專利名稱：：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及兩種或兩種以上肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)蛋白的組合，其制備方法及其作為疫苗在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。該組合物尤其對(duì)預(yù)防嬰兒和老年人鏈球菌感染有效。
背景技術(shù)：
：肺炎鏈球菌是一種導(dǎo)致很高發(fā)病率和死亡率(特別是年幼者和老年人)的革蘭氏陽(yáng)性菌，它引起肺炎、菌血癥、腦(脊)膜炎等侵襲性疾病和急性中耳炎等菌群定居(colonisation)相關(guān)性疾病。美國(guó)60歲以上人群肺炎球菌性肺炎的發(fā)病率為每100,000人中估計(jì)有3~8人，其中20%導(dǎo)致菌血癥和其他癥狀，例如腦膜炎，即使用抗生素治療，其死亡率也接近30%。肺炎球菌被賦予血清型特異性的化學(xué)連接的多糖包裹。有90種公知的肺炎雙球菌血清型，莢膜是肺炎雙球菌毒力的主要決定因素，因?yàn)榍v膜不但保護(hù)細(xì)菌內(nèi)表面不受補(bǔ)體影響，其本身也具有弱免疫原性。多糖是T非依賴型抗原，不能被加工或呈遞在MHC分子上，從而不能與T細(xì)胞相互作用，但它們能通過(guò)一種涉及B細(xì)胞表面受體交聯(lián)的不同的機(jī)制刺激免疫系統(tǒng)。若干試驗(yàn)表明侵襲性肺炎雙球菌疾病的預(yù)防與莢膜特異性抗體密切相關(guān)，且該保護(hù)作用具有血清特異性。肺炎鏈球菌是嬰兒和兒童侵襲性細(xì)菌疾病和中耳炎最常見(jiàn)的致病因素。同樣，老年人對(duì)肺炎球菌疫苗反應(yīng)較弱[Roghmann等，(1987),J.Gerontol.42:265-270],因此在這些人群中細(xì)菌性肺炎的發(fā)病率升高[Verghese和Berk,(1983)Medicine(Baltimore)62:271-285]。23-價(jià)非偶聯(lián)肺炎球菌疫苗的臨床療效變化幅度大，從0%~81%不等(Fedson等，(1994)ArchInternMed.154:2531-2535)。其療效似乎與正凈皮免疫的危險(xiǎn)人群相關(guān)，例如老年組、何杰金氏病組、脾切除術(shù)組、鐮刀細(xì)胞疾病組和無(wú)y球蛋白血癥組(Fine等，(1994)ArchInternMed.154:2666-2677)，此外還與疾病癥狀相關(guān)。23-價(jià)疫苗對(duì)肺炎球菌性肺炎(某些高危組，例如老年組)和中耳炎不顯示預(yù)防性。為克服嬰兒這種缺乏免疫原性所作的策略包括多糖與大分子免疫蛋白的連接，該大分子免疫蛋白提供旁路T細(xì)胞輔助，并且對(duì)與之結(jié)合的多糖抗原引起免疫記憶。然而，還需要更好的肺炎球菌疫苗組合物，特別是能更有效地預(yù)防或改善老年人和兒童肺炎球菌疾病(尤其是肺炎)的肺炎球菌疫苗組合物。本發(fā)明提供這種更好的疫苗。發(fā)明概述本發(fā)明一方面是一種免疫原性組合物，該組合物至少包含兩種選自多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、Spl01、Spl30、Spl25和Spl33的肺炎鏈球菌蛋白。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，一種蛋白質(zhì)選自多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，一種蛋白質(zhì)選自膽石咸結(jié)合蛋白家族(CbpX),或CbpX截短物，或CbpX片段-LytX截短物嵌合蛋白。本方明一個(gè)相關(guān)方面提供一種用于治療或改善嬰兒中耳炎或老年人肺炎的疫苗。任選地，該疫苗可以另外包含一種佐劑，優(yōu)選地，該佐劑為TH1應(yīng)答的誘導(dǎo)物。本發(fā)明另一相關(guān)方面是本發(fā)明疫苗的制備方法，該方法通過(guò)選擇和分離兩種不同的肺炎鏈球菌蛋白并將這兩種蛋白與可藥用載體混合。本發(fā)明涉及1.一種含有至少兩種肺炎鏈球菌蛋白的免疫原性組合物，其中一種肺炎鏈球菌蛋白選自多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)，另一種肺炎鏈球菌蛋白選自膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、Spl01、Spl30、Spl25和Sp133。2.—種含有至少兩種肺炎鏈球菌蛋白的免疫原性組合物，其中一種肺炎鏈球菌蛋白選自膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物和CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白，另一種肺炎鏈球菌蛋白選自多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、LytC、肺炎球菌溶血素(Ply)、PsaA和Sp128。3.項(xiàng)1~2的免疫原性組合物，其中PhtX為PhtA、PhtB或PhtD。4.項(xiàng)1~3的免疫原性組合物，其中CbpX為CbpA或PspC。5.項(xiàng)1~4的免疫原性組合物，其還含有佐劑。6.—種含有項(xiàng)5的免疫原性組合物的疫苗。7.—種引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，其通過(guò)用項(xiàng)1~5的免疫原性組合物免疫哺乳動(dòng)物。8.—種預(yù)防或改善55歲以上患者鏈球菌感染的方法，包括給與所述患者安全且有效量的項(xiàng)6的疫苗。9.項(xiàng)6的疫苗在制備預(yù)防55歲以上患者肺炎的藥物中的應(yīng)用。10.—種預(yù)防或改善嬰兒中耳炎的方法，包括給與所述患者安全且有效量的項(xiàng)6的疫苗。11.一種制備項(xiàng)6的疫苗的方法，包括下述步驟選擇和分離兩種不同的肺炎鏈球菌蛋白，然后將所述蛋白與可藥用載體混合。圖1顯示了嬰兒血清反應(yīng)陽(yáng)性率％。圖2顯示了嬰兒隨年齡的血清轉(zhuǎn)變。圖3顯示了年輕成人的中點(diǎn)滴度。圖4顯示了年輕成人血清反應(yīng)陽(yáng)性率％。圖5顯示了老年人中點(diǎn)滴度。圖6顯示了老年人血清反應(yīng)陽(yáng)性率％。發(fā)明描述本方明通過(guò)依賴基于肺炎球菌蛋白的途徑提供一種用于治療或改善老年人(例如肺炎)和/或嬰兒(例如中耳炎)肺炎球菌感染的改進(jìn)的疫苗。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該疫苗適用于預(yù)防和改善老年人肺炎球菌感染。大部分成人都接觸過(guò)肺炎鏈球菌，通過(guò)服用至少兩種本發(fā)明的肺炎球菌蛋白，該疫苗能激發(fā)成人和老年人的潛在免疫應(yīng)答至保護(hù)水平。該肺炎球菌蛋白在沒(méi)有肺炎鏈球菌多糖的條件下服用。在本發(fā)明的內(nèi)容中，55歲或55歲以上的人視為老年人，通常為60歲以上，更普遍的為65歲以上。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供一種用于預(yù)防老年人肺炎的包含肺炎球菌蛋白的疫苗組合物。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含兩種或兩種以上本發(fā)明肺炎J求菌蛋白的適用于嬰兒(通常為0~2歲)的疫苗組合物。本發(fā)明的肺炎球菌蛋白本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白為至少在肺炎球菌生命周期期間暴露的表面，或者是由肺炎球菌分泌或釋放的蛋白。本發(fā)明的蛋白組合優(yōu)選從以下蛋白中選取不同的兩種，例如具有LXXC(X為任何氨基酸，例如多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX))II型信號(hào)序列基序的蛋白，膽堿結(jié)合蛋白(CbpX),具有I型信號(hào)序列基序的蛋白(例如Spl01)，具有LPXTG基序的蛋白(X為任意氨基酸，例如Spl28、Spl30)和毒素(例如Ply)等。上述種類(或基序)的優(yōu)選例為下列蛋白或其免疫功能等效物。本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少兩種選自多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、SplOl、Spl30、Spl25和Spl33的蛋白。但是，如果CbpX為PspC,則第二種蛋白不為PspA或PsaA。優(yōu)選地，該免疫原性組合物包含兩種或兩種以上選自多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽石成結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家力矣、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(PIy)、PspA、PsaA和Sp^8的蛋白。更優(yōu)選地，該免疫原性組合物包含兩種或兩種以上選自多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽石咸結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎球菌溶血素(Ply)和Spl28的蛋白。Pht家族(多組氨酸三聯(lián)體)包含PhtA、PhtB、PhtD和Ph伍蛋白。該家族的特點(diǎn)是脂質(zhì)化序列，兩個(gè)功能區(qū)被脯氨酸富集區(qū)和數(shù)個(gè)組氨酸三聯(lián)體分隔，可能涉及金屬或核苷的結(jié)合或酶活性，(3-5)巻曲的螺旋區(qū)域，一個(gè)保守的N-末端和一個(gè)異源的C-末端。它出現(xiàn)在所有受沖企肺炎雙球菌菌抹中。其它鏈球菌和奈瑟菌屬中也發(fā)現(xiàn)有同源蛋白。優(yōu)選該家族成員包含PhtA、PhtB和PhtD,更優(yōu)選包含PhtA或PhtD。但是，應(yīng)該理解PhtA、B、D和E是指具有公開(kāi)于下述引文序列的蛋白質(zhì)以及具有與參考蛋白至少90%序列同源性的其天然(和人工)變體，優(yōu)選與參考蛋白至少95%相同，最優(yōu)選97%相同。PhtX蛋白中，PhtA公開(kāi)于WO98/18930,也被稱為Sp36。如上所述，PhtA來(lái)自多組氨酸三聯(lián)體家族，具有II型LXXC信號(hào)基序。PhtD公開(kāi)于WO00/37105,也被稱為Sp036D。如上所述，PhtD也來(lái)自多組氨酸三聯(lián)體家族，具有II型LXXC信號(hào)基序。PhtB公開(kāi)于WO00/37105,也被稱為Sp036B。PhtB家族的另一成員是C3降解的多肽，公開(kāi)于WO00/17370。該蛋白也來(lái)自多組氨酸三聯(lián)體家族，具有II型LXXC信號(hào)基序。優(yōu)選免疫功能等效物為WO98/18930中公開(kāi)的Sp42。PhtB截短物(約為79kD)公開(kāi)于W099/15675，也被視為PhtX家族成員之一。PhtE公開(kāi)于WO00/30299中，也被稱為BVH-3。膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)成員最初被視為能用膽i威親和層析純化的肺炎球菌蛋白。所有膽堿結(jié)合蛋白都非共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞壁磷壁酸和膜結(jié)合脂磷壁酸的磷酸膽堿部分。雖然該蛋白質(zhì)的確切性質(zhì)(氨基酸序列、長(zhǎng)度等)可以不同，但整個(gè)家族具有數(shù)個(gè)在結(jié)構(gòu)上相同的區(qū)域。一般來(lái)說(shuō)，膽堿結(jié)合蛋白包含N-末端區(qū)域(N),保守重復(fù)區(qū)域(R1和/或R2),脯氨酸富集區(qū)域(P)和保守的膽堿結(jié)合區(qū)域(C)，該膽堿結(jié)合區(qū)由多個(gè)重復(fù)單元組成，約占該蛋白的一半。本申請(qǐng)中所用的術(shù)語(yǔ)"膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)"選自W097/41151中所鑒定的膽石威結(jié)合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公開(kāi)于W097/41151，CbpD和CbpG公開(kāi)于WO00/29434,PspC公開(kāi)于WO97/09994,PbcA公開(kāi)于W098/21337,SpsA是WO98/39450中公開(kāi)的膽堿結(jié)合蛋白。該膽堿結(jié)合蛋白優(yōu)選選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。另一優(yōu)選方案是CbpX截短物，其中"CbpX"如上述定義，"截短物，，指缺省50。/?；蚋嗄憠A結(jié)合區(qū)域(C)的CbpX蛋白。優(yōu)選這樣的蛋白質(zhì)缺省整個(gè)膽堿結(jié)合區(qū)域。更優(yōu)選這樣的蛋白質(zhì)截短物缺省(i)膽堿結(jié)合區(qū)域和(ii)該蛋白質(zhì)的N-末端一半的一部分，但至少保留一個(gè)重復(fù)區(qū)域(R1或R2)。更優(yōu)選地，該截短物具有兩個(gè)重復(fù)區(qū)域(R1和R2)。該優(yōu)選實(shí)施方案的例子是在W099/51266或W099/51188中舉例說(shuō)明的NRlxR2和RlxR2，但其它缺乏相似膽堿結(jié)合區(qū)域的膽堿結(jié)合蛋白也納入本發(fā)明的考慮范圍。LytX家族是與細(xì)胞溶解有關(guān)的月莫相關(guān)蛋白(membraneassociatedproteins)。N-末端區(qū)域包含膽堿結(jié)合區(qū)域，但是，LytX家族并不具有在上述CbpA家族中發(fā)現(xiàn)的所有特征，因此，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，LytX家族不同于CbpX家族。與CbpX家族相比，LytX的C-末端區(qū)域包含LytX蛋白家族的催化區(qū)域。該家族包含LytA、B和C。LytX家族中，LytA公開(kāi)于Ronda等,EurJBiochem，164:621-624(1987)。LytB公開(kāi)于WO98/18930,也被稱為Sp46。LytC也公開(kāi)于WO98/18930,也被稱為Sp91。該家族的優(yōu)選成員是LytC。另一優(yōu)選方案是LytX截短物，其中"LytX"如上述說(shuō)明，"截短物"指缺省50%或50%以上膽堿結(jié)合區(qū)域的LytX蛋白。優(yōu)選這樣的蛋白質(zhì)缺省整個(gè)膽堿結(jié)合區(qū)域。這樣的截短物例子可在本發(fā)明的實(shí)施例部分找到。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案是CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)。優(yōu)選該蛋白包含CbpX的NRkR2(或RlxR2)和LytX的C-末端部分(Cterm,即缺省膽;威結(jié)合區(qū)域)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。更優(yōu)選CbpX選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC,其中更優(yōu)選CbpX為CbpA。優(yōu)選LytX為L(zhǎng)ytC(也^皮稱為Sp91)。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案是PspA或PsaA截短物，該截短物缺省膽堿結(jié)合區(qū)域(C)，并且表達(dá)為帶LytX的融合蛋白，優(yōu)選LytX為L(zhǎng)ytC。肺炎球菌溶血素是一種具有明顯溶細(xì)胞(溶血)作用和補(bǔ)體活化作用的多功能毒素(Rubins等，Am.Respi.CitCareMed，153:1339-1346(1996))。該毒素不由肺炎雙球菌分泌，但它在肺炎雙球菌受自溶素的影響而裂解時(shí)被釋放。它的作用包括例如刺激人體單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，抑制人體呼吸上皮纖毛顫動(dòng)，降低嗜中性粒細(xì)胞的殺菌活性和遷移性。肺炎球菌溶血素最明顯的作用是在裂解紅細(xì)胞方面的作用，該作用涉及與膽固醇結(jié)合。由于肺炎球菌溶血素是一種毒素，因此在體內(nèi)給藥前必須脫毒(即用于預(yù)防的該藥的劑量對(duì)人體是無(wú)毒的)。該領(lǐng)域中已知野生型或天然肺炎球菌溶血素的表達(dá)和克隆，參見(jiàn)例如Walker等(lnfectlmmun,55:1184-1189(1987)),Mitchell等(BiochimBiophysActa,1007:67-72(1989)和Mitchell等(NAR,18:4010(1990))。Ply的脫毒可以用化學(xué)方法，例如用福爾馬林或戊二醛或二者的組合進(jìn)行處理，這樣的方法在許多毒素脫毒4支術(shù)中公知。或者，ply可以用基因方法脫毒。因此，本發(fā)明包括肺炎球菌蛋白衍生物，該衍生物可能是例如突變蛋白。此處所用的術(shù)語(yǔ)"突變"是指用公知的定點(diǎn)誘變技術(shù)或其它常規(guī)方法使分子缺失、增加或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸。例如如上所述，突變型ply蛋白可以被改變，以使其失去生物學(xué)活性但仍保持其致免疫表位，參見(jiàn)例如WO90/06951,Berry等，(InfectImmun,67:981-985(1999))和WO99/03884。此處所用的術(shù)語(yǔ)"Ply"是指適于醫(yī)用(即無(wú)毒的)的突變或脫毒的肺炎球菌溶血素。PsaA禾口PspA在本4頁(yè)i或乂^殺p。i"列i口Berry&Paton,InfectImmun1996Dec;64(12):5255-62中描述了PsaA和其5爭(zhēng)膜缺失變體(transmembranedeletionvariants)。PspA和其^爭(zhēng)膜缺失變體7>開(kāi)于例如US5804193,W092/14488和WO99/53940。Spl28和Spl30公開(kāi)于WO00〃6540。Spl25是帶有LPXTG(其中X為任何氨基酸)細(xì)胞壁錨定基序的肺炎球菌表面蛋白的例子。在本發(fā)明的
發(fā)明內(nèi)容中發(fā)現(xiàn)具有此基序的這類肺炎球菌表面蛋白中的任何蛋白都有用，因此將其視為本發(fā)明的另一種蛋白。Spl25本身公開(kāi)于WO98/18930,也稱為ZmpB，即鋅金屬蛋白酶。Spl01公開(kāi)于WO98/06734(其中它參考并y85993)，其特征是I型信號(hào)序列。Spl33公開(kāi)于WO98/06734(其中它參考并y85992),其特征是I型信號(hào)序列。本發(fā)明的蛋白也可以進(jìn)行有益的組合，優(yōu)選組合物包括但不限于PhtD+NRkR2、PhtD+NRkR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Spl28、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NRlxR2、PhtA+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Spl28、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、麵xR2+LytC、NRlxR2+PspA、NRlxR2+PsaA、NRkR2+Spl28、RlxR2+LytC、RlxR2+PspA、RlxR2+PsaA、RlxR2+Spl28、RkR2+PhtD、RlxR2十PhtA。優(yōu)選NRlxR2(或RlxR2)來(lái)自CbpA或PspC,更優(yōu)選來(lái)自CbpA。特別優(yōu)選的肺炎球菌蛋白的組合包含Ply(或其截短物或免疫功能等效物)+1^0(或其截短物或免疫功能等效物)+NRlxR2(或RlxR2)。優(yōu)選NRlxR2(或RlxR2)來(lái)自CbpA或PspC，更優(yōu)選來(lái)自CbpA。本發(fā)明也包括本發(fā)明蛋白的"免疫功能等效物"。"免疫功能等效物"定義為包含至少一種來(lái)自本發(fā)明蛋白的保護(hù)性表位的肽或蛋白質(zhì)。這些表位的特征是表面暴露，高度保守，能引起宿主的殺菌抗體應(yīng)答或預(yù)防毒性作用。優(yōu)選地，該功能等效物至少含有15個(gè)，優(yōu)選30個(gè)或30個(gè)以上來(lái)自本發(fā)明蛋白質(zhì)的連續(xù)的氨基酸，前提是其能產(chǎn)生與天然蛋白基本相同的免疫應(yīng)答。聯(lián)合運(yùn)用2D-結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和抗原指數(shù)預(yù)測(cè)兩種方法鑒定表面暴露且具有抗原性的肽，由此可以迅速確定蛋白質(zhì)序列中潛在的B-細(xì)胞表位的位置。用PS1PRED程序能進(jìn)行2D-結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(來(lái)自DavidJones,BruneiBioinformaticsGroup,Dept.BiologicalSciences,BruneiUniversity,UxbridgeUB83PH,UK)?？梢栽贘ameson和Wolf(CABIOS4:181-186[1988])說(shuō)明的方法基礎(chǔ)上計(jì)算抗原指數(shù)。本發(fā)明在下述方面優(yōu)于肺炎鏈球菌多糖疫苗本發(fā)明的復(fù)合肺炎鏈球菌蛋白(免疫原性的)組合物可能包括對(duì)多種血清型的更大的交叉保護(hù)作用，能進(jìn)一步抑制粘著和集落形成，還能潛在地增加能夠中和病原體毒性/酶作用的抗體。而且，另外的表面抗原還提供一種進(jìn)一步刺激調(diào)理吞噬的方式。本發(fā)明也考慮預(yù)防一系列不同病原體的組合疫苗。目前許多兒科疫苗以組合疫苗的形式給予，以減少兒童的注射次數(shù)。因此對(duì)于兒科疫苗來(lái)說(shuō)，來(lái)自其它病原體的其它抗原可以與本發(fā)明的疫苗一起制備。例如本發(fā)明的疫苗可以用公知的"三價(jià)，，組合疫苗配制(或同一時(shí)間分別服用),該三價(jià)組合疫苗包含白喉類毒素(DT),破傷風(fēng)類毒素(TT)和百日咳成分[通常是脫毒的百日咳類毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，任選pertactin(PRN)和/或凝集素1+2],例如市售疫苗INFANRIX-DTPaTM(SmithKlineBeechamBiologicals)包含DT、TT、PT、FHA和PRN抗原，或帶有完整百日咳細(xì)胞成分，例如SmithKlineBeechamBiologicalss.a.銷售的TritanrixTM。該組合疫苗也可以包含其它抗原，如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原(例如滅活的三價(jià)脊髓灰質(zhì)炎病毒-IPV)、卡他莫拉菌(MoraxellaCatarrhalis)外膜蛋白、非典型流感嗜血桿菌蛋白、腦膜炎奈瑟氏球菌B外膜蛋白。原的優(yōu)選實(shí)例為OMP106[WO97/41731(Antex)和WO96/34960(PMC)];OMP21;LbpA和/或LbpB[WO98/55606(PMC)];TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)];CopB[HelminenME,等，(1993)Infect.Immun.61:2003-2010];UspAl和/或UspA2[WO93/03761(UniversityofTexas)];OmpCD;HasR(PCT/EP99/03824);PilQ(PCT/EP99/03823);OMP85(PCT/EP00/01468);lipo06(GB9917977.2);lipo10(GB9918208.1);lipoll(GB9918302.2);lipo18(GB9918038.2);P6(PCT/EP99/03038);D15(PCT/EP99/03822);OmplAl(PCT/EP99/06781);Hly3(PCT/EP99/03257)和OmpE?？梢园诮M合疫苗中(特別是用于預(yù)防中耳炎)的非典型流感嗜血桿菌抗原優(yōu)選實(shí)例為Fimbrin蛋白[(US5766608-OhioStateResearchFoundation)]和含來(lái)自該蛋白的肽的融合體[例如LB1(f)肽融合體；US5843464(OSU)或WO99/64067];OMP26[WO97/01638(Cortecs);P6[EP281673(StateUniversityofNewYork)];TbpA和/或TbpB;Hia;Hsf;Hin47;Hif;Hmwl;Hmw2;Hmw3;Hmw4;Hap;D15(W094/12641);蛋白質(zhì)D(EP594610);P2和P5(W094/26304)。另一實(shí)施方案中，以上引用的多種抗原可以包含在本發(fā)明的免疫原性組合物中，作為抗原出現(xiàn)在由細(xì)菌制成的外膜嚢(泡)的表面。其它考慮的組合物是本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白與病毒抗原的組合，所述病毒抗原例如來(lái)自流感病毒(減毒的、解體的(split)或其亞單位)[例如表面糖蛋白神經(jīng)氨酸酶(NA)和血凝素(HA),參見(jiàn)例如ChaloupkaI.等，Eur.JournalClin.Microbiol.Infect.Dis.1996,15:121-127]，RSV(例如F和G抗原或F/G融合體，參見(jiàn)例如SchmidtA.C.等，JVirol，May2001,p4594—4603)，PIV3(例如HN和F蛋白，參見(jiàn)Schmidt等，同上)，水痘病毒(例如減毒的，糖蛋白I-V等)和MMR(麻瘆，流行性腮腺炎，風(fēng)滲)的任意(或全部)組分。本發(fā)明的多糖抗原本申請(qǐng)也考慮帶有兩種或兩種以上肺炎鏈球菌蛋白的組合疫苗，該肺炎鏈球菌蛋白與肺炎鏈球菌以外的多糖組合。這樣的多糖可以從例如流感嗜血桿菌，流感嗜血桿菌B型(Hib),腦膜炎奈瑟氏球菌A、C、W、Y族(group),肺炎鏈球菌以外的鏈球菌(例如B族鏈球菌，釀膿鏈球菌(S.pyrogenes)等)，葡萄球菌屬(例如金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌)，大腸桿菌，腸球菌屬(例如糞腸球菌(E.faecalis)屎腸球菌(E.faecium))等。優(yōu)選多糖選自流感嗜血桿菌B型(Hib),和/或腦膜炎奈瑟氏球菌A、C、W135和/或Y族。如上所述，用于接種的多糖的問(wèn)題是多糖本身為弱免疫原。為克服此問(wèn)題，可以將多糖與提供旁路T細(xì)胞輔助的蛋白載體結(jié)合。因此優(yōu)選將本發(fā)明所用多糖與這樣的蛋白載體結(jié)合，目前常用于生產(chǎn)多糖免疫原的此種蛋白載體的例子包括白喉和破傷風(fēng)類毒素(分別為DT、DTCRM197、其它DT突變體例如第148位Glu的突變體等[參見(jiàn)例如US4,709,017，WO93/25210,W095/33481等]和TT(和TT截短物C))，匙孔血藍(lán)蛋白(KLH),來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的OMPC和結(jié)核菌素的純蛋白衍生物(PPD)。另一種用于基于多糖的免疫原性組合物(或疫苗)的載體是來(lái)自于流感嗜血桿菌(EP594610-B)的蛋白D或其片段。適用的片段包括包含T-輔助細(xì)胞表位的那些片段。具體是蛋白D片段優(yōu)選包含該蛋白N-末端的1/3?？梢岳萌魏喂姆椒▽⒃摱嗵沁B接到載體蛋白上(例如用Likhite,美國(guó)專利號(hào)4,372,945和Armor等，美國(guó)專利號(hào)4,474,757)。優(yōu)選執(zhí)行CDAP偶聯(lián)(WO95/08348)。為增強(qiáng)免疫原性，可以控制多糖分子大小(解聚)，加入佐劑，冷凍干燥或連接到不同的載體蛋白上。本發(fā)明的TH1佐劑本發(fā)明疫苗優(yōu)選配有佐劑。合適的佐劑包括鋁鹽，例如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁，也可以是4丐鹽、鎂鹽、鐵鹽或鋅鹽，或也可以是?；野彼岵蝗苄詰腋∫海蝓；?，陽(yáng)離子或陰離子衍生多糖，或聚磷腈。優(yōu)選地，該佐劑是誘導(dǎo)TH1型應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)物。如此高水平的Thl型細(xì)胞因子有助于誘導(dǎo)對(duì)給定的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而高水平的Th2型細(xì)胞因子有助于誘導(dǎo)對(duì)該抗原的體液免疫應(yīng)答。Thl型免疫應(yīng)答和Th2型免疫應(yīng)答的區(qū)別不是絕對(duì)的，記住這一點(diǎn)很重要?，F(xiàn)實(shí)中，個(gè)體可能表現(xiàn)為以Thl為主或以Th2為主的免疫應(yīng)答，但是通常用Mosmann和Coffman在鼠CD4+veT細(xì)胞克隆中所描述的來(lái)考慮該細(xì)胞因子家族比較方便(Mosmann,T.R和Coffman，R.L.(1989)THlandTH2cells:differentpatternsoflymphokinesecretionleadtodifferentfunctionalproperties.AnnualReviewofImmunology,7,pl45-173)。Thl型應(yīng)答與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-y和IL-2細(xì)胞因子有關(guān)。通常與Thl型免疫應(yīng)答誘導(dǎo)直接有關(guān)的其它細(xì)胞因子不由T細(xì)胞產(chǎn)生，例如IL-12。比較而言，Th2型應(yīng)答與11-4，IL-5,IL-6和IL-10的分泌有關(guān)。激發(fā)以TH1應(yīng)答為主的應(yīng)答的合適佐劑系統(tǒng)包括單磷酰脂A或其衍生物，特別是3-去氧酰化單磷酰脂A(3-de-O-acylatedmonophosphoryllipidA)(3D-MPL)(其制備參見(jiàn)GB2220211A);和單磷酰脂A的組合，優(yōu)選3-去氧?；瘑瘟柞Ｖ珹與鋁鹽(例如磷酸鋁或氬氧化鋁)或水包油型乳劑組合。在這樣的組合中，抗原和3D-MPL被包含在同一顆粒結(jié)構(gòu)中，允許抗原和免疫刺激信號(hào)更有效地傳遞。研究表明3D-MPL能進(jìn)一步加強(qiáng)明礬吸附抗原的免疫原性[Thoden等，Vaccine(1998)16:708-14;EP689454-Bl]。強(qiáng)化系統(tǒng)包括單磷酰脂A和皂苷(saponin)衍生物的組合，特別是WO94/00153中7>開(kāi)的QS21和3D-MPL的組合，或WO96/33739中公開(kāi)的反應(yīng)原性稍弱的組合，其中QS21用膽固醇猝滅。特別有效的佐劑制劑包括QS21，3D-MPL和生育酚的水包油型乳劑，公開(kāi)于WO95/17210,并且為優(yōu)選制劑。疫苗優(yōu)選含有皂苷，更優(yōu)選QS21。該制劑也可以含有水包油型乳劑和生育酚(WO95/17210)。本發(fā)明還提供一種疫苗制劑的制備方法，該方法包括將本發(fā)明的一種蛋白與可藥用賦形劑例如3D-MPL的混合。包含寡核苷酸的非曱基化CpG(WO96/02555)也是誘導(dǎo)TH1應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)物，并且適用于本發(fā)明。本發(fā)明另一方面提供一種醫(yī)用疫苗。一個(gè)實(shí)施方案中提供了一種預(yù)防或改善老年人肺炎的方法，包括給所述老年患者服用安全而有效劑量的本發(fā)明疫苗，且任選服用一種Thl佐劑。另一實(shí)施方案提供了一種預(yù)防或改善嬰兒(24個(gè)月以下)或幼兒(24個(gè)月~5歲)中耳炎的方法，包括給所述嬰兒或幼兒服用安全而有效劑量的疫苗，該疫苗包含本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白，且任選服用一種Thl佐劑。本發(fā)明的疫苗制品本發(fā)明的疫苗制劑可以用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人類患者)的感染，其方法是通過(guò)全身或粘膜給藥途徑給予所述疫苗。給藥方式包括肌肉注射、腹膜內(nèi)注射、皮內(nèi)注射或皮下注射，或口腔/消化道、呼吸道和泌尿生殖道粘膜給藥。治療肺炎或中耳炎優(yōu)選鼻內(nèi)給與疫苗(由于能更有效地阻止肺炎雙球菌的鼻咽運(yùn)送，因此能在最早期階段減弱感染)。本發(fā)明的疫苗可以單劑給藥，其組分也可以同時(shí)或不同時(shí)聯(lián)合服用(例如如果疫苗中有多糖，則多糖可以與細(xì)菌蛋白組合物在同一時(shí)間分開(kāi)服用，或在服用細(xì)菌蛋白組合物后1~2周服用，以使二者發(fā)揮最佳免疫應(yīng)答協(xié)同作用)。除單一給藥途徑之外，還能采用兩種不同的給藥途徑。例如病毒抗原能以ID(皮內(nèi))方式給藥，而細(xì)菌蛋白能以IM(肌肉)或IN(鼻內(nèi))方式給藥。如果有多糖，則多糖能以IM(或ID)方式給藥，細(xì)菌蛋白能以IN(或ID)方式給藥。另夕卜，本發(fā)明的疫苗能以IM方式給予初次免疫、以IN方式給予加強(qiáng)免疫。單劑疫苗劑量中偶聯(lián)物抗原的量是能誘導(dǎo)免疫保護(hù)應(yīng)答，但在通常的疫苗中又無(wú)明顯副作用的量，此量隨特異性免疫原的使用及其被呈遞的方式而改變。蛋白抗原在疫苗中的通常含量范圍為l~100/ig,優(yōu)選5-50pg,最常見(jiàn)的范圍為5~25(ig。如果含有多糖，預(yù)計(jì)一般單劑包含O.l-lOOpg多糖，優(yōu)選O.l~50嗎，更優(yōu)選O.l~IO嗎，其中15lig為最優(yōu)選范圍。特殊抗原中各成分的最佳量可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)確定，包括觀察受試者適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。初次接種后，患者可以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔內(nèi)接受一次或多次加強(qiáng)性免疫接種。通常，疫苗包含抗原(蛋白)、佐劑、賦形劑或可藥用載體。疫苗制齊'J通常乂>開(kāi)于VaccineDesign("Thesubunitandadjuvantapproach"(PowellM.F.和NewmanM.J.編)(1995)PlenumPressNewYork)。脂質(zhì)體膠嚢公開(kāi)于Fullerton的美國(guó)專利4,235,877。雖然本發(fā)明的疫苗能以任何途徑給藥，所述疫苗皮內(nèi)給藥(ID)構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例。人的皮膚包含一層外部"角質(zhì)，，表皮層，稱之為角質(zhì)層，它覆蓋了表皮。此表皮下是真皮層，真皮層依次覆蓋了皮下組織。研究者們已發(fā)現(xiàn)皮內(nèi)注射，特別是真皮內(nèi)注射疫苗能刺激免疫應(yīng)答，還伴隨其它好處。此處所述的皮內(nèi)接種疫苗構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選特征。皮內(nèi)注射的常規(guī)技術(shù)"芒圖操作(mantouxprocedure)"包括下述步驟清洗皮膚，伸出一只手，然后使小號(hào)針的斜面朝上(2631號(hào))，以10-15°的角度將針插入。一旦針斜面被插入后，針筒下降，施予輕微壓力進(jìn)一步推進(jìn)，使其在皮下抬起。然后液體緩慢注入，導(dǎo)致皮膚表面形成包或隆起，最后緩慢抽出針。近來(lái)，皮內(nèi)或通過(guò)皮膚給與液體制劑的特定裝置已被公開(kāi)，例如該裝置公開(kāi)于WO99/34850和EP1092444，噴射注射裝置公開(kāi)于WO01/13977US5,480,381,US5,599,302,US5，334，144，US5，993，412，US5,649,912,US5,569，189,US5,704,911,US5,383,851,US5,893,397,US5,466,220,US5,339,163,US5,312,335,US5，503,627,US5,064,413，US5,520,639，US4,596,556,US4,7卯,824,US4,941,880,US4,940,460，WO97/37705和WO97/13537。該疫苗制劑的真皮內(nèi)給藥替代方法包括常規(guī)注射器和針，或固體疫苗的彈道式給藥裝置(WO99/27961),或經(jīng)皮貼劑(WO97/48440;WO98"8037);或皮膚表面給藥(經(jīng)皮的給藥WO98/20734;WO98/28037)。當(dāng)本發(fā)明的疫苗是給至皮膚時(shí)，更具體地說(shuō)是真皮時(shí)，給與小體積量的疫苗，具體地說(shuō)大約為0.05ml和0.2ml。本發(fā)明皮膚或皮內(nèi)疫苗中抗原含量可以類似于肌內(nèi)疫苗所用的常規(guī)劑量。因此，皮內(nèi)疫苗中的蛋白抗原含量范圍可以為1~100jLig,優(yōu)選5~50嗎。同樣，如果有多糖偶聯(lián)物抗原，則預(yù)計(jì)其在單劑疫苗中的含量通常為0.1~IOO嗎多糖，優(yōu)選0.1~50昭，更優(yōu)選0.1~10嗎，可以為1~5嗎。但是，皮膚或皮內(nèi)疫苗的一個(gè)特點(diǎn)是其制劑可以為"低劑量"。因此，"低劑量"疫苗中的蛋白抗原含量則為每劑0.1~IO嗎，優(yōu)選0.15嗎；如果有多糖偶聯(lián)物抗原，則其在單劑疫苗中的含量范圍通常為O.Ol~l嗎多糖，優(yōu)選O.Ol~0,5嗎。此處所用的術(shù)語(yǔ)"皮內(nèi)給藥"是指將疫苗給至皮膚的真皮區(qū)域，但疫苗不一定僅存在于真皮內(nèi)。真皮層是距離人體皮膚表面約1.Omm和約2.0mm的皮層，但個(gè)體之間和同一個(gè)體的不同部位之間存在差異。一般地，預(yù)計(jì)疫苗可以通過(guò)距離表面皮膚1.5mm的深度達(dá)到真皮層。真皮上面為角質(zhì)層和表皮，下面為皮下層。通過(guò)設(shè)計(jì)給藥模式，可以使該疫苗最終僅存在于或主要存在于真皮內(nèi)，或最終分布于表皮和真皮。本發(fā)明另一方面可以包含編碼一個(gè)或多個(gè)肺炎鏈球菌蛋白的DNA,以便在原位產(chǎn)生蛋白質(zhì)。該DNA可以包含在本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)中公知的任何給藥系統(tǒng)中，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)，細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。本領(lǐng)域中許多基因丟會(huì)藥3支術(shù)已7>知，例如Rolland，(Crit.Rev.Therap.DrugCarrierSystems15:143-198，1998)中所描述的及本文參考文獻(xiàn)中所引用的。合適的核酸表達(dá)系統(tǒng)包含在患者體內(nèi)表達(dá)所必需的DNA表達(dá)序列(如適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和終止信號(hào))。當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)為活體重組微生物時(shí)，例如病毒或細(xì)菌，目的基因可以插入活的重組的病毒或細(xì)菌基因組中。用此活載體進(jìn)行接種和體內(nèi)感染會(huì)導(dǎo)致抗原體內(nèi)表達(dá)和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。用于此目的的病毒和細(xì)菌包括痘病毒(例如牛痘(caccinia)，鳥(niǎo)痘(fowlpox)和金絲雀痘病毒(canarypox))，曱病毒(alphaviruses)(中德畢斯病毒(Sindbisvirus),塞姆利基森4木病毒(SemlidiForestvims)，委內(nèi)瑞4立馬月鹵炎病毒(VenezuelianEquineEnecphalitisVims),腺病毒，腺相關(guān)病毒，微小RNA病毒(picornaviruses)(脊髓灰質(zhì)炎病毒，鼻病毒)，皰滲病毒(水痘-帶狀皰疹病毒等)，李司忒菌屬(Listeria)，沙門菌屬(Salmonella),志賀菌屬(Shigella)，奈瑟菌屬(Neisseria)和BCG。上述病毒和細(xì)菌可以具有毒性，或通過(guò)多種途徑減毒以獲得活疫苗。這樣的活疫苗也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明另一方面提供一種制備此處說(shuō)明的疫苗制劑的方法，根據(jù)本發(fā)明，該方法包括混合要進(jìn)行組合的蛋白。含有上文所述多糖的抗原性組合物(和疫苗)使用前優(yōu)選一直是冷凍的，使用時(shí)用稀釋劑臨時(shí)配制。更優(yōu)選地，在3D-MPL存在的條件下冷凍，用鹽;容'液臨時(shí)配制。疫苗冷凍在本領(lǐng)域已公知。通常，液體疫苗在抗結(jié)塊劑，例如蔗糖或乳糖等糖類(起始濃度為10200mg/mL)存在的條件下凍干。冷凍包含一系列典型步驟，例如-69匸開(kāi)始循環(huán)，再逐漸升溫至-24。C，升溫時(shí)間為3小時(shí)，保持此溫度18小時(shí)。再逐漸升溫至-16。C，升溫時(shí)間為l小時(shí)，保持此溫度6小時(shí)。然后逐漸升溫至+34°C，升溫時(shí)間為3小時(shí)，最后保持此溫度9小時(shí)。本發(fā)明的免疫組合物和疫苗可以用多種動(dòng)物模型或人血清進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如下列動(dòng)物模型可以用于評(píng)價(jià)肺炎球菌感染，皮下給與以50plCFA為佐劑的15嗎蛋白免疫C3H/HeJ小鼠(68周大小)，隨后3~4周用帶IFA的15嗎蛋白加強(qiáng)免疫。為證明小鼠對(duì)系統(tǒng)感染的被動(dòng)和主動(dòng)防護(hù)，腹腔注射15~90LD50的肺炎雙球菌進(jìn)行攻擊之前，可以在8~10周腹腔給與小鼠免疫血清或蛋白。另外，蛋白質(zhì)可以用小鼠鼻咽部菌群定居模型進(jìn)行檢測(cè)(Wu等MicrobialPathogenesis1997;23:127-137)。除小鼠外，大鼠幼鼠對(duì)肺炎鏈球菌的定居和感染敏感。在被動(dòng)保護(hù)試驗(yàn)中，2-5天大小的大鼠幼鼠在鼻腔給與肺炎鏈球菌(10(il)進(jìn)行攻擊前，可以給與小鼠免疫血清(100Wi.p.或10^1i.n.)?？梢杂帽橇鞒鑫锏匿伆迮囵B(yǎng)(20~40|111輸入，lOfil流出)確定菌群定居。組合疫苗中的蛋白成分間的有利相互作用可以通過(guò)每次給與疫苗中的一種蛋白來(lái)證明，該疫苗作為單價(jià)疫苗具有亞保護(hù)性。組合疫苗的預(yù)防效力較單價(jià)疫苗升高，這歸結(jié)于各成分之間的有利相互作用。本發(fā)明用下列附加實(shí)施例用來(lái)舉例說(shuō)明。除另有詳細(xì)說(shuō)明外，用本領(lǐng)域技術(shù)中公知和常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施實(shí)施例。實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明，但不限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1抗原的構(gòu)建和表達(dá)NRlxR2CbpA是一種由若干區(qū)域組成的74kDa的表面暴露蛋白。其N-末端區(qū)域包含兩個(gè)高度保守的重復(fù)單元(R1和R2)，C-末端區(qū)域包含10個(gè)串聯(lián)的具有20個(gè)氨基酸的直接重復(fù)序列。制備CbpA截短物用于產(chǎn)生NR1XR2(沒(méi)有膽堿結(jié)合區(qū)域)。NR1XR2基因是從來(lái)自肺炎鏈球菌血清型4菌林的DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增而來(lái)的(參見(jiàn)例如W097/41157或W099/51266)。用ExpandHighFidelityPCR系統(tǒng)或Hi-Fi(Roche)進(jìn)行PCR。所述系統(tǒng)由包含Taq聚合酶和校正性的聚合酶的混合物組成。由于固有的3，-5，核酸外切酶4交正活性，用Hi-Fi使DNA合成的忠實(shí)性比用Taq聚合酶提高3倍。PCR片段被克隆到來(lái)自pGEM-TVectorSystems(Promega)的pGEM-T載體中，這一步對(duì)用限制性內(nèi)切酶消化PCR片段以進(jìn)行進(jìn)一步的連接來(lái)說(shuō)是必需的。pGEM-T載體為線性的，并且包含3，-T突出端。這些突出端促進(jìn)耐熱聚合酶產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物插入，該耐熱聚合酶以不依賴于模板的方式添加單個(gè)脫氧腺苷至擴(kuò)增片段的3，末端。根據(jù)Benore-Parsons等的文章(NucleticAcidsresearch,23，4926-4927,1995),將所述片段和載體在酶消化后純化(NdeI和Xbal消化)。3~4小時(shí)內(nèi)將瓊脂糖薄片完全凍干。把l:1的乙醇-TE溶液加入凍干凝膠中。樣品輕微混合一小時(shí)，壓緊瓊脂糖，然后通過(guò)離心沉淀完全除去。用乙醇沉淀方法從洗脫液中回收DNA。編碼NRlxR2的DNA克隆到包含噬菌體A的長(zhǎng)啟動(dòng)子L的載體中。當(dāng)出現(xiàn)在AR58大腸桿菌菌抹中時(shí)，目的蛋白能被熱誘導(dǎo)，或出現(xiàn)在AR120大腸桿菌菌抹中時(shí)，能被萘咬酮酸誘導(dǎo)。在30。C進(jìn)行細(xì)菌隔夜預(yù)培養(yǎng)，將該預(yù)培養(yǎng)液稀釋約40倍，至總體積為20ml，30。C下放置至O.D.為0.4-0.6，然后在42°C下進(jìn)行熱誘導(dǎo)。分別在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，lml培養(yǎng)液以7000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。培養(yǎng)物上清液在-2(TC下存放，沉淀物(全部提取物)重新懸浮在500nl樣品緩沖液(蛋白印跡或十二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳分析)或500^1裂解緩沖液中，37°C下溫育30分鐘(ELISA)。裂解緩沖液的組分為十二烷基硫酸鈉0.1%,去氧膽酸鹽0.1%，枸櫞酸鈉0.015M。樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳，上樣至4~20%的凝膠上(NovexInvitrogen),200V下進(jìn)行遷移。用考馬斯藍(lán)染色。上樣至4~20%的凝膠上(Novex,Invitrogen)進(jìn)行蛋白印跡，200V下進(jìn)行遷移。將凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維上，用兔a-NRlXR2多克隆抗體(第一抗體)和與堿性磷酸酯酶偶聯(lián)的a-兔抗體(第二抗體)進(jìn)行顯影。在十二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳分析中發(fā)現(xiàn)一條約為55kDa的帶。在十二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳分析分析基礎(chǔ)上選擇一個(gè)28B2克隆并轉(zhuǎn)移后進(jìn)行發(fā)酵。該克隆被測(cè)序且其序列得到確認(rèn)(第39(即信號(hào)序列之后)~446位的氨基酸=406個(gè)氨基酸)。對(duì)隔夜誘導(dǎo)的細(xì)菌進(jìn)行裂解，然后離心，進(jìn)行NR1XR2可溶性研究。再進(jìn)行SDS-PAGE分析和ELISA試驗(yàn)，NR1XR2似乎主要(>95%)回收自可溶性組分。RlxR2，PhtD,Sp91,(N)RlxR2-Sp91[C-末端區(qū)域]和Ply上述基因也以與NRlxR2相似的方式克隆、測(cè)序和表達(dá)。RlxR2包含CbpA(肺炎鏈球菌血清型4N)的第177~443位的氨基酸，PhtD包含第21位(即信號(hào)序列之后)至末端(肺炎鏈球菌血清型4N的第839位氨基酸)的氨基酸，Sp91以第20位的氨基酸(VAA)開(kāi)始直至末端。對(duì)于融合體蛋白，RlxR2-Sp91Cterm包含CbpA的第177~443位氨基酸和翻譯終點(diǎn)之前的271個(gè)氨基酸。對(duì)于兩種融合蛋白，(N)RlxR2和Sp91Cterm序列之間發(fā)現(xiàn)兩個(gè)附加的氨基酸(GS)。對(duì)于所有結(jié)構(gòu)，ATG引入基因起始的5，端以允許轉(zhuǎn)錄和翻譯，這就意味著上述各序列前面都有一個(gè)附加的N-末端蛋氨酸。實(shí)施例2血清學(xué)使用來(lái)自臨床研究的血清，對(duì)肺炎鏈球菌蛋白自然產(chǎn)生的抗體應(yīng)答進(jìn)行ELISA檢測(cè)。2.1實(shí)—驗(yàn)步驟血清采樣當(dāng)嬰兒為24個(gè)月和6~12個(gè)月大小時(shí)分別收集兩份血清(N:20,研究DTPaHBV)。-20歲成人血清(N-50)。65歲以上老年人血清(N:140)。ELISA步驟4。C下各種蛋白均以ljiig/ml覆蓋免疫反應(yīng)板，放置過(guò)夜。連續(xù)兩倍稀釋的血清(從1/10th的稀釋液開(kāi)始)在室溫(RT)下振蕩溫育一小時(shí)。用稀釋了4000倍的過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗人IgG單克隆抗體(Strateck,HP6043),在RT下振蕩溫育30分鐘進(jìn)行免疫檢測(cè)。顯色后用SoftMaxPro算出中點(diǎn)滴度。滴度>10的血清視為陽(yáng)性。用幾何平均值計(jì)算，滴度為5的(截留值的一半);波主觀定為陰性血清。通過(guò)比較樣品光密度(OD)和生色I(xiàn)gG纟屯品(chromopureIgG)(Jackson)的OD曲線，確定IgG濃度(表示為嗎/ml)。該IgG純品被多克隆抗人IgG羊抗體捕獲到反應(yīng)板中，然后用與上述相同的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行顯色。2.2結(jié)果2.2.1嬰兒鏈球菌蛋白血清學(xué)受檢的2~4個(gè)月嬰兒血清中，PhtD,PsaA,Spl28和NRlxR2的抗體滴度和血清陽(yáng)性反應(yīng)率最高，Sp91和Ply次之。SplOl和Spl30無(wú)應(yīng)答或有低應(yīng)答。Sp46和PhtA未檢測(cè)(材料獲得性問(wèn)題)。相同受試者在6-12個(gè)月時(shí)收集的血清中抗體應(yīng)答總體下降，這表明上述高滴度主要由被動(dòng)轉(zhuǎn)移的母體抗體所導(dǎo)致。但是，某些嬰兒對(duì)相同蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答隨年齡增加，可能是自然暴露于肺炎雙球菌的結(jié)果。主要與此血清轉(zhuǎn)變相關(guān)的抗原確定為PsaA。有些受試者對(duì)PhtD,NRlxR2，Spl28,Sp91和Ply的抗體水平也增加，對(duì)SplOl和Spl30的體液應(yīng)答僅發(fā)現(xiàn)有微弱變化。(參見(jiàn)圖1和2)。2.2.2年輕成人鏈球菌蛋白血清學(xué)根據(jù)滴度的幾何平均值可知，被評(píng)價(jià)的年輕成人群體中，PhtD,PhtA和NRlxR2是最具免疫原性的蛋白，Spl28,Ply'和Sp91次之。所有受試者都能檢測(cè)到對(duì)這些蛋白質(zhì)的抗體。對(duì)Sp46，特別是對(duì)Spl30和Spl01的應(yīng)答較弱。PsaA未檢測(cè)(血清不夠)。(參見(jiàn)圖3和4)。2.2.3老年人鏈球菌蛋白血清學(xué)老年人鏈球菌蛋白的抗體水平比年輕成人明顯降低。老年人最好的免疫原為PhtD,其次為Spl28、NRlxR2、Sp91、Ply和PsaA。Spl30和Sp101僅有微弱應(yīng)答。Sp46和PhtA未檢測(cè)(材料獲得性問(wèn)題)。(參見(jiàn)圖5和6)。表1老年人的IgG幾何平均濃度(GMC)(jug/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>此說(shuō)明書中引用的所有出版物包括但不限于專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖耍?入作為參考，就如同各個(gè)出版物全文內(nèi)容在此弓1入并全部公開(kāi)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案已經(jīng)在上文中作了舉例說(shuō)明，應(yīng)該理解本發(fā)明不限于此處公開(kāi)的精確教導(dǎo)，本發(fā)明權(quán)利要求的范圍包括對(duì)上述說(shuō)明作出的所有改變。權(quán)利要求1.一種免疫原性組合物，含有至少兩種肺炎鏈球菌蛋白，所述蛋白選自多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)，膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白，肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133的肺炎鏈球菌蛋白。2.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，含有一種源自多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)的蛋白和另一種選自膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白，肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、Spl01、Spl30、Spl25和Spl33的蛋白。3.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，含有一種選自膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX),CbpX截短物和CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白的蛋白和另一種選自多組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)，LytX家族，肺炎球菌溶血素(Ply),PspA,PsaA,Spl28,Spl01，Spl30,Spl25和Spl33的蛋白。4.權(quán)利要求1~3的免疫原性組合物，其中PhtX為PhtA、PhtB或PhtD。5.權(quán)利要求1~4的免疫原性組合物，其中CbpX為CbpA或PspC。6.權(quán)利要求1~5的免疫原性組合物，其還含有佐劑。7.—種含有權(quán)利要求6的免疫原性組合物的疫苗。8.—種引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，其通過(guò)用權(quán)利要求1~6的免疫原性組合物免疫哺乳動(dòng)物。9.一種預(yù)防或改善55歲以上患者鏈球菌感染的方法，包括給與所述患者安全且有效量的權(quán)利要求7的疫苗。10.權(quán)利要求7的疫苗在制備預(yù)防55歲以上患者肺炎的藥物中的應(yīng)用。11.一種預(yù)防或改善嬰兒中耳炎的方法，包括給與所述患者安全且有效量的權(quán)利要求7的疫苗。12.—種制備權(quán)利要求7的疫苗的方法，包括下述步驟選擇和分離兩種不同的肺炎鏈球菌蛋白，然后將所述蛋白與可藥用載體混合。全文摘要本發(fā)明涉及疫苗。本發(fā)明涉及兩種或更多種肺炎鏈球菌蛋白的組合，它們的制備以及它們作為疫苗在醫(yī)學(xué)中的用途。這樣的組合尤其可保護(hù)嬰幼兒和老年人抗御鏈球菌感染。文檔編號(hào)A61KGK101502648SQ20091012853公開(kāi)日2009年8月12日申請(qǐng)日期2001年9月12日優(yōu)先權(quán)日2000年9月15日發(fā)明者伊維斯·洛貝特,克雷格·A·J·拉弗里爾,簡(jiǎn)·普爾曼,菲利普·赫曼德申請(qǐng)人:史密斯克萊.比奇曼生物公司