表1和表2顯示了酸化和經(jīng)離心上清液中存在的肽的濃度，其是由LC/MS/MS定量的。這些表中展示的多種肽的濃度是相對加入到溫育混合物中的每克酪蛋白酸鉀而言計算的。如表1所示，1小時的溫育后IPP達到其最大濃度。IPP濃度不會在其上進一步增加。五肽VVVPP的形成展示出了與IPP產生相同的動力學。如理論所預期的，VVVPP的摩爾產率與LPP肽的摩爾產率相似。LPP和VVVPP的產率達到理論可行的大約60％。LPP的最大濃度在僅3小時溫育后即達到這個事實暗示對beta酪蛋白分子特定部分的切割可能略微更困難。與VVVPP相反，六肽VVVPPF完全不形成。該觀察表示，脯氨酸特異性內切蛋白酶高效切割-P-F-鍵，由此產生VVVPP。三肽IPP立即形成，但是其摩爾產率不高于VVVPP或LPP最大摩爾產率的大約三分之一。因為在beta酪蛋白和kappa酪蛋白中都含有IPP三肽，該結果是預料不到的。對于該觀察而言，可能的解釋是脯氨酸特異性內切蛋白酶能產生IPP，但是只能從酪蛋白酸鹽的kappa酪蛋白部分產生。考慮到kappa酪蛋白的相關氨基酸序列，這表明-A107-I108-肽鍵被該酶的丙氨酸特異性活性切割開。如果這是真的，釋放的IPP的量達到存在于kappa酪蛋白中的量的大約40％，但是不超過理論上存在于beta加kappa酪蛋白中存在的IPP的量的大約10％。該針對IPP釋放的切割機制還解釋了VPP為何不能從其前體分子VVVPP形成簡單地，需要的內蛋白水解(或氨基肽酶)活性不存在于所使用的A.niger來源的酶制劑中。表1基于加入的每克蛋白計算得到的、酸化上清液中的摩爾肽含量表2以mg/g加入的蛋白計算的、酸化上清液中的肽濃度實施例6并入酸性酪蛋白沉淀步驟導致了對ACE抑制肽的5倍濃縮如實施例5所述，以10％(w/w)蛋白濃度存在的酪蛋白酸鉀被用于與A.niger來源的脯氨酸特異性內切蛋白酶在pH6.0下溫育。數(shù)次不同溫育周期后，加熱樣品，終止其它酶活性，之后將pH降低至4.5，以最小化酪蛋白溶解度。通過低速離心除去不可溶酪蛋白分子。在表1和表2中，我們已經(jīng)提供了基于10％蛋白的起始濃度計算的ACE抑制肽的濃度。但是，作為酸化和隨后離心步驟的結果，已經(jīng)除去了大部分加入的蛋白。為將酸化上清液的這些減少的蛋白含量考慮進來，進行氮(Kjeldehl)分析。根據(jù)后者數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)不同上清液含有下述蛋白水平。表3酸化上清液的蛋白含量考慮到這些數(shù)據(jù)，我們重新計算了每種上清液中存在的ACE抑制肽的濃度，但是這是使用它們真實的蛋白含量。這些重新計算的結果示于表4。表4以存在的每克蛋白計算得到的、酸化上清液中的肽濃度對表2和表4的比較清楚地顯示，簡單酸化步驟之后接著進行工業(yè)上可行的傾析、過濾或低速離心步驟，導致特定的ACE抑制肽濃度的5倍增加。后面的實驗顯示可通過在傾析、過濾或低速離心之前對酸化懸浮液進行過夜貯藏來提高酸沉淀步驟的效率。實施例7對ACE抑制肽生產中污染性的酶活性加以定量根據(jù)本發(fā)明，ACE抑制肽可在簡單的一步法中獲得，這通過對合適的蛋白底物和脯氨酸特異性內切蛋白酶一起溫育來實現(xiàn)。隨后對水溶性ACE抑制肽的富集由通過酸化沉淀較大分子量的蛋白片段來完成。后一酸富集方法的效率依賴于對底物分子非常有選擇性的切割。存在的蛋白水解活性越多，則由此形成的水溶性肽就越多，因此會降低ACE抑制肽的富集因子。例如，在與底物溫育期間，額外的非脯氨酸或非丙氨酸特異性內切蛋白酶的存在導致更多非生物活性肽的可溶，由此稀釋了IPP和LPP在最終濃縮物中的相對濃度。此外，污染性外切蛋白酶(例如羧基肽酶或氨基肽酶)的存在導致游離氨基酸的釋放。這些額外的游離氨基酸也會稀釋ACE抑制肽的相對濃度，此外，作為增加的Maillard反應的結果，給予培養(yǎng)液不好的味道。為最小化所有這些不想要的副反應，優(yōu)選使用基本上純的脯氨酸特異性內切蛋白酶。基本上純指在所用的培養(yǎng)條件下，污染性內切蛋白酶以及污染性外切蛋白酶的活性是最小化的或者優(yōu)選不存在。下述檢驗流程被用來對此類污染性活性加以定量。該檢驗流程的基礎是通過數(shù)種選擇性發(fā)色肽的集合形成的。在所有這些發(fā)色肽中，“Z”代表芐氧羰基和“pNA”代表發(fā)色團對硝基酰苯胺。因為僅脯氨酸特異性寡和內切蛋白酶能從N末端被“Z”基團封閉的肽釋放出有色的pNA，因此肽Z-AAAP-pNA被用于對想要的脯氨酸特異性內蛋白水解活性加以定量。因為很多內切蛋白酶能從Z-AAAF-pNA和Z-AAAR-pNA釋放pNA，因此這兩種肽被用于對污染性的、非脯氨酸特異性內蛋白水解活性加以定量。因為肽QNIPP和VVVPP向IPP和VPP的分別轉化需要能有效除去Gln(Q)和Val(V)殘基的氨基肽酶，因此Q-pNA和V-pNA被用于對此類污染性氨基肽酶活性加以定量。因為很多羧基肽酶能從肽釋放Phe(F)和Arg(R)殘基，因此含有這些殘基的肽備選用來對污染性羧基肽酶活性加以定量。但是，對于測量羧基肽酶而言沒有合適的發(fā)色基團，從而不得不開發(fā)出使用合成肽Z-AF和Z-AR的替代方法。該替代方法下文提供。所有發(fā)色肽都從Pepscan(Lelystad，TheNetherlands)獲得。肽Z-AF和Z-AR購自Bachem(Switserland)。所有溫育都在40℃進行。為闡述該方法，對可通過商業(yè)途徑獲得的酶制劑Flavourzyme1000L(BatchHPN00218，從Novozymes(Denmark)獲得)、來自ShinNihon(Japan)的SumizymeFP和來自ABEnzymes(UK)的CorolaseLAP(Ch.4123)加以檢驗，并與來自A.niger的脯氨酸特異性內切蛋白酶相比較。檢驗的商業(yè)酶制劑被稀釋，以產生最優(yōu)的溫育條件，但在最終數(shù)據(jù)的表述中要將其重新計算為商業(yè)產品的濃度(見表5)。測量污染性氨基肽酶活性將100％DMSO中的150mmol/lV-pNA和Q-pNA貯液在0.1MBisTris緩沖液(pH6)中稀釋80倍，制作以1∶1的比例含有V-pNA和Q-pNA的3.75mmol/lV-pNA+Q-pNA底物溶液。將該氨基肽酶底物溶液按200μl一份移取入微滴定板(MTP)的各個孔中。預先在40℃于TecanGeniosMTP(Salzburg，Vienna)中溫育MTP，在Magellan4軟件下運行。通過加入50μl合適的酶溶液來起始反應，使得溫育在3mM的底物濃度下發(fā)生。典型地，使用1∶50稀釋的液體酶樣品Flavourzyme、CorolaseLAP和脯氨酸特異性內切蛋白酶。關于干的SumizymeFP產品，使用1％溶液。通過TecanGeniosMTP顯影在405nm處對黃顏色加以測量，這是作為對氨基酸-pNA鍵進行切割的結果，接著進行至少20個動力學循環(huán)(大約10分鐘)。該軟件產生作為OD405/分鐘獲得的數(shù)據(jù)。測量脯氨酸特異性酶活性該測量基本與氨基肽酶試驗一樣來進行，但是在該試驗中，Z-AAAP-pNA被用作為唯一底物，其終濃度為3mmol/l。通過將pH6緩沖液中的懸浮液加熱至50-55℃來溶解該底物，得到室溫下清澈的溶液。測量在40℃進行。典型地，使用1∶50稀釋的液體酶樣品Flavourzyme、CorolaseLAP。SumizymeFP以1％溶液來使用。典型地，脯氨酸特異性內切蛋白酶以1∶5000稀釋來使用。軟件產生以OD405/分鐘表示的數(shù)據(jù)。測量污染性非脯氨酸特異性內切蛋白酶活性該測量也按照與對氨基肽酶試驗的描述基本一樣的方式來進行，但是，在該檢驗中，1∶1比例以及3mmol/l終濃度的Z-AAAF-pNA和Z-AAAR-pNA被用作為底物。底物Z-AAAF-pNA在所用的pH6.0的檢驗條件下極少可溶，但是有枯草桿菌蛋白酶的檢驗溫育卻能使得底物迅速溶解，伴隨pNA釋放。測量在40℃進行。但是，為了彌補該弱的可溶性，對MTP讀數(shù)器加以程序調整，使其在動力學循環(huán)之間搖動。軟件仍產生以OD405/分鐘表示的數(shù)據(jù)。測量污染性羧基肽酶活性因為不可獲得敏感的發(fā)色肽用于測量羧基肽酶活性，因此使用基于Boehringer方案的方法，來對羧基肽酶C加以定量。將乙醇中的150mmol/lZ-A-F和Z-A-R貯液在0.1MBisTris緩沖液(pH6)中稀釋80倍，制作以1∶1的比例含有Z-A-F和Z-A-R的3.75mmol/lZ-A-F+Z-A-R底物溶液。取200μl該底物溶液，移入eppendorf管，在40℃預先溫育。通過加入50μl合適的酶稀釋液來起始反應。典型地，關于Flavourzyme和CorolaseLAP和脯氨酸特異性內切蛋白酶，使用1∶50的稀釋液。關于SumizymFP，使用1％的溶液。5分鐘之后，通過加入250μl茚三酮(ninhydrine)試劑來終止反應。茚三酮試劑由溶解于15mlDMSO中的60mg還原茚三酮(hydrindantin)和400mg茚三酮(Merck)制成，向其中加入5ml4.0mol/l的乙酸鋰緩沖液(pH5.2)。4.0mol/l的乙酸鋰緩沖液是通過溶解LiOH(Sigma)之后用冰醋酸(Merck)將pH調節(jié)至pH5.2來制得的。終止反應之后，在95℃對每份樣品加熱15分鐘，以促進顏色形成，隨后用純的乙醇稀釋10倍。在Uvikon分光光度計中于578mn對形成的顏色加以測量。以與活性樣品同樣的方式制作空白對照，但是茚三酮試劑和酶的加入被顛倒進行。為對羧基肽酶活性產生的游離氨基酸加以定量，氨基酸L-苯丙氨酸被用于產生校正曲線。以與樣品同樣的方式，對在緩沖液(pH6)中含有0.1875、0.375、0.75、1.5和3.0mol/lL-苯丙氨酸(Sigma)的溶液進行處理，即，小管中250μl。從獲得的OD578值，在Excel中構建曲線。使用該曲線來計算含有Z-A-F和Z-A-R底物的樣品中存在的游離氨基酸的濃度。從獲得的值，可以計算出羧基肽酶活性，其表示為相對每份檢驗的酶的含量每分鐘的微摩爾。計算活性比例為建立用于本發(fā)明方法的多種酶制劑的適宜性，對相關酶活性的系數(shù)(quotient)加以計算。在基于MTP讀數(shù)器的試驗中，通過相對時間上的pNA釋放來分析酶活性，即作為ΔOD405/分鐘。通過MTP讀數(shù)器獲得的酶活的系數(shù)是通過簡單地除以針對酶的同樣數(shù)量獲得的ΔOD/分鐘值來計算的。但是，在羧基肽酶試驗的情況下，產生的OD不能直接與基于MTP-pNA的試驗產生的ΔOD/分鐘加以比較。此時首先要將測得的OD轉化為每分鐘釋放的氨基酸(μmol/分鐘)。為達到此目的，在MTP讀數(shù)器中產生校正曲線，其中，純pNA(Sigma)稀釋為0.25、0.125、0.0625、0.0312和0.015mmol/l，每個孔測量250μl。在Excel中從獲得的數(shù)據(jù)構建校正曲線。從該校正曲線將ΔOD/分鐘轉化為μmol/分鐘，使得基于pNA的測量可與基于茚三酮的測量相比較。在上述檢驗中產生的數(shù)據(jù)的基礎上，針對想要的脯氨酸特異性和污染性內切蛋白酶、氨基肽酶和羧基肽酶活性對所用的多種酶制劑進行分析。每種酶制劑中存在的想要的脯氨酸特異性活性顯示于表5“脯氨酸特異性活性”一欄中。關于污染性氨基肽酶活性(氨基肽酶/脯氨酸特異性活性)和污染性羧基肽酶(羧基肽酶/脯氨酸特異性活性)和內蛋白水解活性(內蛋白水解/脯氨酸特異性活性)的數(shù)據(jù)相對存在的脯氨酸特異性活性顯示。在每種酶制劑中存在的相對于污染性羧基肽酶的污染性氨基肽酶的活性以(氨基肽酶/羧基肽酶)顯示。明顯地，檢驗的商業(yè)酶制劑沒有哪種含有任何顯著的脯氨酸特異性寡或內蛋白水解活性。此外，檢驗的所有商業(yè)酶制劑都含污染性內和外蛋白水解活性。表5對多種酶制劑中污染性蛋白水解活性的定量*Sumizyme是在1％溶液中測量的，F(xiàn)lavourzyme和Corolase作為1∶50的稀釋液測量。從A.niger獲得的脯氨酸特異性活性作為l∶5000稀釋液來測量。然后將數(shù)據(jù)換算為提供的產品中存在的活性。A.可通過傳統(tǒng)配方流程，使用下述成分來制備藥物組合物實施例8軟明膠膠囊使用下述成分，通過傳統(tǒng)流程來制備軟明膠膠囊活性成分蛋白水解產物0.3g其它成分甘油、水、明膠、植物油實施例9硬明膠膠囊使用下述成分，通過傳統(tǒng)流程來制備硬明膠膠囊活性成分蛋白水解產物0.7g其它成分填料數(shù)量足夠的乳糖或纖維素或纖維素衍生物潤滑劑如果需要的話，硬脂酸鎂(0.5％)實施例10片劑使用下述成分，通過傳統(tǒng)流程來制備片劑活性成分蛋白水解產物0.3g，未水解蛋白0.4g其它成分微晶纖維素、二氧化硅(SiO2)、硬脂酸鎂、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉。B.可以使用下列組分按照傳統(tǒng)工序來制備食物產品實施例11有30％果汁的軟飲典型份量240ml活性成分蛋白水解產物和作為碳源的麥芽糊精被加入到該食物產品中蛋白水解產物1.5-15g/每份麥芽糊精3-30g/每份I.用下述成分制備軟飲復合物果汁濃縮物和水溶性香料[g]1.1橙汁濃縮物60.3℃白利糖度(Brix)，5.15％酸度657.99檸檬濃縮物43.5℃白利糖度，32.7％酸度95.96水溶性橙味香料13.43水溶性杏味香料6.71水26.461.2顏料β-胡蘿卜素10％CWS0.89水67.651.3酸和抗氧化劑抗壞血酸4.11無水檸檬酸0.69水43.181.4穩(wěn)定劑果膠0.20安息香酸鈉2.74水65.601.5油溶性香料油溶性橙味香料0.34蒸餾得到的甜橙油0.341.6活性成分活性成分(這指上文提到的活性成分蛋白水解產物和麥芽糊精)以上文提到的濃度存在。果汁濃縮物和水溶性香料在沒有空氣摻入的條件下混合起來。顏料溶于去離子水中。抗壞血酸和檸檬酸溶于水中。安息香酸鈉溶于水中。攪拌下加入果膠，煮沸令其溶解。冷卻所述溶液。油溶性香料和甜橙油預先混合起來。1.6中提到的活性成分被干燥地混合起來，然后優(yōu)選攪拌添加到果汁濃縮物混合物(1.1)中。為制備所述的軟飲復合物，3.1.1至3.1.6的所有部分都被混合到一起，然后用Turrax再用高壓均質機(p1＝200bar，P2＝50bar)對其進行均質。II.用下述成分來制備瓶裝糖漿軟飲復合物74.50水50.00糖漿，60℃白利糖度150.00所述瓶裝糖漿的成分被混合到一起。用水將所述瓶裝糖漿稀釋到1L，成為現(xiàn)成可用的飲料。變化可以對所述飲料進行巴氏消毒來代替使用安息香酸鈉。所述飲料還可經(jīng)過碳酸化。實施例12不同商業(yè)酶制劑的氨基肽水解活性在beta酪蛋白中，IPP被含有于序列-P71-Q72-N73-174-P75-P76-中，VPP被含有于序列-P81-V82-V83-V84-P85-P86-中，LPP被含有于序列-P150-L151-P152-P153-中。在酪蛋白的其它蛋白組分中，僅kappa酪蛋白包括含有IPP的序列。從脯氨酸特異性內切蛋白酶的特異性，可以推斷出，將beta酪蛋白與A.niger來源的酶一起溫育，將形成Q72-N73-I74-P75-P76-、V82-V83-V84-P85-P86-和L151-P152-P153-。與LPP相反，形成的兩種五肽僅展示出低的ACE抑制活性。例如，EP0583074報道，VVVPP的IC50值為873微摩爾/l，而截短的VPP分子則具有9微摩爾/1的IC50值。所以明顯地，為產生酪蛋白水解產物的完全ACE抑制能力，在與脯氨酸特異性內切蛋白酶溫育期間形成的VVVPP和QNIPP必須被分別轉化為三肽VPP和IPP。因為氨基肽酶隨后可從肽的N末端除去氨基酸，因此需要能高效釋放VPP序列前的兩個纈氨酸(“V”)殘基以及IPP序列前的谷氨酰胺(“Q”)和天冬酰胺(“N”)殘基的氨基肽水解酶活性。因為己知XPP三肽中存在的X-P和P-P肽鍵能抵抗酶促切割，此類氨基肽水解活性就可能將這兩種五肽轉變?yōu)橄胍腣PP和IPP三肽。針對它們的氨基肽水解活性，對三種商業(yè)酶制劑進行了檢驗Flavourzyme1000LBatchHPN00218(Novozymes，Denmark)、SumizymeFP(ShinNihon，Japan)和CorolaseLAPCh.4123(ABEnzymes，UK)。已知Flavourzyme和SumizymeFP是復合酶制劑，其中除了非特異性的內蛋白水解和羧基肽水解活性之外還含有數(shù)種氨基肽水解酶活性。CorolaseLAP展示出相對純的、克隆并且過量表達的來自Aspergillus的亮氨酸氨基肽酶活性。使用發(fā)色底物F-pNA(對照)、Q-pNA和V-pNA對這三種商業(yè)制劑中存在的氨基肽水解活性加以檢驗。為達到此目的，將DMSO中150mMX-pNA的貯液在Bis-Tris緩沖液(pH6)中稀釋100x。向微滴定板中每個孔裝入200μl經(jīng)過緩沖的底物溶液，在40℃于TecanGeniosMTP讀數(shù)器(受Magellan4軟件的控制)中預先溫育。通過加入50μl合適的酶溶液來起始反應(SumizymeFP粉末在使用之前以100mg/ml的濃度溶解于Bis-Tris緩沖液(pH6)中)。接著在405nm監(jiān)視10分鐘黃色pNA的釋放。軟件計算OD/分鐘。將每種酶制劑針對多種底物的活性相對它們針對F-pNA的活性進行標準化。獲得的數(shù)據(jù)顯示于圖4中。明顯地，所有三種酶制劑都展示出了針對F-pNA的最高活性，但是Q-pNA和V-pNA也形成了這些酶的底物。這些結果表明，如果與脯氨酸特異性內切蛋白酶組合，商業(yè)制劑中的每一種都應當能形成想要的ACE抑制三肽IPP、VPP以及LPP，因為氨基肽酶的活性能將脯氨酸特異性蛋白酶形成的肽QNIPP和VVVPP分別轉化為IPP和VPP。在實施例13所述的實驗中檢驗了該假設。實施例13用來自A.niger的脯氨酸特異性內切蛋白酶與不同氨基肽水解酶制劑來溫育酪蛋白酸鹽，產生高產率的IPP、LPP和VPP在本實施例中，我們研究了將來自A.niger的脯氨酸特異性蛋白酶與氨基肽水解活性在同一溫育步驟中組合使用對于多種ACE抑制肽形成的作用。為達到此目的，制備酪蛋白酸鹽溶液，這是通過將50克酪蛋白酸鈉溶解于506克70攝氏度水中，產生含有81克蛋白/1的溶液來實現(xiàn)的。將該溶液冷卻至50攝氏度，之后使用磷酸將pH降低至6.0(在20℃測量的)，之后加入多種酶組合。向所有樣品(每份10ml)中加入脯氨酸特異性蛋白酶，達到每克蛋白4個單位的濃度(關于單位的定義，參見材料和方法一節(jié))。樣品A1僅含該脯氨酸特異性蛋白酶。樣品B1含有脯氨酸特異性蛋白酶加38微升的下述溶液，其中含有稀釋于5克水中的1140mg經(jīng)濃縮Flavourzyme液體。在樣品B2中，脯氨酸特異性蛋白酶與8微升的該Flavourzyme溶液組合。在樣品C1中，脯氨酸特異性蛋白酶與100微升的CorolaseLAP液體組合。在樣品C2中，脯氨酸特異性蛋白酶與10微升經(jīng)過10倍稀釋的CorolaseLAP液體樣品組合。在所有5份樣品中，溫育被允許在50攝氏度進行6小時。通過將混合物加熱至90攝氏度5分鐘來終止酶促反應。在Eppendorf離心管中離心10分鐘之后獲得的澄清的上清液被收集起來，冷凍放置，直到進行LC/MS/MS分析。LC/MS/MS分析之后獲得的數(shù)據(jù)展示于表5中。如前所述，對樣品A1的溫育條件(僅用脯氨酸特異性蛋白酶)高效地產生了LPP以及VVVPP，但是沒有顯著數(shù)量的VPP。肽VVVPPF的不存在表明脯氨酸特異性蛋白酶在所用的條件下能高效切割脯氨酸殘基的羧基末端。在樣品A1中，IPP的產率大致為VVVPP產率的三分之一。但是，將脯氨酸特異性蛋白酶與Flavourzyme(樣品B1或B2)或與CorolaseLAP(樣品C1)組合，對于IPP產率有著明顯的激發(fā)作用。在樣品C2(具有低濃度的CorolaseLAP)中，IPP的產率沒有增加，這大概是因為氨基肽酶的濃度不足以轉化脯氨酸特異性蛋白酶形成的所有QNIPP。因為1克酪蛋白理論上能產生6.9mg(21.1微摩爾)的IPP(叢beta酪蛋白加kappa酪蛋白產生)，樣品B1和C1中存在的IPP水平分別占到最大可獲得產率的70％和55％。與我們的期望一致，增加的氨基肽水解活性導致了VVVPP濃度的降低以及VPP濃度的增加。少量中間產物肽VVPP在樣品B2和C2中可被探測到這個事實表明，在這些樣品中，氨基肽水解活性不足以將脯氨酸特異性蛋白酶形成的VVVPP完全轉化為VPP。因為1克酪蛋白理論上能產生4.58mg(14.7微摩爾)的VPP，在樣品B1、B2和C1中，達到了最大的VPP產率?？偠灾緦嶒炃宄乇砻?，脯氨酸特異性蛋白酶與合適的氨基肽水解活性的組合可高效產生高濃度的ACE抑制肽。脯氨酸特異性蛋白酶與氨基肽酶的組合最好在用脯氨酸特異性酶進行的溫育之后進行。取決于特定的工藝要求，用額外的酶進行的溫育可在使用低pH條件或水可混溶溶劑進行純化之前或之后發(fā)生。此外，溫育可用能除去具有ACE抑制作用的氨基酸序列之前的不想要的氨基酸殘基的氨基肽酶活性來進行，或者其可以用合適的內蛋白水解活性來進行。此類內蛋白水解活性的合適例子由木瓜蛋白酶(其可作為Collupulin從DSMFoodSpecialities，Delft，TheNetherlands獲得)所代表，其能有效切割Asn(N)和Val(V)殘基的羧基末端。如果用額外的酶進行的溫育在酸化或乙醇沉淀步驟之前進行，那么該溫育最好用相對純的氨基肽酶，例如CoralaseLAP來進行(見實施例7)。表6以mg/(g加入的蛋白)計算的上清液中肽濃度權利要求1.一種方法，用于生產包含來自蛋白的IPP的組合物，其中，從所述蛋白產生的IPP與VPP的重量比為至少5∶1，優(yōu)選至少10∶1，更優(yōu)選至少20∶1(wt/wt)，所述方法包含使用具有脯氨酸特異性內切蛋白酶活性或脯氨酰寡肽酶活性的酶活性和能水解-I-P-P-序列氨基末端側的鍵的酶活性。2.如權利要求1所述的方法，其中，所述具有脯氨酸特異性內切蛋白酶活性或脯氨酰寡肽酶活性的酶活性和所述能水解-I-P-P-序列氨基末端側的鍵的酶活性存在于一種酶中，優(yōu)選地，該酶是脯氨酸特異性內切蛋白酶或脯氨酰寡肽酶，更優(yōu)選地，該酶是脯氨酸特異性內切蛋白酶。3.如權利要求1至3中任意一項所述的方法，其中，所述脯氨酸特異性內切蛋白酶不含氨基肽酶活性和/或羧基肽酶活性。4.如權利要求1或2所述的方法，其中，溫育時間小于24小時，優(yōu)選小于10小時，更優(yōu)選小于4小時。5.如前述任意一項權利要求所述的方法，其中，溫育溫度高于30℃，優(yōu)選高于40℃，更優(yōu)選高于50℃。6.如前述任意一項權利要求所述的方法，其中，還產生LPP。7.如前述任意一項權利要求所述的方法，其中，使用奶蛋白，優(yōu)選使用酪蛋白。8.如權利要求7所述的方法，其中，所述蛋白序列中存在的-A-I-P-P-和/或-P-I-P-P-序列至少30％轉化為肽IPP。9.如權利要求6所述的方法，其中，所述蛋白序列中存在的-P-L-P-P-和/或-A-L-P-P-序列至少40％轉化為肽LPP。10.一種方法，用于制備包含可溶肽，優(yōu)選地包含IPP的組合物，所述方法包括將通過用合適的蛋白來源水解產生的、優(yōu)選通過權利要求1至9中任意一項所述的方法產生的組合物的pH改變?yōu)槭顾獾鞍椎囊徊糠肿優(yōu)椴豢扇艿膒H，以及將所述不可溶的部分與可溶肽分離，得到包含可溶肽的組合物。11.一種方法，用于制備包含可溶肽的組合物，所述組合物是通過下述步驟生產的-首先，用脯氨酸特異性內切蛋白酶將蛋白水解至5至30％的DH，-可選地，進行第二種酶處理，以及-之后，將水解蛋白的不可溶部分與可溶部分在選定的pH條件下分離，優(yōu)選在酸性pH條件下，更優(yōu)選在3.5至6之間的pH下，最優(yōu)選在4至5之間的pH下，以產生包含可溶肽的組合物。12.一種組合物，所述組合物包含可溶肽，其中，所述肽的至少70wt％，優(yōu)選至少80wt％，最優(yōu)選至少90wt％在3.5至6之間的pH，優(yōu)選4至5之間的pH下是可溶的，并且，其中，所述可溶肽中沒有任何一種肽以大于所述可溶肽40wt％的量存在，優(yōu)選地，所述可溶肽中沒有任何一種肽以大于所述可溶肽30wt％的量存在，最優(yōu)選地，所述可溶肽中沒有任何一種肽以大于所述可溶肽20wt％的量存在，并且所述組合物可通過權利要求11所述的方法獲得。13.脯氨酸特異性內切蛋白酶用于從蛋白生產IPP的用途，其中，產生的IPP(重量)是產生的VPP的至少五倍。14.一種組合物，所述組合物是通過蛋白水解產生的，所述組合物包含IPP，其中，所述組合物中IPP對VPP的重量比為至少5∶1，優(yōu)選至少10∶1，更優(yōu)選至少20∶1。15.如權利要求14所述的組合物，其還包含LPP。16.如權利要求14或15所述的組合物，其作為營養(yǎng)藥物存在，優(yōu)選作為藥劑存在。17.如權利要求12至16中任意一項所述的組合物，其是由權利要求1至10中任意一項所述的方法產生的。18.如權利要求12和14-17中任意一項所述的組合物或根據(jù)權利要求1至11中任意一項所述的方法產生的組合物作為營養(yǎng)藥物，優(yōu)選地作為藥劑的用途，所述用途是用于生產促進健康或者預防和/或治療疾病用的營養(yǎng)藥物，優(yōu)選地，藥劑，或者用于生產用于治療或預防疾病，例如高血壓、心力衰竭、前糖尿病或糖尿病、肥胖、葡萄糖耐量受損或壓力的營養(yǎng)藥物，優(yōu)選地，藥劑。19.如權利要求18所述的用途，其中所述組合物以膳食補充劑的形式存在，以個人護理應用的形式存在，所述應用包括以水劑、凝膠或乳劑的形式存在的局部應用，或者作為食物、飼料或寵物食品成分存在。20.如權利要求12和14至17中任意一項所述的組合物的用途，用于生產功能性食物產品，所述食物產品用于預防肥胖或用于體重控制。21.如權利要求12和14至17中任意一項所述的組合物的用途，用于生產功能性食物產品，所述食物產品用于心血管健康保持。22.如權利要求21所述的用途，其中所述心血管健康保持包含抑制血管緊張素轉化酶。23.如權利要求21所述的用途，其中所述心血管健康保持包含控制血膽固醇水平。24.功能性食物產品，其能對其消費者提供健康方面的好處，所述健康方面的好處選自預防肥胖、體重控制和心血管健康保持，所述食物產品包含如權利要求12和14至17中任意一項所述的組合物。25.如權利要求24所述的功能性食物產品，其中，所述心血管健康保持方面的好處包含抑制血管緊張素轉化酶和/或控制血膽固醇水平。26.如權利要求24或25任意一項所述的功能性食物產品，其包含50-200mmol/kg的K+和/或15-60mmol/kg的Ca2+和/或6-25mmol/kg的Mg2+。27.如權利要求26所述的功能性食物產品，其包含110-135mmol/kg的K+和/或35-45mmol/kg的Ca2+和/或13-20mmol/kg的Mg2+。28.如權利要求24至27任意一項所述的功能性食物產品，其包含一種或多種B族微生物。29.如權利要求28所述的功能性食物產品，其包含葉酸、維生素B6和維生素B12。30.如權利要求24至29任意一項所述的功能性食物產品，其包含3至25wt％的固醇，更優(yōu)選地，7至15wt％的固醇。31.一種方法，用于生產食物產品、飲料產品或膳食補充劑，所述方法包括(a)根據(jù)權利要求1至9中任意一項所述的方法來生產包含IPP的組合物；(b)將所述含有IPP的組合物加入到食物產品、飲料產品或膳食補充劑中。32.如權利要求31所述的方法，其中，在步驟a中，使用奶蛋白，優(yōu)選使用酪蛋白。33.如權利要求32所述的方法，其中在步驟a中，所述蛋白序列中存在的-A-I-P-P-或-P-I-P-P-序列至少10％，更優(yōu)選至少30％被轉化為肽IPP。34.如權利要求32所述的方法，其中在步驟a中，所述蛋白序列中存在的-P-L-P-P-或-A-L-P-P-序列至少10％，更優(yōu)選至少40％被轉化為肽LPP。35.如權利要求31所述的方法，還包括步驟c)，以純化來自水解蛋白的肽，所述蛋白優(yōu)選地被非天冬氨酸蛋白酶水解，更優(yōu)選被絲氨酸蛋白酶水解，所述水解蛋白能在選定的pH條件下沉淀，所述步驟包括將pH改變?yōu)槟苁顾鏊獾鞍壮恋淼膒H，以及將沉淀的蛋白與所述水解蛋白分離。36.如權利要求35所述的方法，其中步驟c在步驟a)之后并在步驟b)之前發(fā)生。37.如權利要求31所述的方法，其中，所述食物產品、飲料產品或膳食補充劑選自由植物黃油、涂抹醬、黃油、奶制品或含乳清飲料構成的組，優(yōu)選地，基于酸奶或奶的產品，例如酸奶或奶。38.可通過權利要求31至37中一項或多項所述的方法獲得的食物產品、飲料產品或膳食補充劑。39.如權利要求38所述的食物產品、飲料產品或膳食補充劑，其包含0.05至10wt％，更優(yōu)選0.1至5wt％，最優(yōu)選0.2至4wt％的所述含有IPP的組合物。40.如權利要求38或39所述的食物產品、飲料產品或膳食補充劑，其包含相對每100克產品而言0.05至50mg的IPP，更優(yōu)選0.1至40mg，最優(yōu)選0.2至30mg。41.如權利要求38至40中一項或多項所述的食物產品、飲料產品或膳食補充劑，其中，IPP對VPP的重量比為5∶1至100∶1，更優(yōu)選5∶1至48∶1。42.如權利要求38至41中一項或多項所述的食物產品、飲料產品或膳食補充劑，其包括IPP和LPP，其中，IPP對LPP的重量比為1∶10至1∶1，更優(yōu)選為1.5∶7.1至4.8∶7.1。43.如權利要求38至42中一項或多項所述的食物產品、飲料產品或膳食補充劑，用于緩解人類的高血壓。全文摘要本發(fā)明描述了一種方法，用于從蛋白來源生產IPP，其中，從蛋白生產的IPP和VPP的比例至少為5，優(yōu)選至少為10，更優(yōu)選至少20，所述方法包括使用脯氨酸特異性內切蛋白酶。文檔編號A61K38/06GK1997750SQ200580023491公開日2007年7月11日申請日期2005年7月12日優(yōu)先權日2004年7月12日發(fā)明者路泊·埃登斯,安德烈·利納爾杜斯·魯斯·德,羅伯特斯·安東尼厄斯·馬金德爾特·霍文·范德,飛利浦斯·安東尼厄斯·帝恩申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司