專利名稱：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了改良的疫苗組合物，其生產(chǎn)方法及其在醫(yī)學(xué)上的用途。具體而言，本發(fā)明提供了佐劑化的(adjuvanted)疫苗組合物，其含有志賀菌毒素的B亞單位或其免疫學(xué)上的功能等價物和用佐劑配制的抗原。
美國專利6613882公開了具有下式的嵌合多肽B--X，其中B代表志賀菌毒素的B片段或其功能等價物，而X代表具有治療價值的一種或多種多肽，其中所述多肽與由B介導(dǎo)的逆向轉(zhuǎn)運相容，以確保X的加工或正確尋址。
WO02/060937為公開了直接或間接靶向Gb3受體且具有式STxB-Z(n)-Cys的通用多肽載體的申請，其中StxB為志賀菌毒素的B亞單位，Z為無巰基的氨基酸接頭，n為0、1、2或多肽，且Cys為半胱氨酸。
要求主要誘導(dǎo)細胞反應(yīng)的疫苗的開發(fā)仍然是一個挑戰(zhàn)。因為CD8+T細胞(細胞免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞)識別在病原體感染細胞中合成的抗原，所以成功的接種要求在疫苗接種者的細胞中合成免疫原性抗原。這可通過減毒活疫苗實現(xiàn)，然而該疫苗也存在明顯的局限。首先，當疫苗接種者受到免疫抑制時或當病原體(如人免疫缺陷病毒)本身能誘導(dǎo)免疫抑制時，有感染的風(fēng)險。其次，一些病原體難以或不可能在細胞培養(yǎng)物中生長(如丙型肝炎病毒)。其他現(xiàn)有的疫苗如滅活的全細胞疫苗或明磯佐劑化的重組蛋白亞單位疫苗是極差的CD8反應(yīng)誘導(dǎo)物。
出于這些原因，正在開發(fā)備選的方案活載體化(vectored)疫苗、質(zhì)粒DNA疫苗、合成多肽或特異性佐劑?；钶d體化疫苗的優(yōu)點在于能誘導(dǎo)強細胞反應(yīng)，但針對載體的已有免疫(例如腺病毒)或疫苗誘導(dǎo)的免疫會危及額外疫苗劑次的有效性(Casimiro等人，JOURNAL OF VIROLOGY，June 2003，p.6305-6313)。質(zhì)粒DNA疫苗也能誘導(dǎo)細胞反應(yīng)(Casimiro等人，JOURNAL OF VIROLOGY，June 2003，p.6305-6313)，但所述反應(yīng)在人中很弱(Mc Conkey等人，Nature Medicine 9，729-735，2003)，而且抗體反應(yīng)非常弱。另外，合成多肽目前在臨床試驗中進行評價(Khong等人，J Immunother 2004；27472-477)，但疫苗逃逸突變體的出現(xiàn)或必需首先選擇HLA-匹配的病人會妨礙這種編碼有限數(shù)目的T細胞表位的疫苗的功效。
也已描述了基于使用非活載體如細菌毒素遞送抗原的備選方案。志賀菌毒素B載體化(vectorisation)系統(tǒng)(STxB)以志賀菌毒素的無毒性B亞單位為基礎(chǔ)。該分子具有許多似乎是傾向于作為抗原呈遞載體的特征無毒性、低免疫原性、通過CD77受體尋靶和能誘導(dǎo)所載抗原進入1類MHC限制的抗原呈遞途徑(Haicheur等人，(2003)Int.Immunol 15 pp 1161-1171)。具體而言，在小鼠模型中已顯示抗原與志賀菌毒素的B亞單位的物理連接可誘導(dǎo)可檢測的CD8反應(yīng)(Haicheur等人，2000 Journal of Immunology 165 pp 3301-3308；Haicheur等人，2003 Int.Immunol 15 pp 1161-1171)。但是，該反應(yīng)要求分三次注射大量抗原(最高達80μg，Haicheur等人，2003 Int.Immunol 15 pp 1161-1171)，而且當腹膜內(nèi)施用時不能通過與弗氏不完全佐劑混合得到促進(Haicheur等人，2000 Journal of Immunology165 pp 3301-3308)。
疫苗抗原和遞送系統(tǒng)的這些局限性證明尋找新的疫苗組合物是對的。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在含有志賀菌毒素的B亞單位或其免疫學(xué)上的功能等價物的組合物中包含佐劑能在所造成的免疫反應(yīng)(具體來說是CD8特異反應(yīng))中具有有益的作用。
所以本發(fā)明提供了含有志賀菌毒素的B亞單位或其免疫學(xué)上的功能等價物的疫苗組合物，其能與Gb3受體結(jié)合；能與抗原復(fù)合；并且還含有佐劑，前提是當佐劑只是一種金屬鹽時，其就可照這種方法配制不超過約60％的抗原被吸附到金屬鹽上。
特定的佐劑是選自金屬鹽、水包油乳劑、Toll樣受體激動劑(具體而言為Toll樣受體2激動劑、Toll樣受體3激動劑、Toll樣受體4激動劑、Toll樣受體7激動劑、Toll樣受體8激動劑和Toll樣受體9激動劑)、皂苷或其組合的那些佐劑，附帶條件是，金屬鹽僅與另一種佐劑一起使用而不單獨使用，除非其照這種方法配制不超過約60％的抗原被吸附到金屬鹽上。優(yōu)選地，不超過約50％，如40％的抗原被吸附到金屬鹽上，且在一個實施方案中，不超過約30％的抗原被吸附到金屬鹽上。吸附到金屬鹽上的抗體水平可由本領(lǐng)域熟知的技術(shù)確定，如在實施例1.5中所列的方法?？赏ㄟ^，如在磷酸根離子(如磷酸緩沖鹽水)存在的情況下配制組合物，或通過增大抗原對金屬鹽的比率來增加游離抗原的水平。在一個實施方案中，佐劑不包括金屬鹽作為單一佐劑。在一個實施方案中，佐劑不包括金屬鹽。與現(xiàn)有技術(shù)所示的情況相反，本發(fā)明人展示了當這種組合物不經(jīng)肌內(nèi)施用時，不完全弗氏佐劑增加志賀菌毒素(或其免疫學(xué)上的功能等價物)和抗原的作用的能力。另外，在一次注射后和當用低劑量抗原時，很容易觀察到CD8反應(yīng)的促進。
志賀菌毒素的B亞單位和其免疫學(xué)上的功能等價物在本文中稱為本發(fā)明的蛋白。志賀菌毒素的B亞單位的免疫學(xué)上的功能等價物定義為能結(jié)合Gb3受體的蛋白，諸如，但不限于毒素、毒素亞基或其功能片段。這種結(jié)合能力可按照在實施例1.2中列出的測定規(guī)程確定。認為Gb3結(jié)合可誘導(dǎo)目的抗原的正確運輸并由此促進抗原的1類MHC呈遞。在一個實施方案中，這種蛋白在氨基酸水平上與志賀菌毒素的B亞單位的成熟形式有至少50％的氨基酸序列同一性，優(yōu)選60％、70％、80％、90％或95％的同一性。
這種免疫學(xué)上的功能等價物包括從各種志賀氏菌屬(Shigella)物種中分離的毒素的B亞單位，尤其是痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)。另外，志賀菌毒素的B亞單位的免疫學(xué)上的功能等價物包括能結(jié)合其他細菌的Gb3受體的同源毒素，這些毒素優(yōu)選與志賀菌毒素的B亞單位具有至少50％的氨基酸序列同一性。例如，大腸桿菌(E coli)的Vero細胞毒素-1(VT1)的B亞單位與志賀菌毒素的B亞單位是相同的。已知大腸桿菌的VT1和VT2以及其他細菌產(chǎn)生的其他志賀菌樣毒素能結(jié)合Gb3受體并且可用于本發(fā)明的背景中。在本發(fā)明的背景中，詞語毒素用來表示已經(jīng)脫毒的毒素，從而它們就不再對人有毒性了，或者表示其毒素亞單位或片段，后者在人體中基本上沒有毒性。
本發(fā)明的疫苗組合物能促進CD8特異性免疫反應(yīng)。當與對無佐劑的含有與本發(fā)明的蛋白復(fù)合的抗原的組合物的反應(yīng)或有佐劑的含有抗原的制劑的反應(yīng)比較時，通過觀察對本發(fā)明的組合物的反應(yīng)可測量促進，其中本發(fā)明的組合物包含與本發(fā)明的蛋白復(fù)合的抗原和佐劑。促進可定義為免疫反應(yīng)水平的提高；用更低劑量的抗原產(chǎn)生等同的免疫反應(yīng)；免疫反應(yīng)質(zhì)量的提高；免疫反應(yīng)持久性的提高；或上述情況的任意組合。這種促進在第一次免疫后可以觀察得到，和/或可在接著的免疫后觀察到。
在本發(fā)明的一個實施方案中，可利用低劑量的抗原(一只小鼠低至8ng抗原)增強這種免疫反應(yīng)。在該實施方案中，與佐劑化的、沒有復(fù)合本發(fā)明蛋白的抗原，或復(fù)合了本發(fā)明蛋白但無佐劑的抗原相比，上述這些抗原不能產(chǎn)生持久的反應(yīng)，佐劑化的、與本發(fā)明蛋白復(fù)合的抗原能誘導(dǎo)持久的初級CD8反應(yīng)(正如通過四聚體染色、細胞內(nèi)的細胞因子染色和體內(nèi)細胞毒素的活性測得的)。
CD8免疫反應(yīng)隨時間推移變?nèi)醴逯岛?，有一個收縮階段，在該階段大多數(shù)效應(yīng)細胞死亡，而記憶細胞還活著。該反應(yīng)性記憶T細胞群體的確立通過對抗原特異性細胞及其被加強的能力的長期檢測來鑒別。
佐劑優(yōu)選選自皂苷，脂質(zhì)A或其衍生物，免疫刺激寡核苷酸，烷基氨基葡糖苷磷酸(alkyl glucosaminide phosphate)，或它們的組合。進一步優(yōu)選的佐劑是結(jié)合另一種佐劑的金屬鹽。優(yōu)選的是，佐劑是Toll樣受體激動劑，具體而言是Toll樣受體2、3、4、7、8或9的激動劑，或皂苷，尤其是Qs21。還優(yōu)選的是，佐劑系統(tǒng)包括前面所列的兩個或更多個佐劑。具體而言，組合優(yōu)選地包含皂苷(尤其是Qs21)佐劑和/或Toll樣受體9激動劑如含有CpG的免疫刺激寡核苷酸。其他優(yōu)選的組合包含皂苷(尤其是QS21)和Toll樣受體4激動劑如一磷酸脂質(zhì)A或其3脫酰衍生物，3D-MPL，或皂苷(尤其是QS21)和Toll樣受體4配體如烷基氨基葡糖苷磷酸。
特別優(yōu)選的佐劑是3D-MPL和QS21的組合(EP 0 671 948 B1)，含有3D-MPL和QS21的水包油乳劑(WO 95/17210，WO 98/56414)，或用其他載體配制的3D-MPL(EP 0 689 454 B1)。其他優(yōu)選的佐劑系統(tǒng)包括3D-MPL、QS21和CpG寡核苷酸的組合，如US6558670、US6544518中所述。
在一個實施方案中，佐劑是Toll樣受體(TLR)4配體，優(yōu)選激動劑如脂質(zhì)A衍生物，特別是一磷酸脂質(zhì)A或更特別為3脫酰一磷酸脂質(zhì)A(3D-MPL)。
3D-MPL由Corixa公司以MPL商標進行銷售，且主要促進了IFN-g(Th1)表型的CD4+T細胞反應(yīng)。可依據(jù)GB 2 220 211 A中公開的方法生產(chǎn)3D-MPL。在化學(xué)上，3D-MPL是具有3、4、5或6個?；湹?-脫酰一磷酸脂質(zhì)A的混合物。在本發(fā)明的組合物中優(yōu)選使用小顆粒的3D-MPL。小顆粒3D-MPL具有這樣的顆粒大小，從而使其可通過0.22μm的過濾器進行無菌過濾。在國際專利申請No.WO94/21292中描述了這種制備。已知并且認為脂質(zhì)A的合成衍生物是TLR4激動劑，包括但不限于OM174(2-脫氧-6-o-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二酰氧十四?；被鵠-4-o-膦?；?β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氫磷酸脂)，(WO 95/14026)OM 294 DP(3S，9R)-3-[(R)-十二酰氧十四?；被鵠-4-氧-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基十四?；被鵠癸-1，10-二醇，1，10-雙(二氫磷酸脂)，(WO 99/64301和WO 00/0462)OM 197 MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二酰氧十四?；被鵠-4-氧-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠癸-1，10-二醇，1-二氫磷酸脂10-(6-氨基己酸)(WO 01/46127)其他可用的TLR4配體是烷基氨基葡糖苷磷酸(AGP)，如在WO 9850399或US6303347中公開的那些(也公開了AGP的制備方法)，或如US6764840中所公開的AGP的藥學(xué)上可接受的鹽。有些AGP是TLR4激動劑，而有些是TLR4拮抗劑。兩者都被認為可用作佐劑。
另一個用于本發(fā)明的優(yōu)選免疫刺激劑是Quil A和其衍生物。QuilA是從南美皂皮樹(Quilaja Saponaria Molina)中分離出來的皂苷制劑，并且被Dalsgaard等人在1974年首次描述為具有佐劑活性(“Saponin adjuvants”，Archiv.Für die gesamte Virusforschung，Vol.44，Springer Verlag，Berlin，p243-254)。通過HPLC已經(jīng)分離了Quil A的純化片段，其保留了佐劑活性而沒有與Quil A相關(guān)的毒性(EP 0362 278)，例如QS7和QS21(也稱為QA7和QA21)。QS-21是來源于皂皮樹樹皮的天然皂苷，其誘導(dǎo)CD8+細胞毒性T細胞(CTL)、Th1細胞和主要的IgG2a抗體反應(yīng)，并且是本發(fā)明背景的優(yōu)選皂苷。
已經(jīng)描述了特別優(yōu)選的QS21的具體制劑，這些制劑還包括固醇(WO 96/33739)。本發(fā)明的皂苷形成部分可以是獨立的微團形式、混合的微團(優(yōu)選地但不僅僅是膽鹽)的形式，或者當用膽固醇和脂質(zhì)制備時可以是ISCOM基質(zhì)(EP 0 109 942 B1)、脂質(zhì)體或相關(guān)膠體結(jié)構(gòu)的形式，如蠕蟲狀或環(huán)狀多聚體復(fù)合物或者脂質(zhì)的/分層的結(jié)構(gòu)和薄片，或者是水包油乳劑(例如WO 95/17210中所述)的形式。皂苷優(yōu)選與金屬鹽結(jié)合，諸如氫氧化鋁或磷酸鋁(WO 98/15287)。優(yōu)選地，皂苷以脂質(zhì)體、ISCOM或水包油乳劑的形式存在。
還可以使用免疫刺激寡核苷酸或任何其他的Toll樣受體(TLR)9激動劑。用于本發(fā)明佐劑或疫苗的優(yōu)選寡核苷酸為包含CpG的寡核苷酸，優(yōu)選包含兩個或更多個二核苷酸CpG基元，該基元是由至少三個，更優(yōu)選至少六個或更多個核苷酸分離的。一個CpG基元是胞嘧啶核苷酸后接鳥嘌呤核苷酸。本發(fā)明的CpG寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸內(nèi)核苷酸間是二硫代磷酸酯，或更優(yōu)選為硫代磷酸酯鍵，然而磷酸二酯和其他核苷酸間鍵也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是具有混合核苷酸間鍵的寡核苷酸。生產(chǎn)硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在US5,666,153、US5,278,302和WO 95/26204中描述。
優(yōu)選寡核苷酸的實例具有以下序列。序列優(yōu)選包含硫代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵。
OLIGO 1(SEQ ID NO1)TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)OLIGO 2(SEQ ID NO2)TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)OLIGO 3(SEQ ID NO3)ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACGOLIGO 4(SEQ ID NO4)TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)OLIGO 5(SEQ ID NO5)TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)OLIGO 6(SEQ ID NO6)TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)備選的CpG寡核苷酸可包含上述優(yōu)選序列，因為它們具有序列內(nèi)的不重要的缺失或添加。
本發(fā)明所用的CpG寡核苷酸可通過本領(lǐng)域已知的任一方法合成(如參見EP 468520)。為了方便起見，這種寡核苷酸可利用自動合成儀合成。
TLR2激動劑的實例包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑并喹啉，如咪喹莫特和Resiquimod是已知的TLR7激動劑。單鏈RNA也是已知的TLR激動劑(人類為TLR8和小鼠為TLR7)，而雙鏈RNA和聚IC(聚肌胞苷酸----一種商品化的病毒RNA合成模擬物)是TLR3激動劑的實例。3D-MPL是TLR4激動劑的實例，而CpG是TLR9激動劑的實例。
在一個實施方案中，志賀菌毒素的B亞單位或其免疫學(xué)上的功能等價物和抗原復(fù)合在一起。復(fù)合是指志賀菌毒素的B亞單位或其免疫學(xué)上的功能等價物和抗原是物理結(jié)合的，例如經(jīng)靜電作用或疏水相互作用或共價鍵。在一個優(yōu)選的實施方案中，志賀菌毒素的B亞單位和抗原或者作為融合蛋白共價連接(Haicheur等人，2000 Journal ofImmunology 165 pp 3301-3308)或者以WO 02/060937中所述的方式經(jīng)半胱氨酸殘基連接(同前)。在本發(fā)明的實施方案中，每一個毒素B分子連接了超過一個抗原，如每個毒素B上2、3、4、5、6個抗原分子。當存在超過一個抗原時，這些抗原可以全部相同，可以一個或多個與其他的不同，或者全部抗原可以彼此不同。
抗原本身可以是包含一個或多個目的表位的肽或蛋白。選擇抗原，從而當按本發(fā)明預(yù)期方式配制時，所述抗原可提供針對細胞內(nèi)病原體如HIV、結(jié)核、衣原體、HBV、HCV和流感的免疫，這是優(yōu)選的實施方案。本發(fā)明也發(fā)現(xiàn)了抗原的效用，其能夠增強針對良性病癥和增殖性病癥如癌的相關(guān)免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的疫苗制劑優(yōu)選地包含能引發(fā)針對人類病原體的免疫反應(yīng)的抗原或抗原性組合物，該抗原或抗原性組合物來源于HIV-1，(如gag或其片段，諸如p24、tat、nef，被膜如gp120或gp160，或這些的任一個的片段)，人類皰疹病毒，如gD或其衍生物或立即早期蛋白(Immediate Early protein)如來自HSV1或HSV2的ICP27，巨細胞病毒((尤其是人類)(如gB或其衍生物)、輪狀病毒抗原、非洲淋巴瘤病毒(如gp350或其衍生物)、水痘-帶狀皰疹病毒(如gpI、II和IE63)，或來自肝炎病毒如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)，或來自甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒的抗原，或來自其他病毒病原體，如副粘病毒呼吸道合胞病毒(如F G和N蛋白或其衍生物)，副流感病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，人乳頭瘤病毒(例如HPV6、11、16、18)，黃病毒(如黃熱病毒，登革病毒，蜱傳腦炎病毒，日本腦炎病毒)或流感病毒純化蛋白或其重組蛋白，如HA、NP、NA或M蛋白，或其組合)，或來源于細菌病原體，如奈瑟氏球菌屬物種(Neisseria spp)，包括淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhea)和腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)(例如，運鐵蛋白結(jié)合蛋白、乳鐵蛋白結(jié)合蛋白、PilC、粘附素)；化膿鏈球菌(S.pyogenes)(如M蛋白或其片段，C5A蛋白酶)，無乳鏈球菌(S.agalactiae)，變異鏈球菌(S.mutans)；杜氏嗜血菌(H.ducreyi)；莫拉氏菌屬物種(Moraxella spp)，包括粘膜炎莫拉氏菌(M catarrhalis)，也稱為粘膜炎布蘭漢氏球菌(Branhamella catarrhalis)(例如高分子量和低分子量的粘附素和侵襲素)；博德特氏菌屬物種(Bordetella spp)，包括百日咳博德特氏菌(B.pertussis)(例如pertactin、百日咳毒素或其衍生物、絲狀血凝素(filamenteous hemagglutinin)、腺苷酸環(huán)化酶，菌毛)，副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)和支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)；分枝桿菌屬物種(Mycobacterium spp.)，包括結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)(例如ESAT6、抗原85A、-B或-C)，牛分枝桿菌(M.bovis)，麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)，鳥分枝桿菌(M.avium)，副結(jié)核分枝桿菌(M.paratuberculosis)，恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)；軍團菌屬物種(Legionella spp)，包括侵肺軍團菌(L.pneumophila)；埃希氏菌屬物種(Escherichia spp)，包括腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(enterotoxic E.coli)(例如定居因子、熱不穩(wěn)定毒素或其衍生物、熱穩(wěn)定毒素或其衍生物)，腸出血性大腸桿菌，腸致病性大腸桿菌；弧菌屬物種(Vibrio spp)，包括霍亂弧菌(V.cholera)(例如霍亂毒素或其衍生物)；志賀氏菌屬物種(Shigella spp)，包括索氏志賀氏菌(S.sonnei)，痢疾志賀氏菌，弗氏志賀氏菌(S.flexnerii)；耶爾森氏菌屬物種(Yersinia spp)，包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)(例如Yop蛋白)，鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)，假結(jié)核耶爾森氏菌(Y.pseudotuberculosis)；彎曲桿菌屬物種(Campylobacter spp)，包括空腸彎曲桿菌(C.jejuni)(例如毒素、粘附素和侵襲素)和大腸彎曲桿菌(C.coli)；沙門氏菌屬物種(Salmonella spp)，包括傷寒沙門氏菌(S.typhi)，副傷寒沙門氏菌(S.paratyphi)，豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)，腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)；利斯特氏菌屬物種(Listeria spp)，包括單核細胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；螺桿菌屬物種(Helicobacter spp)，包括幽門螺桿菌(H.pylori)(例如脲酶、過氧化氫酶、空泡毒素)；假單胞菌屬物種(Pseudomonas spp)，包括銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)；葡萄球菌屬物種(Staphylococcus spp)，包括金黃色葡萄球菌(S.aureus)，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)；腸球菌屬物種(Enterococcus spp)，包括糞腸球菌(E.faecalis)，屎腸球菌(E.faecium)；梭菌屬物種(Clostridium spp)，包括破傷風(fēng)梭菌(C.tetani)(例如破傷風(fēng)毒素和其衍生物)，肉毒梭菌(C.botulinum)(例如肉毒桿菌毒素和其衍生物)，艱難梭菌(C.diffcile)(例如梭菌毒素A或B和其衍生物)；芽孢桿菌屬物種(Bacillus spp)，包括炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)(例如肉毒桿菌毒素和其衍生物)；棒桿菌屬物種(Corynebacterium spp)，包括白喉棒桿菌(C.diphtheriae)(例如白喉毒素和其衍生物)；疏螺旋體屬物種(Borrelia spp.)，包括布氏疏螺旋體(B.burgdorferi)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)，嘎氏疏螺旋體(B.garinii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)，阿氏疏螺旋體(B.afzelii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)，B.andersonii(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)，赫氏蜱疏螺旋體(B.hermsii)；埃里希氏體屬物種(Ehrlichia spp)，包括馬埃里希氏體(E.equi)和人粒細胞埃里希氏體病(Ehrlichiosis)試劑；立克次氏體屬物種(Rickettsiaspp)，包括立氏立克次氏體(R.rickettsii)；衣原體屬物種(Chlamydiaspp.)，包括砂眼衣原體(C.trachomatis)(例如MOMP，肝素結(jié)合蛋白)，肺炎衣原體(C.pneumoniae)(例如MOMP，肝素結(jié)合蛋白)，鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)；鉤端螺旋體屬物種(Leptospira spp.)，包括問號鉤端螺旋體(L.interrogans)；密螺旋體屬物種(Treponema spp.)，包括蒼白密螺旋體(T.pallidum)(例如稀有外膜蛋白)，齒垢密螺旋體(T.denticola)，豬痢疾密螺旋體(T.hyodysenteriae)；或來源于寄生物，如瘧蟲屬物種(Plasmodium spp.)，包括惡性瘧蟲(P.falciparum)；弓形蟲屬物種(Toxoplasma spp.)，包括鼠弓形蟲(T.gondii)(例如SAG2、SAG3、Tg34)；內(nèi)變形蟲屬物種(Entamoeba spp.)，包括痢疾內(nèi)變形蟲(E.histolytica)；巴貝蟲屬物種(Babesia spp.)，包括果氏巴貝蟲(B.microti)；錐蟲屬物種(Trypanosoma spp.)，包括克魯氏錐蟲(T.cruzi)；賈第蟲屬物種(Giardia spp.)，表吮賈第蟲(G.lamblia)；利什曼蟲屬物種(Leishmania spp.)，包括碩大利什曼蟲(L.major)；肺囊蟲屬物種(Pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊蟲(P.carinii)；毛滴蟲屬物種(Trichomonas spp.)，包括陰道毛滴蟲(T.vaginalis)；血吸蟲屬物種(Schisostoma spp.)，包括曼氏血吸蟲(S.mansoni)，或來源于酵母，如假絲酵母屬物種(Candida spp.)，包括白色假絲酵母(C.albicans)；隱球酵母屬物種(Cryptococcus spp.)，包括新型隱球酵母(C.neoformans)。
其他針對結(jié)核分枝桿菌的優(yōu)選特異性抗原是例如Tb Ra12、TbH9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCC1(WO 99/51748)。針對結(jié)核分枝桿菌的蛋白也包括融合蛋白和其變體，其中結(jié)核分枝桿菌的至少兩個，優(yōu)選三個多肽融合到一個更大的蛋白上。優(yōu)選的融合體包括Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO 99/51748)。
大多數(shù)針對衣原體的優(yōu)選抗原包括例如高分子量蛋白(HMW)(WO 99/17741)、ORF3(EP 366 412)和推定的膜蛋白(Pmp)。疫苗制劑的其他衣原體抗原可選自WO 99/28475所述的組。
優(yōu)選的細菌疫苗包含源自鏈球菌屬物種(Streptococcus spp.)的抗原，包括肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)(例如PsaA、PspA、鏈球菌溶血素、膽堿結(jié)合蛋白)和蛋白抗原肺炎球菌溶血素(Biochem BiophysActa，1989，67，1007；Rubins等人，Microbial Pathogenesis，25，337-342)，和其突變體解毒衍生物(WO 90/06951；WO 99/03884)。其他優(yōu)選的細菌疫苗包含源自嗜血菌屬物種(Haemophilus spp)的抗原，包括B型流感嗜血菌(H.influenzae)，不可定型的流感嗜血菌，例如OMP26、高分子量粘附素、P5、P6、蛋白D和脂蛋白D，和絲束蛋白和絲束蛋白衍生的肽(US 5,843,464)或多重拷貝變體或其融合蛋白。
乙型肝炎表面抗原的衍生物是本領(lǐng)域熟知的，且尤其包括，那些在歐洲專利申請EP-A-414 374、EP-A-0304 578和EP 198-474中所列出的PreS1、PreS2 S抗原。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的疫苗制劑包含HIV-1抗原，gp120，尤其是在CHO細胞中表達時。在另一個實施方案中，本發(fā)明的疫苗制劑包含如本文前面所述的gD2t。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，含有請求保護的佐劑的疫苗包括源于人乳頭瘤病毒(HPV)的抗原，認為HPV是造成生殖疣的原因(HPV6或HPV11等)，且HPV病毒也是造成子宮頸癌的原因(HPV16、HPV18等)。
生殖疣預(yù)防性或治療性疫苗的特別優(yōu)選形式包括L1蛋白，和含有一個或多個選自HPV蛋白E1、E2、E5、E6、E7、L1和L2的抗原的融合蛋白。
融合蛋白的最優(yōu)選形式是如WO 96/26277中公開的L2E7，和WO 99/10375中公開的蛋白D(1/3)-E7。
優(yōu)選的HPV子宮頸感染或癌的預(yù)防性或治療性疫苗、組合物可含有HPV16或18抗原。
特別優(yōu)選的HPV16抗原包括早期蛋白E6或E7，所述早期蛋白與蛋白D載體融合形成了HPV16的蛋白D-E6或E7融合體，或其組合；或E6或E7與L2的組合(WO 96/26277)。
備選地，HPV16或18早期蛋白E6和E7可以以單分子的形式存在，優(yōu)選為蛋白D-E6/E7融合體的形式。這種疫苗可任選地包含HPV18的E6和E7蛋白的一種或兩種，優(yōu)選為蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白的形式。
本發(fā)明的疫苗可另外包含其他HPV品系的抗原，優(yōu)選為品系HPV31或33。
本發(fā)明的疫苗還包含源于可導(dǎo)致瘧疾的寄生物的抗原，例如來自惡性瘧蟲的抗原，其包括環(huán)子孢子蛋白(CS蛋白)、RTS，S、MSP1、MSP3、LSA1、LSA3、AMA1和TRAP。RTS是基本上含有惡性瘧蟲的環(huán)子孢子(CS)蛋白全部C-末端部分的雜合蛋白，所述雜合蛋白經(jīng)乙型肝炎表面抗原的preS2部分的四個氨基酸連接到乙型肝炎病毒的表面(S)抗原上。其完整結(jié)構(gòu)在國際專利申請?zhí)朠CT/EP92/02591中公開，在要求了UK專利申請?zhí)?124390.7優(yōu)先權(quán)的編號WO93/10152下發(fā)表。當在酵母中表達時，RTS作為脂蛋白顆粒生產(chǎn)，而當與HBV的S抗原共表達時，得到稱為RTS，S的混合顆粒。TRAP抗原在國際專利申請?zhí)朠CT/GB89/00895中描述，在WO 90/01496下發(fā)表?？赡苁嵌嗉壇懠惨呙缃M分候選物的瘧蟲抗原是惡性瘧蟲MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、鉗合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230和它們在瘧蟲屬物種中的類似物。本發(fā)明的一個實施方案是瘧疾疫苗，其中抗原制劑包括RTS，S或CS蛋白或其片段，如RTS，S的CS部分，其與一個或多個其他瘧疾抗原組合，其之一或兩者可與按照本發(fā)明的志賀菌毒素B亞單位附著。該一個或多個其他瘧疾抗原可選自，例如MPS1、MSP3、AMA1、LSA1或LSA3。
制劑也可包含抗腫瘤抗原并且用于癌癥的免疫治療性的治療中。例如，佐劑制劑與腫瘤排斥抗原一起發(fā)揮效用，如針對前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌或黑素瘤癌的那些抗原。示例性的抗原包括MAGE1和MAGE3或其他MAGE抗原(用于治療黑素瘤)、PRAME、BAGE或GAGE(Robbins和Kawakami，1996，Current Opinions in Immunology 8，pps 628-636；Van den Eynde等人，International Journal of Clinical & Laboratory Research(1997年提交)；Correale等人(1997)，Journal of the National Cancer Institute 89，p293。實際上這些抗原在廣泛的腫瘤類型中表達，如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。其他腫瘤特異性的抗原適合與本發(fā)明的佐劑一起使用，且包括但不限于腫瘤特異性的神經(jīng)節(jié)苷脂、前列腺特異性抗原(PSA)或Her-2/neu、KSA(GA733)、PAP、乳腺珠蛋白(mammaglobin)、MUC-1、癌胚抗原(CEA)。因此，在本發(fā)明的一個方面中提供了含有根據(jù)本發(fā)明的佐劑組合物和腫瘤排斥抗原的疫苗。
本發(fā)明特別優(yōu)選的方面是疫苗含有腫瘤抗原，如前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌、卵巢癌或黑素瘤癌。因此，制劑可包含腫瘤相關(guān)抗原，以及與腫瘤支持機制(即血管生成、腫瘤侵襲)相關(guān)的抗原。另外，治療癌癥的疫苗的特定相關(guān)抗原也包括前列腺特異性膜抗原(PSMA)、前列腺干細胞抗原(PSCA)、酪氨酸酶、survivin、NY-ESO1、prostase、PS108(WO 98/50567)、RAGE、LAGE、HAGE。另外，所述抗原可以是自身肽激素，如全長促性腺激素釋放激素(GnRH，WO 95/20600)，其是短的10個氨基酸長的肽，用于治療許多癌癥，或用于免疫去勢。
本發(fā)明的疫苗可用于變態(tài)反應(yīng)的預(yù)防或治療。這種疫苗可包含變應(yīng)原特異性抗原，如Der p1。
每劑疫苗中抗原的量選擇為可誘導(dǎo)一般的疫苗接種者的免疫保護性反應(yīng)，而沒有明顯的、不良的副作用的量。該量會根據(jù)所施用的特定的免疫原以及提供方式而有所變化。其中組合物包含作為單一佐劑的金屬鹽時，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，游離的抗原水平(例如用實施例1.5中所列方法進行測量的)是免疫保護的決定量。
一般說來，預(yù)計用于人的每劑量包含0.1-1000μg的抗原，優(yōu)選為0.1-500μg，優(yōu)選為0.1-100μg，最優(yōu)選為0.1-50μg。具體疫苗的最佳量能通過標準研究確定，包括觀察疫苗接種的受試者的合適的免疫反應(yīng)。首次接種之后，受試者可得到一次或幾次足夠間隔的加強免疫。這樣一種疫苗制劑可以以引發(fā)或加強疫苗接種的方案應(yīng)用于哺乳動物的粘膜表面；或備選地做全身性施用，例如經(jīng)皮膚、皮下或肌內(nèi)途徑。優(yōu)選肌內(nèi)施用。
所用3D MPL的量一般很小，但取決于疫苗制劑，3D MPL的量可為每劑1-1000μg，優(yōu)選每劑1-500μg，且更優(yōu)選每劑1-100μg。
本發(fā)明的佐劑或疫苗中CpG或免疫刺激寡核苷酸的量一般很小，但取決于疫苗制劑，CpG或免疫刺激寡核苷酸的量可為每劑1-1000μg，優(yōu)選每劑1-500μg，且更優(yōu)選每劑1-100μg。
用于本發(fā)明佐劑的皂苷的量可為每劑1-1000μg，優(yōu)選每劑1-500μg，更優(yōu)選每劑1-250μg，且最優(yōu)選每劑1-100μg。
本發(fā)明的制劑可用于預(yù)防和治療的目的。因此，本發(fā)明提供了如本文所述的用于醫(yī)學(xué)的疫苗組合物。
在另一個實施方案中，提供了通過施用基本上如本文所述的組合物來治療疑似或患有某一疾病的個體的方法。
也提供了預(yù)防個體免于感染疾病的方法，所述疾病選自細菌和病毒性傳染病，寄生物病，尤其是細胞內(nèi)病原體的疾病，增殖性疾病如前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌、卵巢癌或黑素瘤癌；非癌癥慢性病，變態(tài)反應(yīng)，所述方法包括給所述個體施用基本上如本文所述的組合物。
此外，闡述了誘導(dǎo)哺乳動物的CD8+抗原特異性免疫反應(yīng)的方法，包括給所述哺乳動物施用本發(fā)明的組合物。還提供了生產(chǎn)疫苗的方法，其包括使與志賀菌毒素的B亞單位或其免疫學(xué)上的功能等價物組合的抗原與佐劑混合。
用于本發(fā)明組合的合適的藥學(xué)上可接受的賦形劑的實例除了別的以外包括水、磷酸緩沖鹽水、等滲緩沖溶液。
本說明書中引用的所有出版物，包括但不限于專利和專利申請均被引入本文作為參考，正如具體和單獨顯示每一單獨出版物被仿佛完全闡釋一樣引入本文作為參考。
參考以下實施例和附圖來舉例說明本發(fā)明。在所有附圖中，adeno-ova(包含OVA蛋白的腺病毒載體)被用作首次注射的陽性對照。P/B(引發(fā)/加強)是首次注射Adeno-ova及第二次加強注射AS A中的Ova蛋白(在圖6B中為AS H)的陽性對照。


圖1首次注射AS A STxB Ova和AS H STxB Ova疫苗后7天PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。
圖2首次注射AS A STxB Ova和AS H STxB Ova疫苗后14天PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。
圖3首次注射AS A STxB Ova和AS H STxB Ova疫苗后第15天通過siinfekl特異性的細胞因子產(chǎn)生性CD8T細胞在PBL中評價的效應(yīng)T細胞反應(yīng)的持久性。
圖4首次注射AS A STxB Ova和AS H STxB Ova疫苗后第15天通過抗原特異性的細胞因子產(chǎn)生性CD8 T細胞在PBL中評價的效應(yīng)T細胞反應(yīng)的持久性。
圖5首次注射AS A STxB Ova和AS H STxB Ova疫苗后15天通過體內(nèi)檢測到的細胞毒素活性評價的效應(yīng)T細胞反應(yīng)。
圖6(A)第二次注射AS A STxB Ova和AS H STxB Ova疫苗后47天PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。(B)第0天至第98天的PBL中Siinfekl特異性的CD8頻率的動力學(xué)。
圖7第二次注射AS A和AS H STxB Ova疫苗后47天通過PBL中的抗原特異性的細胞因子產(chǎn)生性CD4 T細胞評價的效應(yīng)T細胞反應(yīng)。
圖8第二次注射AS A和AS H STxB Ova疫苗后47天通過PBL中的抗原特異性的細胞因子產(chǎn)生性CD8T細胞評價的效應(yīng)T細胞反應(yīng)。
圖9第二次注射AS A STxB Ova和AS H STxB Ova疫苗后47天通過體內(nèi)檢測到的細胞毒素活性評價的效應(yīng)T細胞反應(yīng)。
圖10A第二次注射AS A STxB Ova和AS H STxB Ova疫苗后15天和40天的體液反應(yīng)。
圖10B第二次注射AS H STxB-OVA后78天在脾內(nèi)評價的抗-Ova記憶B細胞頻率。
圖11首次注射AS A、AS F、AS D、AS E、STxB-ova疫苗后13天PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。
圖12A首次注射AS A、AS B、AS C、AS G、AS I和AS HSTxB-ova疫苗后15天PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。
圖12B第二次注射AS A、AS B、AS C、AS G、AS I和AS HSTxB-ova疫苗后6天PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。
圖13用相同劑量AS H配制的STxB-ova疫苗的不同劑量的PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。
圖14通過首次注射后14天在PBL中測得的具有AS J(兩劑)或AS K的STxB-Ova體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的評價。(A)Siinfekl特異性的CD8頻率。(B)抗原特異性的細胞因子產(chǎn)生性CD8頻率。(C)體內(nèi)測得的Siinfekl特異性的裂解。
圖15首次注射AS L、AS G、AS M STxB-ova疫苗后14天PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。
圖16首次注射AS B、AS C、AS K、AS F或AS T STxB-ova疫苗后14天PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。
圖17首次注射AS B、AS N、AS I STxB-ova疫苗后14天PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。
圖18首次注射AS G、AS O、AS P、AS Q STxB-ova疫苗后14天PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。
圖19首次注射AS G、AS R、AS S STxB-ova疫苗后14天PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。
圖20首次注射AS A STxB-ova疫苗后14天或42天進行的第二次注射后15天測得的體液反應(yīng)。
圖21首次注射AS G、AS L、AS U、AS V STxB-ova疫苗后14天PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。
圖22首次注射ASW1、ASW2-ova疫苗后14天PBL中的Siinfekl特異性的CD8頻率。
實施例1.試劑和介質(zhì)1.1佐劑化的STxB-Ova的制備與全長雞卵清蛋白偶聯(lián)的STxB為使蛋白化學(xué)偶聯(lián)到STxB上限定的受體位點，將半胱氨酸添加到野生型蛋白的C-末端，從而產(chǎn)生STxB-Cys。按照以前的介紹(Haicheur等人，2000，J.Immunol.165，3301)生產(chǎn)重組突變體STxB-Cys蛋白。通過鱟測定檢驗確定的內(nèi)毒素濃度低于0.5EU/ml。以前已經(jīng)對STxB-ova進行過闡述(HAICHEUR等人，2003，Int.Immunol，15，1161-1171)，而且Ludger Johannes和Eric Tartour(Curie Institute)友善提供STxB-ova。
在下面所注的每一個佐劑系統(tǒng)中配制與全長雞卵清蛋白偶聯(lián)的StxB。
1.2Galabiose結(jié)合測定由志賀菌毒素的B亞單位優(yōu)選識別的Gb3受體是細胞表面鞘糖脂，神經(jīng)酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide)(Galα-1-4Galβ1-4葡糖神經(jīng)酰胺)，其中Gal是半乳糖。下面敘述的方法是以Tarrago-Trani敘述的方法(Protein Extraction and Purification 38，pp170-176，2004)為基礎(chǔ)的，且涉及在商業(yè)可獲得的galabiose連接的瓊脂糖凝膠(calbiochem)上的親和層析。Galabiose(Galα1-＞4Gal)是Gb3的寡糖部分的末端碳水化合物部分，而且被認為代表了志賀菌毒素的B亞單位可識別的最小結(jié)構(gòu)。該方法已經(jīng)成功地應(yīng)用于直接從大腸桿菌裂解物中純化志賀菌毒素。所以可假定結(jié)合該部分的蛋白可結(jié)合Gb3受體。
將PBS緩沖液(500μl)中的目的蛋白與100μl事先在同樣的緩沖液中平衡過的固定化galabiose樹脂(Calbiochem)混合，且在旋轉(zhuǎn)輪(rotating wheel)上于4℃溫育30分鐘到1小時。于5000rpm第一次離心一分鐘后，將沉淀用PBS洗滌兩次。然后通過在2×500μl的100mM甘氨酸pH2.5中重懸終沉淀來洗脫結(jié)合的材料兩次。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、考馬斯染色和蛋白印跡分析相當于流過的、合并的洗滌液和合并的洗脫物的樣品。這些分析技術(shù)允許鑒定蛋白是否結(jié)合到galabiose上，并從而結(jié)合Gb3受體。
1.3-用于佐劑系統(tǒng)的水包油乳劑的制備遵循WO 95/17210中所述規(guī)程制備水包油乳劑。該乳劑包含5％角鯊烯，5％生育酚，2.0％tween 80；顆粒大小為180nm。
水包油乳劑的制備(2倍濃度)將Tween 80溶于磷酸緩沖鹽水(PBS)中，以得到溶于PBS中的2％溶液。為提供100ml兩倍濃度的乳劑，渦旋5克的DLα生育酚和5ml的角鯊烯，直到徹底混合。加入90ml PBS/Tween溶液并徹底混合。接著使所得乳劑通過注射器并最終用M110S微流化機器(microfludics machine)微流化(microfluidise)。所得油滴具有約180nm的大小。
1.4-佐劑系統(tǒng)的制備1.4.1佐劑系統(tǒng)AQS21和3D-MPL將溶于有機溶劑中的脂質(zhì)(例如來自卵黃或合成的磷脂酰膽堿)和膽固醇和3D-MPL的混合物在真空(或備選地在惰性氣體流)下干燥。然后加入水性溶液(如磷酸緩沖鹽水)，并攪動容器，直到所有脂質(zhì)都處于懸浮狀態(tài)。接著將懸浮液微流化，直到脂質(zhì)體的大小減少到約100nm，并然后通過0.2μm的過濾器無菌過濾。擠出或超聲處理可取代所述步驟。
膽固醇∶磷酸酰膽堿的比率通常是1∶4(w/w)，并加入水性溶液，以獲得5-50mg/ml的膽固醇終濃度。
脂質(zhì)體具有100nm的限定大小，且被稱為SUV(表示小的單層脂質(zhì)體)。脂質(zhì)體本身隨時間推移是穩(wěn)定的，并且沒有融合能力。將大量無菌的SUV加入PBS中，以達到10、20或100μg/ml的3D-MPL終濃度。PBS組成為磷酸氫二鈉9mM；磷酸二氫鉀48mM；氯化鈉100mM，pH6.1。將溶于水性溶液中的QS21加入SUV。該混合物被稱為DQMPLin。然后加入Stx-OVA。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。如果需要，檢查pH并用NaOH或HCl調(diào)節(jié)至6.1+/-0.1。
在下面3.1部分描述的實驗中，StxB-OVA的濃度為4、10、20或100μg/ml，而3D-MPL和QS21的濃度為10μg/ml。在這些情況下，50μl注射體積對應(yīng)于0.2-5μg的STxB-OVA和0.5μg的3D-MPL和QS21。0.2μg的STxB-OVA注射結(jié)果顯示在圖1-10中。也進行50μl注射體積對應(yīng)于0.5、1和5μg的STxB-OVA的實驗。這些實驗得出圖1-10中所示的比較結(jié)果。
在其他實驗中，StxB-OVA的濃度為20或40μg/ml，而3D-MPL和QS21的濃度為20或100μg/ml。
在這些實驗中，25μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-OVA和0.5μg的3D-MPL和QS21(在圖12A和12B中示出)或1μg的STxB-OVA和各2.5μg的3D-MPL和QS21(在圖11和20中示出)。
1.4.2佐劑系統(tǒng)BQS211.4.2.1佐劑系統(tǒng)B1根據(jù)用于佐劑系統(tǒng)A但去除3D-MPL的方法制備佐劑。
調(diào)節(jié)StxB-OVA和QS21的濃度為10或20μg/ml。
25或50μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的StxB-OVA和0.5μg的QS21(如圖12A、12B和17所示)。
1.4.2.2佐劑系統(tǒng)B2在pH6.8的PBS中稀釋QS21為濃度100μg/ml，然后加入StxB-OVA以達到抗原終濃度為40μg/ml。
25μl注射體積對應(yīng)于1μg的StxB-OVA和2.5μg的QS21(如圖16所示)。
1.4.3佐劑系統(tǒng)C3D-MPL1.4.3.1佐劑系統(tǒng)C1在終濃度為9.25％的蔗糖溶液中稀釋大量無菌的3D-MPL為100或200μg/ml。加入StxB-OVA，以達到抗原終濃度為20或40μg/ml。
25μl注射體積對應(yīng)于1μg的StxB-OVA和5μg的3D-MPL(參見圖16)或0.5μg的StxB-OVA和2.5μg的3D-MPL(結(jié)果未示出，但是可比較的)。
1.4.3.2佐劑系統(tǒng)C2根據(jù)用于佐劑系統(tǒng)A但去除QS21的方法制備佐劑。
調(diào)節(jié)StxB-OVAT和MPL的濃度為10μg/ml。
50μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的StxB-OVA和0.5μg的MPL。
1.4.4佐劑系統(tǒng)D水包油乳劑中的3D-MPL和QS21將按實施例1.3制備的大量無菌乳劑加入PBS中，以達到每毫升250或500μl乳劑(v/v)的終濃度。然后加入3D-MPL，以達到50或100μg/ml的終濃度。接著加入QS21，以達到50或100μg/ml的終濃度。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。然后加入StxB-OVA，以達到10或40μg/ml的終濃度。15分鐘后，檢查pH，且如果需要，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH到6.8+/-0.1。
25或50μl注射體積對應(yīng)于0.5或1μg的STxB-OVA、2.5μg的3D-MPL和QS21、12.5μl或25μl的乳劑。用50μl注射體積的實驗在圖11中示出。用25μl注射體積的實驗給出了可比較的結(jié)果。
1.4.5佐劑系統(tǒng)E水包油乳劑中的高劑量3D-MPL和QS21將按實施例1.3制備的大量無菌乳劑加入PBS中，以達到每毫升500μl乳劑(v/v)的終濃度。然后加入200μg的3D-MPL和200μg的QS21。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。然后加入StxB-OVA，以達到40μg/ml的終濃度。15分鐘后，檢查pH，且如果需要，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH到6.8+/-0.1。
25μl注射體積對應(yīng)于1μg的STxB-Ova、5μg的兩種免疫刺激劑和12.5μl的乳劑。
1.4.6佐劑系統(tǒng)F低濃度水包油乳劑中的3D-MPL和QS21水包油乳劑如實施例1.3所述，其中將膽固醇加入到有機相中，以達到1％角鯊烯、1％生育酚、0.4％tween 80和0.05％膽固醇的終組成。形成乳劑后，接著加入3D-MPL，以達到100μg/ml的終濃度。然后加入QS21，以達到100μg/ml的終濃度。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。然后加入StxB-OVA，以達到40μg/ml的終濃度。15分鐘后，檢查pH，且如果需要，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH到6.8+/-0.1。25μl注射體積對應(yīng)于1μg的STxB-Ova、2.5μg的3D-MPL和QS21、2.5μl的乳劑。
1.4.7佐劑系統(tǒng)GCpG2006將大量無菌的CpG加入到PBS或氯化鈉150mM溶液中，以達到100或200μg/ml的終濃度。
然后加入StxB-OVA，以達到10或20μg/ml的終濃度。
所用CpG為24聚體，其具有如下序列5’-TCG TCG TTT TGTCGT TTT GTC GTT-3’(Seq ID No.4)。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。檢查pH，且如果需要，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH到6.1+/-0.1。
50μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova和5μg的CpG(圖12A，12B和21)。進行25μl注射體積(對應(yīng)于05μg的STxB-OVA和5μg的CpG)的實驗。結(jié)果未示出但是可比較的。
1.4.8佐劑系統(tǒng)HQS21、3D-MPL和CpG2006將大量無菌的CpG加入到PBS溶液中，以達到100μg/ml的終濃度。PBS組成為磷酸氫二鈉9mM；磷酸二氫鉀48mM；氯化鈉100mM，pH6.1。然后加入StxB-OVA，以達到20μg/ml的終濃度。最后，加入作為含有3D-MPL和QS21的大量無菌SUV的預(yù)混合物(被稱為DQMPLin)的QS21和3D-MPL，以達到10μg/ml的3D-MPL和QS21的終濃度。
所用CpG為24聚體，其具有如下序列5’-TCG TCG TTT TGTCGT TTT GTC GTT-3’(Seq ID No.4)。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。檢查pH，且如果需要，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH到6.1+/-0.1。
50μl注射體積對應(yīng)于1μg的STxB-Ova、0.5μg的3D-MPL和QS21和5μg的CpG。然后在3D-MPL/QS21和CpG的溶液中稀釋該制劑(濃度分別是10、10和100μg/ml)，以獲得0.2、0.04和0.008μg劑量的STxB-OVA。(使用了這些制劑的實驗顯示在圖1-10和13)在圖12A和12B所示的實驗中，CpG的濃度為100μg/ml，3D-MPL和QS21的濃度為10μg/ml，且STxB-OVA的濃度為10μg/ml。
50μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-OVA、0.5μg的3D-MPL和QS21和5μg的CpG。
在另外一個實驗中，CpG的濃度為1000μg/ml，3D-MPL和QS21的濃度為100μg/ml，且STxB-OVA的濃度為40μg/ml。25μl注射體積對應(yīng)于1μg的STxB-OVA、2.5μg的3D-MPL和QS21和25μg的CpG。這個實驗的結(jié)果未示出，但與具有其他濃度的組分的結(jié)果可進行比較。
1.4.9佐劑系統(tǒng)IQS21和CpG2006將大量無菌的CpG加入到PBS或氯化鈉150mM溶液中，以達到100或200μg/ml的終濃度。PBS組成為PO4 10mM，NaCl 150mM，pH7.4或者磷酸氫二鈉9mM；磷酸二氫鉀48mM；氯化鈉100mM；pH6.1。然后加入StxB-OVA，以達到10或20μg/ml的終濃度。最后，加入作為大量無菌SUV和QS21的預(yù)混合物(被稱為DQ，按實施例1.3.14制備)的QS21，以達到10或20μg/ml的QS21的終濃度。
所用CpG為24聚體，其具有如下序列5’-TCG TCG TTT TGTCGT TTT GTC GTT-3’(Seq ID No.4)。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。檢查pH，且如果需要，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH到6.1或7.4+/-0.1。
50μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova、0.5μg的QS21和5μg的CpG(圖12A和12B)。
也進行25μl注射體積(對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova、0.5μg的QS21和5μg的CpG)的實驗。結(jié)果未示出，但是可比較的。
1.4.10佐劑系統(tǒng)J不完全弗氏佐劑(IFA)IFA是從CALBIOCHEM得到的。將IFA用大量的抗原在1分鐘期間內(nèi)進行乳化，其中使用渦旋。
在pH6.8或7.4的PBS中稀釋STxB-ova為濃度40μg/ml，并與500μl/ml的IFA混合，所述IFA或者就這樣使用，或者用PBS稀釋20倍后再使用。
25μl注射體對應(yīng)于1μg的STxB-ova和12.5或0.625μl的IFA(在圖14中示出)。
在其他實驗中，在pH6.8或7.4的PBS中稀釋STxB-OVA為濃度10μg/ml，并與500或250μl/ml的IFA混合。50μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-OVA和12.5或25μl的IFA。這些實驗給出了與圖14中示出的那些可比較的結(jié)果。
1.14.11佐劑系統(tǒng)K水包油乳劑1.4.11.1佐劑系統(tǒng)K1按實施例1.3但去除3D-MPL和QS21制備大量無菌乳劑。
25μl注射體積對應(yīng)于1μg的STxB-OVA和12.5μl的乳劑。結(jié)果顯示為圖16的佐劑系統(tǒng)K。
1.4.11.2佐劑系統(tǒng)K2按佐劑系統(tǒng)F但去除3D-MPL和QS21制備大量無菌乳劑。
25μl注射體積對應(yīng)于1μg的STxB-OVA和2.5μl的含膽固醇的乳劑。
結(jié)果未示出，但與佐劑系統(tǒng)K1看到的那些可比較。
1.4.12佐劑系統(tǒng)LPoly I:C
Poly I:C(聚肌胞苷酸)是Amersham公司商業(yè)合成的病毒RNA的模擬物。在一些實驗中，將StxB-OVA在NaCl 150mM中稀釋，以達到20μg/ml的終濃度。然后加入大量無菌Poly I:C以達到20μg/ml的終濃度。
在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。
25μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova和0.5μg的Poly I:C(在圖15和21中示出)。
在其他實驗中，STxB-OVA的濃度為10μg/ml，而Poly I:C的濃度為20或100μg/ml。
50μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-OVA和1或5μg的PolyI:C。
這些實驗給出了與圖15和21中示出的那些可比較的結(jié)果。
1.4.13佐劑系統(tǒng)MCpG5456在NaCl 150mM中稀釋StxB-OVA，以達到20μg/ml的終濃度。然后加入大量無菌CpG，以達到200μg/ml的終濃度。
所用CpG為22聚體，其具有如下序列5’-TCG ACG TTT TCGGCG CGC GCC G-3’(CpG5456)。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。
25μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova和5μg的CpG。
1.4.14佐劑系統(tǒng)NQS21和Poly I:C將溶于有機溶劑中的脂質(zhì)(如來自卵黃或合成的磷脂酰膽堿)和膽固醇的混合物在真空(或備選地在惰性氣體流)下干燥。然后加入水性溶液(如磷酸緩沖鹽水)，并攪動容器直到所有脂質(zhì)均處于懸浮狀態(tài)。接著將懸浮液微流化，直到脂質(zhì)體大小減少到約100nm，然后通過0.2μm過濾器無菌過濾。擠壓或超聲處理可取代該步驟。
膽固醇∶磷脂酰膽堿的比率通常是1∶4(w/w)，且然后加入水性溶液，以得到5-50mg/ml的膽固醇終濃度。
脂質(zhì)體具有100nm的限定大小，且被稱為SUV(表示小的單層脂質(zhì)體)。脂質(zhì)體本身隨時間推移是穩(wěn)定的，并且沒有融合能力。
將大量無菌的SUV加入PBS中，以達到100μg/ml的MPL終濃度。將QS21水溶液加入SUV，以達到100μg/ml的QS21終濃度。這種脂質(zhì)體和QS21的混合物被稱為DQ。
在NaCl 150mM中稀釋大量無菌Poly I:C(Amersham，同前)，以達到20μg/ml的終濃度，然后加入DQ，以達到QS21中的20μg/ml終濃度。然后加入Stx-OVA，以達到20μg/ml的終濃度。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。
25μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova、0.5μg的QS21和0.5μg的Poly I:C。
1.4.15佐劑系統(tǒng)OCpG2006和水包油乳劑按實施例1.3制備水包油乳劑。
將大量無菌的乳劑加入PBS，以達到每毫升500μl乳劑(v/v)的終濃度。然后加入CpG，以達到200μg/ml的終濃度。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。然后加入StxB-OVA，以達到20μg/ml的終濃度。15分鐘后，檢查pH，且如果需要，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH到6.8+/-0.1。
所用CpG為24聚體，其具有如下序列5’-TCG TCG TTT TGTCGT TTT GTC GTT-3’(Seq ID No.4)。
25μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova、5μg的CpG和12.5μl的乳劑。
1.4.16佐劑系統(tǒng)PCpG2006和水包油乳劑遵循公開在Chiron Behring FluAd疫苗所含說明書小冊子中的配方制備水包油乳劑。
通過在200ml水中混合36.67mg檸檬酸與627.4mg二水合檸檬酸鈉，制備檸檬酸緩沖液。在磁力攪拌條件下單獨混合3.9g角鯊烯和470mg的Span 85。
將470mg Tween 80與檸檬酸緩沖液混合。將所得混合物加入到角鯊烯/Sapn 85混合物中，并用磁力攪拌“強力”混合。終體積為100ml。
接著將混合物放入M110S微流化機器(購自Microfluidics)，以減小油滴的大小。用0.06的多分散性得到145nm的z平均值。使用以下技術(shù)條件在Zetasizer 3000HS(購自Malvern)上獲得該大小。
-激光波長532nm(Zeta3000HS)-激光器功率50mW(Zeta3000HS)-在90°檢測到的散射光(Zeta3000HS)
-溫度25℃-持續(xù)時間由軟件自動確定-數(shù)值3次連續(xù)測量-z-平均直徑通過累積量分析將大量無菌的所得乳劑加入PBS，以達到每毫升500μl乳劑(v/v)的終濃度。然后加入CpG，以達到200μg/ml的終濃度。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。然后加入StxB-OVA，以達到20μg/ml的終濃度。15分鐘后，檢查pH，且如果需要，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH到6.8+/-0.1。
所用CpG為24聚體，其具有如下序列5’-TCG TCG TTT TGTCGT TTT GTC GTT-3’(Seq ID No.4)。
25μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova、5μg的CpG和12.5μl的乳劑。
1.4.17佐劑系統(tǒng)QCpG2006和IFA水包油乳劑將從CALBIOCHEM得到的IFA加入PBS，以達到每毫升500μl乳劑(v/v)的終濃度。然后加入CpG，以達到200μg/ml的終濃度。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。然后加入StxB-OVA，以達到20μg/ml的終濃度。15分鐘后，檢查pH，且如果需要，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH到7.4+/-0.1。
所用CpG為24聚體，其具有如下序列5’-TCG TCG TTT TGTCGT TTT GTC GTT-3’(Seq ID No.4)。
25μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova和5μg的CpG、12.5μl的乳劑。
1.4.18佐劑系統(tǒng)RCpG2006和Al(OH)3將得自Brentag的Al(OH)3在水中稀釋為終濃度1mg/ml(Al+++)，做注射用。在30分鐘期間，StxB-OVA被吸附到Al+++上，濃度為20μg/ml。加入CpG，以達到200μg/ml濃度，并溫育30分鐘，然后加入NaCl以達到150mM的終濃度。全部溫育在室溫下在定軌振蕩(orbital shacking)下進行。
所用CpG為24聚體，其具有如下序列5’-TCG TCG TTT TGTCGT TTT GTC GTT-3’(Seq ID No.4)。
25μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova、5μg的CpG和25μg的Al+++。
1.4.19佐劑系統(tǒng)SCpG2006和AlPO4將得自Brentag的AlPO4在水中稀釋為終濃度1mg/ml(Al+++)，做注射用。在30分鐘期間，StxB-OVA被吸附到Al+++上，濃度為20μg/ml。加入CpG，以達到200μg/ml濃度，并溫育30分鐘，然后加入NaCl以達到150mM的終濃度。全部溫育在室溫下在定軌振蕩下進行。
所用CpG為24聚體，其具有如下序列5’-TCG TCG TTT TGTCGT TTT GTC GTT-3’(Seq ID No.4)。
25μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova、5μg的CpG和25μg的Al+++。
1.4.20佐劑系統(tǒng)T3D-MPL和Al(OH)3將得自Brentag的Al(OH)3在水中稀釋為終濃度1mg/ml(Al+++)，做注射用。在30分鐘期間，StxB-OVA被吸附到Al+++上，濃度為40或20μg/ml。加入3D-MPL，以達到100μg/ml濃度，并溫育30分鐘，然后加入NaCl以達到150mM的終濃度。全部溫育在室溫下在定軌振蕩下進行。
25μl注射體積對應(yīng)于1或0.5μg的STxB-Ova、2.5μg的3D-MPL和25μg的Al+++。1μg的STxB-Ova的結(jié)果在圖16中示出。注射0.5μg的STxB-Ova的實驗沒有顯示，但給出了與圖16所示的可比較的結(jié)果。
1.4.21佐劑系統(tǒng)UTLR2-配體所用TLR2配體為合成的Pam3CysSerLys4，其是從Microcollections購買的細菌脂肽(其已知是TLR2特異性的)。在NaCl 150mM或PBS pH7.4中稀釋StxB-OVA，以達到10或20μg/ml的終濃度。然后加入大量無菌的Pam3CysSerLys4，以達到40、100和200μg/ml的終濃度。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。
50μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova和5或10μg的Pam3CysSerLys4。(5μg的結(jié)果在圖21中示出，參見3.2.9部分對其他劑量TLR2的結(jié)果的討論)在其他實驗中，25μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-OVA和1μg的Pam3CysSerLys4。
1.4.22佐劑系統(tǒng)VTLR7/8配體所用TLR7/8配體是稱為resiquimod或R-848(Cayla)的咪喹莫特衍生物。R-848是咪唑并喹啉家族的低分子量化合物，其在動物模型中具有很強的抗病毒和抗腫瘤特性。咪喹莫特的活性主要是通過誘導(dǎo)細胞因子介導(dǎo)的，所述細胞因子包括IFN-a和IL-12。R-848是咪喹莫特的更強效類似物(Akira，S.和Hemmi，H.；IMMUNOLOTYLETTER，85(2003)，85-95)。
在PBS pH7.4中稀釋StxB-OVA，以達到10或20μg/ml的終濃度。然后加入大量無菌的R-848，以達到20和100μg/ml的終濃度。在每次加入組分之間，攪拌中間產(chǎn)物5分鐘。
50μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova和1或5μg的R-848。在其他實驗中，25μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-OVA和0.5μg的R-848。
1.4.22佐劑系統(tǒng)WAlPO41.4.22.1佐劑系統(tǒng)W1將得自Brentag的AlPO4在水中稀釋為終濃度0.5mg/ml(Al+++)，做注射用。在30分鐘期間，StxB-OVA被吸附到Al+++上，濃度為10μg/ml，然后加入NaCl，以達到150mM的終鹽濃度。全部溫育在室溫下在定軌振蕩下進行。
50μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova和25μg的Al+++。
1.4.22.2佐劑系統(tǒng)W2將得自Brentag的AlPO4在PBS pH7.4中稀釋為終濃度0.5mg/ml(Al+++)。在30分鐘期間，STxB-OVA被吸附到Al+++上，濃度為10μg/ml。全部溫育在室溫下在定軌振蕩下進行。
50μl注射體積對應(yīng)于0.5μg的STxB-Ova、5μg的CpG和25μg的Al+++。按XXXXX中所述的SDS-PAGE檢查表明，約70％的抗原沒有吸附到AlPO4上。
1.5確定抗原/金屬鹽復(fù)合物上吸附的抗原的水平將目的制劑在6500g離心6分鐘。使所得上清液的樣品在95℃變性5分鐘，并加載到在還原性樣品緩沖液中的SDS-PAGE凝膠上。不含佐劑的抗原樣品也進行加載。然后在200V、200mA電泳凝膠1小時。接著按照Daichi方法銀染凝膠。通過比較佐劑化制劑的樣品與無佐劑抗原的樣品，確定制劑中游離抗原的水平。也可以使用本領(lǐng)域熟知的其他技術(shù)，如蛋白印跡。
實施例2給C57/B6小鼠接種本發(fā)明的疫苗用上面所述的各種制劑接種6-8周齡的C57BL/B6雌小鼠(10只/組)。小鼠得到一次注射或相隔14天的兩次注射，且在1、2、3和8周放血(實際放血天數(shù)參見具體實施例)。以肌內(nèi)方式接種小鼠(將25μl或50μl終體積注射到左側(cè)腓腸肌內(nèi))。以5 107-108VP的各種劑量注射卵清蛋白重組腺病毒。
在完全培養(yǎng)基中實施轉(zhuǎn)體內(nèi)(ex-vivo)PBL刺激，所述完全培養(yǎng)基是RPMI 1640(Biowitaker)，其補加了5％FCS(Harlan，Holland)，抗小鼠抗體CD49d和CD28(BD，Biosciences)每種各1μg/ml，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，10μg/ml streptamycin sulfte，10單位/ml青霉素G鈉(Gibco)，10μg/ml streptamycin，50μM B-ME巰基乙醇和100X稀釋的非必需氨基酸，所有這些添加劑均來自Gibco LifeTechnologies。肽刺激總是在37℃，5％CO2下進行。
2.1免疫學(xué)測定2.1.1抗原特異性T細胞的檢測分離PBL和四聚體染色。血液取自后眼窩靜脈(retro orbitalvein)(每只小鼠50μl，每組10只小鼠)并直接在RPMI+肝素(LEO)培養(yǎng)基中稀釋。通過lymphoprep梯度(CEDERLANE)分離PBL。然后洗滌、計數(shù)細胞，且最終將1-5 105個細胞重懸在含有1/50終濃度(f.c.)的CD16/CD32抗體(BD Biosciences)的50μl FACS緩沖液(PBS，F(xiàn)CS 1％，0.002％NaN3)中。10分鐘后，向細胞懸浮液中加入50μl的四聚體混合物。四聚體混合物包含分別來自Immunosource或Immunomics Coulter的0.2μl或1μlsiinfekl-H2Kb四聚體-PE，根據(jù)可用性而定?？笴D8a-PercP(1/100 f.c.)和抗CD4-APC(1/200 f.c.)(BDBiosciences)抗體也加入測試。然后在室溫放置細胞45分鐘(對Immunosource四聚體而言)或在37℃放置細胞10分鐘(對Immunomics Coulter四聚體而言)，然后洗滌一次并使用FACSCaliburTM用CELLQuestTM軟件進行分析。
2.1.2細胞內(nèi)細胞因子染色(ICS)對如2.1.1段中所述采集的血液樣品進行ICS。
將5-10105PBL重懸于完全培養(yǎng)基中，所述完全培養(yǎng)基補加了或沒有補加1μg/ml的siinfekl肽或17個15聚體的Ova肽的集合(11個I型MHC限制的肽和6個II型MHC限制的肽)，每一Ova肽的濃度都是1μg/ml。2小時后，加入1μg/ml布雷菲爾德菌素-A(BDBiosciences)，進行16小時，并在總計18小時后收集細胞。洗滌細胞一次，然后用抗小鼠抗體(全部購自BD，Biosciences)染色；所有進一步的步驟都在冰上進行。首先在50μl CD16/32溶液(1/50f.c.，F(xiàn)ACS緩沖液)中溫育細胞10分鐘。加入50μl T細胞表面標記的混合物(1/100 CD8a perCp，1/100CD4PE)，并溫育細胞20分鐘，然后洗滌細胞。在200μl透化/固色(perm/fix)溶液(BD，Biosciences)中固定及透化細胞，在透化/洗滌(perm/wash)緩沖液(BD，Biosciences)中洗滌一次，然后在4℃用抗IFNg-APC和抗IL2-FITC各染色2小時或者過夜。用FACS CaliburTM用CELLQuestTM軟件分析數(shù)據(jù)。
在圖14B中，抗CD4抗體用APC Cy7標記，抗CD8抗用PercPCy5.5標記體，而且在細胞因子染色步驟中包括抗TNFa-PE抗體。
2.1.3在體內(nèi)檢測到的細胞介導(dǎo)的細胞毒素的活性(體內(nèi)CMC)為評價siinfekl特異性的細胞毒性，給免疫小鼠和對照小鼠注射由2個CFSE差別標記的同源脾細胞和淋巴結(jié)群體組成的靶混合物，所述混合物加載了或沒有加載1nM siinfekl肽。使用濃度0.2μM或2.5μM的羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE；分子探針-Palmoski等人；2002，J.Immunol.168，4391-4398)進行差別標記。兩種類型的靶都以1/1的比率合并，并重懸為濃度108靶/ml。第一次注射后15天，將每只小鼠200μl靶混合物注射到尾靜脈內(nèi)。通過對從在不同的時間點(在靶注射后4、18或24小時)被宰殺的動物身上采集的引流淋巴結(jié)(draining lymphnode)或血液(頸靜脈)進行FACSR分析來評價細胞毒性。相對于抗原陰性的對照，用下式計算加載了siinfekl的靶細胞的平均裂解百分比。

注射前的靶細胞＝體內(nèi)注射前，由FACS獲得的肽脈沖的靶(preinj.+)和非脈沖靶(preinj.-)的混合物。
校正靶(+)＝體內(nèi)注射后，由FACS獲得的肽脈沖的靶數(shù)目，進行校正是為了把注射前的混合細胞中的preinj.+細胞數(shù)目考慮在內(nèi)(見上)。
2.1.4Ag特異性抗體滴定(總IgG的個別分析)ELISA在第二次注射后15天和40天評價血清學(xué)分析。通過后眼窩穿刺給小鼠(每組10只)放血。用ELISA測量抗-ova的總IgG。在4℃用抗原包被96孔板(NUNC，免疫吸附板)過夜(每孔50μl ova溶液(ova 10μg/ml，PBS)。然后在洗滌緩沖液(PBS/0.1％Tween20(Merck))中洗滌板并用100μl飽和緩沖液(PBS/0.1％Tween20/1％BSA/10％FCS)在37℃飽和1小時。在洗滌緩沖液中又洗滌三次后，加入100μl稀釋的小鼠血清并在37℃溫育90分鐘。再洗滌三次后，將板與在飽和緩沖液中稀釋1000倍的生物素化抗小鼠總IgG在37℃再溫育1小時。飽和之后按照上述再洗滌96孔板。加入在飽和緩沖液中稀釋1000倍的鏈霉抗生物素蛋白過氧化物酶(Amersham)溶液，每孔50μl。最末次洗滌是在洗滌緩沖液中的5步洗滌。最后，每孔加入50μl TMB(溶于酸性緩沖液中的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺-H2O2的濃度是0.01％-BIORAD)，并將板室溫放在黑暗中10分鐘。
為了終止反應(yīng)，每孔加入50μl H2SO40.4N。用BIORAD公司的ELISA讀板儀(plate reader)在450/630nm波長讀出吸收。使用softmax-pro軟件計算結(jié)果。
2.1.5B細胞酶聯(lián)免疫斑點(Elispot)在第二次注射后78天收集脾細胞和骨髓細胞，并在完全培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)五天，所述完全培養(yǎng)基補加了3μg/ml CpG2006和50U/mlrhlL-2以使記憶B細胞分化成抗體分泌性漿細胞。五天后，將96孔過濾器板與70％乙醇溫育10分鐘，洗滌，并用卵清蛋白(50μg/ml)或山羊抗小鼠Ig抗血清包被。然后用完全培養(yǎng)基飽和它們。收獲細胞，洗滌，并分裝到板上，每孔2×105個細胞，于37℃進行1小時。接著于4℃過夜貯存板。第二天，通過用PBS Tween 20 0.1％洗滌板來去除細胞。然后將細胞與在1/500 PBS中稀釋的抗IgG生物素化抗體在37℃溫育1小時，洗滌，并與extravidin-辣根過氧化物酶(4μg/ml)溫育1小時。洗滌步驟后，通過與氨基-乙基-咔唑(AEC)和H2O2的溶液溫育10分鐘，并用自來水洗滌板進行固定，來揭示斑點。每一個已分泌IgG或Ova特異性IgG的細胞均呈現(xiàn)為紅色斑點。結(jié)果用每100個總IgG斑點中ova-特異性IgG斑點的頻率表示。
3.結(jié)果下述結(jié)果表明通過將STxB系統(tǒng)與各種佐劑系統(tǒng)或一些其組分組合起來，STxB系統(tǒng)誘導(dǎo)CD8反應(yīng)的效率急劇提高。
3.1佐劑系統(tǒng)A和H的數(shù)據(jù)3.1.1對AS A和AS H的初級反應(yīng)的評價所得結(jié)果表明沒有佐劑時STxB-ova的低劑量(0.2μg)免疫不能誘導(dǎo)可被轉(zhuǎn)體內(nèi)檢測到的強的CD8T細胞免疫反應(yīng)。相反，當STXB-OVA與佐劑系統(tǒng)A或H之一組合起來時，觀察到了強的免疫反應(yīng)。而且，在佐劑化的蛋白上證實了明確的優(yōu)勢。
用佐劑系統(tǒng)A或H佐劑化的STxB-ova在誘導(dǎo)強而持久的初級反應(yīng)方面是強效的。它誘導(dǎo)了高頻率的抗原特異性CD8T細胞(圖1-對于AS H，注射液包括0.2μg的STxB-OVA，0.5μg的3D-MPL和QS21，和5μg的CPG。方法按上面2.1.1所述的實行，在第一次注射后7天給小鼠放血)。另外，圖2(對于AS H，注射液包括0.2μg的STxB-OVA，0.5μg的3D-MPL和QS21，和5μg的CPG。方法按上面2.1.1所述的實行，在第一次注射后14天給小鼠放血)表明在注射后第7天至第14天siinfekl特異性CD8反應(yīng)仍然在增加。這種情況在接種了佐劑化的蛋白后沒有觀察到，但卻有由活載體如腺病毒誘導(dǎo)的初級反應(yīng)的特征。引發(fā)的CD8T細胞是容易地分化的效應(yīng)T細胞，不論是否用免疫優(yōu)勢肽或ova肽集合進行刺激，所述效應(yīng)T細胞都能產(chǎn)生IFNγ(分別在圖3和4中示出，對于AS H，注射液包括0.2μg的STxB-OVA，0.5μg的3D-MPL和QS21，和5μg的CPG。方法按上面2.1.2所述的實行，在第一次注射后14天給小鼠放血)。用肽集合重刺激后觀察到更高頻率的反應(yīng)CD8T細胞，表明初級CD8T細胞庫并不局限于I類免疫優(yōu)勢表位。另外，只有當STxB-ova被佐劑化時，才能在體內(nèi)檢測到高細胞毒素活性(圖5-對于AS H，注射液包括0.2μg的STxB-OVA，0.5μg的3D-MPL和QS21，和5μg的CPG。方法按上面2.1.3所述的實行，在靶注射后18小時進行)。
最后，由AS H佐劑化的STxB-ova誘導(dǎo)的初級反應(yīng)是強烈持久的，如圖6B中所釋(注射液包括0.2μg的STxB-OVA，0.5μg的3D-MPL和QS21，和5μg的CPG。方法按上面2.1.1所述的實行，在不同時間點給小鼠放血)。
3.1.2對AS A和AS H的次級反應(yīng)的評價將STxB毒素遞送系統(tǒng)與強佐劑組合起來也能提高次級免疫反應(yīng)的幅度和持久性。通過在加強后47天評價反應(yīng)最好地例證了這一點。重要的是，由佐劑化的STxB-OVA誘導(dǎo)的高CD8反應(yīng)與由重組腺病毒引發(fā)/佐劑化蛋白加強策略誘導(dǎo)的反應(yīng)有相似的強度和持久性(圖6A-對于AS H，注射液包括0.2μg的STxB-OVA，0.5μg的3D-MPL和QS21，和5μg的CPG。方法按上面2.1.1所述的實行，在第二次注射后47天給小鼠放血)。關(guān)于效應(yīng)T細胞群體，在CD4和CD8T細胞區(qū)室內(nèi)都能檢測到細胞因子產(chǎn)生性T細胞(圖7和8-對于AS H，注射液包括0.2μg的STxB-OVA，0.5μg的3D-MPL和QS21，和5μg的CPG。方法按上面2.1.2所述的實行，在第二次注射后47天給小鼠放血，用ova肽集合刺激PBL)。此外，在所述晚的時間點上，在靶注射后4小時(數(shù)據(jù)未顯示)和24小時(圖9-對于AS H，注射液包括0.2μg的STxB-OVA，0.5μg的3D-MPL和QS21，和5μg的CPG。方法按上面2.1.3所述的實行)的體內(nèi)仍能檢測到細胞毒素活性。
研究了加強后15天和40天的體液反應(yīng)(圖10a-對于AS H，注射液包括0.2μg的STxB-OVA，0.5μg的3D-MPL和QS21，和5μg的CPG。方法按上面2.1.4所述的實行，結(jié)果通過計算每組10個小鼠的geomean表示)。沒有佐劑時，單獨的STxB-ova不能誘導(dǎo)任何B細胞反應(yīng)。相反，在兩個測試的時間點上，不論佐劑化蛋白是否偶聯(lián)在STxB上，都檢測到了相等的抗體效價。
在圖10B中(注射液包括0.2μg的STxB-OVA，0.5μg的3D-MPL和QS21，和5μg的CPG。方法按上面2.1.5所述的實行)，顯示了注射后78天的抗ova記憶B細胞頻率。盡管兩次注射后15天和40天檢測的抗體效價是相等的，但與佐劑化蛋白相比，記憶B細胞反應(yīng)的質(zhì)量是不同的，因為當STxB-ova被佐劑化時，檢測到了更高頻率的記憶B細胞。單獨的STxB-ova本身不能誘導(dǎo)記憶B細胞。
有趣的是，當引發(fā)和加強的間隔時間用42天代替14天時(圖20-注射液包括0.5μg的STxB-OVA和0.5μg的3D-MPL和QS21，方法按上面2.1.4所述的實行)，由STxB-OVA AS A誘導(dǎo)的體液反應(yīng)比OVA AS A誘導(dǎo)的高，再次表明當與佐劑化組合起來時，載體化可以誘導(dǎo)更高頻率的B細胞記憶細胞。
3.1.3由低劑量STxB-OVA與AS H佐劑系統(tǒng)組合起來誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的評價圖13(注射液包括0.008、0.04、0.2或1μg的STxB-OVA，0.5μg的3D-MPL和QS21，和5μg的CPG。方法按上面2.1.1所述的實行，在第一次注射后14天給小鼠放血)表明，在單次注射劑量低至8ng的STxB-ova(在AS H中制備，對應(yīng)于4ng抗原)后14天，仍能檢測到siinfekl特異性的CD8群體。這些結(jié)果表明，佐劑與STxB系統(tǒng)的組合使用允許顯著降低抗原劑量而不會減弱被誘導(dǎo)的T細胞反應(yīng)。
3.2由STxB-OVA與其他佐劑系統(tǒng)組合起來誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的評價接下來我們想查出不同于AS A或AS H的佐劑系統(tǒng)是否也能與STxB載體化系統(tǒng)協(xié)同作用。
3.2.1接種AS A、F、D或E STxB-ova疫苗后的免疫反應(yīng)評價初級反應(yīng)評價清楚地表明，無論測試什么佐劑系統(tǒng)，佐劑化的STxB-ova都誘導(dǎo)了高頻率的抗原特異性TCD8(圖11-方法按上面2.1.1所述的實行，在第一次注射后13天給小鼠放血)。明顯地，甚至是AS D和AS E也能看到這一點，對于AS D和AS E，在用佐劑化蛋白單次接種后通常不能檢測到與檢測的CD8反應(yīng)。佐劑化的STxB-ova強烈地引發(fā)了很容易分化成細胞因子分泌性效應(yīng)T細胞的CD8T細胞(數(shù)據(jù)未顯示)。
3.2.2由STxB-OVA與佐劑系統(tǒng)(3D-MPL-AS C2，QS21-AS B，CpG2006-AS G)的單個組分組合起來誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的評價接下來我們評價在體內(nèi)的前面佐劑系統(tǒng)的不同組分。圖12A(方法按上面2.1.1所述的實行，在第一次注射后15天給小鼠放血)表明，如果STxB-ova被單個的免疫刺激劑如QS21或TLR9-配體如CpG，以及在較小程度上被TLR-4配體如3D-MPL(AS C2)佐劑化，就能檢測到siinfekl特異性的CD8群體，后面的這種免疫刺激劑當按高劑量使用時甚至更有效(AS C1)，如圖16所示。如上述，這些被引發(fā)的CD8T細胞很容易分化成細胞因子分泌性效應(yīng)細胞(數(shù)據(jù)未顯示)。由每次佐劑組分單獨誘導(dǎo)的次級CD8反應(yīng)是相等的，但是當STxB-ova被QS21和至少一個TLR配體的組合佐劑化時，觀察到更高的反應(yīng)(圖12B-方法按上面2.1.1所述的實行，在第二次注射后6天給小鼠放血)。
3.2.3由與佐劑J或佐劑K組合的STxB-OVA誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的評價與以前公開的觀察結(jié)果相反的是，當STxB-OVA與乳劑如IFA組合時，也觀察到CD8反應(yīng)的增強。含有IFA，即油包水乳劑的制劑，以劑量依賴性的方式增強了CD8反應(yīng)。Siinfekl特異性CD8T細胞的增加的頻率(圖14A)對應(yīng)于增強的CD8效應(yīng)子功能如細胞因子生產(chǎn)(圖14B)和細胞毒素活性(圖14C)。當STxB-ova與水包油乳劑組合起來時，得到了相似的結(jié)果。
3.2.4由與佐劑系統(tǒng)C1、B、K、F或T組合的STxB-ova誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的評價接下來我們評價AS T和佐劑系統(tǒng)F的不同組分。圖16表明，當與STxB-OVA組合起來時，每種組分都能增強siinfekl特異性的CD8T反應(yīng)。不過，當這些組分在制劑中結(jié)合起來時，觀察到最高的反應(yīng)。
3.2.5由與佐劑L、G或M組合的STxB-ova誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的評價圖15表明，STX-B-OVA與TLR配體如代表了B類和C類的polyI:C(TLR3)或CpG序列(TLR9)的組合顯著地增強了siinfekl特異性的CD8T反應(yīng)的幅度。
3.2.6由與佐劑系統(tǒng)B、N或I組合的STxB-ova誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的評價圖17表明，當被單獨的QS21或與TLR3配體(poly I:C)或TLR9配體(CpG)組合的QS21佐劑化時，由STxB-OVA誘導(dǎo)的CD8反應(yīng)明確地被促進。
3.2.7由與佐劑系統(tǒng)G、O、P或Q組合的STxB-ova誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的評價圖18表明，當被單獨的CpG或與IFA或與不同的水包油乳劑組合的CpG佐劑化時，由STxB-OVA誘導(dǎo)的CD8反應(yīng)明確地被促進。
3.2.8由與佐劑系統(tǒng)G、R或S組合的STxB-ova誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的評價圖19表明，當被單獨的CpG或與Al(OH)3或AlPO4組合的CpG佐劑化時，由STX-B-OVA誘導(dǎo)的CD8反應(yīng)明確地被促進。
3.2.9由與佐劑系統(tǒng)G、L、U或V組合的STxB-ova誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的評價圖21表明，除了TLR9和3配體外，STX-B-OVA與TLR2和TLR7/8配體的組合也能顯著增強siinfekl特異性的CD8T反應(yīng)的幅度。以0.2-10μg的劑量范圍測試了TLR2配體。劑量低于5μg時看不到增強。有趣的是，當劑量增加到10μg時，看到了降低的反應(yīng)。這可用TLR2配體誘導(dǎo)調(diào)控分子如IL-10的能力加以解釋。
3.2.10由與佐劑系統(tǒng)W1或W2組合的STxB-ova誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的評價圖22表明，STxB-ova和AS W1(其在制劑中含有磷酸鋁，制劑中抗原被吸附到鋁鹽上)的組合給予免疫反應(yīng)超過用非佐劑化的STxB-ova肽所看到的很小的促進。不過，當這樣配制組合物，從而一些抗原(在這種情況中為約70％)沒有吸附到鋁鹽上，例如用溶解到磷酸緩沖鹽水中的鋁鹽進行吸附，如可在AS W2中看到的，那么看到了免疫反應(yīng)超過由不含佐劑的STxB-ova所給予的反應(yīng)的促進。
權(quán)利要求
1.一種疫苗組合物，其含有能結(jié)合Gb3受體上、與抗原復(fù)合的志賀菌毒素的B亞單位或其免疫學(xué)上的功能等價物，而且還含有佐劑，前提是當佐劑只是一種金屬鹽時，就可以以這樣的方式配制不超過約50％的抗原被吸附到金屬鹽上。
2.如權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述志賀菌毒素的B亞單位的免疫學(xué)上的功能等價物與志賀菌毒素的B亞單位有至少50％的氨基酸序列同一性。
3.如權(quán)利要求2的疫苗組合物，其中所述載體是志賀菌毒素的B亞單位或其功能片段。
4.如權(quán)利要求2的疫苗組合物，其中所述載體是Vero細胞毒素-1的B亞單位或其功能片段。
5.如權(quán)利要求1-4任一項中所請求保護的疫苗組合物，其中所述佐劑選自金屬鹽、水包油乳劑、Toll樣受體激動劑、皂苷或其組合。
6.如權(quán)利要求5中所請求保護的疫苗組合物，其中所述佐劑是Toll樣受體激動劑。
7.如前面任一項權(quán)利要求中所請求保護的疫苗組合物，其中所述抗原和B亞單位是共價附著的。
8.如權(quán)利要求7中所請求保護的疫苗組合物，其中所述抗原通過半胱氨酸殘基與毒素附著。
9.如前面任一項權(quán)利要求中所請求保護的疫苗組合物，其中所述佐劑選自金屬鹽、皂苷、脂質(zhì)A或其衍生物、烷基氨基葡糖苷磷酸、免疫刺激寡核苷酸或其組合。
10.如權(quán)利要求9中所請求保護的疫苗組合物，其中所述皂苷以脂質(zhì)體、Iscom或水包油乳劑的形式存在。
11.如權(quán)利要求9或10中所請求保護的疫苗組合物，其中所述皂苷是QS21。
12.如權(quán)利要求9、10或11中所請求保護的疫苗組合物，其中所述脂質(zhì)A衍生物選自一磷酸脂質(zhì)A、3脫酰一磷酸脂質(zhì)A、OM174、OM197、OM294。
13.如權(quán)利要求1-12任一項中所請求保護的疫苗組合物，其中所述佐劑是來自以下組的兩個的至少一個代表物的組合，i)皂苷，ii)Toll樣受體4激動劑，和iii)Toll樣受體9激動劑。
14.如權(quán)利要求13中所請求保護的疫苗組合物，其中所述皂苷是QS21，并且toll樣受體4激動劑是3脫酰一磷酸脂質(zhì)A，以及toll樣受體9是含有CpG的免疫刺激寡核苷酸。
15.如權(quán)利要求1-14任一項中所請求保護的疫苗組合物，其中所述抗原選自提供針對選自細胞內(nèi)病原體或增殖性疾病的疾病組的免疫的抗原。
16.一種疫苗組合物，其含有志賀菌毒素的B亞單位或其免疫學(xué)上的功能等價物以及抗原和醫(yī)學(xué)用佐劑。
17.志賀菌毒素的B亞單位或其免疫學(xué)上的功能等價物和抗原和佐劑在生產(chǎn)用于預(yù)防或治療疾病的疫苗中的用途。
18.如權(quán)利要求17中的用途，其用于提高抗原特異性的CD8反應(yīng)。
19.一種治療或預(yù)防疾病的方法，其包括給患有或易患某種疾病的病人施用根據(jù)權(quán)利要求1-15的任一項的疫苗組合物。
20.一種引起抗原特異性的CD8免疫反應(yīng)的方法，其包括給病人施用根據(jù)權(quán)利要求1-15的任一項的疫苗。
21.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-15的任一項的疫苗的方法，其中將與志賀菌毒素的B亞單位或其免疫學(xué)上的功能等價物組合的抗原與佐劑混合。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，其含有能結(jié)合Gb3受體上、與抗原復(fù)合的志賀菌毒素的B亞單位或其免疫學(xué)上的功能等價物，而且還含有佐劑，前提是當佐劑只是一種金屬鹽時，就可以以這樣的方式配制不超過約50％的抗原被吸附到金屬鹽上。和與抗原復(fù)合但無佐劑的志賀菌毒素或其免疫學(xué)上的功能等價物相比，或者和有佐劑的單獨抗原相比，這種組合物提供了增強的免疫反應(yīng)。
文檔編號A61K39/39GK1956729SQ200580016322
公開日2007年5月2日 申請日期2005年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月21日
發(fā)明者P·肖梅茲, C·P·A·G·科利弄, M·P·范梅歇倫 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司